UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ

VETERINARĂ “ION IONESCU DE LA BRAD” DIN IAȘI

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

SPECIALIZAREA: SAPCCPA

Proiect pe tema: Metode moderne de identificare și dozare prin

folosirea cromatografiei pe strat subțire

2020
 Cuprins:

1. CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE

2. CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBȚIRE

3. FAZA STAȚIONARĂ

4. FAZA MOBILĂ

5. APARATURA FOLOSITĂ ÎN CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBȚIRE

6. ANALIZA CALITATIVĂ

7. ANALIZA CANTITATIVĂ

8. ANALIZA COLORANTILOR ALIMENTARI SINTETICI

9. BIBLIOGRAFIE.
 CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBȚIRE

1. CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE

Metoda cromatografică se bazează pe repartiția diferită a componentelor unui amestec

între o fază mobilă și una staționară, având ca urmare deplasarea, cu viteza diferită a
componentelor purtate de către faza mobilă de-a lungul fazei staționare [47-50]. În funcție de
natura fazelor există patru tipuri de metode cromatografice (tab.1.).

Tabelul 1. Clasificarea metodelor cromatografice funcție de natura fazei mobile respectiv

staționare.

Faza mobila Faza stationara Denumirea tipului de cromatografie

Gaz Solid Cromatografia gaz-solid G – S

Gaz Lichid Cromatografia gaz-lichid G – L

Lichid Solid Cromatografia lichid-solid L – S

Lichid Lichid Cromatografia lichid-lichid L – L

În funcție de aparatura împlicată în procesul de separare cromatografică în cromatografia

de lichide putem face distincție între cromatografia pe coloană închisă (cromatografia de lichide
de înaltă performanță - HPLC) și cromatografia pe coloana deschisă. În cazul în care faza
staționară este depusă pe o suprafața plană avem cromatografia plană (cromatografia pe strat
subțire și cromatografia pe hartie).

2. CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBȚIRE

Necesitatea analizei compușilor cu greutate moleculară mare, instabili termic sau a

compușilor biologici, fără efectuarea unor reacții auxiliare de derivatizare au impulsionat în mod
hotărâtor dezvoltarea cromatografiei de lichide. În prezent se poate afirma că din totalul
amestecurilor de compuși naturali și sintetici, 80% pot fi separați și analizați prin cromatografia
de lichide.

Cromatografia pe strat subțire este o tehnică simplă ca aparatura, care ne oferă posibilități
multiple de separare. Aceasta tehnica se mai numește și cromatografia plană. În ultimul deceniu
s-au înregistrat progrese însemnate atât în privința fazelor staționare cât și a perfecționării
aparaturii de măsurare. Această dezvoltare a permis obținerea unor limite de detecție de ordinul
μg si chiar a pg in cazul unor compuși adecvați.
 În cazul cromatografiei pe strat subțire nu există ingrădiri în privința utilizării unor
solvenți ca eluenți ce absorb în UV (de exemplu: toluen, acetonă, acetat de etil etc.) și care
prezintă selectivități bune într-o serie de separări. De asemenea nu există limitări în privința
utilizării unor reactivi pentru detecție sau identificare.

Metode moderne de identificare și dozare prin folosirea cromatografiei pe strat subțire

Cromatografia pe strat subțire este o tehnica foarte raspandită datorită simplității ei și posibilității
de analizare a unor amestecuri complexe din punct de vedere calitativ si cantitativ.

Tehnica de lucru constă în aplicarea probei (soluției), sub formă de spot sau banda la 1-2
cm de marginea inferioară a placii cromatografice, pe o linie imaginară numită linie de start.
Probele pot fi aplicate automat sau manual cu microcapilare, micropipete sau microseringi. Placa
cromatografică este formată dintr-o placă de sticlă sau folie de aluminiu acoperită cu un strat
subțire de adsorbent (silicagel, silicagel chimic modificat, alumina, celuloză microcristalină etc.).
După ce solventul în care a fost dizolvată proba s-a evaporat, placa este introdusă cu partea
inferioară într-o cuvă ce conține solventul sau amestecul de solvenți de developare. Developarea
se poate realiza in camere normale (N) sau camere sanwich (S). Nivelul eluentului se va situa
sub nivelul liniei de start. Eluentul migrează de-a lungul plăcii cromatografice datorită forțelor
de capilaritate, purtând cu viteze diferite componenții amestecului de analizat, fapt care se
concretizeaza în separarea lor. Nivelul până la care se ridică eluentul se numește linie de front.
După ce frontul eluentului parcurge o anumită distanță (≈8cm) placa se scoate și se usucă.
Vizualizarea se realizează prin pulverizare cu reactivi de culoare specifici.

Intr-un sistem dat faza stationara-faza mobila, fiecarui component ii corespunde o anumita
valoare Rf :
Aceasta se defineste ca fiind raportul dintre distanta migrata de component h, masurata de la
linia de start pana la centrul spotului si distanta migrata de eluent H, masurata de la linia de start
pana la linia de front (fig.1.).

Figura 1. Marimi caracteristice cromatografiei pe strat subtire.

Marimea Rf ia valori intre 0 - 1. O valoare egala cu zero respectiv o distanta migrata nula
semnifica o interactiune puternica intre component si faza stationara. In cazul in care marimea
Rf ia valoarea 1 are loc o deplasare in front a componentului.

2.2. Procesul elementar de separare

Separarea cromatorafică a componenților unei probe are loc ca urmare a echilibrelor ce se

realizează la interfața faza mobilă - faza staționară. Curgerea fazei mobile peste faza staționară se
realizează în condițiile unei suprafețe foarte mari a interferenței dintre cele 2 faze. Acest fapt se
concretizează în multiplicarea echilibrelor între cele 2 faze de un număr foarte mare de ori.

În funcție de polaritatea relativa a fazei staționare față de faza mobila avem:

cromatografie cu faze directe: cand faza staționară este mai polară decât faza mobilă,

cromatografie cu faze inverse: faza mobilă este mai polară decât faza staționară.

Procesul elementar de separare este dictat de interactiunile dintre cele doua faze. Astfel,
daca faza staționară este silicagelul, iar faza mobilă un solvent sau amestec de solvenți organici
nepolari, separarea are loc o printr-un proces de adsorbție-desorbție a moleculelor solventului
respectiv componentului. Utilizând aceeași fază staționară, dar un solvent organic polar capabil
de a forma punți de hidrogen (alcooli, acizi) sau amestecuri ai acestora cu diferite cantități de
apă, suprafața silicagelului se va îmbrăca cu un film de lichid, cu proprietăți diferite de cele ale
fazei mobile. În acest caz componenții se vor separa pe baza unui proces de repartiție între două
faze lichide nemiscibile. Utilizând ca faza staționară silicagelul chimic modificat și ca faza
mobilă un solvent organic sau amestecuri fără apă procesul de separare va fi tot de repartiție. În
cazul în care faza mobilă conține apă, mecanismul de separare este unul special, bazat pe
interacțiuni hidrofobe.

3. FAZA STAȚIONARĂ

Alegerea unei anumite faze staționare presupune a gasi raspunsul la întrebarile:

Care sunt proprietățile compușilor probei?

Care ar fi cel mai potrivit mecanism de separare?

 Pentru a raspunde la primul punct este necesar sa se cunoască măcar aproximativ
structura substanțelor de separat, respectiv polaritatea lor si masa lor moleculară. Pentru
substanțe nepolare se recomandă adsorbenți polari, alumina si silicagelul adecvate
(cromatografie de adsorbție); pentru substanțe polare se recomandă adsorbenți mai puțin activi,
silicagelul dezactivat cu apa sau chimic modificat, poliamida, celuloza etc., în timp ce
substanțele ionizabile se separă pe schimbători de ioni. În cazul când componentele sunt de
aceeasi clasă, diferind foarte puțin în ceea ce privește natura gruparilor polare (serii omoloage) se
preferă cromatografia de repartiție. Când substanțele din amestec diferă prin natura grupărilor
funcționale sau prin structură se preferă cromatografia de adsorbție. Când substanțele diferă prin
dimensiunea moleculelor se alege un material de strat care sa permită ecluziunea sterică în
domeniul respectiv de mase moleculare sau se face uz de cromatografia prin precipitare.

În alegerea adsorbentului și a liantului trebuie sa se țină cont de metoda de vizualizare

folosită. Ca materiale granulare pentru conofectionarea straturilor subțiri pot fi utilizate în
principiu oricare din substanțele solide puțin solubile în eluentul utilizat, având o granulație
suficient de mică pentru o adsorbție suficientă, dar destul de mare pentru a se asigura o viteză de
migrare rapidă. Distribuția granulometrică nu trebuie sa fie prea largă pentru a se realiza straturi
uniforme.

Cea mai utilizată grosime a straturilor subțiri este de 0,25 mm si 0,3 mm, pentru scopuri
analitice, iar pentru cele preparative se utilizează și straturi de 0,5 mm sau 1-2 mm si chiar mai
groase. În scopuri analitice, au apărut o serie de plăci cromatografice cu grosimea stratului și
dimensiunea particulelor mult mai mici, cu performanțe ridicate în separarea probelor complexe
- HPTLC. În ultima perioadă în loc de straturile pe bază de granule s-au introdus straturile
monolitice de silicagel -UTLC, caracterizate printr-o viteză mare de separare.

Modificarile materialelor obișnuite de strat prin impregnare cu diverse substanțe sau chiar
amestecuri de doua materiale se face numai atunci cand celelalte metode nu duc la rezultate
potrivite, sau pentru a usura punere in evidenta a zonelor.

Pentru alegerea celor mai bune condiții de lucru, de cele mai multe ori, se recurge la
schema dată de Stahl (fig. 2.).

Triunghiul se asează cu un varf în dreptul proprietății celei mai importante a probei, la

celelalte 2 vârfuri se citesc condițiile pentru faza staționara si faza mobilă.
Figura 2. Schema lui Stahl pentru alegerea condițiilor potrivite pentru separarea prin
cromatografie pe strat subțire de adsorbție / repartiție.

Cele mai larg folosite faze staționare sunt silicagelul, silicagelul chimic modificat (C18) si
alumina. Pe langă acestea se mai utilizează si poliamida, kiselgurul, oxidul de magneziu, florisit,
geluri, etc.

1. Silicagelul

Silicagelul este în momentul de față materialul de strat cel mai des folosit datorita faptului
ca poate fi utilizat pentru toate tipurile de componenti: acizi, bazici, neutri, polari si nepolari.
Proprietatile unui sort de silicagel cromotografic depind de: compozitia granulometrică,
suprafața specifică, puritate, diametrul mediu, forma si distributia porilor, precum si de procentul
de apa continut in strat. Silicagelul are in mod obisnuit un pH acid, dar de obicei acesta este
corectat la PH ≈ 7. Se utilizeaza in practica si silicageluri acide sau bazice.

Dupa Stahl, silicagelul utilizat in cromatografia pe strat subtire trebuie sa aiba granulatia
cuprinsa intre 10 – 40 μ.

O alta caracteristica de baza a silicagelului este structura poroasa, care determina atat
marimea suprafetei cat si mecanismul de separare. Astfel, daca porii sunt fini, suprafata va fi mai
mare, incat in cazul moleculelor mici se va obtine o rezolutie mai buna. Componentele cu
molecule mari vor fi separate mai bine pe silicagelul cu pori mari.

Suprafata specifica a silicagelului utilizat in cromatografia pe strat subtire poate avea

valori foarte diferite, intre 10 m2/g pana la 1000 m2/g in functie de componentele de separat. Cele
uzuale pentru cromatografie cu suprafata specifica intre 300-600 m2/g.

Silicagelul activat nelegat, este privit ca cel mai polar adsorbant disponibil, prezentand ca
interactiune principala interactiunea polara iar ca interactiune secundara cea de schimb cationic.
Particulele de silicagel pot fi privite ca si polimeri ai acidului silicic, constand din tetraedre de
SiO4 legate. Activitatea suprafetei de silicagel a fost exprimata in mai multe moduri :
 prin intermediul gruparilor OH legate de scheletul de SiO2 ;

datorita apei adsorbite pe suprafata SiO2.

S-a aratat ca, grupele silanol de pe suprafata silicagelului sunt centrii pe care se adsorb,
prin intermediul puntilor de hidrogen, apa și multe alte molecule organice polare ce conțin
oxigen. A fost demonstrat că pe suprafața silicagelului există grupări OH care prezintă un
caracter mai acid decat gruparile OH ale silanilor alifatici. Proprietatile gruparii OH sunt
dependente de modul lor de distribuție. Pe suprafață, oxigenul poate fi sub forma gruparilor
silanol (Si-OH) sau a punților siloxanice (Si-O-Si). În funcție de reactivitatea lor grupele silanol
pot fi clasificate în grupe izolate, când atomul de siliciu are trei legături în faza de volum a
adsorbantului și o valență ocupată de o grupare OH. Aceste grupe pot fi libere sau legate prin
punți de hidrogen de moleculele de apă care se adsorb pe suprafață ; grupe silanol
vicinale (reactive) cind doi atomi de siliciu vecini contin fiecare cate o grupare OH care sunt
suficient de apropiate pentru a forma punți de hidrogen. Grupările geminale constau din 2 grupe
OH atașate la un singur atom de siliciu. Punțile siloxanice provin în urma deshidratării la 900 K
a grupelor silanol vicinale. Puterea relativa a acestor grupe (Fig. ) ca și centre de adsorbție este:
legat < libere < geminale < reactive.

Fig. Tipuri de grupari

silanol.

Apa este legată de

suprafața silicagelului atât ca
și apa ”capilară” cât și ca apa
asociata grupărilor hidroxil de pe suprafață. Primul tip de apa, fiind fizic adsorbită poate fi
îndepartată prin încalzire la 105 0C. Cel de-al doilea tip legată de suprafață de silicagel prin punți
de hidrogen poate fi îndepartată prin încalzire la 120-180 0C. Cu cât procentul de apă adsorbită
pe suprafață este mai mic cu atât activitatea este mai mare.

2. Alumina

Alumina este oxidul de aluminiu hidratat Al2O3·nH2O, unde n variaza intre 0- Activitate
adsorbantă și catalitică prezintă numai g-alumina, care se produce prin descompunerea termica
controlata (700-11000C) a gibbsitei si a böhemitei. Are polaritatea asemanatoare silicagelului dar
chimia suprafetei este diferita avand o concentratie mica de centri activi de tip acid Brönsted si
un numar mare de centri activi tip acid sau baza Lewis. Cu cresterea temperaturii de calcinare
centri de tip Brönsted se transforma in centri de tip Lewis. Centri Lewis acid se manifesta prin
acceptarea unei perechi de electroni. Continutul total de grupe hidroxil pentru g-alumina este de
3mmol/m2. Datorita prezentei oxidului de sodiu, g-alumina are caracter bazic dobandind
proprietati schimbatoare de cationi. Alumina bazica, prin neutralizare poate fi transformata in
alumina neutra sau chiar acida (Fig.4.). Alumina acida are proprietati schimbatoare de de anioni.
 Suprafata specifica a aluminei variaza intre 50-200 m 2/g, retinand preferential compusi
organici nesaturati si aromatici. Retentia compusilor organici cu caracter acid sau bazic poate fi
controlata prin intermediul naturii aluminei (pH).

Fig. 4. Tipuri de alumina.a)-

alumina acida ; b)- alumina
neutra ; c)- alumina bazica

Alumina sau oxidul de aluminiu este un adsorbant mai puternic decat silicagelul,
prezentand un efect catalitic. Componentii cu caracter acid (pH < 5) sunt retinuti ireversibil.
Exceptând hidrocarburile alifatice toate substanțele organice separate prin cromatografie sunt
adsorbite intr-o masura mai mare sau mai mica pe alumină. Pentru separarea substantelor cu
caracter acid se poate utiliza alumina acidă (a), iar pentru substanțe cu caracter bazic, alumina
bazica (b). Există și alumina neutră (c).

Straturile subțiri uzuale sunt cele de 0,2-0,3 nm grosime, care dau si o rezoluție optimă.
Electrolitic s-a reușit să se obțină straturi de 6 μm pe foi de aluminiu si care conferă eficiență și
sensibilitate ridicată analizei.

Alte faze staționare

Poliamida are numeroase aplicații în separarea de substraturi polare cum ar fi flavonele,

fenolii, esterii, aminoacizii, nitroderivatii etc.

Kiselgurul este de fapt un pământ diatomitic purificat, tratat termic și adus la granulația
corespunzatoare utilizării în straturi subțiri (10-40 μ). Kisegurul se utilizează ca aditiv pentru
marirea vitezei de migrare pentru unii adsorbenti fini (MgO, carbuni etc) ca suport pentru faze
stationare lichide, pentru micsorarea activitatii unei alte faze stationare.

Oxidul ce magneziu hidratat si hidroxidul de magneziu se folosesc in separarea computilor

naturali, de exemplu: lipide, steroide, carotinoide etc.

Florisitul este un adsorbent acid, intermediar intre alumina si silicagel, avand o tendinta
mai redusa de a cataliza unele reactii.

Gelurile se folosesc in cazul excluziunii sterice, hidroxidul de calciu, s-a folosit pentru
separarea carotinoidelor, zaharul pudra este un adsorbent bun pentru clorofile si compusi
asemanatori, folosit la separarea derivatilor hidroxilici.
4. FAZA MOBILĂ

Alegerea fazei mobile pentru o separare dată constituie etapa cheie în vederea realizării
unei bune separări în cromatografia pe strat subțire. Ca și fază mobilă se folosesc o serie de
solvenți organici sau amestecuri ale acestora.

Pentru ca un solvent să poată fi utilizat ca fază mobila trebuie să îndeplineasca

urmatoarele condiții: tărie proprie εo, vâscozitate scăzută, compatibilitate cu sistemul de detecție,
stabilitate și compatibilitate cu adsorbentul, volatilitate pentru a facilita recuperarea
componentului, să fie uzual, ușor de purificat și ieftin.

În privința alegerii celui mai potrivit solvent, de mare utilitate este seria eluotropă. Pentru
silicagel există urmatoarea serie eluotropă, valorile din paranteza reprezentand tăria eluentului
(εo): hexan, eter de petrol(0,00), ciclohexan(0,03), tetraclorura de carbon(0,14), toluen(0,22),
benzen(0,25), cloroform(0,31), eter etilic(0,39), acetat de etil(0,45), acetonă(0,43), alcool n-
propilic(0,63), etanol(0,68), metanol(0,75), apa(mare). Prin combinarea solvenților de mai jos în
diferite proporții, se pot obține amestecuri de solvenți de tărie egală.

Selectarea sistemului de solvenți se face în funcție de natura polarității compușilor de

separat și al gradului de activitate al adsorbantului.

De mare utilitate este clasificarea în opt grupe a solvenților făcută de Snyder (tab.).

Tabelul Solvenți utilizați în cromatografia pe strat subțire

Grupa Solvent Taria solventului P

n-Hexan

Eter n-butilic

I Eter diizopropilic

Eter metil-tertbutilic

Eter dietilic
n-Butanol

2-Propanol

II 1-Propanol

Etanol

Metanol
III THF (tetrahidrofuran)

Piridina
 Metoxietanol

Dimetilformamida
IV
Acid acetic

Formamida

Diclorometan
V
1,1-Dicloroetan
Acetat de etil

Meti-etil cetona

VI Dioxan

Acetona

Acetonitril
Toluen

VII Benzen

Nitrobenzen
Cloroform

VIII Nitrometan

Apa

Astfel, Snyder clasifică solvenții pe baza capacităților lor de acceptor de proton (X e),
donor de proton(Xd) si a interacțiunii de dipol (Xn) – unde Xe , Xd si Xn reprezintă parametrii de
selectivitate calculați pentru etanol, dioxan, respectiv nitrometan – și a caracterizat selectivitatea
lor prin intermediul unei diagrame triunghiulare, în care solvenții sunt împărțiți în opt grupe, pe
baza proprietăților lor fizico-chimice. Solvenții din aceeasi grupă prezintă aproximativ
interacțiuni similare.

Pe de altă parte, există o scară a polarității și în rândul diferitelor clase de compuși după
cum urmează: hidrocarburi<esteri<cetone<amine<alcooli<acizi.

În cazul compușilor nepolari se vor alege solvenți nepolari și adsorbent cu activitate

ridicată. Pentru compușii polari se vor utiliza solvenți polari și adsorbenți cu activitate scazută.
5. APARATURA FOLOSITĂ ÎN CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBȚIRE

5.1. Dispozitive pentru aplicat probe

Modul de aplicare a probelor depinde de tipul analizei. În cazul analizei calitative probele
se aplică sub formă de spot. În cazul analizei cantitative probele se aplica sub forma de benzi
scurte sau spoturi cu microcapitare calibrate sau microseringi. Pentru scopuri preparative se
recomanda aplicarea probelor sub forma unor benzi lungi pe toata latimea placii. Aplicarea
probelor se face cu manual, cu dispozitive semiautomate sau cu aparate automate.

1. Dispozitive manuale de aplicat probe. Cele mai simple dispozitive de aplicat probe sunt
microcapilarele care pot fi confectionate in orice laborator si micropipete gradate (1μl, 2µl,
5µl, 10µl si 20µl). De asemenea pentru aplicarea probelor sub forma de spot se pot utiliza
microseringi.

2. Dispozitivul automat pentru aplicarea spoturilor. Spoturile sunt aplicate automat, de un

dispozitiv controlat de un microprocesor. Se poate fixa astfel cantitatea de proba care trebuie
aplicata, tipul aplicarii (banda sau spot), distanta de aplicare, atat fata de marginea inferioara
cat si distanta dintre spoturi. O facilitate deosebit de importanta pe care o asigura aceste
aparate este aplicarea in ciclii a probei. Intre ciclii solventul este evaporat cu ajutorul unui
curent de aer.

5.2. Tehnici de developare

Developarea este operatia prin care componentii probei se separa unii de altii, datorita
interactiunilor diferite pe care acestia le realizeaza atunci cand sunt purtati de-a lungul fazei
stationare de catre faza mobila. In urma acestei operatii se obtine cromatograma, care in cazul
cromatografiei pe strat subtire este o succesiune de spoturi. Cromatografia pe strat subtire
conventionala implica o singura developare intr-un sistem de solventi adecvat. Aceasta se
realizeaza prin introducerea placii in eluent, care este apoi lasat sa migreze suficient de departe
pe placa pentru a obtine separarea dorita. Aceasta procedura simpla este adesea insuficienta cand
este necesara separarea amestecurilor complexe si in special cand componentii acopera un
domeniu larg de polaritati. Pentru solutionarea acestor probleme s-au pus la punct mai multe
tehnici: developarea liniara sau circulara. Developarea liniara se poate realiza in mai multe
variante: continua; multipla, bidimensionala. Developarea se poate realiza la presiune normala
sau sub presiune (OPTLC). De asemenea poate implica operarea manuala sau automatizata [55].

a) Developare simpla

Pentru developarea continua solventul este lasat sa avanseze pe o distanta fixata pe placa,
moment in care este evaporat continuu. Tehnica exploateaza faptul ca in cromatografia pe strat
subtire viteza de migrare a fazei mobile este invers proportionala cu patratul distantei strabatute.
Realizarea unei distante de developare scurte unde viteza solventului este mai mare, permite ca
separarea sa fie rapid obtinuta, in special cand este utilizata in crogmatografia pe strat subțire de
înaltă performanță (HPTLC).
b) Developare multiplă

In developarea multipla, placile sunt repetat redevelopate in acelasi sistem de solventi sau in
sisteme diferite. Daca placa este redevelopata cu acelasi sistem de solventi, se obtine doar
cresterea valorilor Rf , iar daca placa este redevelopata cu sisteme diferite de solvenți, se va
obține o îmbunatățire a separării. Între developări, placa este scoasă din cuva de developare și
solventul îndepărtat prin uscare.

c) Developarea multiplă programată

Developarea multiplă se realizează cu aparate automate de developat. Placa este developată cu

solvenți diferiți ca si compoziție pe distanțe de migrare crescatoare. Între developări, placa este
uscată.

d) Developarea bidimensională

Pe placa, pe linia de start, se aplica un spot si se developează cu eluentul dat, apoi placa se usucă,
se intoarce cu 900, noua linie de start fiind linia de separare a primului spot. Daca developarea se
realizeaza cu același eluent atunci spoturile compușilor separați vor fi plasati pe diagonala placii.
Rezultate mai bune se obțin în cazul în care se utilizează sisteme diferite de developare, cel de-al
doilea fiind mai polar.

e) Developare circulara si anticirculara

In developarea circulară solventul este alimentat în centrul plăcii și migrează către

exteriorul acesteia. Proba de analizat este dispusă într-un cerc de jur imprejurul locului de intrare
al solventului. Dupa developare compușii separați se vor dispune in cercuri concentrice. Intre
valoarea Rf din developarea liniară și cea circulară există relația:

In developarea anticirculara migrarea solventului se face de la marginile placii catre

interiorul acestora, spre centru. Proba este aplicata intr-un cerc de raza mai mica decat aceea a
liniei de alimentare a solventului.

f) Developarea sub presiune (OPTLC)

In multe separari pe strat subtire, placa este expusa vaporilor solventului in care este
developata cu consecinte considerabile pentru cromatografie. Acest inconvenient este inlaturat in
developarea sub presiune. Stratul subtire este acoperit cu ajutorul unei presiuni externe, astfel
este eliminat spatiul vaporilor de deasupra placii.
5. Camerele cromatografice pentru developari pe strat subtire

In analiza cromatografica pe strat subtire se disting doua tipuri principale de camere

cromatografice: camerele normale (N) si camerele sandwich (S).

a)      Camera cromatografica normala (N) pentru developarea ascendenta. Cele mai uzuale
camere sunt cele propuse de Stahl, avand forma paralelipipedica, inchise cu un capac slefuit pe
margini. Camerele pot avea diferite dimensiuni functie de dimensiunile placii cromatografice:
(pentru placi de 20×20 cm si 20×10 cm). De regula camerele cromatografice sunt construite din
sticla, material inert pentru toti solventii utilizati in cromaotgrafia de lichide. Cu aceeasi eficienta
pot fi utilizate vase din sticla cilindrice, de dimensiuni adecvate placilor utilizate. Placa
cromatografica este rezemata de peretii vasului (fig.5.a).

a      b

Figura 5. Camera de developare normala N (a) si S

(b) : 1) placa de strat subtire, 2) placa de sticla, 3)
clema, 4) invelis dublu de otel inoxidabil, 5) solvent, 6)
suport.

b)      Camera Sandwich (S). O astfel de camera se

compune din doua placi suprapuse (fig.5.b):

o placa cromatografica obisniuta, care pe trei margini are faza

stationara razuita

o contra-placa de sticla, care pe trei laturi are lipita o rama de sticla.

Prin suprapunerea celor doua placi se formeaza o camera de developare cu dimensiuni

foarte mici, a carui pereti sunt formati din placa cu strat subtitre si contraplaca. Cele doua placi
sunt mentinute in contact cu ajutorul a doua cleme fixatoare. Intrge anasamblul este introdus intr-
o cuva avand capacul perforat, astfel incat placile sa ajunga in solvent. Clemele de fixare au si
rol de sprijin.

Caracteristica principala care diferentiaza camerele cromatografice este volumul lor,

respectiv distanta dintre stratul subtire si peretele camerei. Astfel, camerele de tip N au un volum
mare, respectiv o distanta strat-perete mai mica de 3 mm, comparativ cu camerele S care au un
volum mic, respectiv o distanta mai mica de 3 mm.

5.4. Vizualizarea

Vizualizarea este etapa din analiza cromatografica prin care sunt puse in evidenta spoturile
compusilor separati [56, 57.].

In cazul in care componentii sunt colorati, respectiv absorb radiatia din domeniul vizibil
al spectrului electromagnetic, nu este necesara o tehnica speciala de vizualizare, utilizanduse o
placa normala si inspectarea se realizeaza in lumina alba.
 Pentru compusii care nu prezinta absorbanta in domeniul vizibil se pot utiliza placi
fluorescente, care au inglobat in stratul subtire un luminofor. O astfel de placa privita UV (254
mm) se prezinta ca un „ camp “ fluroscent (galben verzui, roz sau albastru deschis) iar spoturile
componentului apar ca pete de culoare inchisa nefluroscente – metoda de vizualizare fiind
cunoscuta sub numele de stingerea fluroscentei. In multe cazuri vizualizarea se realizeaza prin
pulverizarea pe suprafata placii a unui reactiv de culoare, specific componentului de interes.

Daca compusul analizat prezinta fluorescenta atunci se folosesc placi normale,

inspectarea realizandu-se in lumina UV, la 254nm respectiv 366nm.

5.5. Fotodensitometrarea

Cromatograma obtinuta in urma develorparii poate furniza informatii de natura calitativa si in

unele cazuri, prin compararea marimii spoturilor sau a intensitatii coloratiei, informatii
semicantitative. In vederea efectuarii analizei cantitative este necesara ridicarea
fotodensitogramei, respectiv transformarea spoturilor in picuri cromatografice.

Procesul se bazeaza pe absorbtia radiatiei electromagnetice de o anumita lungime de

unda de catre componenti, intr-un rapot proportional cu concentratia componentului in spot.
Astfel, o parte din intensitatea radiatiei incidente este absorbita iar cealalta reflectata sau
transmisa, deci absorbanta poate fi masurata in cele doua moduri (fig.6.a, b):

- Reflexie
- transmitanta.

Ca linie de baza se considera absorbanta fondului placii. Bazei picului cromatografic ii

corespund zonele marginale ale spotului unde concentratia componentului este mica iar varful
picului cromatografic corespunde centrului spotului (fig.6.c.).
Figura 6. Principiul fotodensitometrarii. a) reflexie ; b) transmisie ; c) obtinerea picului
cromatografic

La ora actuală există în comerț fotodensitometre total computerizate echipate cu softuri

speciale de prelucrare a fotodensitogramelor obtinute.

6. ANALIZA CALITATIVĂ

In cazul in care compusii sunt colorati sau in urma pulverizarii rezulta compusi colorati,
identificarea se poate face si pe baza culorii colerata cu valoarea R f-ului. Identificarea se poate
realiza si pe baza spectrului de absortie in UV-VIS in situ, direct de pe placa. Dupa separare
“spotul poate fi decupat” si componentul poate fi transferat in solutie, identificarea relizandu-se
prin alte metode: spectru UV, IR, MS etc [58].

7. ANALIZA CANTITATIVĂ

In cazul cromatografiei pe strat subtire determinarile cantitative se pot realiza atat direct pe
placa prin fotodensitometrare in UV-Viz - determinare in situ, cat si prin elutia prin diverse
metode a compusului de pe placa urmata de determinarea cantitativa printr-o metoda
instrumentala potrivita - tehnici de transfer. Cea mai uitlizata metoda este cea de determinare in
situ, deoarece sunt evitate pierderile de substanta care pot avea loc in timpul transferului.

Fotodensitograma obtinuta este prelucrata in acelasi mod ca si cromatogramele din

cromatografia de lichide.

In cazul cromatografiei pe strat subtire pentru determinarea cantitativa se prefera

utilizarea curbei de calibrare. Aria picurilor de interes se determina automat prin programul cu
care este echipat fotodensitometrul. Analiza cantitativa decurge in doua etape:

- obtinerea ecuatiei curbei de calibrare A= f (m) unde A= aria picului cromatografic

corespunzator unei cantitati de compus data –m.
 - pe baza ariei picului cromatografic corespunzator compusului din proba necunoscuta si
pe baza ecuatiei de regresie se determina cantitatea de compus din spot.

8. ANALIZA COLORANTILOR ALIMENTARI SINTETICI

Alaturi de metodele spectrofotometrice, colorantii alimentari sintetici pot fi analizati si

prin metode cromatografice, cum ar fi cromatografia de lichide de inalta performanta cu formare
de perechi de ioni, cromatografia de schimb ionic si electroforeza. Cromatografia pe strat subtire
ocupa un loc important in identificarea si dozarea colorantilor alimentari sintetici, in literatura de
specialitate existand o serie de articole care trateaza pe larg aceasta tema.

Cele mai utilizate faze stationare sunt cele de silicagel. Sistemele de developare variaza foarte
mult, putandu-se folosi atat amestecuri de natura anorganica cat si organica, cum ar fi:

amoniac (d = 0,88) - apa (1:99, v/v),

clorura de sodiu solutie apoasa 2,5 %;

clorura de sodiu 2 % in alcool etilic 50 %

apa - acid clorhidric (d = 1,18) (30:6,5, v/v)

se dilueaza 5 ml amoniac 0,88 la 100 ml cu apa si apoi se dizolva 2 g citrat trisodic ;

izobutanol - etanol - apa (3:2:1, v/v) ;

n-butanol - apa - acid acetic glacial (20:12:5, v/v)

izobutanol - etanol - apa (3:2:2, v/v) ; apoi la 99 ml amestec se adauga 1 ml amoniac

(d = 0,88) ;

etil-metil-cetona - acetona - apa - amoniac (d = 0,88), (350:150:150:1, v/v)

etil-metil-cetona - acetona - apa (7:3:3, v/v) ;

acetat de etil - piridina - apa (11:5:4, v/v).

Confirmarea identitatii colorantilor separati se realizeaza prin comparatia valorilor

Rf (tab. 4.) si a spectrelor in vizibil ridicate in-situ.

Separarea colorantilor alimentari sintetici s-a realizat si prin alte mecanisme decat cele de
simpla repartitie. Astfel placile de silicagel au fost impregnate cu bromura de cetiltrimetilamoniu
(CTMA) iar ca faza mobila s-a utilizat sistemul metanol-acetona (9:1) + acid acetic glacial 1%.
 O altă posibilitate de separare se bazeaza pe interactia colorantului anionic cu un ion
metalic, impregnat anterior pe placa cromatografica de silicagel. Astfel Srivastava si colab.
utilizeaza o solutie de acetate de cadmiu 5% pentru impregnare si doua sisteme de faza mobila :
butanol-benzen-acetat de etil (40:35:25, v/v) sau n-butanol-apa-acid formic (35:10:5, v/v). Într-o
alta varianta, acelasi autor, utilizeaza pentru impregnare un amestec de molibdat de amoniu si
sulfat de cupru, developarea realizandu-se cu sitemul butanol-amoniac 50%-dioxan (25:5:10,
v/v).

În ultima perioada, ca alternativa a analizei cantitative prin fotodensitometrare, a fost

folosita videodensitometrarea, cromatogramele obtinute pot fi captate electronic si apoi
interpretate cu ajutorul unor softuri special proiectate. De asemenea utilizand tehnici moderne de
interpretare a spectrelor in vizibil a putut fi realizata analiza calitativa si cantitativa a colorantilor
incomplet separati prin cromatografie pe strat subtire.

O alta faza stationara utilizata la separarea colorantilor prezentata in literatura de

specialitate, este celuloza. Ca faze mobile a fost utilizat sistemul etanol-butanol-piridina-apa
(1:7:6:6) sau acetate de etil-butanol-piridina apa (5:5:6:5).

Placile de alumina au fost developate cu sistemul de faza mobila metanol - amoniac (8:2, v/v).

Au fost utilizate de asemenea si placi de poliacrilonitril utilizandu-se mai multe sisteme

de developare: dietilamina - acid acetic glacial - apa (20:5:75, v/v), piridina - acid acetic glacial -
apa (20:5:75, v/v), etanol - acetat de zinc - apa (20:1,8:80) si dietil amina - acid acetic glacial -
etanol apa (20:5:20;55, v/v)

O alta faza stationara este poliamida, faza mobila utilizata fiind un amestec de metanol-
etanol-alcool izoamilic- amoniac 25% (15:10:5:3, v/v).

Separarea colorantilor alimentari sintetici a fost realizata de asemenea si prin

cromatografie pe strat subtie pe faza inversa RP-18. Ca faze mobile au fost utilizate sistemele:

solutie apoasa Na2SO4 5%-metanol-acetonitril (10:3:3, v/v) sau Na2SO4 5%-metanol-etil

metil cetona (1:1:1, v/v), metanol-apa (17:3).

O altă modalitate de separare a coloranților alimentari sintetici se bazează pe impregnarea

prealabila a placii de Sil –C18 cu o soluție metanolică de bromură de tetrabutilamoniu, urmată de
separarea analitilor cu o soluție apoasă de metanol 80% ca fază mobilă.
 BIBLIOGRAFIA
1. Harry W. Lewis & Christopher J. Moody (13 d.Hr.). Experimental Organic Chemistry:
Principles and Practice (ed. Illustrated). WileyBlackwell;

2. A.I. Vogel; A.R. Tatchell; B.S. Furnis; A.J. Hannaford; P.W.G. Smith. Vogel's Textbook of
Practical Organic Chemistry (ed. 5th);

3. I. Jianu, E. Alexa, Cromatografia pe strat subţire în analiza şi controlul produselor

agroalimentare, Ed.Eurobit, Timişoara, 1998;

4. P. Bodoga, C. Mărunţoiu M. Coman, Cromatografia pe strat subţire, Ed. Tehnică, Bucureşti,

1995;

5. B. Kolb, „Gaschromatographie in Bildern“, Friedr.Vieweg & Sohn,

Braunschweig/Wiesbaden, Germania, 1999;

6. S. Gocan, “Cromatografia de inalta performanta”, Ed. Dacia, Cluj Napoca, 1998;

7. Peter J. Baugh, „Gaschromatographie“, Friedr.Vieweg & Sohn, Braunschweig/Wiesbaden,

Germania, 1997;

8. Victor David, Andrei Medvedovici, Metode de separare ți analiză cromatografică, Editura

Universității din București, Bucureşti, 2008;

9. Thomas Dippong, Cristina Mihali, Analiza fizico-chimică a alimentelor utilizand metode

instrumentale de analiză, Editura Risorpint , Cluj Napoca , 2015;

10. https://ro.wikipedia.org/wiki/Cromatografie_pe_strat_sub%C8%9Bire.