Sunteți pe pagina 1din 40

Curs 7

MUTAGENEZA DIRIJATĂ

Genetica studiază două fenomene biologice fundamentale:

- ereditatea;

- variabilitatea.

Variaţiile caracterelor bacteriene pot fi grupate în:

- fenotipice;

- genotipice.

Variaţiile fenotipice spre deosebire de cele genotipice nu se transmit ereditar. Fenotipul = ansamblul caracterelor observabile; Genotipul = ansamblul genelor raspunzatoare de aparitia fenotipului.

Gregor Mendel – a sugerat pentru prima dată existenţa genelor (anii 1860) - există în mazăre un factor care trece de la „părinţi la copii”. Nu a folosit încă termenul de genă. Mendel – primul - a lansat ipoteza distincţiei dintre dominant şi recesiv, dintre heterozigot şi homozigot şi diferenţa dintre ceea ce mai târziu, s-a numit genotip şi fenotip.

Individ homozigot = linia pura pentru caracterul luat in considerare;

• produce o singura categorie de gameti; Individ heterozigot = hibridul pentru caracterul luat in considerare;

• produce doua categorii de gameti.

ADN

ADN-ul unei gene codifică structura chimică a proteinelor. Codul genetic determină secvenţa de aminoacizi care structurează proteinele. Codificarea unei secvenţe de 3 nucleotide la un aminoacid specific este esenţială pentru toate formele de viaţă cunoscute, de la bacterii la oameni. Acidul deoxiribonucleic (ADN) este un acid nucleic care conţine instrucţiuni genetice care specifică dezvoltarea biologică a formelor celulare ale vieţii.

Prezentarea schematic ă a ADN

Prezentarea schematică a ADN

• ADN …. Ereditate

• ADN - responsabil de propagarea genetică a majorităţii caracterelor.

• Reproducere - ADN-ul este replicat şi transmis copiilor.

• În bacterii şi în alte celule simple, ADN-ul nu este separat de citoplasmă prin înveliş nuclear.

• În celulele complexe, prin contrast, majoritatea ADN-ului este localizat în nucleii celulari.

• Organele generatoare de energie, cloroplastele şi mitocondriile sunt purtătoare de ADN.

Gene

• genele - guvernează celulele în care stau prin intermediul proteinelor; rolul instrumental al proteinelor = suport mecanic al structurii celulare.

• genele:

- controlează in organismele multicelulare dezvoltarea individuală de la fertilizarea oului; - funcţionarea de zi cu zi a celulelor, ţesuturilor şi organelor.

În 1910, Tomas Hunt Morgan

• genele există pe cromozomi specifici.

• in celula umana = 23 perechi de cromozomi;

• in Drosophila = 4 perechi;

• in E. coli = 1pereche in forma de inel.

Mai târziu,

• genele ocupă locaţii specifice pe cromozom;

se începe prima hartă cromozomială la Drosophila.

În 1928, Frederick Griffith

• genele pot fi transferate.

În 1941, George Wells Beadle şi Edward Lawrie Tatum:

• mutaţiile în gene cauzează erori în desfăşurarea cailor metabolice - existenţa de gene specifice codificate pentru proteine specifice. 1944, Oswald Avery, Collin Macleod şi Maclyn McCarty:

• ADN-ul deţine informaţiile genelor 1953 - structura moleculară a ADN.

Evolutia geneticii

1928

-Transformarea la pneumococ (Griffith)

1939

- Cinetica multiplicării bacteriofagilor

(virusurile bacteriilor). (Ellis, Delbruck)

1941- Genetica reacţiilor biochimice la Neurospora; - Variante auxotrofe la E.coli K12(Beadle, Tatum)

1943 - La bacterii există mutaţii - rezistenţa faţă

de bacteriofagi).(Luria, Delbruck) 1944 - ADN purtătorul eredităţii la bacterii (Avery, MacLeod, McCarty)

1946

- Există mutaţii induse la bacteriofagi (Delbruck)

1946

- La bacterii există recombinare (între mutantele

auxotrofe ale E.coli K12); fenomenul de conjugare (Lederberg, Tatum)

1950 - Lizogenie înseamnă persistenţa bacteriofagului în

celula bacteriană (Lwoff)

1952 - ADN, purtătorul eredităţii la bacteriofagi (Hershey, Chase)

1952 - Bacteriofagii lizogeni pot transfera gene

cromozomiale – transducţie (Zindler, Lederberg)

1952 - Factorii F determină conjugarea; primele culturi

Hfr.(Hayes ş.a.)

1972 - prima moleculă recombinată din ADN de la două

virusuri (Berg)

1976 - determinarea secvenţei de perechi de baze a unei

gene specifice (A,C,T,G).

1980 - Clonarea în E.coli a genelor pentru insulina

umană şi a celor pentru interferon.

1982 - vaccin ADN recombinat pentru animale domestice;

insulina umană produsă în bacterii modificate genetic,

aprobată de către FDA.

1983 - obţinerea petuniei modificată genetic,

demonstrându-se astfel că plantele modificate genetic transmit noile caractere la descendenţii lor (culoarea).

1986 - a fost obţinut prin inginerie genetică primul vaccin

uman pentru prevenirea hepatitei B 1987- aprobare pentru testarea în câmp a unor plante de cultură modificate genetic: soiuri de tomate şi de cartof rezistente la virusuri.

1989 - aprobare pentru testarea în câmp a

bumbacului modificat genetic rezistent la atacurile insectelor (bumbacul Bt); - debutează proiectul “Genomul Plantelor”.

1990 - Porumbul Bt, drojdiile modificate genetic,

păstrăvul modificat genetic

1996,1997 - Comercializarea porumbului KnockOut, bumbacului Bollgard şi soia roundup Ready; Primul animal clonat – oaia Dolly

1998 Obţinerii de papaia rezistentă la boli.

2000- Prima hartă completă a genomului unei plante: Arabidopsis thaliana

2001 - Prima hartă genomică a unei plante

cultivate: orezul

Aceste descoperiri = dogma centrală a biologiei moleculare = proteinele sunt translatate din ARN şi sunt transcrise din ADN. Excepţii - transcripţia reversibilă în retroviruşi. ARN = produs intermediar în translaţia moleculară a genelor în proteine doar pentru câteva secvenţe de gene, moleculele ARN sunt produşii finali funcţionali. moleculele ARN = ribozomi - funcţiuni enzimatice sau rol de reglare. Secvenţe de ADN, din care sunt transcrise câteva ARN, sunt cunoscute ca gene ARN. Toate organismele vii au genele proprii şi le transmit copiilor prin ADN, numai unii viruşi prin ARN. Pe de altă parte, retroviruşii, cum ar fi cei ai HIV, necesită trascripţia inversă a genomului de la ARN la ADN înainte ca proteinele să fie sintetizate.

- erori rare şi spontane (ex. în replicarea ADN) - pot apărea mutaţii ale secvenţelor de gene - odată propagată la noua generaţie, această mutaţie poate conduce la variaţii în cadrul speciilor.

- Variante ale unei singure gene sunt cunoscute sub termenul de alele; diferenţele în alele pot conduce la diferite caracteristici, de exemplu, culoarea ochilor.

- Cele mai comune alele ale genelor sunt numite “sălbatice” şi cele rare sunt numite “mutante”.

Mutaţia = schimbare a secvenţei de nucleotide din ADN, în absenţa interacţiunii acesteia cu o altă secvenţă. Mutaţiile = modificări spontane, cu caracter nedirecţionat, care survin la nivel molecular în structura unor determinanţi genetici şi, care, afectând o parte din informaţia genetică a organismului, duc la apariţia unui genotip mutant, care se exprimă printr-un fenotip diferit de cel normal, corespunzător genotipului sălbatic. Mutaţia - proteina modificata care poate avea o funcţie alterată sau poate fi integral nefuncţională. Molecula de ADN = foarte stabilă - mutaţiile spontane - foarte rar şi sunt, în general, mascate în cultură, de predominanţa celulelor normale.

Diagrama schematică a unei gene. Instronii sunt regiuni găsite adesea în genele eucariote care sunt înlăturate în procesul de divizare: numai exonii codifică proteinele. Aceasta defineşte gena ca o regiune de nu mai mult de 40 de baze. În realitate multe gene sunt mult mai mari.

Aceasta define ş te gena ca o regiune de nu mai mult de 40 de baze.

ADN-ul = substratul fizic al informaţiei genetice, fundament al conservării, reproducerii şi evoluţiei speciilor. Conţinutul în ADN = constant în diferitele celule somatice ale unui organism, fiind insă variabil de la o specie la alta, dar este dublu în celulele somatice faţă de cele reproducătoare.

de la o specie la alta, dar este dublu în celulele somatice fa ţă de cele

Replicarea ADN-ului

• ADN = structură polimeră permiţând înscrierea în macromolecula sa, sub forma unor secvenţe specifice de baze azotate, a unei cantităţi enorme de informaţie genetică.

• Numai o catenă de 100 de nucleotide poate fi construită sub forma a 4100 variante diferite - enorme posibilităţi de realizare a variaţiilor calitative şi cantitative dintre specii.

• Bazele azotate din structura ADN sunt nucleotidele:

adenina, timina, citozina şi guanina - nucleotide care constituie alfabetul genetic.

• O secvenţă de 3 nucleotide consecutive = codon, reprezintă vocabularul codificării proteinelor.

• Genomul uman contine 6 miliarde nucleotide.

• Copiii au 50 de mutatii mononucleotidice care-i difera de parinti.

• Genele = regiuni ale acizilor nucleici care trec de la părinţi la copii în timpul reproducţiei, ca cromozomi în nucleii gameţilor. Aceste entităţi codifică informaţia esenţială pentru fabricarea proteinelor şi a enzimelor sau altor molecule care determină creşterea şi funcţionalitatea organismului.

Număr de gene în diferite organisme

Organism

Gene

Perechi de baze

Plante

<50000

<10 11

Oameni

25000

3x10 9

Muşte

12000

1,6x10 8

Albine

15000

3×10 8

Viermi

19000

9.7×10 7

Mucegaiuri

6000

1.3×10 7

Bacterii

500–6000

5×10 5 –10 7

Virus ADN

10–900

5,000–800,000

Virus ARN

1–25

1,000–23,000

• Toate genele şi ADN corespunzător = genomul unui organism; în multe specii acesta se divide în două sau mai multe copii.

• Locaţia genelor sau a cromozomilor este arbitrară.

• Replicarea, funcţie esenţială a materialului genetic, este un proces biochimic fundamental pentru lumea vie, comun pentru ADN-ul tuturor sistemelor biologice.

• Replicarea macromoleculei de ADN se bazează pe complementaritatea bazelor azotate şi unirea catenelor complementare prin legaturi de hidrogen.

• metode genetice elaborate în ultimii 30 de ani se bazează pe buna cunoaştere a genomului celulelor vii (structura ADN) şi a proteinelor sau enzimelor pe care acestea le exprimă.

• S-a învăţat cum să se modifice genele prin metode enzimatice, precum şi cum să se transfere şi să se exprime genele în organismul – ţintă. Astfel, există acum o capacitate în permanentă creştere de a accelera reproducerea unor varietăţi de culturi noi şi îmbunătăţite şi de a introduce informaţii genetice complet noi, de exemplu, de la bacterii sau animale la plante.

descoperiri majore care au condus la nivelul actual de cunoştinţe sunt:

• Elucidarea structurii dublu helicoidale a ADN-ului şi a modului în care informaţia genetică este codificată prin secvenţele de nucleotide de-a lungul lanţului ADN-ului;

• Modul în care genele sunt exprimate de către acizii ribonucleici mesageri (mRNA) în proteinele specifice;

• Modul în care ADN-ul poate fi modificat prin utilizarea unor enzime de restricţie, care extrag anumite gene pe care le adaugă genelor din cadrul ADN-ului plasmidic, prin utilizarea ligazelor;

• Modul în care noul ADN recombinant poate fi introdus şi exprimat într-o celulă-ţintă, prin utilizarea unui vector bacterian (Agrobacterium tumefaciens), a unei gene- pistol (metoda biolistică) sau a microinjecţiilor.

• Mutageneza nu este consecinţa recombinării genetice.

• Mutageneza „in vitro” poate fi utilizată pentru modificarea controlată a secvenţei de nucleotide a unei gene, urmată de introducerea acesteia într-o gazdă corespunzătoare şi apoi studierea funcţiilor acesteia.

• organismele sau alimentele modificate genetic reprezintă o parte a naturii, cauzată de transformările spontane ale genelor (mutaţii). De-a lungul ultimilor 10.000 de ani, specia umană a accelerat aceste transformări prin metode de reproducţie tradiţionale.

Organisme Modificate Genetic pot fi plante, bacterii şi animale, modificate prin intermediul ingineriei genetice

Istoria alimentelor MG

1953

Este descrisă structura ADN

1968

Metode enzimatice de tăiere sau recombinare a ADN-ului sau genelor (enzime de restricţie şi ligaze) care produc ADN-ul recombinat Metode de transfer ale genelor / ADN-ului în interiorul celulelor

1973

Primele Directive UE privind alimentele MG

1990

Comercializarea primelor alimente MG (tomate) în SUA

1994

Dezvoltarea fragmentelor de ADN pentru o uşoară identificare a materialului

1995

genetic; Dezvoltarea genomului primului organism

1995

Aprobarea de către UE a soiei MG

1996

Aprobarea de către UE a porumbului MG

1997

Directiva UE pentru alimente noi

1997

Oprirea temporară de către UE a testării pe teren a culturilor MG

1998

Dezvoltarea a aproximativ 40 de genomuri

2000

Dezvoltarea genomului uman

2001

În aşteptare, Directive UE privind aprobarea, siguranţa, trasabilitatea şi

2002

etichetarea alimentelor GM

Biotehnologie modernă”, tehnologie ADN recombinant (tehnologie r-ADN)” şi „inginerie genetică= transferul genelor dintr-un loc într-altul. În domeniul agroalimentar, modificări genetice - în principal, pentru a reduce pierderile şi cheltuielile de producţie şi, în ultimii ani, şi pentru a îmbunătăţi calitatea alimentelor, de exemplu gustul sau proprietăţile benefice pentru sănătate. Industria alimentară - microorganisme transgenice, cum ar fi bacterii sau drojdii: ele pot fi utilizate la producerea brânzei, iaurtului, vinului, pâinii şi cărnii, pentru a îmbunătăţi caracteristicile gustului şi texturii.

• Este posibilă modificarea unei gene a unei plante (rapiţă) şi obţinerea unui produs final care nu este MG (ulei de rapiţă) - pentru îmbunătăţirea proprietăţilor culturilor (de exemplu, toleranţă la pesticide

• doar soia şi porumbul MG au fost aprobate în cadrul pieţii Uniunii Europene, dar şi alte alimente MG au fost notificate Comisiei ca fiind, în mare parte, echivalente soiurilor tradiţionale, conform Directivei pentru alimente noi.

• o serie de aplicaţii se află, în stadii diferite, în procesul de autorizare completă, dar niciuna dintre acestea nu a fost adoptată încă, datorită sistării temporare în 1998 a testărilor pe teren.

• În SUA, peste 50 de alimente obţinute prin tehnologia ADN-ului recombinant (r-ADN) au fost evaluate, de către Administraţia Alimentelor şi Medicamentelor (AAM).

• În afară de recoltele cu noi r-ADN, modificate în vederea îmbunătăţirii parametrilor agrotehnici (toleranţa faţă de erbicide şi insecticide), sunt şi: rapiţă oleaginoasă cu conţinut mare de fitază (BASF), soia cu conţinut ridicat de acid oleic (DuPont), dovlecel rezistent la viruşi (seminţe vegetale Seminis), roşie cu coacere modificată a fructului (Agritope), canola (Calgene) şi roşia rezistentă la înmuiere (Calgene şi Zeneca Plant Science).

• În anul 2000, suprafaţa totală pe plan mondial ocupată de către culturile MG (sau culturi transgenice) era de peste 44 milioane ha, liderul de piaţă fiind SUA (68%), urmat de Argentina (23%). În Europa, datorită deciziilor politice, suprafaţa este aproape nulă.

ă deciziilor politice, suprafa ţ a este aproape nul ă . Sinteza proteinelor (sursa: International Life

Sinteza proteinelor (sursa: International Life Sciences Institute – ILSI)

Agrobacterium infecteaz ă în mod natural unele tipuri de plante ş i introduce noul ADN

Agrobacterium infectează în mod natural unele tipuri de plante şi introduce noul ADN în interiorul acestora. Biologii utilizează forme speciale de Agrobacterium pentru a modifica plantele din punct de vedere genetic (sursa: International Life Sciences Institute – ILSI)

Organism

Caracteristică Nouă Toleranţă la insecte ş i erbicide

Utilizare în alimentaţie Alimente şi ingrediente alimentare Alimente şi ingrediente alimentare Ulei procesat

Aplicant

Statut

legal

Porumb

Ciba-Geigy, Novartis Seeds

A

Soia

Toleranţă la erbicide

Monsanto

A

Canola

Toleranţă la erbicide

Agrevo UK, Plant Genetic Systems, Monsanto, Hoechst Schering Monsanto, Pioneer, Overseas Corp. AgrEvo

N

Porumb

Rezistenţă la insecte

Ingrediente

N

 

alimentare

Porumb

Toleranţă la erbicide

Ingrediente

N

 

alimentare

Roş ii

Coacere întârziată

Roşii

Zeneca

C

 

procesate

Cicoare

Toleranţă la erbicide şi sterilitate masculină

Legume

Bejo-Zaden

C

Radicchio

 

(cu miezul

roşu şi

verde)

Soia

Conţinut ridicat de acid oleic Toleranţă la erbicide

Ulei

EI DuPont

C

Nemours

Porumb

Alimente şi

Monsanto

C

 

ingrediente

alimentare

Soia

Toleranţă la erbicide

Seminţe

Plant Genetic System Novartis Seeds, Monsanto, Pioneer Overseas Corp

C

Porumb

Toleranţă la erbicide şi insecte

Legume, porumb dulce congelat ş i praf, ingrediente alimentare Zahăr, ingrediente alimentare din miez Pioneer Overseas Corp

C

Sfeclă de

Toleranţă la erbicide

Monsanto, Novartis Seeds

C

zahăr

Porumb

Toleranţă la erbicide şi insecte

Pioneer Overseas Corp, Mycogen Seeds DLF-Trifolium, Monsanto, Danisco seeds Amylogen

C

Sfeclă

Toleranţă la erbicide

Furaj

C

furajeră

Cartofi

Compoziţie modificată a amidonului Toleranţă la erbicide sau insecte

Amidon ş i ingrediente Utilizat ca orice alt bumbac

C

Bumbac

Monsanto

C

Culturi

aprobate

(A)

notificate (N) şi în curs de autorizare (C) de către UE

• În cazul primei generaţii de culturi r-ADN - îmbunătăţirea caracteristicilor agronomice, în vederea reducerii pierderilor şi costurilor de producţie, în special pe toleranţa la erbicide, rezistenţa la insecte, rezistenţa la viruşi - pe viitor vor fi abordate rezistenţa la secetă, rezistenţa la mediul sărat şi tolerarea diferitelor temperaturi.

• În cazul celei de-a doua generaţii, care a fost deja creată - caracteristici calitative, care prezintă un mult mai mare interes pentru consumatori:

1. modificare conţinut de ulei

2. modificare conţinut de proteine

3. modificare conţinut de glucide

4. modificare senzorială

5. îmbunătăţire nutriţională, a ingredientelor alimentare şi nealimentare.

• La fel ca şi culturile transgenice, microorganismele transgenice (GMM) prezintă interes pentru industria alimentară. Ele pot fi utilizate pe post de culturi starter în alimente (de exemplu, brânză, iaurt, vin, pâine şi carne) sau în fermentaţie pentru producerea de enzime, coloranţi, acizi organici etc.

Chimozină pură pentru producerea brânzei poate fi, în prezent, obţinută din drojdie modificată genetic (sursa: International Life Sciences Institute – ILSI)

fi, în prezent, ob ţ inut ă din drojdie modificat ă genetic (sursa: International Life Sciences

• Culturi starter transgenice nu există, în prezent, pe piaţa europeană, dar în SUA sunt permise.

• multe enzime şi aditivi alimentari sunt produşi de către microorganisme transgenice, cum ar fi chimozină, alfa- amilază, catalază, lipază, glucozizomerază, beta-glucanază şi glucozoxidază. În prezent, acestea sunt exceptate de la etichetarea specifică.

• Modificarea secvenţei de nucleotide se poate face la întâmplare, prin mutageneză „clasica” cu agenţi mutageni obişnuiţi (fizici sau chimici) sau prin inducerea unor greşeli de incorporare a nucleotidelor cu ajutorul unor enzime (ex. reverstranscriptaza produsă de virusul mieloblastozei aviare). Consecinţa acestor tratamente poate fi de tipul deletiilor, adiţiilor, substituţiilor, inversiilor etc.

• În ultimii ani au fost elaborate metode de mutageneză la situs-specific care permit modificarea controlată (prin deleţii, adiţii sau substituţii de nucleotide) a unei secvenţe de ADN.

• Mutageneza în vitro are numeroase aplicaţii:

- caracterizarea unor regiuni ale ADN care controlează exprimarea unei gene;

- modificarea unor gene în produsul natural astfel încât acestea să-şi îndeplinească cat mai bine rolul.

natural astfel încât acestea s ă - ş i îndeplineasc ă cat mai bine rolul. Tehnica

Tehnica de mutageneză în vitro

• Tehnologia ADN recombinant face parte din cadrul mai larg al ingineriei genetice.

• Ingineria genetica cuprinde toate procedeele efectuate în vitro, cu gene, cromozomi şi uneori, cu celule întregi, în scopul construirii unor structuri genetice cu proprietăţi ereditare premeditate.

• Denumirea de tehnologia ADN recombinant, propusă de Grobstein în 1977, grupează toate tehnicile care permit sinteza chimică sau izolarea mai multor gene naturale de la un organism, urmată de inserţia lor în informaţia genetică a altei celule.

Pentru exprimarea unor fragmente de ADN exogen în celulele animale, este necesar ca vectorii de clonare să conţină:

• secvenţe derivate din plasmide bacteriene care să le permită multiplicarea şi selecţia în celule bacteriene gazdă (E.coli);

• elemente genetice eucariote care să controleze iniţierea transcrierii;

• secvenţe de poliadenilare a ARN mesager;

• gene marker care permit selecţia celulelor animale ce conţin vectorul recombinat. Vectorii de clonare pentru celula animală derivă de la virusuri şi retrovirusuri.

Pentru celulele vegetale, vectorii specifici sunt derivaţi ai plasmidelor naturale de la Agrobacterium tumefaciens şi A. rhizogenes. sau de la virusuri specifice celulelor vegetale.

• Ca şi ceilalţi vectori pentru alte tipuri de organisme, vectorii pentru celulele vegetale sunt vectori tip navetă, ceea ce înseamnă că ei pot funcţiona atât în celulele bacteriene (E.coli, Agrobacterium sp), cat şi în celulele eucariote. Pentru exprimarea unor fragmente de ADN exogen în celulele animale, este necesar ca vectorii de clonare să conţină:

• secvenţe derivate din plasmide bacteriene care să le permită multiplicarea şi selecţia în celule bacteriene gazdă (E.coli);

• elemente genetice eucariote care să controleze iniţierea transcrierii;

• secvenţe de poliadenilare a ARN mesager;

• gene marker care permit selecţia celulelor animale ce conţin vectorul recombinat.

• Vectorii de clonare pentru celula animală derivă de la virusuri şi retrovirusuri.

• Pentru celulele vegetale, vectorii specifici sunt derivaţi ai plasmidelor naturale de la Agrobacterium tumefaciens şi A. rhizogenes. sau de la virusuri specifice celulelor vegetale.

• Ca şi ceilalţi vectori pentru alte tipuri de organisme, vectorii pentru celulele vegetale sunt vectori tip navetă, ceea ce înseamnă că ei pot funcţiona atât în celulele bacteriene (E.coli, Agrobacterium sp), cat şi în celulele eucariote.