Sunteți pe pagina 1din 120

INGINERIE GENETICA

Conf. Dr. Biolog Vasilica Barbu


Cercetatori vs. profani

BIOTEHNOLOGIA
Antichitate: fabricarea vinului, a berii, a painii, a
produselor lactate, a conservelor, etc.;
In prezent ramura noua a biologiei contemporane;
Sintetizeaza ideile si metodele biologiei celulare si
moleculare, biochimiei, geneticii si ingineriei
genetice;
Are ca ax central tehnologia ADN recombinant
tehnologie de baza a ingineriei genetice.
Ingineria genetica
Ramura a biologiei care, pe baza tehnologiei ADN
recombinant, urmareste creearea de noi programe
genetice utile pentru cercetarea fundamentala, dar mai
ales pentru diferite ramuri ale economiei: industria
alimentara, farmaceutica, agricultura, medicina, etc.
Stiinta scumpa investitii enorme in echipamente de
ultima generatie, dar pe deplin compensate de valoarea
rezultatelor obtinute.
Prima companie bazata pe tehnologia ADN recombinant
GENETECH - s-a infiintat in San Francisco, in 1976.
Permanenta cursa a cunoasterii (din 1944 pana in
prezent.)
Istoric
1928 E. Griffith Diplococcus pneumoniae
S - virulent
- colonii netede (smooth)
- cu capsula polizaharidica: SI, SII, SIII
R - nevirulent
- colonii rugoase (rough)
- nu au capsula.
S se poate transforma prin mutatii spontane doar in serotipul
corespunzator: SI in RI, SII in RII, etc
Experienta in vivo: S (soarecii mor de pneumonie), R (soarecii
sunt perfect sanatosi), apoi RII impreuna cu SIII omorat in
prealabil prin fierbere (soarecii mor de pneumonie si din
plamani se recolteaza pneumococi SIII vii)
Nu a putut explica rezultatul!!!!
Istoric
1935 N.P. Dubinin, prin iradiere cu UV determina
modificarea complementului cromozomal de la Drosophilla
melanogaster de la 2n=8 2n=6 (D. willstoni)
Serie robertsoniana = specii inrudite cu numar diferit de
cromozomi, dar numar egal de brate cromozomale, deci aceeasi
cantitate de ADN.
Ex. D. virilis (2n=12) D. pseudoobscura (2n=10) (1+2)
D. melanogaster (2n=8) (2+3 si 4+5)
D. willstoni (2n=6) (1+2, 4+5 si 6+3)
1944 O.T Avery, Mac Leod si Mac Carty rolul ADN
1956 E. Sears obtine un soi nou de grau Transfer (rezistent
la rugini), prin iradierea cu raze X a polenului hibridului dintre T.
aestivum (2n=42) si Aegilops umbellulata (2n=14).
T. monococcum (2n=14) x A. speltoides (2n=14)

T. dicoccoides (2n=28) x A. squarrosa (2n=14)

T. aestivum (2n=42) x A. umbellulata (2n=14)

Transfer (2n=56)

AMFIPOLIPLOIDIE
Istoric
1965 G. Harris hibridarea celulelor somatice de la specii
indepartate filogenetic (om - soarece, soarece hamster, etc.),
creste daca se adauga in mediul de cultura virusul paragripal de
tip Sendai, inactivat termic.
Hibridarea somatica la plante - fuziunea de protoplasti (celule
vegetale rezultate dupa indepartare peretelui celular
pectocelulozic cu celulaza si pectinaza) duce la obtinerea unui
calus (masa de celule nediferentiate) si apoi a unor plante intregi
amfidiploizi (hibrizi parasexuali interspecifici sau
intergenerici) care nu pot fi obtinuti pe calea clasica a
incrucisarii sexuate.
Hibridarea somatica la animale duce numai la formarea de clone
celulare hibride si nu de animale hibride
Soarecii alofenici
Microchirurgia ovulelor clone de elita
linii total homozigote
Istoric
1969 Beckwith izoleaza operonul lac de la E. coli;










1970 Khorana sinetizeaza pe cale chimica gena ce codifica ARNt ce
transporta alanina la locul sintezei proteice, la S. cerevisiae (77pb);
1970 Temin si Baltimore descopera reverstranscriptaza
1977-1978 Maxam si Gilbert clarifica structura genei eucariote (gena
ovalbuminei cu 8 exoni si 7 introni);
1977 Itakura clarifica structura genei somatostatinei umane;
1979 Goddel - clarifica structura genei insulinei umane;
1982 Kolosov si Gorodeni - clarifica structura genei bradichininei umane;
Tehnologia ADN recombinant, descoperirea restrictazelor si a ligazelor, folosirea
plasmidelor ca vectori au dus la clonarea genelor si la infiintarea bancilor de gene
Istoric
Istoric
1977 Boyer - plasmidul pBR322 cu ajutorul caruia
s-au clonat in genomul de E. coli genele: insulinei umane,
a hormonului STH sau a interferonului (146-166
aminoacizi)
Istoric
1981-1982 Garfinkel si Zambriski
incearca clonare unor gene de
rezistenta la plante (rezistenta la
metrotexat de la plante necultivate la
tutun) utilizand plasmide Ti (de la
Agrobacterium tumefaciens) sau Ri
(de la A. rhizogenes). Aceste plasmide
contin gene ce determina malignizarea
(boala tuberculilor fuziformi la cartof
sau boala radacinilor paroase la
plante), dar prin eliminarea genelor
responsabile de malignizare si
clonarea unor gene utile, pot servi ca
vectori genetici. S-a incercat astfel
clonarea la plante a celor 17 genele nif
(care codifica nitrogenaza) de la
Rhizobium leguminosarium. Enzima
functioneaza insa doar in conditii
anaerobe, iar celula vegetala este o
celula cu metabolism aerob.
Genom totalitatea genelor dintr-un set haploid de cromozomi.
Genomica ramura a geneticii care investigheaza structura si
functia genelor.
In prezent se cunosc integral genomurile de la 259 specii si
partial - genomurile de la 798 gene. Este era genomicii.
1995 - genomul de la Haemophillus influenzae;
1996 genomul de la Saccharomyces cerevisiae;
1997 genomul de la Escherichia coli;
1998 genomul de la Caenorabditis elegans;
2000 genomul de la Arabidopsis thaliana;
- genomul de la Drosophila melanogaster;
2002 genomul de la Mus musculus;
2003 genomul de la Homo sapiens;
2004 genomul de la Rattus norvegicus;
2005 - genomul de Pan troglodytes (cimpanzeu).

Istoric
Istoric
Transcriptomica ramura a geneticii care
investigheaza moleculele de ARNm (structura,
secventiere, marime, etc) din celula, rezultate prin
transcrierea genelor.
Proteomica ramura a geneticii care studiaza
procesul de translatie a moleculelor de ARNm, la
nivelul ribozomilor si sinteza proteinelor
corespunzatoare.
Metabolomica ramura a biologiei celulare care
studiaza procesul de sinteza a altor molecule din celula
(nu proteine sau enzime) cum ar fi aminoacizi,
vitamine, pigmenti, etc.
Toate alcatuiesc sistemul OMIC`s al celulei sau
biologia celulara sistemica.
TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT
Include tehnici de manipulare a fragmentelor de ADN sau a
genomului unui organism. Presupune:
Izolarea sau sinteza pe cale chimica a genelor de la diferite
organisme;
Introducerea lor in repliconi mici (plasmide sau virusuri) cu
rol de vectori;
Transferul acestora in celule-gazda adecvate.
Cea mai obisnuita metoda de a izola gene din surse naturale
consta in REVERSTRASCRIERE - sinteza de ADN
complementar monocatenar dupa matrita de ARN cu ajutorul
reverstranscriptazei, ADN care apoi este convertit in ADN
dublu catenar si clonat in diferite celula gazda.
ARNm reverstranscriere ADNc monocatenar ADN dc
Virusuri
Dezoxiribovirusuri au material genetic ADN: ADNmc (fagul fx174)
sau ADN dc (fagul l, T
4
, F
1
, virusurile: variolei, polioma, herpes,
hepatita B, etc.);
Ribovirusuri au material genetic ARN si se replica ARN ARN
(MS
2
, F
2
, VMT, gripal, polio, virusul turbarii, Lassa, Ebola);




Retrovirusuri au material genetic ARN dar se replica printr-un
intermediar ADN (ARN ADN intermediar ARN). Sunt
virusuri oncogene (tumorale) care induc leucemii, sarcoame, alte tipuri
de neoplazii de la reptile pana la primate. Cele mai studiate sunt v.
leucemiei aviare, v. mieloblastozei aviare, v. sarcomului Rous la gaina
(RSV), v. HIV, etc.
Retrovirusurile
Poseda 3 gene majore:
gag care codifica proteinele structurale ale invelisului
corpusculului central;
pol pentru reverstranscriptaza si nucleazele virale;
env pentru glicoproteinele virale implantate in invelisul
exterior format din fosfolipide din membrana celulara.
Biosinteza reverstranscriptazei la virusul
mieloblastozei aviare consta in formarea unui
precursor proteic de 180kdaltoni codificat de genele
gag-pol care apoi se transforma in enzima propriu-
zisa ce poseda 2 subunitati a de 68 kda si b de 92kda.
Enzima se gaseste sub 3 forme active aa, ab si bb.
Ciclul viral la virusul HIV
REVERSTRANSCRIPTAZA
1960 - H. Temin rastoarna dogma fundamentala a geneticii
conform careia informatia genetica se transmite unidirectional
de la ADN ARN proteine
Experienta: infecteaza embrioni de gaina cu RSV si observa ca
ciclul viral seamana cu cel al unui fag temperat care, in stadiul
de profag (provirus), are materialul genetic inclus in genomul
celulei gazda. Stadiul de profag este greu de explicat deoarece
se cunostea ca RSV este un ribovirus (are material genetic
ARN). Mai mult, actinomicina D (care blocheaza replicarea
ADN) impiedica transformarea maligna a embrionilor de gaina
infectati cu RSV.
Concluzia: ARN-ul virusului RSV este convertit intr-un
transcript ADN care constituie provirusul integrat in
cromozomii celulei gazda.
RSV
REVERSTRANSCRIPTAZA
1970 - David Baltimore si Howard Temin descopera
enzima raspunzatoare de acest proces denumita ADN-
polimeraza dependenta (sau dirijata) de ARN, transcriptaza
inversa sau reverstranscriptaza (RT).
Enzima nu se intalneste doar la retrovirusuri (v. tumorale) ci
si la E. coli, fibroblaste, limfocite umane normale,
neinfectate (poate ca dovada a unei infectii virale latente),
oocite de Xaenopus laevis (legat de fenomenul de
amplificare genica a genelor ADNr in peste 1000
copii/celula).
Activitate enzimatica:
ADN polimeraza dependenta de ARN (reverstranscriere);
ADN polimeraza dependenta de ADN (replicare);
RN-aza H (exonucleaza care degradeaza catena ARN a hibrizilor
ADN-ARN naturali sau sintetici, fie de la capatul 3 fie de la cel 5;
Repararea moleculelor ARN sau ADN (asemanator ADN
polimerazei I);
Unwindaza (proteina destabilizatoare a dublului helix - HDP care
nu permite reasocierea monocatenelor complementare, deci
stabilizeaza monocatenele);
Endonucleaza (desface legaturi fosfodiesterice din interiorul
cetenelor polidezoxiribonucleotidice);
Are un mecanism progresiv, ramane atasata de matrita si de primer
si catena ADN fiica creste prin adaugarea de nucleotide.
REVERSTRANSCRIPTAZA
Conditiile reactiei enzimatice de reverstranscriere:
Temperatura: 40-50C la retrovirusurile aviare sau 37-
40C in cazul retrovirusurilor de la mamifere;
pH: 7,8-8,5 (optim 8,2);
Substratul: este obligatorie prezenta tuturor celor 4 tipuri de
d(NTP) libere, la concentratii inalte (1000mM din fiecare);
lipsa uneia blocheaza reactia);
Matrita: ARNm care la eucariote are capatul 3 poliadenilat
poli(A);
Primerul: oligo (dT)
12-18
;
Alte cerinte: Mg
2+
si Mn
2+
.
REVERSTRANSCRIPTAZA
Etapele replicarii
Etapele reverstranscrierii in vitro
1. Izolarea ARN total din celula presupune inactivarea
ribonucleazelor celulare, denaturarea proteica si inlaturarea
ADN-ului prin:
Liza celulara rapida;
Denaturare proteica cu guanidintiocianat 4M si SDS 2% + proteinaza K;
Separare de ADN prin centrifugare in gradient de CsCl 5,7M;
Pentru inlaturarea totala a ADN se incubeaza la 4C cu DN-aza I
pancreatica.
2. Izolarea din ARN celular total a ARNm care are captul 3
poliadenilat (20-250 nucleotide cu Adenina) se face prin
cromatografie de afinitate pe coloana de oligo(dT)-celuloza sau
poli(U)-sepharoza, la 60C si concentratii saline mici;
3. Identificarea ARNm specific (dorit) ridica probleme deoarece
in celula sunt mii de molecule de ARNm de diferite marimi si
secvente de nucleotide. Se recomanda alegerea unor celule
inalt specializate ce contin mari cantitati de ARNm de un
anumit tip (de exemplu ARNm pentru globina se extrage din
reticulocitele de iepure). Se realizeaza prin precipitare cu
anticorpi corespunzatori, urmata de electroforeza in gel de
SDS-poliacrilamida.
Etapele reverstranscrierii in vitro
4. Clonarea ADN complementar dublucatenar
Obtinerea hibridului ARNm-ADNc in prezenta reverstranscriptazei, a
primerului oligo(dT)
12-18
si a tuturor celor patru tipuri de d(NTP);
Hidroliza alcalina a ARNm si a primerului oligo(dT)
12-18
de la capatul 5
terminal si se obtine un ADNcomplementar ( ADNc) monocatenar: simplu
sau cu structura in ac de par la capatul 3 terminal.
Obtinerea ADN complementar dublucatenar se poate face pe doua cai:
Calea autoprimerului (cand capatul 3 in ac de par: serveste ca primer si
este elongat cu d(NTP) tot de catre reverstranscriptaza) sau
Prin atasarea unei cozi scurte homopolimerice poli (dC) la capatul 3 al
ADNc mc cu ajutorul terminal transferazei (citidin-transferazei). La acest
capat se va atasa un primer oligo(dG) la care reverstranscriptaza va
adauga apoi dNTP
Inlaturarea cozilor homopolimerice sau deschiderea structurii in ac de par
cu ajutorul nucleazei S
1
izolata de la Aspergillus oryzae.
Adaugarea de cozi homopolimerice poli(dC) la capatele 3 in prezenta citidin-
transferazei si a dCTP-urilor
Etapele reverstranscrierii in vitro
Clonarea genei izolate prin reverstranscriere
Linearizarea vectorului
(plasmidul pBR322 sau pUC
18/19 sau pSC101, etc) cu
ajutorul endonucleazelor de
restrictie care taie in situsuri
specifice si formeaza capete
netede sau lipicioase.
Exemplu: Vectorul pBR 322
este linearizat cu endonucleaza
de restrictie PstI, apoi se adauga
cozi homopolimerice poli(dG)
complementare cu cozile
poli(dC) ale fragmentului de
ADN izolat prin
reverstranscriere. Cu ajutorul
ADN ligazei se uneste
plasmidul linearizat cu gena de
interes si se obtine un ADN
recombinat ce poate fi clonat
intr-o celula de E coli.
Folosirea vectorului
pUC19 pentru
clonarea genica
Dupa un astfel de protocol s-au clonat genele:
Insulinei umane;
Hormonului de crestere;
b-globinei de iepure;
Interferonului;
Ovalbuminei;
Hemaglutininei virusului gripal;
Virusului hepatitei B;
Factorilor stimulatori pentru multiplicarea macrofagelor si
granulocitelor (tratarea pacientilor cu sistem imunitar
deficitar dupa tratament antitumoral chimic sau prin
iradiere);
Factorului necrozant al celulelor tumorale (perspective in
rezolvarea problemei cancerului), etc.
ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC LA PROCARIOTE
Prin genom ( gr. genos = urma], mo]tenitor) se n\elege totalitatea genelor dintr-un set
complet haploid de cromozomi mo]tenit, ca o unitate, de la un p`rinte. Genomurile
indivizilor unei specii constituie genofondul acelei specii.
Genomica studiaz` genomurile organismelor:
secven\ializarea materialului genetic,
[ntocmirea h`r\ilor genetice,
fenomenele de interac\iune intragenic` ]i intergenic`,
rela\iile func\ionale dintre gene (expresia genelor [n diferite condi\ii).
Studiul [ntregului set de proteine dintr-un tip de celul` sau \esut, schimb`rile petrecute
[n diferite condi\ii, fac obiectul proteomicii.
Genomica a ap`rut in anii 1980, odat` cu ini\ierea proiectelor privind genomurile
unor specii.
{n 1972, Walter Fiers ]i echipa sa de la Laboratorul de Biologie Molecular` din
Ghent (Belgia), secven\ializeaz` pentru prima dat`, gena ce codific` o protein` a
[nveli]ului bacteriofagului MS
2
, iar [n 1976 este secven\ializat [ntregul genom ARN
al fagului.
Primul genom ADN secven\ializat [n [ntregime este cel al bacteriofagului F-X174
(5368pb), de c`tre Frederick Sanger, [n 1977.
{n 1995 este secven\ializat genomul primei bacterii (Haemophilus influenzae) care
de\ine 1,8Mb.
In 2003 este complet secven\ializat genomul uman.
ORGANIZAREA MATERIALULUI
GENETIC LA PROCARIOTE
P@n` [n septembrie 2007 se cunoa]tea secven\a genomic` complet` la:
1879 de virusuri,
577 bacterii,
23 specii eucariote (din care aproape jum`tate sunt fungi).
Dintre eucariotele al c`ror genom este complet secven\ializat enumer`m pe cele mai
importante:
drojdia de bere - Saccharomyces cerevisiae (modelul celulei eucariote),
musculi\a de o\et - Drosophila melanogaster,
viermele pluricelular - Caenorhabditis elegans,
pe]tii: Brachydanio rerio ]i Tetraodon nigroviridis,
dintre angiosperme Arabidopsis thaliana,
dintre mamifere: c@inele - Canis familiaris, ]obolanul - Rattus norvegicus, ]oarecele Mus
musculus, cimpanzeul Pan troglodytes .
ORGANIZAREA MATERIALULUI
GENETIC LA PROCARIOTE
ORGANIZAREA MATERIALULUI
GENETIC LA PROCARIOTE
Celula bacterian`, spre deosebire de celulele organismelelor
eucariote, nu are un nucleu adev`rat, ci un "nucleu" cu organizare
primitiv`, fiind lipsit de membran`, iar materialul genetic este liber
[n citoplasm`, [n partea central` a celulei. Aceast` form` de
existen\` a materialului genetic nu parcurge procesele specifice
diviziunii indirecte, de aceea se nume]te nucleoid sau pur ]i simplu
cromozom bacterian.
Astfel, [n cazul celulelor procariote, condi\ia normal` este haploidia
]i informa\ia genetic` este de\inut` de un singur cromozom, iar
genele din componen\a acestuia se transmit [nl`n\uit constituind
unicul grup de linkage.
Multiplicarea se realizeaz` prin diviziune direct` sau amitoz` (f`r`
diferen\ierea fusului de diviziune).
ORGANIZAREA MATERIALULUI
GENETIC LA PROCARIOTE
Genomul bacterian este alc`tuit din
dou` categorii de gene: gene esen\iale
eucromozomale, localizate [n
cromozomul bacterian ]i gene
accesorii prezente [n plasmide, in
elemente genetice transpozabile ]i [n
unii fagi (Campbell, 1981). {n celula
procariot` putem vorbi deci, despre un
genom cromozomal ]i unul
plasmidial.
ORGANIZAREA MATERIALULUI
GENETIC LA PROCARIOTE

CROMOZOMUL BACTERIAN


are forma circular`
este alc`tuit dintr-o singur` molecul` de ADN dublucatenar, circular, covalent [nchis,
suprar`sucit negativ ]i [mpachetat,
ata]at de membrana plasmatic` [n una sau mai multe puncte (p@n` la 20), numite mezozomi.
Cel mai important mezozom este cel din vecin`tatea originii de replicare (ori C) ]i are un
procent mare de perechi A=T.
Cromozomul bacterian poart` [n structura sa, toat` informa\ia ereditar` necesar` pentru
existen\a unei celule, adic` poart` toate genele necesare pentru desf`]urarea metabolismului ]i
pentru reglarea activit`\ii celulare. Acesta determin` ]i arhitectura celulei care-l con\ine,
ereditatea ]i capacitatea ei de evolu\ie.
CROMOZOMUL BACTERIAN
Lungimea macromoleculei de ADN poate varia de la 600-800 kpb (la Mycoplasma,
Ureaplasma bacterii f`r` perete celular), p@n` la 12000-13000 kpb la genurile
Myxococcus ]i Calothrix. La Escherichia coli este un cromozom de m`rime medie, de
aproximativ 4700 kpb
Replicarea acestei macromolecule de ADN [ncepe dintr-un punct numit origine de
replicare (ori C) ]i se termin` [ntr-un punct notat ter, iar mecanismul replic`rii a fost
elucidat de Cairns [n 1963 ]i decurge dup` modelul Theta, modelul inelului rotativ
(engl. rolling circle) sau modelul buclei D.
Treimea cromozomului care are [n centru regiunea ori C de\ine clusteri genetici cu o
pozi\ie fix` ]i precis`, [nalt conservat` [n evolu\ie (similari la taxoni bacterieni foarte
[ndep`rta\i filogenetic). Aceasta [nseamn` c` ini\ierea ]i terminarea replic`rii sunt
procese extrem de vechi, controlate prin mecanisme asem`n`toare, la majoritatea
bacteriilor.
Replicarea la procariote
Microrganism Tipul %AT
M`rime
(Mbp)
Num`r de
gene
%
transcris
Data
public`rii
Escherichia coli tulpina K-12 MG1665 Gram - 49 4.64 4288 88% Oct,1997
Escherichia coli tulpina K-12 W3110 Gram - 49 4.64 4085 79% -
Haemophilus influenzae Gram - 62 1.83 1703 87% Aug, 1995
Helicobacter pylori Gram - 61 1.67 1590 90% Iun, 1997
Treponema pallidum Gram - 47 1.14 1041 93% Iul,1998
Borrelia burgdorferi Gram - 71 0.91 853 94% Iul,1997
Campylobacter jejuni Gram - 69 1.64 1731 94% Oct, 1998
Chlamydia trachomatis Gram - 59 1.04 938 91% Nov, 1998
Rickettsia prowazekii Gram - 71 1.11 834 76% Nov,1998
Rhizobium sp. NGR234 plasmid pNGR234a Gram - 42 0.54 483 71% 1998
Bacillus subtilis Gram + 56 4.20 4222 88% Nov,1997
Mycoplasma genitalium Gram + 68 0.58 470 89% Oct, 1995
Mycoplasma pneumoniae Gram + 60 0.82 677 87% Nov, 1996
Mycobacterium tuberculosis Gram + 34 4.41 3924 91% Iun,1998
Aquifex aeolicus Eubacteria 57 1.55 1512 94% Mar,1998
Synechocystis sp. Alg` albastr`-verde 52 3.57 3168 87% Sep, 1996
Archaeoglobus fulgidus Archaebacteria 51 2.18 2436 91% Iun,1997
Methanococcus jannashchii Archaebacteria 69 1.66 1738 88% Aug, 1996
Methanobacterium
thermoautotrophicum
Archaebacteria 50 1.75 1918 91% Mai,1997
Pyrococcus horikoshii Archaebacteria 58 1.74 2022 88% Ian,1998
Saccharomyces cerevisiae Eucariot 62 12.07 5885 72% Ian, 1996
CROMOZOMUL BACTERIAN
De]i condi\ia normal` a celulei procariote este haploidia, unele gene se pot afla
simultan ]i pe cromozomul bacterian ]i pe plasmide, de aceea, starea real` a celulei
procariote este meroploidia par\ial`. {n func\ie de pozi\ia genei [n cromozom (pornind
de la ori C c`tre regiunea ter), unele gene sunt deja replicate, [n timp ce altele, [nc`
nu. Deci unele gene sunt [n mai multe copii per genom, dec@t altele.
Mai mult dec@t at@t, exist` specii bacteriene care prezint` copii multiple ale [ntregului
cromozom, [n aceea]i celul`:
Desulfovibrio vulgaris 4 copii,
D. gigas 17 copii,
Azotobacter chroococcum 20-25 copii,
A. vinelandii 40-80 copii.
{n aceste cazuri, exist` mecanisme de reglaj genetic prin inactivare cromozomal`, astfel [nc@t,
r`m@n func\ionale genele de pe un singur cromozom.
CROMOZOMUL BACTERIAN
Compozi\ia global` [n nucleotide poate varia [n limite destul de largi, [n func\ie de gen ]i
chiar de specie. Astfel:
la Mycoplasma %GC este de 25%,
la Micrococcus luteus %GC este de 75%,
la Escherichia coli con\inutul de GC de 49-51,5% iar acest procent este controlat de dou` gene: mut T, care
controleaz` transversiile AT [n CG ]i mut Y , care controleaz` transversiile CG [n AT. Procentul este corelat
]i cu frecven\a anumitor codoni sens sinonimi care sunt prefera\i (anume aceeia care au [n pozi\ia 3
adenina sau timina).
Densitatea informa\iei genetice este un parametru variabil [n genomul bacterian ]i se exprima
prin mai multe mecanisme:
1. printr-un grad diferit de suprapunere a genelor (par\ial sau total), c@nd transcrierea [ncepe din
puncte diferite ale aceleia]i catene, dar se termin` [n acela]i punct, rezult@nd astfel catene
polipeptidice diferite. Exemple:
locusul McrB (implicat in restrictia in pozitia 5-metil-citozina) con\ine 48%GC si 3 ORF-uri care, prin
transcriere, formeaza 3 polipeptide de greutati moleculare diferite (51,53,54 Kda), cu capete NH
2
diferite ,
dar cu acelasi capat COOH terminal,
locusul CysE (care codific` serin-acetil-transferaza) contine 58%GC si de\ine gena cys X suprapus` total (prin
transcrierea ambelor catene) cu gena cys E;
Densitatea informa\iei genetice:

prin frameshift transla\ional, c@nd pe aceea]i gen` rezult`, prin transcriere, un
singur transcript ARNm, dar prin transla\ia acestuia [n moduri diferite, rezult`
dou` catene polipeptidice distincte. De exemplu: subunit`\ile g ]i t ale ADN
polimerazei III, codificate de gena dnaX;
prin existen\a copiilor de siguran\` pentru unele gene care func\ioneaz` [n scopuri
metabolice diferite sau [n condi\ii diferite de mediu ]i care sunt reglate diferit
(sisteme backup sau redundan\` genic`). De exemplu: genele aro F, G, H codific`
toate aceea]i enzim`: 3-Deoxi-D-Arabino-Heptulosanat-7-Fosfat-sintetaza
(DAHPaza), dar aceasta prezint` sensibilitate la diferi\i aminoacizi (tirozin`,
fenilalanin`, respectiv triptofan).
CROMOZOMUL BACTERIAN
CROMOZOMUL BACTERIAN
Genele sunt distribuite de obicei, randomizat [n cromozomul bacterian. Uneori [ns`,
genele [nrudite fiziologic au o distribu\ie ce pare mai pu\in [nt@mpl`toare, fapt ce
argumenteaz` teoria conform c`reia, la arhitectura cromozomului bacterian au
participat, de-a lungul evolu\iei filogenetice, mai mul\i taxoni, de la care s-au p`strat
anumite fragmente cromozomale. Astfel:
genele implicate [n catabolismul glucozei la E. coli sunt dispuse [n patru zone echidistante ale
nucleoidului.
genele housekeeping (menajere), implicate [n metabolismul central al oric`rei celule, sunt aranjate
la Pseudomonas sp. [ntr-o jum`tate a nucleoidului, [n timp ce, cealalt` jum`tate este aproape
goal`.
la Streptomycetae, genele sunt grupate [n dou` regiuni diametral opuse pe cromozom, [ntre ele
fiind dou` zone aproape goale (lipsite de gene).
CROMOZOMUL BACTERIAN
La unele bacterii, [n cromozom, exist` situsuri specifice pentru inser\ia
genomului bacteriofagilor ([n stadiul lizogen, de profag, [n care genomul
fagic se replic` simultan cu nucleoidul bacterian). Astfel, fagul l (]i [n
general fagii lambdoizi) se inser` situs-specific [n genomul de E. coli,
tulpina K-12, [n situsuri intergenice.
Inser\ia se realizeaz` pe baza omologiei dintre situsul bacterian attB (engl.
attachment on bacteria) sau BOB care are min. 21pb ]i cel fagic attP (engl.
attachment on phage) sau POP care are 234pb.
Secven\a O din cele dou` situsuri (miezul de 15pb:
GCTTTTTTATACTAA) este identic`, iar procesul de integrare este facilitat
de enzime codificate de gene fagice:
integraza (int),
excizionaza (xis),
dar ]i de proteina histone-like, IHF, codificat` de o gen` din cromozomul
bacterian.
La E. coli K-12 s-au identificat 15 astfel de situsuri pentru fagi lambdoizi,
situate [ntre pozi\iile 6 ]i 44 (exprimate [n minute de conjugare).
Situs fagic
Situs bacterian
Enzime specifice
Fagul integrat [n cromozomul
bacterian
CROMOZOMUL BACTERIAN
La Escherichia coli, ca la majoritatea celorlalte bacterii, cromozomul este
format dintr-o unic` molecul` de ADN dublu catenar, circular covalent
[nchis ]i superhelicat.
Perimetrul acestei molecule de ADN este de 1400 m, iar diametrul de 2,5
nm.
Masa moleculara este de circa 2,5 10
9
daltoni ]i con\ine aproximativ
4000 de gene, dispuse liniar pe cromozomul circular, alc`tuind un singur
grup de linkage.
{n structura secundar` a nucleoidului bacterian predomin` forma B (de
dreapta dextrogir sau dextru), cu un diametru de 20 , cu un pas al
helixului (un tur complet, de 360) de 10 pb ]i de 34 . Pe distan\e
scurte, [nt@lnim ]i forma senestr` ADN-Z (r`sucit [n sens invers
acelor de ceasornic).
{n condi\iile [n care o bacterie are form` cilindric` cu un diametru de 1m
]i o lungime de maxim 3m, este normal ca acest cromozom s` fie
suprar`sucit pentru a putea [nc`pea [n celul`. A. Worcel si W. Burgi [n
1972 ]i Pettijohn, [n 1974, au reu]it s` clarifice structura cromozomului
de la Escherichia coli .
CROMOZOMUL BACTERIAN
S-a demonstrat c` el const` [n 40-50 de bucle sau domenii topologice
semiindependente, care []i p`streaz` structura cu ajutorul ARN nascent.
Fiecare bucl` are aproximativ 100 kpb, este bogat` [n ARN ]i poate
func\iona (sufer` suprar`suciri ]i relax`ri) relativ independent de
celelalte.
Cele 40-50 de bucle mari au suprar`suciri secundare (engl. supercoil),
fiecare cu o lungime de aproximativ 400pb.
Men\inerea acestor bucle de dimensiuni diferite se pare c` se face, nu
numai cu ajutorul ARN, ci ]i cu ajutorul unor proteine ]i enzime de
tipul endonucleazelor. {n acest fel, structura cromozomal` este stabil`,
iar cromozomul bacterian []i p`streaz` continuitatea. Una din enzimele
care joac` un rol esen\ial [n replicarea ADN bacterian ]i este
responsabil` de suprar`sucirea sa, este ADN-giraza.
Dac` [ntr-o cultur` de E. coli se adaug` [n mediu coumeromicina, (un
antibiotic cu rol inhibitor al func\iei ADN-girazei), cromozomul celulei
respective []i va pierde constitu\ia suprahelical`.
CROMOZOMUL BACTERIAN
Al`turi de ADN-giraz` exist` ]i o a doua enzim` implicat` [n r`sucirea cromozomului -
topoizomeraza I. Aceasta enzim` produce relaxarea regiunilor suprahelicale. Au fost izolate
]i mutante lipsite de topoizomeraz` sau care produc o form` inactiv` a acesteia. Nucleoidul
izolat de la astfel de mutante prezint` un grad [nalt de suprar`sucire, cu circa 32 % mai
mult dec@t normal. Paradoxal [ns`, aceste multante nu sufer` defecte de cre]tere ]i, [n
plus, sufer` frecvent muta\ii ale genei pentru ADN-giraz`, care conduc la producerea unei
giraze mai pu\in eficiente. {n consecin\`, cromozomul prezint` un grad normal de
superspiralizare.
MECANISMUL DE ACTIUNE
ADN-giraza se ata]eaz` la situsuri specifice, situate la baza buclelor (secven\ele
necodificatoare REP (din engl. Repeated Extragenic Palindromes), care sunt palindroame
de 38pb, grupate c@te 2-4 [n clusteri (elemente REPE). Exist` c@te o molecul` de ADN-
giraz` la aproximativ 100kpb, deci la un domeniu topologic (sau bucl`).
CROMOZOMUL BACTERIAN
Ata]area ADN-girazei la REPE este facilitat` de o protein` histone-like, proteina HU (din engl. Helix
Unwinding):
are o compozi\ie chimic` bogat` [n lizin` ]i asem`n`toare histonei H2A de la eucariote;
este un dimer, cu o greutate molecular` de 9,7 kdaltoni;
format din dou` catene polipeptidice HU-a ]i HU-b codificate de dou` gene hup A ]i hup B;
se asociaz` cu segmente de ADN de 200pb, rezult@nd forma\iuni nucleosome-like.
S-au identificat aproximativ 25.000 proteine HU per genom de E. coli, cu o frecven\` mai mare la
periferia nucleoidului.
Cromozomul bacterian nu prezint` proteine histonice tipice (cunoscute la eucariote), ci proteine histone-like.
Se cunosc 9 astfel de proteine bazice, cu greutate molecular` cuprins` [ntre 9-28 kdaltoni ]i care se ata]eaz` de
ADN [ntr-o manier` situs nespecific`, de regul`. {nafar` de proteina HU, se mai cunosc proteinele H, H1, H-
NS, IHF. Proteina IHF (engl. Integration Host Factor) se ata]eaz` situs specific ]i are rol [n integrarea fagului
l [n genomul de E. coli. Are o greutate molecular` de 20kd ]i este format` din dou` subunit`\i: a ]i b
codificate de dou` gene: him A ]i him B.
CROMOZOMUL BACTERIAN
Ca ]i la eucariote, ]i [n cromozomul bacterian exist` secven\e de ADN repetitiv: unele
necodificatoare, altele codificatoare.
ADN repetitiv necodant este dispus [n afara ORF-urilor (cadre deschise citirii, din engl. Open
Readin Frames). Este reprezentat de:
secven\ele REP, ce intr` [n alc`tuirea elementelor REPE (100-200/genom la E.coli ]i Salmonella typhimurium),
situsurile chi au 8pb: (5GCTGGTGG3) ]i sunt recunoscute specific de endonucleazele de restric\ie: Rec A, Rec
BCD, favoriz@nd recombinarea genetic` la procariote. La E. coli exist` 950 situsuri chi/genom (1 situs/5kpb),
mai frecvente [n regiunea oriC (un cluster de 22 situsuri chi).
situsurile dam au 4pb: (5GATC3) ]i sunt recunoscute de metilaze bacteriene ce metileaz` adenina [n pozi\ia
N
6
. La E. coli exist` aproximativ 18000 astfel de situsuri (1 situs /250pb), mai frecvente [n oriC.
ADN-ul repetitiv codant este reprezentat de operonii rrn (7 - la E.coli sau 10 - la S. typhimurium
]i care codific` ARNr), genele pentru ARNt (41 la E.coli) ]i secven\ele rhs (engl. rearrangemnet
hot-spots, implicate [n generarea duplica\iilor genice prin crossing-over inegal [ntre secven\e
repetate).
ORGANIZAREA MATERIALULUI
GENETIC LA PROCARIOTE
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Plasmidele
reprezint` material genetic accesoriu [n celula bacterian`,
Lederberg le define]te, [n 1952, ca unit`\i genetice extracromozomale, fizic independente de
nucleoid.
{n 1958, F. Jacob ]i E.L.Wollman le denume]te epizomi unit`\i genetice capabile de a exista
alternativ at@t [n stare autonom`, c@t ]i integrate [n cromozomul bacterian.
Denumirea cea mai potrivit` este aceea de plasmide cu func\ii epizomale (starea liber`, [n
citoplasm`, reprezint` plasmidul, iar starea integrat` [n nucleoid, reprezint` epizomul).
Unii cercet`tori le consider` organisme acelulare sau specii moleculare, al`turi de virusuri,
transpozoni, secven\e de inser\ie.
Prezen\a lor pare s` fie un fenomen universal [n lumea bacterian` (bacterii Gram pozitive sau
Gram negative), dar sunt [nt@lnite ]i la unele eucariote inferioare (drojdii sau fungi) precum ]i [n
mitocondrii sau cloroplaste. Peste 300 din num`rul total de plasmide cunoscute p@n` [n prezent au
fost descrise la E. coli.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Plasmidele
Sunt structuri moleculare invizibile prin tehnici uzuale in situ, dar vizibile la microscopul
electronic, dup` extrac\ie ]i purificare. Plasmidele sunt molecule de ADN dublu catenar,
circular covalent [nchis (ADNdcCCC) sau liniar (mai rar, la Borrelia burgdorferi,
holobacterii), care posed` informa\ie genetic` proprie ]i, de regul`, diferit` de cea a
nucleoidului (posed` un %GC diferit de cel al cromozomului bacterian).
Au calitate de repliconi, deci se replic` autonom de cromozomul bacterian ]i posed` chiar
unele gene ce codific` enzime necesare propriei replic`ri.
Cromozomul bacterian exercit` [ns` un control asupra replic`rii plasmidiale care poate fi
absolut (c@nd plasmidul este integrat ca epizom [n nucleoid), stringent (pentru plasmide
mari, aflate [n num`r mic [n celul`) sau relaxat (pentru plasmidele mici ]i numeroase).
Plasmidele se replic` prin trei mecanisme: Theta, Rolling Circle (RC-modelul cercului rotativ),
Strand-Displacement (SD-modelul buclei D).
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Plasmidele
Se transmit pe vertical` (de la o genera\ie la alta)
prin diviziune direct` - prin parti\ia echilibrat` a
num`rului de plasmide din celula mam` [n celulele
fiice, dar ]i pe orizontal` (de la un individ la altul,
[ntr-o popula\ie) prin conjugare.
Sunt exemplul tipic de clonare natural`, in vivo,
fiind capabile s` transfere, pe l@ng` informa\ia
genetic` proprie ]i unele gene cromozomale
deoarece, c@nd se desprind din cromozomul
bacterian, pot prelua una sau c@teva gene de pe
acesta, din vecin`tatea situsului de integrare ]i s` le
transfere unei alte bacterii prin procesul de
conjugare bacterian`.
Receptor
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Plasmidele
Pot fi naturale (ColE1) sau artificiale (create prin tehnici de
inginerie genetic`) ]i sunt folosite ca vectori [n experimentele
de clonare genic`. Nota\ia lor presupune, de regul`, la
[nceput, itemul p (exemple: pBR322, pUC18/19, pGEM ,
pBluescript).
Plasmida artificial` pBR322 posed` gene marker (gene pentru
rezisten\` la antibiotice: Ap
R
sau Tc
R
) precum ]i numeroase
situsuri pentru endonucleaze de restric\ie (PstI, EcoRI,
HindIII, BamHI, SalI, etc.), cu o topografie cunoscut`, utile [n
tehnicile de inginerie genetic` [n care se folosesc.
Exist` ]i plasmide criptice care par s` nu confere gazdei un
caracter adaptativ ]i se [ncadreaz` [n categoria selfish DNA.
{ns`, cele mai multe plasmide, confer` gazdei caractere
adaptative avantajoase (rezisten\` la antibiotice, la metale
grele, etc.) datorit` unor gene marker pe care le posed`.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Plasmidele con\in gene:
pentru propria replicare (originea replic`rii plasmidiale se noteaz` oriV pentru a se deosebi de
ori C de pe cromozom), stabilitate ]i parti\ie;
pentru transferul pe orizontal` prin conjugare: operonul tra, din cadrul unui element genetic
superior, CONJUGON (pentru plasmidele autotransferabile, conjugative) ]i genele mob
(pentru plasmidele mobilizabile care pot realiza transferul conjugativ doar [n prezen\a altei
plasmide conjugative);
pentru metabolismul central al celulei gazd`, gene care controleaz` c`i metabolice esen\iale,
catabolice sau anabolice:
gene ce codific` enzime proteolitice, amilolitice, glicolitice, gene fixatoare de azot (genele nif de la
Rhisobium leguminosarium),
gene implicate [n metabolismul opinelor: octolina ]i nopalina, din plasmidul Ti de la Agrobacterium
tumefaciens (care produce cancerul de colet la plante) etc.
Genele nif de la Rhisobium leguminosarium
Plasmidul Ti de la Agrobacterium tumefaciens
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Plasmidele con\in gene:
pentru fenotip adaptativ:
gene ce codific` antibiotice: de exemplu la Actinomicete din genul Streptomyces sp. care
produc streptomicin` (S. griseus), kanamicin` (S. kanamiceticus), neomicin` (S. fradiae),
cloramfenicol (S. venezuelae), tetraciclin` (S. aureofaciens), eritromicin` (S. erithreus),
rifampicin` (S. mediterranei), nistatin (S. noursei) sau la bacterii formatoare de endospori:
Micromonospora purpurea gentamicin`, Bacillus polymyxa polimixin`, Bacillus
colistinus colistin, B. licheniformis bacitracin`, Nocardia uniformis nocardicin`.
gene ce codific` bacteriocine - substan\e cu efect antimicrobian, inhibitor, de regul` asupra
unor microorganisme [nrudite, dar ]i asupra unui spectru mai larg de bacterii, unele chiar
patogene ]i chiar asupra unor drojdii, fungi. Aceste gene pot fi localizate fie [n
cromozomul bacterian, fie [n plasmide, mai ales la bacterii Gram pozitive din genurile
Lactobacillus, Streptococcus. Cele mai studiate ]i utilizate bacteriocine sunt: nisina,
diplococina, helveticina, plantaricina, brevicina, bulgaricina, lactocidina, reuterina,
acidofilina, acidolina.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Plasmidele con\in gene:
pentru fenotip adaptativ:
gene de rezisten\` la antibiotice, pentru care, plasmidele au fost denumite la [nceput, factori
R (au fost descoperite [n 1956, de c`tre Watanabe, pe tulpini de Shigella dysenteriae).
La bacteriile gram-negative, factorii R pot de\ine determinan\i de rezisten\` pentru practic toate
antibioticele ]i chimioterapicele cunoscute: macrolide (Mr), tetracicline (Tc), streptomicin` (Sr), sulfamide
(Su1), peniciline (P), ampicilina (Ap), cloramfenicol (Cf), grupul kana-neo-paromomicin`-aminosidin`
(A/Nr), grupul nitrofurantoin-furazolidon (N/Fr), cefalosporine (Cephr), acid nalidixic (ANr), gentamicin`
(Gr), polimixine (Por) etc.
Num`rul determinan\ilor de rezisten\` prezen\i concomitent pe un acela]i plasmid poate varia de la unul
(monorezistent) la 6-8 (multirezisten\`);
Av@nd n vedere rezisten\a ncruci]at`, un unic factor R poate induce rezisten\` fa\` de 10-15 antibiotice.
La stafilococ, un plasmid are n general un unic marker de R, dar o bacterie poate purta mai multe
plasmide cu markeri diferi\i de rezisten\`;
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Plasmidele con\in gene:
pentru fenotip adaptativ:
gene de rezisten\` la bacteriocine;
gene de rezisten\` la metale grele (Hg,
Co, Ni, Pb, Cd, Zn, Ag, Bi, Sb), iar
bacteriile purt`toare ale unor astfel de
plasmide sunt utilizate pentru
concentrarea acestor metale din diferite
medii;
gene pentru patogenitate, toxicitate ]i
virulen\`;
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
CLASIFICAREA PLASMIDELOR
Dup` criteriul autotransferabilit`\ii exist` trei categorii de plasmide:
Conjugative sau autotransferabile care sunt numite ]i plasmide transferabile,
infec\ioase, conjugoni sau transferoni. Ele posed` conjugonul cu operonul tra ]i
se pot transfera pe orizontal`, de la o bacterie la alta, [n cadrul unei popula\ii,
prin conjugare.
Mobilizabile care nu posed` operonul tra, dar posed` gene mob ]i pot realiza
transferul conjugativ doar [n prezen\a altei plasmide conjugative care s` ini\ieze
procesul.
Neconjugative sunt plasmide f`r` operonul tra ]i f`r` gene mob, deci nu pot
realiza conjugarea bacterian`.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
CLASIFICAREA PLASMIDELOR
Dup` criteriul integr`rii [n cromozomul bacterian exist` dou` grupe de plasmide:
Epizomi sau plasmide integrative ce pot exista alternativ at@t [n stare autonom`
c@t ]i [n form` integrat` reversibil [n nucleoid.
Neintegrative, plasmide care exist` doar [n stare autonom` ]i nu se pot integra
[n nucleoid.
Dup` criteriul incompatibilit`\ii prin care plasmide din aceea]i grup` nu pot coexista
(nu se pot men\ine ]i propaga stabil) [n aceea]i linie celular` bacterian`, deoarece, fiind
acela]i replicon-type, au origini de replicare similare ]i intr` [n competi\ie molecular`
pentru acelea]i enzime implicate [n proces. La Enterobacteriaceae se cunosc 30 astfel de
grupe de incompatibilitate plasmidial`.
Incompatibilty group Plasmids
FI F, R386
FII R1
FIII Col B-K99, Col B-K166
FIV R124
I
R62, R64, R483 (at
least 5 subgroups)
J R391
N R46
O R724
P RP4, RK2
Q RSF1010
T R401
W R388, S-a
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
CLASIFICAREA PLASMIDELOR
Dup` criteriul num`rului de copii plasmidiale per celul`, sunt plasmide:
High-copy care au [ntre 10 ]i c@teva sute de copii per celul` bacterian`;
Low-copy posed` 1-10 copii per celul` bacterian`.
Dup` criteriul structurii moleculare, exist` dou` clase de plasmide:
Circulare care sunt alc`tuite din ADNdc care, cel mai adesea, este CCC (engl. circular covalently closed) ]i
doar temporar, se poate [nt@lni ]i forma CO (engl. circular open) ce prezint` o leg`tur` fosfodiesteric`
desf`cut`, pe o caten`. In vivo se mai [nt@lnesc ]i intermediari concatemeri (oligo/multimeri).
Liniare care sunt formate din ADNdc liniar (L) ]i care pot fi:
Cu telomere [n ac de p`r (engl. hairpin), adic` cele dou` catene se continu` una pe cealalt` printr-o
leg`tur` covalent` ]i au palindroame terminale, bogate [n perechi A=T. Se [nt@lnesc la spirochete din
genul Borrelia, dar ]i [n mitocondrii la unele drojdii ]i la fungi.
Cu telomere invertoni, la care, cele dou` catene nu se continu` una pe cealalt`, ci prezint` fiecare, la
cap`tul 5 o protein` TP (engl. telomeric protein) ata]at` covalent. {n 1990, K. Sakaguchi, define]te ca
invertoni o categorie de elemente genetice mobile, cu replicare autonom`, similare cu transpozonii, care
posed` la capete proteine TP. Astfel de plasmide se g`sesc [n mitocondrii, la fungi ]i la plante.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
CLASIFICAREA PLASMIDELOR
Dup` propriet`\ile majore (func\ionale) exist` mai
multe categorii de plasmide:
Plasmide F sau factori de fertilitate (engl. fertility)
con\in operonul tra (alc`tuit din 14-15 gene) care
controleaz` transferul conjugativ [ntre bacteria
donor ]i cea receptor prin intermediul pilului de
conjugare (denumirea veche - pil de sex). Primul
plasmid descris a fost plasmidul F de la E. coli
(din grupul Inc F) care are 44,5kpb (cu 49% GC),
din care 33,3kpb reprezint` operonul tra. Este un
plasmid low-copy (1-2 copii/celul`), cu peste 70
ORF-uri cartate p@n` [n prezent.
Operon tra
Ori T
Gene implicate
[n replicare
Ori V
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
CLASIFICAREA PLASMIDELOR
{n func\ie de prezen\a/absen\a, localizarea ]i structura plasmidului F, bacteriile pot fi:
F- - celule bacteriene care nu posed` plasmid F nici liber, nici ca epizom. Are [ntotdeauna
rol de receptor [n conjugare. Erau considerate bacterii femele [n perioada c@nd
conjugarea era asimilat` fenomenului de sexualitate.
F+ - celule bacteriene (considerate mascule) care prezint` factorul de fertilitate [n form`
extracromozomal` (1-2 copii/celul`). {ndepline]te rol de bacterie donor [n procesul de
conjugare.
Integrarea mediat` de IS a plasmidului F [n cromozomul
bacterian
Transformarea unei bacterii F+ [n bacterie Hfr
Hfr (engl. high frequency of recombination) celule procariote care prezint`
plasmidul F integrat ca epizom [n nucleoid ]i care prezint` un poten\ial crescut de
recombinare a genelor cromozomale. Integrarea este posibil` deoarece plasmidul F
posed` 4 secven\e de inser\ie IS, care mai poart` denumirea de situsuri Hfr ]i care
sunt omoloage cu situsuri din cromozomul bacterian. {ntre acestea se poate realiza
proces de recombinare genetic`.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
{n conjugare, o astfel de bacterie Hfr poate
[ndeplini rol de donor, chiar cu plasmidul [n form`
integrat` ]i atunci transferul conjugativ dintr-o
bacterie [n cealalt`, [ncepe cu regiunea lider ]i rep-
inc din epizom, apoi o monocaten` [ntreag` a
cromozomului bacterian (deci toate genele
cromozomale) ]i la sf@r]it, partea final` din
epizom. Cele dou` bacterii donor ]i receptor
trebuie s` r`m@n` [n contact direct timp
[ndelungat. Prin experimente de conjugare
[ntrerupt` a fost realizat` harta cromozomului
circular de la E. coli, [n care distan\a dintre gene
este exprimat` [n minute de conjugare.
Conjugarea dintre o bacterie donor Hfr ]i o bacterie
receptor F-
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
CLASIFICAREA PLASMIDELOR

F bacterii la care excizia epizomului F din cromozomul bacterian se face incorect ]i
astfel plasmidul achizi\ioneaz` una sau c@teva gene cromozomale (care exist` [n celul`
tot [ntr-un singur exemplar, [n acest caz, doar [n plasmidul F). Poate avea rol de
donor [n conjugare.
F bacterii care rezult` [n urma conjug`rii dintre o celul` F ]i o celul` F- ]i care
posed` genele achizi\ionate de plasmidul F (recombinant) [n stare diploid` (at@t pe
cromozom, c@t ]i [n plasmid).
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
CLASIFICAREA PLASMIDELOR
{n afar` de plasmidul F mai exist` ]i alte plasmide conjugative (cu operon tra) din alte grupe
de incompatibilitate: RP1, RP4 din grupul de incompatibilitate Inc P.
Plasmidul RP4 se caracterizeaz` prin:
o greutate molecular` de 40Mdal,
un procent de 60% GC,
prezen\a a 8 secven\e de inser\ie (IS),
trei gene marker de rezisten\` la antibiotice: Ap
R
, Tc
R
, Km
R
.
exist` [ntr-un num`r de 4-7 copii/celul` (este o plasmid` low-copy),
originea replic`rii ori V este diferit` de originea transferului conjugativ ori T,
prezint` 1-3 regiuni tra (pentru autotransferabilitate) ]i o gen` pri care codific` o primaz` proprie.
posed` pili de conjugare rigizi, de aceea transferul conjugativ se poate realiza eficient doar pe suport solid.
a fost descoperit` la Pseudomonas aeruginosa, dar ulterior ]i la alte gazde bacteriene Gram negative.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
CLASIFICAREA PLASMIDELOR

Plasmide R con\in gene ce determin` rezisten\a
celulei gazd` la antibiotice, sulfamide,
chimioterapice. Ele au caracter de conjugon
precum ]i capacitatea de a forma prin
recombinare agregate plasmidiale (plasmide
gigant) de rezisten\` multipl`. Ridic` mari
probleme [n prezent, [n medicin`, deoarece face
imposibil` tratarea unor maladii infec\ioase.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
REPLICAREA PLASMIDELOR
1. Replicarea plasmidelor liniare a fost elucidat` de H.Hinnebusch et al. [n 1993.
La plasmidele cu telomere hairpin, ADN polimeraza trece de pe o caten` pe cealalt`, la
nivelul capetelor legate covalent, rezult@nd un intermediar replicativ concatemeric.
Ini\ierea replic`rii
Telomerele se rup
]i se reunesc
Nick-are situs specific` la nivelul
telomerelor
Formarea capetelor hairpin
Replicare
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
REPLICAREA PLASMIDELOR
La plasmidele liniare cu telomere invertoni, primarea replic`rii este realizat` de proteina TP
care este legat` de o adenin` (A) de la cap`tul 5 al fiec`rei catene. {n citoplasm` se formeaz`
noi complexe TP-A. Noul complex va dimeriza, prin intermediul proteinei TP, de cel existent
la cap`tul 5 al fiec`rei catene, iar adenina nou-adus` se va lega prin dou` pun\i de hidrogen de
timina de la capatul 3 al catenei opuse ]i, [n acela]i timp, ofer` cap`tul 3hidroxil liber pentru
o nou` leg`tur` fosfodiesteric` cu al doilea nucleotid, astfel av@nd loc elongarea noii catene [n
direc\ia 5-3
T
A
3
5
5
3
5
Proteina TP
Proteina TP
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
REPLICAREA PLASMIDELOR
2. Replicarea plasmidelor circulare a fost elucidat` de M. Espinosa et al. [n 1995 ]i se realizeaz` prin
3 mecanisme: Theta, Rolling Circle (RC), Strand Displacement (SD).
Mecanismul Theta de replicare plasmidial` este similar celui de replicare a cromozomului
bacterian. Denumirea e dat` de forma intermediarului de replicare asem`n`toare literei grece]ti
theta.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE MECANISMUL THETA
Relicarea plasmidei [ncepe de la regiunea ori V care cuprinde: 4-5 secven\e ADN cu repeti\ie
direct` (numite iteroni), o regiune bogat` [n perechi A/T ]i cutiile dnaA.
Proteina care ini\iaz` acest mecanism de replicare este proteina Rep, singura enzim` din aparatul
de replicare codificat` plasmidial (restul sunt codificate de gene din cromozomul bacterian ]i sunt
acelea]i cu cele care intervin [n replicarea nucleoidului).
Sinteza celor dou` catene noi (leading ]i lagging) se desf`]oar` unidirec\ional (]i nu bidirec\ional
ca [n cazul cromozomului bacterian), cuplat ]i cvasisimultan.
Plasmide care se replic` prin mecanismul Theta sunt: pSC101, P1, R1, RP4, RK2, RK6, Col E2,
ColE3.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE MECANISMUL THETA
Procesul de replicare decurge cu urm`toarele etape:
Ata]area situs specific` a proteinei Rep la iteroni determin` curbarea moleculei de ADN plasmidial [n aceast`
zon`, ceea ce favorizeaz` etapa urm`toare.
Ata]area proteinei DnaA (codificat` de o gen` cromozomal`) la cutiile dnaA.
Ata]area complexului proteic DnaB-DnaC la regiunea din oriV bogat` [n A=T. Dna B are func\ie de helicaz`
]i desface dublul helix [n aceast` zon`.
Ata]area unei ARN-polimeraze, cu rol de primaz` (codificat` de o gen` cromozomal` [n regiunea oriV) care
ini\iaz` sinteza unui primer ARN.
DNA polimeraza III asigur` etapa de elongare a replic`rii cu dezoxiribonucleotide complementare cu cele
citite pe catena matri\`.
Direc\ia de replicare
Plasmid oriV
Secven\ele din iteroni
la care se leag` proteina Rep
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE MECANISMUL THETA
Mecanismul de control negativ al replic`rii, elucidat la plasmida ColE1.
ARN primer [ncepe s` fie sintetizat de la 555pb mai sus de oriV ]i este numit ARNII. Aceast` molecul` contine 6
resturi consecutive de guanin`, situate la aproximativ 265 pb de la cap`tul 5 al acesteia, care sunt complementare cu
6 resturi consecutive de citozin`, aflate la 20pb [n amonte de oriV, pe catena matri\` ADN. Pe baz` de
complementaritate, se stabilesc triple leg`turi de hidrogen GC ]i are loc hibridizarea temporar` ADN-ARN II. RN-aza
H desface o leg`tur` fosfodiesteric` pe primer ]i ADN polimeraza I elongheaz` primerul ARN la cap`tul 3OH, cu
dezoxiribonucleotide.
La 445 pb [n amonte de ori V, pe catena opus` (deci [n sens invers fa\` de ARN II primer), se sintetizeaz` o alt`
molecul`, numit` ARN antisens ]i notat` ARN I. Acesta are 108 ribonucleotide ]i hibridizeaz` cu ARN II,
modific@ndu-i acestuia conforma\ia astfel [nc@t nu-i mai permite s` hibridizeze cu matri\a ADN, [n regiunea oriV.
{n acest fel replicarea este blocat` controlat, c@nd exist` un num`r suficient de plasmide [n celul`.
ARN I este instabil, iar hibridizarea lui cu primerul este facilitat` de proteina Rop (codificat` de gena rop). Astfel,
ad`ugarea, [n mediul de cultur`, a unui inhibitor al sintezei proteice (cloramfenicolul), care blocheaz` sinteza
proteinei Rop, dar nu ]i a ADN polimerazei I (care exist` [n stoc [n celul`), determin` cre]terea frecven\ei de ini\iere
a replic`rii plasmidei Col E1, [n celula gazd` de E. coli (controlul negativ nu mai func\ioneaz`). Acest lucru este util
adesea in vitro, [n experimentele de amplificare plasmidial`.
Replicare
Blocarea
replic`rii
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Mecanismul Strand-Displacement (modelul buclei D)
const` [n dislocare uneia din cele dou` catene ADN
[n timpul procesului de replicare, sub forma unei
bucle (de unde ]i denumirea mecanismului)
Este [nt@lnit la plasmide din grupul de
incompatibilitate IncQ (pRSF 1010), la care regiunea
oriV este alc`tuit` din: 3 iteroni, o regiune bogat` [n
AT (31pb), o regiune bogat` [n GC (174pb) precum
]i secven\ele cele mai importante: ssiA sau ssiB
situate fiecare pe o caten`, simetric ]i adiacent, de la
care porne]te replicarea [n momentul c@nd sunt
expuse monocatenar.
Ini\ierea replic`rii decurge numai cu ajutorul unor
proteine codificate plasmidial (RepA, RepB, RepC) ]i
nu depinde de enzime codificate de gene
cromozomale.
REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE
Mecanismul Strand-Displacement
Etapele acestui mecanism de replicare sunt urm`toarele:
Ata]area proteinei RepC la secven\ele iteroni din oriV.
Ata]area proteinei RepA, cu rol de helicaz` [n regiunea bogat` [n A/T din oriV ]i desfacerea
dublului helix.
Ata]area proteinei RepB, cu rol de primaz`, la regiunea ssiB de pe o caten` a ADN-ului
plasmidial (aceea ce se replic` prima) ]i [ncepe sinteza unui primer ARN. Cealalt` caten`
([nt@rziat`) nereplicat` deocamdat`, pe care se afl` ssiA, este disclocat` ]i [ndep`rtat` treptat
(de c`tre helicaza RepA), form@nd bucla D.
Ata]area ADN polimerazei ce determin` elongarea catenei noi (leading) pe catena matri\` B. La
sf@r]itul acestei etape rezult` o molecul` de ADNdc circular` (catena matri\` B ]i catena nou
sintetizat` leading) ]i o molecul` de ADN monocatenar (catena matri\` A, ce forma bucla D),
pe care se afl` descoperit situsul ssiA ]i de la care va [ncepe un nou proces de replicare a
catenei noi, lagging. Deci, [n acest mecanism, sinteza celor dou` catene noi nu este cuplat` ]i
simultan`.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Mecanismul Rolling circle (RC cerc rotativ)
Este [nt@lnit la plasmidele pT181, de la Staphylococcus sp.,
pUB110 ]i pC194 de la Bacillus subtilis, pMV158, pSN2, etc.
Originea replic`rii este dubl`, adic` exist` c@te un oriV pe
fiecare caten`, situat` distan\at una de cealalt`: dso (double-
stranded origin) ]i sso (single-stranded origin).
Regiunea dso asigur` ini\ierea replic`rii primei catene noi
(leading) ]i are dou` regiuni: bind - la care se ata]eaz` proteina
ini\iatoare Rep ]i nick - unde proteina Rep rupe o leg`tur`
fosfodiesteric`.
Regiunea sso asigur` replicarea catenei lagging. Deci ]i [n
acest mecanism replicarea celor dou` catene este defazat`, astfel
[nc@t cele dou` catene noi (leading ]i lagging) nu se sintetizeaz`
simultan ]i cuplat.
REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE
Mecanismul Rolling circle (RC cerc rotativ)
Etapele procesului de replicare prin mecanismul RC sunt :
Ata]area proteinei ini\iatoare Rep sub form` de dimer, la regiunea bind din
dso.
Desfacerea unei leg`turi fosfodiesterice din secven\a nick din dso, de c`tre
un monomer al dimerului Rep. Proteina Rep r`m@ne ata]at` printr-un
monomer, la cap`tul 5 al catenei rupte, printr-o leg`tur` Tyr-fosfodiesteric`.
Cap`tul 3 al catenei rupte serve]te ca primer [n replicarea catenei leading.
Helicaza, codificat` de o gen` cromozomal`, desface dublul helix al ADN-
ului plasmidial.
Proteina Ssb, de asemenea codificat` cromozomal, se leag` de cealalt` caten`
matri\`, care temporar nu este replicat` ]i [i confer` stabilitate [n form`
monocatenar`.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE
Mecanismul Rolling circle (RC cerc rotativ)
ADN polimeraza III asigur` elongarea catenei noi, leading, cu dezoxiribonucleotide
complementare cu cele citite pe catena matri\` ]i relicarea nu se opre]te dup` parcurgerea
integral` a catenei matri\` circulare, ci se dep`]e]te regiunea dso, ]i continu` mai multe runde de
replicare, rezult@nd un intermediar concatemeric format din mai multe catene noi leading, cap la
cap.
Monomerul Rep se desprinde de catena matri\` r`mas` deocamdat` nereplicat` ]i reface leg`turile
fosfodiesterice at@t pe aceasta (redevenind circular`), c@t ]i pe cea nou sintetizat`, leading.
Astfel rezult`:
o molecul` de ADN monocatenar (cealalt` caten` matri\` din plasmidul ini\ial, care va fi replicat` ulterior,
pornind de la sso, ]i sintetiz@ndu-se catena lagging),
o plasmid` [ntreag` din ADNdc (cu o caten` matri\` ]i una nou sintetizat` - leading),
concatemerul monocatenar, chiar pe m`sur` ce este elongat, []i sintetizeaz` catena complementar` ]i este
fragmentat de o endonucleaz` [n monomeri plasmidiali bicatenari.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Plasmida pSC101
a fost folosit` pentru prima dat` ca vector de
clonare genic`, [n 1973, de c`tre Cohen,
este o plasmid` natural` care se [nt@lne]te la
tulpini de Salmonella ]i Escherichia coli.
este o plasmid` low-copy (6-7 copii/celul`) ]i
de\ine un marker de rezisten\` la tetraciclin`
[n care se reg`sesc situsuri pentru
restrictazele: HindIII, BamHI, BstI, SalGI.
are o lungime de 9263pb ]i a fost [n
[ntregime secven\ializat`.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
Plasmida pSC101
Regiunea replicativ` a acestei plasmide are 2,2kpb ]i este cuprins` [ntre situsurile a dou` endonucleaze de restric\ie:
HincII ]i RsaI. De\ine trei subregiuni:
gena repA care codific` proteina RepA (cuprinde 316 aminoacizi ]i are o greutate molecular` de 37kdal),
genele parA ]i B (ce codific` proteinele Par A ]i Par B) ]i parS (situsul la care se ata]eaz` proteinele Par A ]i B) cu
rol [n parti\ia controlat` ]i echilibrat` a plasmidelor low-copy [n celulele fiice rezultate prin diviziune direct`,
subregiunea oriV (aproximativ 200pb) care cuprinde:
un cluster de 3 secven\e repetate direct (RS1 24pb, RS2 18pb, RS3 24pb) la care se ata]eaz` proteina
Rep A. De la un promotor situat [n mijlocul lui RS2, [ncepe sinteza unui ARN-Y, care faciliteaz` deschiderea
dublului helix [n regiunea oriV;
cutiile dnaA la care se ata]eaz` proteina DnaA;
dou` secven\e repetate direct (RS1 ]i RS2), de c@te 13pb, la care se ata]eaz` complexul proteic DnaB-DnaC
(replicare prin model Theta). ARN polimeraza (primaza) se ata]eaz` la promotorul pentru ARN-Y situat [n
clusterul cu cele trei secven\e repetate direct;
o secven\` bogat` [n perechi A=T la care se ata]eaz` proteina histone-like IHF form@ndu-se astfel, replisomul.
Legarea simultan` a proteinelor RepA, DnaA, DnaB-DnaC, este favorizat` de curbarea cu 150 a moleculei de
ADN, determinat` de ata]area proteinei IHF la secven\a bogat` [n A=T.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
MECANISME GENETICE DE CONTROL ACTIV AL STABILIT~|II }I
PARTI|IEI PLASMIDIALE
Asigur` men\inerea ]i repartizarea echilibrat` a plasmidelor [n celulele fiice rezultate prin
diviziune direct`, se desf`]oar` cu consum energetic din partea celulei bacteriene ]i sunt
necesare, [n special, pentru plasmidele low-copy.
Cre]terea frecven\ei de ini\iere a replic`rii plasmidiale care asigur` un num`r
suficient de mare de copii/celul`, ca s` permit` distribu\ia lor randomic` [n celulele
fiice.
Sisteme de rezolu\ie multimeric` (mrs multimer resolution system) identificate
la plasmidele: ColE1, RP4, F, P1. Con\in gene ce codific` o resolvaz`, enzim`
r`spunz`toare de scindarea multimerilor plasmidiali (plasmide gigant formate prin
unirea mai multor plasmide de acela]i fel) [n monomeri. Astfel cre]te num`rul de
copii discrete ale plasmidului [n celul` ceea ce permite repartizarea lor relativ
echilibrat`, [n celulele fiice.
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
MECANISME GENETICE DE CONTROL ACTIV AL STABILIT~|II
}I PARTI|IEI PLASMIDIALE
Sistemele genetice de parti\ie activ` sunt variate:
1. Loci par exist` [n multe plasmide. Mai studia\i sunt locii par de la plasmidul P1
Plasmidul P1 este de fapt un bacteriofag care, [n stadiul de profag, nu se integreaz` [n nucleoid, ci se circularizeaz` ]i
devine plasmid-like (se comport` ca un plasmid). Locusul par cuprinde trei gene: parA ce codific` proteina ParA, gena
parB ce codific` proteina ParB ]i gena sau situsul par S sau incB (3 palindroame a c@te 13pb) la se ata]eaz` proteinele
ParA ]i ParB. Etapele mecanismului sunt:
Ata]area a trei monomeri proteici ParB la cele trei palindroame din situsul incB al fiec`rei plasmide;
Dimerizarea plasmidelor prin intermediul monomerilor ParB existen\i pe fiecare;
Ata]area la complexul astfel format (dou` copii plasmidiale + trei dimeri ParB) a unui dimer de proteine Par A;
Ancorarea complexului, prin intermediul dimerului ParA, la un receptor proteic din membrana plasmatic`, [n zona
de ini\iere a septului intercelular (celula este [n diviziune). Complexul proteic este alc`tuit din proteinele Fts I-
FtsA, care se ata]eaz` sub form` de dimer, de o parte ]i de alta a unei proteine FtsZ, de la nivelul c`reia porne]te
septul ce va separa cele dou` celule.
Pe m`sur` ce septul intercelular [nainteaz`, separ` [n cele dou` celule c@te o copie a plasmidului, legat` prin trei
monomeri ParB, de o protein` ParA, care se leag` de un complex FtsI-FtsA din membrana plasmatic`
FtsZ FtsI FtsI
FtsA FtsA
Membrana bacteriei
Septul intercelular



3 monomeri ParB



IncB
Par A
Plasmid
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
2. Sisteme ccd (coupled cell division) au fost descrise la plasmidul F, ulterior ]i la alte plasmide. Sistemul de\ine
dou` gene: ccd A ce codific` proteina Ccd A de 8,3Kdal ]i gena ccd B ce codific` proteina Ccd B de 11,7Kdal.
Proteina Ccd B (are rol de represor) blocheaz` activitatea ADN girazei ]i astfel inhib` replicarea ADN ]i duce la
moarte celular`.
Proteina Ccd A (are rol de antirepresor) se cupleaz` cu Ccd B ]i astfel o inactiveaz`. {ns`, proteina Ccd A este
instabil` [n celul`, este rapid degradat` de proteaza Lon. Pentru asigurarea replic`rii normale, trebuie creat un stoc
citoplasmatic de protein` CcdA printr-o rat` crescut` a transcrierii genei ccdA.
Astfel,
descenden\ii F+ posed` gena ccdA care, prin transcriere intens`, asigur` sinteza antirepresorului r`spunz`tor de blocarea
activit`\ii represorului CcdB ]i deci, ADN se replic` normal.
descenden\ii F-, care nu au primit o copie a plsmidului F, nu posed` gena ccdA, ca urmare proteaza Lon degradeaz`
rapid stocul citoplasmatic de protein` Ccd A primit de la celula mam`, iar proteina CcdB, existent` ]i ea [n stoc
citoplasmatic, []i exercit` func\ia de represor asupra ADN-girazei, blocheaz` replicarea ]i determin` moartea celulei.
Deci, descenden\ii f`r` copii plasmidiale sunt elimina\i din popula\ie.
MECANISME GENETICE DE CONTROL ACTIV AL STABILIT~|II }I PARTI|IEI PLASMIDIALE
Sistemele genetice de parti\ie activ` sunt variate:
GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)
3. Sisteme hok-mok-sok sunt descrise la plasmidele R1, F, RP1. Ele de\in trei gene:
gena hok are 160pb, codific` proteina Hok care modific` poten\ialul electric de membran`, opre]te procesul de
respira\ie celular` (func\ie care la procariote este [ndeplinit` de complexe enzimatice localizate [n plasmalem`);
gena mok cu 150pb, situat` [n amonte de gena hok, pe aceea]i caten`, cele dou` gene fiind co-transcrise
(transcriere policistronic`). Deci, ca s` aib` loc transcrierea genei hok, trebuie s` fie integr` ]i activ` gena mok,
pentru c`, de fapt cu aceasta [ncepe transcrierea;
gena sok are 130pb, este suprapus` par\ial cu gena mok, dar pe cealalt` caten` ADN. Transcriptul ARNsok
hibridizeaz` cu ARNmok, bloc@nd transla\ia co-transcriptului ARNmok-ARNhok. {ns` ARN sok este extrem
de instabil ]i este necesar` o rat` crescut` a transcrierii genei sok.
Deci,
Descenden\ii R1+ posed` gena sok transcris` intens pentru a asigura o cantitate suficient` de ARNsok care, prin
cuplare cu ARNmok, s` fac` imposibil` traducerea co-transcriptului ARNmoh-ARNhok. {n aceste condi\ii ([n lipsa
proteinei Hok), respira\ia celular` nu este afectat`, iar bacteriile se dezvolt` ]i se divid normal.
Descenden\ii R1-, care nu au primit o copie a plasmidului, nu posed` gena sok, ARNsok (mo]tenit ca stoc de la celula
mam`) este rapid degradat, are loc transla\ia cotranscriptului ARNmok-ARNhok, iar proteina Hok afecteaz` fiziologia
plasmalemei ]i, implicit, respira\ia celular`, iar bacteriile nu supravie\iuesc.
MECANISME GENETICE DE CONTROL ACTIV AL STABILIT~|II }I PARTI|IEI PLASMIDIALE
Sistemele genetice de parti\ie activ` sunt variate:
VECTORI ADN
Tehnologia ADN recombinant (clonare genica) asigura transferul
de material genetic de la o specie la alta, mai mult sau mai putin
indepartata filogenetic.
Un sistem clonator de gene are 5 componente:
AND pasager (exogen) ce urmeaza a fi transferat in celula gazda si care
contine gena sau genele de interes; are greutate moleculara mica;
Vectorul sau vehiculul care transfera genele, le multiplica si le mentine in
celula gazda. Poate fi:
plasmid,
bacteriofag l sau derivati ai acestuia,
alte virusuri,
cosmid (plasmid + situsul cos de la fagul l),
fagimid (plasmid + ADN de la fagi filamentosi).
Endonucleaze de restrictie care taie in situsuri specifice si formeaza capete
adezive (coezive sau lipicioase) sau netede;
AND-ligaze ce catalizeaza legarea covalenta a ADN-ului pasager la vector;
Celula gazda (E. coli, S. cerevisiae, alte celule: vegetale sau animale)
VECTORI ADN
Etapele principale ale unei experiente de transfer de gene:
Obtinerea ADN vector;
Obtinerea fragmentelor de ADN pasager (heterolog);
Obtinerea moleculelor de ADN hibride prin insertia pasagerului
in vector;
Introducerea ADN recombinant (hibrid) in celula gazda (prin
transformare, transductie, conjugare, transfectie);
Selectia si caracterizarea recombinantilor;
Exprimarea moleculelor de ADN clonate in celula gazda.
VECTORI ADN
Proprietatile vehiculelor plasmidice:
Sa aiba dimensiuni cat mai reduse;
Sa aiba o capacitate cat mai mare de a accepta ADN
heterolog;
Sa posede un cluster PCS = Poly Cloning Site (MCS =
Multi Cloning Site) care sa contina un numar cat mai mare
de situsuri specifice pentru restrictaze;
Sa prezinte o serie de markeri genetici (rezistenta la
antibiotice, proprietati fermentative, etc.) care lipsesc in
celula gazda, pentru a usura selectia recombinantilor;
PCS sa fie localizat intr-o gena care prin neexprimarea ei
fenotipica (dupa ce in ea s-a inserat ADN-ul heterolog) sa
permita contraselectia;
Sa fie usor de izolat, manipulat, sa fie intr-un numar cat
mai mare de copii per celula.
VECTORI ADN
1. Vectori de clonare
plasmidiali
pBR322
Construita in vitro de H.W.Boyer, in
1977; are 2,6 x 10
6
daltoni;
Contine:
gena de rezistenta la tetraciclina
Tc
R
derivata de la pSC101
gena de rezistenta la ampicilina
Ap
R
derivata de la pRSF212;
Originea replicariii de la Col E1;
Situsuri pentru un numar foarte
mare de endonucleaze de
restrictie: PstI in gena Ap
R
,
HindIII si EcoRI intre cele doua
gene de rezistenta Tc
R
si Ap
R
,
BamHI si SalI in gena Tc
R
pBR322
VECTORI ADN
1. Vectori de clonare plasmidiali
pUC18/19
Sunt vectori de clonare, dar nu permit
exprimarea ADN heterolog;
2,69 kpb;
Doi markeri genetici: Ap
R
si gena defectiva
lacZ care exprima capatul NH
2
terminal al b
galactozidazei, dar e capabila de
complementatie intra-alelica cu o alta forma
defectiva lacZ (ce codifica capatul COOH
terminal al b galactozidazei) dintr-o gazda
bacteriana adecvata in care se va reface
integral b galactozidaza in urma clonarii;
PCS format din numeroase situsuri pentru
restrictaze. PCS are orientare inversa in
pUC18 fata de pUC19;
lac I codifica represorul genei lacZ (deci e
gena reglatoare).
pUC19
VECTORI ADN
1. Vectori de clonare plasmidiali
pGEM 3/4 (si 3z/4z)
Vector de clonare, dar si de exprimare a ADN-ului heterolog;
Contine:
oriV de la Col E1;
Ap
R


PCS cu situsuri pentru foarte multe restrictaze, orientat invers la
3 fata de 4 si flancat de doi promotori din fagii SP6 si din T7
(orientati invers unul fata de altul, pe cele doua catene ale ADN,
permitand transcrierea genelor de interes clonate in PCS, pe
ambele catene);
pGEM3Z/4Z are, in plus, gena defectiva lac Z de la pUC18/19;
VECTORI ADN
2. Vectori de clonare derivati de la fagi filamentosi
Fagii filamentosi (M13, f1, fd, Pf1) sunt formati din ADN monocatenar circular
inchis, catena infectanta +;
Greutate moleculara de 2 x 10
6
daltoni;
Replicare RC (Rolling circle) se formeaza un intermediar dublu catenar din
care, catena va servi ca matrita pentru transcrierea genelor fagice, dar si
pentru sinteza (prin replicare) a catenelor + sub forma unui intermediar
concatemer ce va fi scindat in genomuri individuale.
VECTORI ADN
M13 (6,4kpb) specific pentru
E. coli.
Prezinta omologie cu
genomul fagilor f1 si fd;
90% din genom sunt gene ce
codifica proteine, separate
intre ele doar de cateva
nucleotide; mai mari sunt
regiunea intergenica majora
IG 1 (situata intre genele II si
IV) si IG2 (intre genele VIII
si III).
M13mp18/19 are 7,25kpb,
are inserata in IG1 un
fragment din pUC 18/19 ce
contine gena lacZ, PCS si
gena lac I.

VECTORI ADN
3. Vectori de clonare hibrizi: fagimide si cosmide
Fagimide
Combina caracterele de plasmide: oriV de la Col E1 (ce asigura replicarea dupa
model RC si mentine forma plasmidiala standard) si o gena de rezistenta la
antibiotice,
Cu caractere de fag filamentos: gene pentru morfogeneza particulelor virale si
regiunea intergenica majora IG1 care, in prezenta unui fag filamentos
helper (posesor al genei II ce codifica endonucleaza II ce interfera cu IG1)
asigura replicarea dupa modelul fagilor filamentosi (cu intermediar
concatemer).
pUC118/119
- stabilitate mai mare,
- accepta AND heterolog mai mare decat fagii filamentosi,
- oriV de la ColE1 dar si ori V de la f1 sau M13;
- PCS si gene marker Ap
R
(pentru selectie) lacZ (permite contraselectie)
VECTORI ADN
pBluescript
MCS in gena lac Z pentru 20 de
restrictaze, incadrat de promotorii T3
si T7 (permit transcrierea ambelor
catene ale ADN-ului heterolog
inserat in MCS)
Ap
R
, lac Z pentru selectie si
contraselectie;
oriV de la f1, dar si de la un plasmid;
In prezenta fagului M13 helper,
AND heterolog se va replica dupa
modelul fagilor filamentosi si se
formeaza o monocatena concatemera
ce poate fi utilizata pentru obtinerea
de sonde pentru hibridizarea
moleculara.

3. Vectori de clonare hibrizi: fagimide si cosmide
Fagimide:
VECTORI ADN
3. Vectori de clonare hibrizi: fagimide si cosmide
Derivati din genomul fagului l
Fagul l :
A fost folosit pentru prima data in experiente de clonare,
in 1974, de catre Murray;
Are dimensiuni mari: 48 kpb, 3,1 x 10
7
daltoni,
aproximativ 50 de gene;
ADN dc liniar care are la capetele 5 ale fiecarei catene
cate 12 nucleotide ce formeaza capete coezive
complementare ce permit circularizarea cand infecteaza
celula gazda (cercuri Hershey);
Prin asocierea capetelor coezive se formeaza situsul cos;
Partea centrala a genomului cuprinde gene responsabile de recombinare (red, gam, bio), gene
pentru lizogenie (integrarea ca profag in cromozomul gazdei si replicare sincrona cu acesta):
att, int, xis. Deoarece aceasta regiune (40% din genom) cuprinde gene neesentiale ce pot fi
indepartate si inlocuite cu ADN heterolog, aceasta regiune se numeste regiune stuffer;
1/3 din genom cuprinde genele A W B C D E F Z..J ce codifica proteine ale capului si cozii;
1/3 din genom cuprinde gene pentru reglare (cI, cro) si imunitate la suprainfectie fagica, gene
pentru replicare (O, P, Q) sau gene pentru ciclul litic (S, R);
In ciclul evolutiv prezinta doua optiuni: ciclul litic si ciclul lizogen
VECTORI ADN
3. Vectori de clonare hibrizi: fagimide si cosmide
Derivati din genomul fagului l:
Vectori insertionali cand ADN-ul se insera intr-un situs unde a
taiat o endonucleaza de restrictie si nu inlociueste un fragment
de ADN stuffer;
Vectori de substitutie cand ADN-ul heterolog inlocuieste ADN
stuffer deoarece restrictaza gaseste doua situsuri specifice ce
flancheaza fragmentul.
lCharon sunt vectori insertionali sau de substitutie, de clonare
(pentru constituirea bancilor de gene) nu si de exprimare.
F. Blattner construieste in 1977 16 vectori Charon
lCharon 4A poarta un ADN heterolog de 0-6kpb (prin insertie) sau de 7-20
kpb (prin substitutie);
lCharon 40 este numai vector de substitutie, poseda 2 PCS (fiecare cu cate
16 situsuri) cu orientare inversa, regiunea stuffer poseda o secventa repetata
de 80 de ori (operonul lac + un fragment de ADN de la un adenovirus), intre
repetitii se gaseste situsul pentru endonucleaza NaeI , accepta un ADN
heterolog mare (9,2 - 24,2 kpb).
VECTORI ADN
Derivati din genomul fagului l:
l EMBL: vectori de clonare, nu de exprimare, de substitutie
(deoarece regiunea stuffer e incadrata de 2 PCS-uri orientate invers cu
cate 3 situsuri), accepta ADN heterolog de 20 kpb; Ex. l EMBL 4 are
in PCS situsuri pentru EcoRI, BamHI, SalI.
l gt: vectori insertionali, de clonare dar si de exprimare, accepta ADN
heterolog de dimensiuni mici (6kpb). Situsul EcoRI e situat in gena
imm (pentru imunitate).
l DASH: vectori de exprimare si de substitutie, au regiunea stuffer
(cu genele red, gam si bio) flancata de 2 PCS-uri cu cate 7 situsuri
orientate invers si insotite de promotorii T3 si T7 (deci servesc pentru
obtinerea sondelor ARN.
l ZAP: vectori de insertie care au in regiunea stuffer, fagimidul
pBluescript SK, poseda 1 PCS in regiunea terminala a genei defective
lacZ
VECTORI ADN
Cosmide:
Poseda oriV de la ColE1 si gena Ap
R
(pentru replicare, selectie);

Poseda situsul cos de la fagul l (permite impachetarea in vitro si
propagarea prin transductie si transfectie);
Accepta AND heterolog mare (45kpb), chiar si a unor gene
eucariote intregi;
Construite pentru prima data de J. Collins in 1978.
pJB8: ori V de la Col E1; Ap
R
,

situsul cos de la fagul l Charon
4A, PCS pentru 4 endonucleaze Bam HI, EcoRI, ClaI, Hind III.
c2RB: ori V de la Col E1; Ap
R
, Km
R
, PCS pentru 4
endonucleaze (identic cu cel de la pJB8), 2 situsuri cos ce
flancheaza gena Km
R
.