Curs 7

MUTAGENEZA DIRIJAT

Genetica studiaz dou fenomene biologice fundamentale: - ereditatea; - variabilitatea. Variaiile caracterelor bacteriene pot fi grupate n: - fenotipice; - genotipice. Variaiile fenotipice spre deosebire de cele genotipice nu se transmit ereditar. Fenotipul = ansamblul caracterelor observabile; Genotipul = ansamblul genelor raspunzatoare de aparitia fenotipului.

Gregor Mendel a sugerat pentru prima dat existena genelor (anii 1860) - exist n mazre un factor care trece de la prini la copii. Nu a folosit nc termenul de gen. Mendel primul - a lansat ipoteza distinciei dintre dominant i recesiv, dintre heterozigot i homozigot i diferena dintre ceea ce mai trziu, s-a numit genotip i fenotip.

Individ homozigot = linia pura pentru caracterul luat in considerare; produce o singura categorie de gameti; Individ heterozigot = hibridul pentru caracterul luat in considerare; produce doua categorii de gameti.

ADN
ADN-ul unei gene codific structura chimic a proteinelor. Codul genetic determin secvena de aminoacizi care structureaz proteinele. Codificarea unei secvene de 3 nucleotide la un aminoacid specific este esenial pentru toate formele de via cunoscute, de la bacterii la oameni. Acidul deoxiribonucleic (ADN) este un acid nucleic care conine instruciuni genetice care specific dezvoltarea biologic a formelor celulare ale vieii.

Prezentarea schematic a ADN

 ADN . Ereditate ADN - responsabil de propagarea genetic a majoritii caracterelor. Reproducere - ADN-ul este replicat i transmis copiilor. n bacterii i n alte celule simple, ADN-ul nu este separat de citoplasm prin nveli nuclear. n celulele complexe, prin contrast, majoritatea ADN-ului este localizat n nucleii celulari. Organele generatoare de energie, cloroplastele i mitocondriile sunt purttoare de ADN.

Gene
genele - guverneaz celulele n care stau prin intermediul proteinelor; rolul instrumental al proteinelor = suport mecanic al structurii celulare. genele: - controleaz in organismele multicelulare dezvoltarea individual de la fertilizarea oului; - funcionarea de zi cu zi a celulelor, esuturilor i organelor.

n 1910, Tomas Hunt Morgan genele exist pe cromozomi specifici. in celula umana = 23 perechi de cromozomi; in Drosophila = 4 perechi; in E. coli = 1pereche in forma de inel. Mai trziu, genele ocup locaii specifice pe cromozom; se ncepe prima hart cromozomial la Drosophila. n 1928, Frederick Griffith genele pot fi transferate.

n 1941, George Wells Beadle i Edward Lawrie Tatum: mutaiile n gene cauzeaz erori n desfurarea cailor metabolice - existena de gene specifice codificate pentru proteine specifice. 1944, Oswald Avery, Collin Macleod i Maclyn McCarty: ADN-ul deine informaiile genelor 1953 - structura molecular a ADN.

Evolutia geneticii

1928 -Transformarea la pneumococ (Griffith) 1939 - Cinetica multiplicrii bacteriofagilor (virusurile bacteriilor). (Ellis, Delbruck) 1941- Genetica reaciilor biochimice la Neurospora; - Variante auxotrofe la E.coli K12(Beadle, Tatum) 1943 - La bacterii exist mutaii - rezistena fa de bacteriofagi).(Luria, Delbruck) 1944 - ADN purttorul ereditii la bacterii (Avery, MacLeod, McCarty)

1946 - Exist mutaii induse la bacteriofagi (Delbruck) 1946 - La bacterii exist recombinare (ntre mutantele auxotrofe ale E.coli K12); fenomenul de conjugare (Lederberg, Tatum) 1950 - Lizogenie nseamn persistena bacteriofagului n celula bacterian (Lwoff) 1952 - ADN, purttorul ereditii la bacteriofagi (Hershey, Chase) 1952 - Bacteriofagii lizogeni pot transfera gene cromozomiale transducie (Zindler, Lederberg) 1952 - Factorii F determin conjugarea; primele culturi Hfr.(Hayes .a.)

1972 - prima molecul recombinat din ADN de la dou virusuri (Berg) 1976 - determinarea secvenei de perechi de baze a unei gene specifice (A,C,T,G). 1980 - Clonarea n E.coli a genelor pentru insulina uman i a celor pentru interferon. 1982 - vaccin ADN recombinat pentru animale domestice; insulina uman produs n bacterii modificate genetic, aprobat de ctre FDA. 1983 - obinerea petuniei modificat genetic, demonstrndu-se astfel c plantele modificate genetic transmit noile caractere la descendenii lor (culoarea). 1986 - a fost obinut prin inginerie genetic primul vaccin uman pentru prevenirea hepatitei B 1987- aprobare pentru testarea n cmp a unor plante de cultur modificate genetic: soiuri de tomate i de cartof rezistente la virusuri.

1989 - aprobare pentru testarea n cmp a bumbacului modificat genetic rezistent la atacurile insectelor (bumbacul Bt); - debuteaz proiectul Genomul Plantelor. 1990 - Porumbul Bt, drojdiile modificate genetic, pstrvul modificat genetic 1996,1997 - Comercializarea porumbului KnockOut, bumbacului Bollgard i soia roundup Ready; Primul animal clonat oaia Dolly 1998 Obinerii de papaia rezistent la boli. 2000- Prima hart complet a genomului unei plante: Arabidopsis thaliana 2001 - Prima hart genomic a unei plante cultivate: orezul

Aceste descoperiri = dogma central a biologiei moleculare = proteinele sunt translatate din ARN i sunt transcrise din ADN. Excepii - transcripia reversibil n retrovirui. ARN = produs intermediar n translaia molecular a genelor n proteine doar pentru cteva secvene de gene, moleculele ARN sunt produii finali funcionali. moleculele ARN = ribozomi - funciuni enzimatice sau rol de reglare. Secvene de ADN, din care sunt transcrise cteva ARN, sunt cunoscute ca gene ARN. Toate organismele vii au genele proprii i le transmit copiilor prin ADN, numai unii virui prin ARN. Pe de alt parte, retroviruii, cum ar fi cei ai HIV, necesit trascripia invers a genomului de la ARN la ADN nainte ca proteinele s fie sintetizate.

- erori rare i spontane (ex. n replicarea ADN) pot aprea mutaii ale secvenelor de gene odat propagat la noua generaie, aceast mutaie poate conduce la variaii n cadrul speciilor. - Variante ale unei singure gene sunt cunoscute sub termenul de alele; diferenele n alele pot conduce la diferite caracteristici, de exemplu, culoarea ochilor. - Cele mai comune alele ale genelor sunt numite slbatice i cele rare sunt numite mutante.

Mutaia = schimbare a secvenei de nucleotide din ADN, n absena interaciunii acesteia cu o alt secven. Mutaiile = modificri spontane, cu caracter nedirecionat, care survin la nivel molecular n structura unor determinani genetici i, care, afectnd o parte din informaia genetic a organismului, duc la apariia unui genotip mutant, care se exprim printr-un fenotip diferit de cel normal, corespunztor genotipului slbatic. Mutaia - proteina modificata care poate avea o funcie alterat sau poate fi integral nefuncional. Molecula de ADN = foarte stabil - mutaiile spontane - foarte rar i sunt, n general, mascate n cultur, de predominana celulelor normale.

Diagrama schematic a unei gene. Instronii sunt regiuni gsite adesea n genele eucariote care sunt nlturate n procesul de divizare: numai exonii codific proteinele. Aceasta definete gena ca o regiune de nu mai mult de 40 de baze. n realitate multe gene sunt mult mai mari.

ADN-ul = substratul fizic al informaiei genetice, fundament al conservrii, reproducerii i evoluiei speciilor. Coninutul n ADN = constant n diferitele celule somatice ale unui organism, fiind ins variabil de la o specie la alta, dar este dublu n celulele somatice fa de cele reproductoare.

Replicarea ADN-ului

 ADN = structur polimer permind nscrierea n macromolecula sa, sub forma unor secvene specifice de baze azotate, a unei cantiti enorme de informaie genetic. Numai o caten de 100 de nucleotide poate fi construit sub forma a 4100 variante diferite - enorme posibiliti de realizare a variaiilor calitative i cantitative dintre specii. Bazele azotate din structura ADN sunt nucleotidele: adenina, timina, citozina i guanina - nucleotide care constituie alfabetul genetic. O secven de 3 nucleotide consecutive = codon, reprezint vocabularul codificrii proteinelor. Genomul uman contine 6 miliarde nucleotide. Copiii au 50 de mutatii mononucleotidice care-i difera de parinti.

 Genele = regiuni ale acizilor nucleici care trec de la prini la copii n timpul reproduciei, ca cromozomi n nucleii gameilor. Aceste entiti codific informaia esenial pentru fabricarea proteinelor i a enzimelor sau altor molecule care determin creterea i funcionalitatea organismului.

Numr de gene n diferite organisme

Organism Plante Oameni Mute Albine Viermi Mucegaiuri Bacterii Virus ADN Virus ARN

Gene <50000 25000 12000 15000 19000 6000 5006000 10900 125

Perechi de baze 11 <10 9 3x10 8 1,6x10 8 310 7 9.710 7 1.310 5 7 510 10 5,000800,000 1,00023,000

 Toate genele i ADN corespunztor = genomul unui organism; n multe specii acesta se divide n dou sau mai multe copii. Locaia genelor sau a cromozomilor este arbitrar. Replicarea, funcie esenial a materialului genetic, este un proces biochimic fundamental pentru lumea vie, comun pentru ADN-ul tuturor sistemelor biologice. Replicarea macromoleculei de ADN se bazeaz pe complementaritatea bazelor azotate i unirea catenelor complementare prin legaturi de hidrogen. metode genetice elaborate n ultimii 30 de ani se bazeaz pe buna cunoatere a genomului celulelor vii (structura ADN) i a proteinelor sau enzimelor pe care acestea le exprim. S-a nvat cum s se modifice genele prin metode enzimatice, precum i cum s se transfere i s se exprime genele n organismul int. Astfel, exist acum o capacitate n permanent cretere de a accelera reproducerea unor varieti de culturi noi i mbuntite i de a introduce informaii genetice complet noi, de exemplu, de la bacterii sau animale la plante.

descoperiri majore care au condus la nivelul actual de cunotine sunt: Elucidarea structurii dublu helicoidale a ADN-ului i a modului n care informaia genetic este codificat prin secvenele de nucleotide de-a lungul lanului ADN-ului; Modul n care genele sunt exprimate de ctre acizii ribonucleici mesageri (mRNA) n proteinele specifice; Modul n care ADN-ul poate fi modificat prin utilizarea unor enzime de restricie, care extrag anumite gene pe care le adaug genelor din cadrul ADN-ului plasmidic, prin utilizarea ligazelor; Modul n care noul ADN recombinant poate fi introdus i exprimat ntr-o celul-int, prin utilizarea unui vector bacterian (Agrobacterium tumefaciens), a unei genepistol (metoda biolistic) sau a microinjeciilor.

 Mutageneza nu este consecina recombinrii genetice. Mutageneza in vitro poate fi utilizat pentru modificarea controlat a secvenei de nucleotide a unei gene, urmat de introducerea acesteia ntr-o gazd corespunztoare i apoi studierea funciilor acesteia. organismele sau alimentele modificate genetic reprezint o parte a naturii, cauzat de transformrile spontane ale genelor (mutaii). De-a lungul ultimilor 10.000 de ani, specia uman a accelerat aceste transformri prin metode de reproducie tradiionale. Organisme Modificate Genetic pot fi plante, bacterii i animale, modificate prin intermediul ingineriei genetice

Istoria alimentelor MG

1953 1968

1973 1990 1994 1995 1995 1996 1997 1997 1998 2000 2001 2002

Este descris structura ADN Metode enzimatice de tiere sau recombinare a ADN-ului sau genelor (enzime de restricie i ligaze) care produc ADN-ul recombinat Metode de transfer ale genelor / ADN-ului n interiorul celulelor Primele Directive UE privind alimentele MG Comercializarea primelor alimente MG (tomate) n SUA Dezvoltarea fragmentelor de ADN pentru o uoar identificare a materialului genetic; Dezvoltarea genomului primului organism Aprobarea de ctre UE a soiei MG Aprobarea de ctre UE a porumbului MG Directiva UE pentru alimente noi Oprirea temporar de ctre UE a testrii pe teren a culturilor MG Dezvoltarea a aproximativ 40 de genomuri Dezvoltarea genomului uman n ateptare, Directive UE privind aprobarea, sigurana, trasabilitatea i etichetarea alimentelor GM

 Biotehnologie modern, tehnologie ADN recombinant (tehnologie r-ADN) i inginerie genetic = transferul genelor dintr-un loc ntr-altul. n domeniul agroalimentar, modificri genetice - n principal, pentru a reduce pierderile i cheltuielile de producie i, n ultimii ani, i pentru a mbunti calitatea alimentelor, de exemplu gustul sau proprietile benefice pentru sntate. Industria alimentar - microorganisme transgenice, cum ar fi bacterii sau drojdii: ele pot fi utilizate la producerea brnzei, iaurtului, vinului, pinii i crnii, pentru a mbunti caracteristicile gustului i texturii.

 Este posibil modificarea unei gene a unei plante (rapi) i obinerea unui produs final care nu este MG (ulei de rapi) pentru mbuntirea proprietilor culturilor (de exemplu, toleran la pesticide doar soia i porumbul MG au fost aprobate n cadrul pieii Uniunii Europene, dar i alte alimente MG au fost notificate Comisiei ca fiind, n mare parte, echivalente soiurilor tradiionale, conform Directivei pentru alimente noi. o serie de aplicaii se afl, n stadii diferite, n procesul de autorizare complet, dar niciuna dintre acestea nu a fost adoptat nc, datorit sistrii temporare n 1998 a testrilor pe teren. n SUA, peste 50 de alimente obinute prin tehnologia ADN-ului recombinant (r-ADN) au fost evaluate, de ctre Administraia Alimentelor i Medicamentelor (AAM). n afar de recoltele cu noi r-ADN, modificate n vederea mbuntirii parametrilor agrotehnici (tolerana fa de erbicide i insecticide), sunt i: rapi oleaginoas cu coninut mare de fitaz (BASF), soia cu coninut ridicat de acid oleic (DuPont), dovlecel rezistent la virui (semine vegetale Seminis), roie cu coacere modificat a fructului (Agritope), canola (Calgene) i roia rezistent la nmuiere (Calgene i Zeneca Plant Science).

 n anul 2000, suprafaa total pe plan mondial ocupat de ctre culturile MG (sau culturi transgenice) era de peste 44 milioane ha, liderul de pia fiind SUA (68%), urmat de Argentina (23%). n Europa, datorit deciziilor politice, suprafaa este aproape nul.
Sinteza proteinelor (sursa: International Life Sciences Institute ILSI)

Agrobacterium infecteaz n mod natural unele tipuri de plante i introduce noul ADN n interiorul acestora. Biologii utilizeaz forme speciale de Agrobacterium pentru a modifica plantele din punct de vedere genetic (sursa: International Life Sciences Institute ILSI)

Organism Porumb

Caracteristic Nou Toleran la insecte i erbicide Toleran la erbicide Toleran la erbicide

Soia

Canola

Utilizare n alimentaie Alimente i ingrediente alimentare Alimente i ingrediente alimentare Ulei procesat

Aplicant Ciba-Geigy, Novartis Seeds Monsanto

Statut legal A

Porumb Porumb Roii Cicoare Radicchio (cu miezul rou i verde) Soia Porumb

Rezisten la insecte Toleran la erbicide Coacere ntrziat Toleran la erbicide i sterilitate masculin

Ingrediente alimentare Ingrediente alimentare Roii procesate Legume

Agrevo UK, Plant Genetic Systems, Monsanto, Hoechst Schering Monsanto, Pioneer, Overseas Corp. AgrEvo Zeneca Bejo-Zaden

N N C C

Coninut ridicat de acid oleic Toleran la erbicide Toleran la erbicide Toleran la erbicide i insecte

Ulei Alimente i ingrediente alimentare Semine Legume, porumb dulce congelat i praf, ingrediente alimentare Zahr, ingrediente alimentare din miez Pioneer Overseas Corp Furaj

EI DuPont Nemours Monsanto

C C

Soia Porumb

Plant Genetic System Novartis Seeds, Monsanto, Pioneer Overseas Corp

C C

Culturi aprobate (A) notificate (N) i n curs de autorizare (C) de ctre UE

Sfecl de zahr Porumb

Toleran la erbicide

Monsanto, Novartis Seeds

Toleran la erbicide i insecte Toleran la erbicide Compoziie modificat a amidonului Toleran la erbicide sau insecte

Sfecl furajer Cartofi Bumbac

Amidon i ingrediente Utilizat ca orice alt bumbac

Pioneer Overseas Corp, Mycogen Seeds DLF-Trifolium, Monsanto, Danisco seeds Amylogen Monsanto

C C

1. 2. 3. 4. 5.

n cazul primei generaii de culturi r-ADN mbuntirea caracteristicilor agronomice, n vederea reducerii pierderilor i costurilor de producie, n special pe tolerana la erbicide, rezistena la insecte, rezistena la virui - pe viitor vor fi abordate rezistena la secet, rezistena la mediul srat i tolerarea diferitelor temperaturi. n cazul celei de-a doua generaii, care a fost deja creat - caracteristici calitative, care prezint un mult mai mare interes pentru consumatori: modificare coninut de ulei modificare coninut de proteine modificare coninut de glucide modificare senzorial mbuntire nutriional, a ingredientelor alimentare i nealimentare.

 La fel ca i culturile transgenice, microorganismele transgenice (GMM) prezint interes pentru industria alimentar. Ele pot fi utilizate pe post de culturi starter n alimente (de exemplu, brnz, iaurt, vin, pine i carne) sau n fermentaie pentru producerea de enzime, colorani, acizi organici etc.

Chimozin pur pentru producerea brnzei poate fi, n prezent, obinut din drojdie modificat genetic (sursa: International Life Sciences Institute ILSI)

 Culturi starter transgenice nu exist, n prezent, pe piaa european, dar n SUA sunt permise. multe enzime i aditivi alimentari sunt produi de ctre microorganisme transgenice, cum ar fi chimozin, alfaamilaz, catalaz, lipaz, glucozizomeraz, beta-glucanaz i glucozoxidaz. n prezent, acestea sunt exceptate de la etichetarea specific. Modificarea secvenei de nucleotide se poate face la ntmplare, prin mutagenez clasica cu ageni mutageni obinuii (fizici sau chimici) sau prin inducerea unor greeli de incorporare a nucleotidelor cu ajutorul unor enzime (ex. reverstranscriptaza produs de virusul mieloblastozei aviare). Consecina acestor tratamente poate fi de tipul deletiilor, adiiilor, substituiilor, inversiilor etc. n ultimii ani au fost elaborate metode de mutagenez la situs-specific care permit modificarea controlat (prin deleii, adiii sau substituii de nucleotide) a unei secvene de ADN.

 Mutageneza n vitro are numeroase aplicaii: - caracterizarea unor regiuni ale ADN care controleaz exprimarea unei gene; - modificarea unor gene n produsul natural astfel nct acestea s-i ndeplineasc cat mai bine rolul.

Tehnica de mutagenez n vitro

 Tehnologia ADN recombinant face parte din cadrul mai larg al ingineriei genetice. Ingineria genetica cuprinde toate procedeele efectuate n vitro, cu gene, cromozomi i uneori, cu celule ntregi, n scopul construirii unor structuri genetice cu proprieti ereditare premeditate. Denumirea de tehnologia ADN recombinant, propus de Grobstein n 1977, grupeaz toate tehnicile care permit sinteza chimic sau izolarea mai multor gene naturale de la un organism, urmat de inseria lor n informaia genetic a altei celule.

Pentru exprimarea unor fragmente de ADN exogen n celulele animale, este necesar ca vectorii de clonare s conin: secvene derivate din plasmide bacteriene care s le permit multiplicarea i selecia n celule bacteriene gazd (E.coli); elemente genetice eucariote care s controleze iniierea transcrierii; secvene de poliadenilare a ARN mesager; gene marker care permit selecia celulelor animale ce conin vectorul recombinat. Vectorii de clonare pentru celula animal deriv de la virusuri i retrovirusuri.

Pentru celulele vegetale, vectorii specifici sunt derivai ai plasmidelor naturale de la Agrobacterium tumefaciens i A. rhizogenes. sau de la virusuri specifice celulelor vegetale. Ca i ceilali vectori pentru alte tipuri de organisme, vectorii pentru celulele vegetale sunt vectori tip navet, ceea ce nseamn c ei pot funciona att n celulele bacteriene (E.coli, Agrobacterium sp), cat i n celulele eucariote. Pentru exprimarea unor fragmente de ADN exogen n celulele animale, este necesar ca vectorii de clonare s conin: secvene derivate din plasmide bacteriene care s le permit multiplicarea i selecia n celule bacteriene gazd (E.coli); elemente genetice eucariote care s controleze iniierea transcrierii; secvene de poliadenilare a ARN mesager; gene marker care permit selecia celulelor animale ce conin vectorul recombinat. Vectorii de clonare pentru celula animal deriv de la virusuri i retrovirusuri. Pentru celulele vegetale, vectorii specifici sunt derivai ai plasmidelor naturale de la Agrobacterium tumefaciens i A. rhizogenes. sau de la virusuri specifice celulelor vegetale. Ca i ceilali vectori pentru alte tipuri de organisme, vectorii pentru celulele vegetale sunt vectori tip navet, ceea ce nseamn c ei pot funciona att n celulele bacteriene (E.coli, Agrobacterium sp), cat i n celulele eucariote.