UNIVERSITATEA”ALEXANDRU IOAN CUZA” IAȘI

FACULTATEA DE BIOLOGIE
GENETICĂ MOLECULARĂ

Efectele scăderii protein kinazei 1 asociată Roh (ROCK1) și protein

kinazei ZIPK asupra expresiei genice și funcției ei în cultură de celule
musculare netede arteriale

Șef lucr. dr. Maniu Călin Lucian

Student:
Asavei Elena
Cuprins

II. Introducere.......................................................................................................1

III. Material și metodă............................................................................................2

IV. Rezultate şi discuţii..........................................................................................3

IV. Concluzii.......................................................................................................7

I.
 II. Introducere

ROCK și ZIPK sunt serin/ treonin protein kinaze ce sunt implicate într-un
număr mare de funcții fiziologice importante precum contracția musculaturii
netede, proliferarea celulară, adeziunea celulară, apoptoza și migrația celulară.
ROCK1 fosforilează și activează ZIPK, acest lucru sugerează că cel puțin o funcție
fiziologică are nevoie de ambele enzime.
Experimentul pe care l-am studiat este realizat în cultură de celule musculare
netede arteriale (smooth muscule cells- SMC) și are ca prim scop observarea
efectelor scăderii enzimelor ROCK1 și ZIPK asuprea expresiei genelor. Scăderea
enzimei ROCK1, dar nu și scăderea enzimei ZIPK, reduce viabilitatea celulelor
musculare netede arteriale și le inhinbă poliferarea. Un alt scop al proiectului ales
este de a clarifica dacă activarea mediată de ROCK1 a enzimei ZIPK este implicată
în funcționarea celulelor musculare netede arteriale.
Pentru a testa această ipoteză a activării secvențiale a enzimelor ROCK1 și
ZIPK autorii experimentului au utilizat siARN (short interfering ARN) pentru a
induce scăderea ROCK1 și ZIPK în cultura de celule musculare netede arteriale.

1
 III. Material și metodă

Pentru a înțelege rezultatele experimentului ales am utilizat programul

GEO2R care permite utilizatorilor să compare două sau mai multe seturi de probe.
Seria GEO este folosită pentru a identifica genele care sunt exprimate diferit în
funcție de condițiile experimentale (timp de expunere, vârstă, anumiți inhibitori,
condiții de mediu diferite). Rezultatele sunt prezentate sub forma unui tabel cu
gene ordonate după semnificație. Tabelul cu gene oferă următoarele informații:
adj.P.val. (genele cu cea mai mică valoare P sunt semnificative), în cazul în care se
compară două seturi de probe : testul t, B-statistic, logFC, pentru mai mult de 2
seturi de probe: F.

Seria experimentului pe care l-am ales din GEO este GSE56819.

În cadrul acestui experiment, pentru a obține rezultatele scontate s-au utilizat

3 seturi de probe. În primul set de probe sunt celule musculare netede arteriale la
care s-a adăugat siARN control care nu țintește nicio genă. În celelalte 2 seturi de
probe, unde s-a urmărit scăderea ROCK și ZIPK, s-a adăugat siARN țintit pe
aceste două enzime. Citirea probelor s-a făcut după 48h de transfecție și s-a
obsevat ce efecte induce scăderea ROCK1 și ZIPK asupra expresiei genice.

2
 IV. Rezultate şi discuţii

Primul pas realizat în GEO2R este să definim seturile de probe pe care

dorim să le comparăm pentru a fi analizate statistic. În proiectul studiat sunt 3
seturi de grupe: control siARN, ROCK1 siARN și ZIPL siARN. Ulterior, se
verifică distribuția valorilor, acest lucru se realizează sub forma unui box-plot.
Box-plotul confirmă dacă datele sunt normalizate sau nu, adică dacă au o
distribuție normală (Gauss). Dacă box plot-ul este centrat median, asta înseamnă că
datele sunt comparabile.

3
 Figura 1. Distribuția valorilor

În figura 1, există o distribuție normală a valorilor, așa încât se poate continua

analiza.

În urma analizei făcute am obţinut rezultate care sunt prezentate sub forma
unui tabel cu 250 de gene clasificate după valoarea lui P, cunoscându-se că genele
cu cea mai mică valoare P sunt semnificative (Fig. 2).

Figura 2. TOP250

Prima genă din tabel nu este semnificativă statistic pentru evidențierea

efectelor produse de scăderea ROCK1 și ZIPK. Cea de a doua genă este cea care

4
codifică enzima ROCK1. Barele roșii din figua 3 indică măsura expresiei genei
raportată la valorile înregistrate în fiecare set de probe. Se observă că expresia
genei ROCK1 la probele control este diferită față de probele unde s-a indus
scăderea de enzimă ROCK1 prin transfecție cu siARN, unde gena se exprimă
puțin. La probele în care s-a indus scăderea de enzimă ZIPK expresia genei ROCK
este

asemănătoare cu cea din probele control, rezultând că se infirmă ipoteza conform

căreia ROCK1 activează ZIPK.

5
 Figura 3. Valoarea expresiei genei

Scăderea enzimei ROCK1 afectează expresia a 553 de gene, în timp ce scăderea

enzimei ZIPK afectează expresia a 390 de gene. Alte grupuri afectate de această
scădere sunt: anumiți transportori celulari, kinaze, peptidaze, receptorii
tansmembranari și cei cuplați cu proteina G, factori de creștere, fosfataze și canale
ionice. În cazul acestor grupuri mai multe gene sunt “down-regulated” decât “up-
regulated”, în contrast cu suma totală a genelor afectate. De exemplu, în cazul
citokininelor scăderea ROCK1 are ca rezultat “up-regulation” a 5 gene și “down-
regulation” a 4 gene, în contrast cu scăderea ZIPK care are ca rezultat afectarea
expresiei a doar două gene (ambele “down-regulated”).

6
IV. Concluzii

7
 În articolul studiat s-a utilizat siARN și analiza microarray pentru a înțelege
cum funcționează ROCK1 și ZIPK, este prima încercare de a studia modificările
expresiei genice date de scăderea unei kinase. Scopul acestui experiment a fost de
a identifica gene unice reglementate de ROCK1 și ZIPK, de a explora funcții noi
ale celor două kinaze și de a testa ipoteza conform căreia ROCK1 activează ZIPK.
În concluzie, am folosit GEO2R și am observat că ipoteza conform căreia ROCK1
activează ZIPK în celulele musculare netede arteriale nu este adevărată, aspect
prezentat și de autorii articolului.
Se observă în fig. 3 că expresia genei ROCK1 în setul de probe unde s-a realizat
scăderea ZIPK este asemănătoare cu expresia genei ROCK1 din probele control,
acest lucru explică că ZIPK nu este activat în celulele musculare netede arteriale de
ROCK1. Expresia genei ROCK1 în setul de probe unde s-a produs scăderea
ROCK1 este mult scăzută ( down-regulated).
Alte gene care sunt “down-regulated” de scăderea ROCK și ZIPK: IL-1 și IL-6,
MCP1, COX2, vEGF, ICAM, SOCS3. În concluzie numeroase gene prezintă o
expresie alterată în urma scăderii kinazelor ROCK1 și ZIPK în celulele musculare
netede arteriale.