2.

CROMATOGRAFIA

Cromatografia este o metodă identificare, purificare si dozare a compuşilor, bazata pe

separarea intre doua faze, una stationara (care poate fi solida sau lichida) si una mobila (care poate fi
un gaz sau un lichid).
Ea a fost inventata in 1906 de catre cercetatorul rus Mikhail Tsvet in timpul cercetarii sale
asupra clorofilei din plante. Abia dupa aproximativ 25 ani cromatografia a fost recunoscuta ca tehnica
si de ceilalti cercetatori si a inceput sa se dezvolte.
Tehnicile cromatografice operează pe baza diferenţelor între masa moleculară, încărcarea
electrică, conformaţia, solubilitatea compuşilor sau proprietăţile lor de afinitate, utilizând ca suport de
separare un mediu potrivit, cu proprietăţi caracteristice.
Datorită marii sale puteri de rezoluţie cromatografia se utilizează la obţinerea substanţelor
foarte pure justificând certificatul de calitate de "substanţă cromatografic pură”. Un alt mare avantaj al
cromatografiei este sensibilitatea sa deosebită, prin analiza cromatografică putându-se detecta cantităţi
infime de substanţe până la ordinul nanogramelor.
Tehnicile cromatografice diferă în funcţie de scopul urmărit. Când se doreşte izolarea şi
purificarea unor compuşi se preferă separarea cromatografică pe coloană, în timp ce separările în scop
analitic se realizează pe strat subţire, în una sau două dimensiuni.

Clasificarea metodelor cromatografice

Tehnicile cromatografice se pot clasifica în funcţie de tipul fazei mobile folosite.

1. faza mobilă este un gaz - vom avea gaz cromatografie

2. faza mobilă este un lichid - vom avea lichid cromatografie.
3. faza mobilă este un lichid care este adus aproape de temperatura critica (si din acest
motiv nu se poate spune clar daca faza mobila este gaz sau lichid) – vom avea
cromatografia fluidelor supercritice (SFC).

Gaz cromatografia (GC)

Se aplică compuşilor organici volatili sau care prin derivatizare se pot transforma în compuşi
volatili. Dacă faza staţionară (depusă pe o coloană capilară) este un lichid vom avea gaz-lichid
cromatografie sau, dacă faza staţionară este un solid vom avea gaz-solid cromatografie.
Este foarte mult folosit în laboratoarele de criminalistică pentru analiza urmelor de sânge,
urmelor de droguri din sânge, rezidurilor provenite de la explozivi, etc dar şi a compuşilor volatili din
plante, a monozaharidelor, principiilor active din medicamente, etc.

Lichid cromatografia (LC)

1. Cromatografia pe coloană

Este una din tehnicile de separare cele mai utilizate în biochimie. Această metodă permite, de
exemplu, separarea proteinelor în funcţie de mărimea macromoleculelor. Obţinerea proteinelor în
stare pură este necesară pentru elucidarea structurii lor tridimensionale a proprietăţilor şi a
mecanismului lor de acţiune. Proba supusă separării este trecută printr-o coloana cromatografică ce
conţine un gel (în cazul cromatografiei de excludere), un material anorganic absorbant (în cazul
cromatografiei de adsorbţie) sau o răşină schimbătoare de ioni (în cazul cromatografiei de schimb
ionic).
Principiul separării pentru fiecare dintre variante este descris, pe scurt, în cele ce urmează.

Cromatografia de excludere moleculară (gel-filtrarea) se bazează pe diferenţele între

dimensiunile moleculelor din amestec. Gelul cu care este umplută coloana se comportă ca o "sită
moleculară" care permite o deplasare diferenţiată a moleculelor prin gel, în funcţie de mărimea lor. În
lichidul care părăseşte coloana (în eluat) apar întâi moleculele cu dimensiuni mari şi doar mai târziu
cele cu dimensiuni mici.

Figura II. 2.1. Separarea moleculelor prin cromatografie de excludere moleculară

Figura II.2.2. Separarea moleculelor prin cromatografie cu schimbatori de ioni

Moleculele mici pot difuza în lichidul din interiorul particulelor de gel şi astfel eluţia lor de pe
coloană este încetinită, moleculele mari nu pot pătrunde în particulele gelului şi deci se vor deplasa
odată cu lichidul de eluţie printre particulele gelului (figura II.2.1).

Cromatografia pe schimbători de ioni se bazează pe stabilirea unor legături ionice între

sarcinile electrice ale moleculelor ionizate din amestecul de separat şi sarcinile electrice de semn
contrar ale răşinii schimbătoare de ioni cu care este umplută coloana. Sub acţiunea unui eluant ce
conţine un ion cu afinitate mai mare pentru grupele încărcate ale coloanei, legăturile ionice dintre
răşină şi componenţii amestecului de analizat se desfac. Cu cât numărul de legături ionice dintre un
compus şi răşina schimbătoare de ioni este mai mare cu atât şi numărul de ioni competitivi din
lichidul cu care se face eluţia trebuie să fie mai mare.
Separarea diferenţiată de pe coloană a componentelor amestecului se poate realiza nu numai
prin modificarea progresivă a concentraţiei ionice a lichidului de eluţie dar şi prin modificările de pH
ale acestui lichid. Modificările de pH vor reduce numărul de sarcini electrice ale componenţilor probei
şi, în final, vor anula legăturile ionice cu coloana. Componentele eliberate vor fi antrenate de pe
coloană cu lichidul de eluţie şi vor fi colectate pe rând în eluat.
Este o tehnica utilizata adesea pentru purificarea proteinelor si analiza apei.
Cromatografia de înaltă performanţă în fază lichidă (HPLC) este un procedeu modern de
separare care prezintă o mare putere de rezoluţie şi reproductibilitate. În acest tip de cromatografie o
soluţie care conţine un amestec de compuşi ce urmează a fi identificaţi sau purificaţi este trecut printr-
o coloană umplută cu granule de diametru mic ale unei răşini insolubile. Cu cât granulele sunt mai
mici şi mai strâns împachetate cu atât rezoluţia acestei tehnici este mai mare. Materialul ce umple
coloana cromatografică este atât de dens, încât pentru a depăşi rezistenţa la curgere, soluţia trebuie
pompată prin coloana cromatografică sub presiune mare. În acest scop sunt utilizate pompe precise de
presiune mare, conducte şi coloane din metal, spre deosebire de celelalte tehnici în care materialele
folosite pentru coloane şi conducte sunt plasticul şi sticla.
 Principiile separărilor cromatografice în HPLC sunt aceleaşi ca şi în tehnicile clasice, insa ,
daca faza mobila are aceeasi compozitie pe tot parcursul determinarii se spune ca separarea se face in
regim izocrat, iar daca faza mobila are o compozitie ce se schimba pe parcursul analizei se spune ca
separarea se face in gradient. Daca faza stationara este mai polara decat faza mobila atunci vom avea
cromatografie cu faza normala, iar daca faza mobila este mai polara decat faza stationara vom avea
cromatografie cu faza inversa.
Avantajele acestei tehnici:
- coloana pentru HPLC poate fi refolosita fara a fi reumputa si regenerata ca in cromatografia
cu coloane deschise
- o foarte buna rezolutie si reproductibilitate
- parametrii ce pot afecta eficienta analizei pot fi controlati continuu
- viteza in analiza
- utilizarea unor cantitati foarte mici de proba
Cromatografia de afinitate folosită la purificarea compuşilor biochimici. De exemplu
proteinele au o mare afinitate pentru substratele lor, grupări prostetice, receptori membranari,
inhibitori specifici necovalenţi şi anticorpi specifici. Aceşti compuşi cu mare afinitate pot fi ataşaţi
covalent de o răşină insolubilă şi utilizaţi pentru a purifica o anumită proteină în coloana
cromatografică. Într-un amestec de componenţi eluaţi prin răşina, proteina de interes va fi întârziată
selectiv şi astfel separată.

2. Cromatografia pe strat subţire

Separarea pe strat subţire este comparabilă în multe privinţe cu cea pe hârtie, dar permite
folosirea unei game variate de solvenţi. Astfel, analiza va putea fi realizată prin folosirea unei faze
stationare, dispuse pe o placa speciala, pe care au loc separari prin procese de adsorbţie, schimb de
ioni, partiţie sau cernere moleculară. Tehnica este foarte rapidă şi în mai puţin de o oră se pot realiza
numeroase separări. Compuşii sunt detectabili la o concentraţie mai mică decât pe hârtie, căci
spoturile sunt mai concentrate.
Stratul subţire. Se folosesc plăci pentru cromatografie pe strat subţire cu utilizare directă care se
dovedesc a fi mai uşor de folosit decât cele realizate în laborator. Plăcile, cu suporturile dorite, sunt
furnizate de firme specializate.
Aplicarea probelor. Soluţia care conţine proba se introduce pe placă cu ajutorul unui tub
capilar. Pentru control pe marginile plăcii se pune o probă martor cu compoziţie cunoscută având
valori Rf într-un domeniu convenabil. Raportul dintre distanţa parcursă de fiecare component al
amestecului şi distanţa parcursă de solvent este valoarea R f a acelui component. Acest raport rămâne
mai mult sau mai puţin constant pentru un compus dat într-un anumit sistem solvent-suport, la o
temperatură şi un pH dat. Valoarea R f este dependentă de coeficientul de partiţie  al fiecărui compus.
Coeficientul de partiţie este definit ca raportul dintre concentraţia acelui compus în faza staţionară şi
concentraţia aceluiaşi compus în faza mobilă, la echilibru.

Figura II.2.3. Cromatografie pe strat subtire; Tanc cromatografic

 Figura II.2.4. Cromatografie pe strat subtire

Developarea. Este necesar ca atmosfera din cuva de separare să fie perfect saturată, dacă nu
valorile lui Rf pot varia de la o cuvă la alta. Pentru aceasta este preferabil să se utilizeze o cuvă mică
şi să se aplice pe pereţii săi hârtie îmbibată cu solvent.
Vizualizare şi evaluare. Placa developată se usucă în aer. Unele combinaţii incolore se pot
vizualiza prin fluorescenţă în UV. În altă variantă compuşii pot fi evidenţiaţi şi prin diverşi reactivi
corozivi şi la temperaturi ridicate ceea ce, în mod obişnuit, nu este posibil în cromatografia pe hârtie.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Experiementul nr. 1. Separarea unui amestec de aminoacizi prin cromatografie pe strat subtire
Materiale necesare:
1. Aparat pentru cromatografie – vas paralelipipedic, de sticlă, de dimensiuni 25/14/7 cm (h/L/l)
2. Placă de sticlă (capac) (15/10 cm) (L/l)
3. Placă cromatografică
4. Faza mobila alcatuita din butanol:izopropanol:acid acetic glacial
5. Soluţii etalon de aminoacizi individuali (0,01 M, în soluţii apoase sau alcoolice)
6. Amestec de aminoacizi (proba de analizat) (concentraţia aminoacizilor din amestec este
aproximativ egală cu a celor din soluţiile etalon.
7. Ninhidrină 0,2 % (în etanol 96o sau în acetonă) – soluţie revelator
8. Etuva (t ~ 80-100oC)
Aminoacizii folosiţi ca etalon depind de compoziţia calitativă a probei de analizat. Proba de
analizat poate fi (la alegere):
P1 – Leu (sau Ile) + Pro + Lys (sau Arg)
P2 – Phe + Ala + Cys

Mod de lucru
Se introduce butanolul în aparatul de cromatografie astfel încât să formeze un strat înalt de 2
cm, la partea inferioară a vasului. Pe lăţimea benzii cromatografice se trasează cu creionul o linie
“start”, la o distanţă de 3 cm de marginea inferioară a hârtiei de filtru. (se evită atingerea hârtiei cu
mâna liberă. Se lucrează cu mănuşi chirurgicale; aminoacizii din transpiraţia de pe mâini pot genera
artefacte). Pe linia de “start” trasată, în poziţii marcate cu creionul, la distanţe de 2 cm, atât faţă de
muchiile benzii cât şi între ei, se aplică soluţiile aminoacizilor etalon (ex. Phe, Ala, respectiv Cys) şi
proba de analizat (de exemplu P2).
Aplicarea soluţiilor se realizează cu micropipete, pata umedă realizată la o aplicare nu trebuie
să depăşească 0,5 cm în diametru. Dacă se doreşte “concentrarea aplicării”, se usucă pata rezultată
după prima aplicare şi apoi se repetă aplicarea (astfel diametrul “aplicării” rămâne constant).
Se usucă plăcuţa în etuvă (sau în curent de aer cald) şi se introduce apoi în aparatul de
cromatografie astfel ca marginea ei inferioară să fie imersată ~1 cm în faza mobila. Se astupă etanş
aparatul cu placa de sticlă (capacul) pe care s-a fixat prin aderenţă o hârtie de filtru obişnuită, umezită
(prin pulverizare) cu apă distilată. Se menţine plăcuţa cromatografică in aparat pană când faza mobil
parcurge ascendent aproape toata lungimea ei (aproximativ 2 ore la temperatură constantă). Prin
migrarea fazei mobile aminoacizii din amestec sunt antrenaţi şi separaţi.
Experimentul nr. 2 Separarea unui amestec de compuşi de mase moleculare diferite, prin
cromatografie de excludere moleculară (prin gel filtrare pe coloană)
Materiale necesare
1. Coloana cromatografică 1,5 x 30 cm
2. Sephadex G-75 (6 g % în NaCl 0,15 M sau în apă distilată) care reprezintă materialul
"suport" cu care se umple coloana
3. Soluţie NaCl 0,15 M pentru eluţie (varianta I de lucru)
4. Apă distilată pentru eluţie (varianta II de lucru)
5. Rezervor pentru eluant (eluent)
6. Vată de sticlă
7. Eprubete de sticlă pentru colectarea fracţionată a "eluantului"
8. Proba de analizat, la alegere:
Varianta I de lucru: 3 ml amestec de citocrom c (3 g %o) (roşu), cromat de potasiu (2 g %o)
(galben) şi Blue-Dextran (2 g %o) (albastru)
Varianta II de lucru: 3 ml soluţie de albumină 1%, precipitată cu (NH 4)2SO4, la saturaţie
9. Dispozitiv metalic pentru susţinerea coloanei şi a rezervorului pentru diluant
10. Reactivi pentru identificarea în eluat a proteinei şi a ionilor sulfat, în cazul variantei II:
ninhidrină 0,2 g % şi BaCl2 5 g %

Mod de lucru
Se îmbibă gelul prin introducerea sephadex-ului (~50 g) într-un exces de apă, apoi se diluează
corespunzător pentru obţinerea suspensiei de gel. Se fixează un strat de vată de sticlă la partea
inferioară a coloanei, deasupra tubului capilar de scurgere. Se umple coloana cu suspensia de gel. Se
conectează rezervorul cu lichidul de eluţie şi se spală coloana (se echilibrează cu lichidul de eluţie),
timp de 10-12 ore. Se îndepărtează lichidul de deasupra gelului şi se introduce proba de analizat astfel
ca ea să se dispună deasupra gelului în coloană; se deschide robinetul de scurgere a coloanei pentru ca
proba să pătrundă în gel. Se iniţiază eluţia coloanei încărcate cu proba de analizat; se stabileşte cu
ajutorul unui cronometru viteza de eluţie dorită (de ex. 60 ml/h) şi se colectează volume succesive
(fracţiuni) de eluat, de 6-10 ml, în eprubete separate. Se determină chimic sau fizico-chimic conţinutul
fiecărei fracţiuni recoltate.
Rezultate şi interpretare
In cazul variantei I de lucru se observă chiar de pe coloană separarea a trei regiuni de culori
diferite (albastru, roşu, galben) care progresează diferit spre capătul inferior al coloanei.
Conform principiului cromatografiei de excludere moleculară, compusul cu masa moleculară
cea mai mare (Blue-Dextranul) "migrează" primul de pe coloană (şi este cules în fracţiunile iniţiale)
iar cromatul de potasiu, cu masa moleculară cea mai mică, este "cules" ultimul (apare în fracţiunile
finale).
In cazul variantei II de lucru, proteina (albumina) apare în primele 3-5 eprubete, pe când ionii
sulfat apar în ultimele (6-10). Ionii sulfat, cu masa moleculară mică pot pătrunde în interiorul
particulelor de gel şi deci viteza lor de migrare în coloană este încetinită.
Din primele eprubete dau reacţie pozitivă (coloraţie violet, la cald) la tratare cu ninhidrină şi
rezultat negativ la tratare cu BaCl2 (nu precipită BaSO4).
Cu ultimele fracţii colectate de pe coloană, reacţiile de recunoaştere sunt inversate: probă
pozitivă pentru prezenţa anionilor sulfat şi probă negativă pentru proteină.
 3. ELECTROFOREZA

Molecule de dimensiuni relativ mari, precum proteinele, lipidele şi acizii nucleici, pot fi
separate cu ajutorul tehnicii electroforetice. Electroforeza este o tehnică cu o utilizare de peste 50 de
ani ce a venit în întâmpinarea cercetătorilor pentru a-i ajuta în experimente ce cuprind purificarea
proteinelor, determinarea greutăţii masei moleculare, identificarea punctului izoelectric, determinarea
activităţii enzimelor, etc.
Aşadar, această tehnică are aplicabilitate nu numai în cercetare cât şi în medicină, ea fiind
utilizată în clinică pentru separarea fracţiilor proteice şi lipidice din materiale biologice (sânge, urină,
lichid cefalorahidian, lacrimi, salivă, ţesuturi) cu scopul de a completa tablourile clinice a diverselor
afecţiuni (hepatice, infecţii virale, hemofilii, screloză multiplă, diabet, etc) .

Principiul metodei

Electroforeza este o tehnică în care biomoleculele migrează în câmp electric, având drept
rezultat separarea acestora în funcţie de sarcina lor electrică, masa moleculară şi raza particulelor.
Pentru a realiza o electroforeză calitativă trebuie luată în considerare o serie de factori: viteza de
migrare a moleculei (v), intensitatea câmpului electric în care migrează moleculele (E), încărcarea
electrică a moleculelor (z), forţa de frecare a moleculelor, vâscozitatea mediului (η), etc. Viteza de
migrare a unei molecule în câmp electric depinde de intensitatea câmpului electric (E) în care
migrează, sarcina electrică a particulei (q) şi coeficientul de frecare (f):
qE
v=
f
Forţa electrică, qE, va orienta moleculele încărcate electric către electrodul de sarcină opusă.
Coeficientul de frecare depinde de masa şi forma moleculei ce migrează. Pe lângă aceşti doi factori
este luată în calcul şi vâscozitatea mediului, deoarece în funcţie de aceasta se stabileşte tipul de
suport utilizat pentru migrare (solid, semisolid sau lichid).
Migrarea moleculelor va avea loc într-un singur sens, fie către anod (+), fie către catod (-).
Particulele încărcate pozitiv migrează către polul opus şi se numesc CATIONI, iar particulele
încărcate negativ poartă denumirea de ANIONI. Cu cât încărcarea electrică este mai mare cu atât
migrarea va fi mai rapidă. Viteza de migrare este influenţată şi de dimensiunea particulelor, astfel
încât particulele mici se vor deplasa mult mai repede comparativ cu particulele medii şi mari.
Moleculele cu masă mai mare sunt accelerate mai lent în câmpul electric comparativ cu cele mici, la
aceeaşi încărcare electrică. (Fig. II.3.1)

Figura II.3.1. Migrarea anionilor şi cationilor în câmp electric

Componentele unui sistem de electroforeză şi etapele preliminarii electroforezei.

Pentru a efectua o electroforeză sunt necesare: un suport pe care vor fi aplicate probele, un
sistem tampon, amestecul sau probele ce urmează să fie supuse migrării şi o sursă de curent. Fiecare
componentă trebuie selectată atent în funcţie de scopul experimentului. Pentru a putea urmări zona de
migrare este nevoie de un colorant sau „tracer” introdus în probele ce urmează să fie supuse
electroforezei. Colorantul are menirea de a migra cu o viteză mai mare faţă de componentele
macromoleculare ale probei, indicând momentul stopării electroforezei. In funcţie de tipul probei sunt
mai multe clase de coloranţi, astfel pentru acizi nucleici se folosesc: bromura de etidium, SYBR
Green, pentru proteine: coloraţie cu argint, albastru de bromfenol, verde de metilen, etc. Pe lângă
colorant în probele ce conţin proteine se pot introduce agenţi denaturanţi. Detergenţii (dodecil sulfat
de sodiu-SDS, NP-40, Triton X-100) au rolul de a rupe interacţiile hidrofobe, agenţii reducători
precum β-mercaptoetanol şi DTT (ditiotreitol) intervin pe legăturile sulfurice inter- si intramoleculare,
urea, tiourea şi guanidina distrug legăturile de hidrogen şi interacţiile hidrofobe atât între proteine cât
şi la nivelul structurii secundare a acestora. Dacă proteinele nu sunt supuse solubilizării există riscul
ca acestea să formeze agregate, precipitând.
Sistemul tampon este ales în funcţie de natura moleculelor. De exemplu, proteinele bazice se
vor separa eficient la un pH acid şi invers. Insă există şi excepţii şi anume două proteine de aceeaşi
dimensiune, dar cu puncte izoelectrice diferite, se vor separa cam la toate valorile de pH. La
efectuarea electroforezei se va ţine cont de tăria ionică a sistemului tampon, care trebuie să fie optimă
nemodificând conţinutul probei şi oferind o capacitate de tamponare suficientă. Cu cât tăria ionică
este mai mare, cu atât va fi mai mică rezistenţa electrică, iar curentul transportat va fi mult mai mare,
fapt ce va duce la supraîncălzirea sistemului precedată de denaturarea probelor. La aparatele de
electroforeză se poate integra un sistem de răcire cu scopul de a disipa uniform excesul de căldură.
Acest proces va avea drept efect formarea unor benzi netede, crescând calitatea separării. O soluţie
tampon cu o tărie ionică mică va permite o migrare rapidă, însă cu o calitate inferioară.
Câmpul electric este furnizat de un generator de curent continuu, cu un interval optim al
voltajului cuprins intre 5-8 volti/cm. Denaturarea probelor şi evaporarea sistemului tampon apar la un
voltaj ce depăseşte 10 V/cm.
La alegerea suportului pentru electroforeză se ia în considerare şi tipul probei ce urmează să
fie separată sau purificată. Pentru separarea proteinelor şi lipidelor plasmatice şi/sau urinare, dar şi
pentru cuantificarea hemoglobinelor sunt folosite geluri preturnate, marcate corespunzător. In
cercetare suportul este ales de cel ce întocmeşte protocolul de lucru, electroforeza fiind de cele mai
multe ori precedată de alte tehnici precum imunoblotare.
Unul dintre cele mai ieftine şi uşor de utilizat suporturi este hârtia de filtru. Cel mai mare
dezavantaj pe care acesta îl prezintă este acurateţea mică, având proprietatea de a absorbi moleculele
ce urmează să fie separate. Pe lângă acest inconvenient, mai există şi o limitare a utilizării sale fiind
propusă pentru separarea compuşilor cu molecule mici (aminoacizi, peptide şi proteine cu masă
moleculară mică). Hârtia de filtru este încadrată în categoria de suport solid alături de acetatul de
celuloză. Acetatul de celuloză oferă o separare mult mai bună comparativ cu hârtia de filtru şi pentru
că este extrem de util în identificarea gamapatiilor şi separarea hemoglobinelor, a fost adaptat şi
transformat în suport semisolid, comercializat sub formă de membrane.
Gelurile reprezintă o formă de suport semisolid, fiind folosite atât în clinică, cât şi în
cercetare. In această clasă sunt încadrate gelurile de amidon, agaroză, poliacrilamidă. Gelurile spre
deosebire de suportul solid (hârtia de filtru) sau cel lichid au avantajul de a fi adaptate în funcţie de
necesităţile cercetătorului. Fiecare gel se comportă precum o „sită moleculară”, având scopul de a
separa moleculele mari de cele medii şi mici, iar „ochiurile” acestei site pot fi mărite sau micşorate în
funcţie de amestecul ce urmează să fie separat. Pe lângă dimensiunile moleculelor, fundamentală este
şi sarcina acestora. Pentru a asigura o încărcare electrică netă, lucru ce va uşura migrarea moleculelor
într-un singur sens, proteinele vor fi denaturate prin adăugarea unor substanţe cu rol de destabilizatori
structurali.
Gelul de agaroză este un polimer constituit din galactoza, utilizat în biochimie, biologie
moleculară şi clinică la separarea biomoleculelor. Proteinele pot fi separate pe baza punctului
izoelectric pe gel de agaroză de tip IEF (isoelectric focusing), iar acizii nucleici sunt separaţi în
funcţie de lungimea fragmentelor. In clinică sunt utilizate geluri preturnate de agaroză, pe care pot fi
aplicate până la 30 de probe de la pacienţi diferiţi. Sensibilitatea electroforezei pe gel de agaroză este
relativ mare, de aproximativ 94%. Pentru separarea fragmentelor de acizi nucleici cel mai indicat gel
este cel de agaroză.
 Figura II.3.2. Gel de agaroză preturnat pentru electroforeza proteinelor plasmatice

Figura II.3.3. Reprezentarea fracţiilor proteice serice umane (valori normale)

Gelul de amidon este un gel uşor de procurat, având costuri mici, însă prezintă un dezavantaj si
anume este necesară o degazare prealabilă pentru a creşte calitatea gelurilor. Este utilizat doar pentru
separarea proteinelor.
Gelul de poliacrilamidă este unul din cele mai utilizate suporturi de electroforeză. Este extrem de
important pentru cercetare fiind inclus în tehnica PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis). Este
folosit la separarea proteinelor pentru a determina masa moleculară a acestora. Pentru a putea stabili
greutatea unei proteine, exprimată în Da (daltoni), este introdus o dată cu probele, un standard numit
marker de greutate. Markerul de greutate cuprinde proteine cu masă moleculară cunoscută cu rol de
„riglă” moleculară în determinarea maselor moleculare a compuşilor separaţi. (Fig. II.3.4)

Figura II.3.4. Marker de greutate cu diferite proteine (MM=mass molecular exprimată in

kDa)
Pe lângă aceste suporturi sunt menţionate în literatură şi suportul lichid sau sistemele tampon
ce pot fi utilizate la separare electroforetică. Acest tip de suport este întâlnit la separarea fragmentelor
de ADN care depăşesc 107 perechi de baze în metoda PEGE ( pulsed-field gel electrophoresis) sau
electroforeză în câmp pulsatoriu.
Tehnici electroforetice
Clasificarea tehnicilor electroforetice este destul de amplă, tinându-se cont de o multitudine
de factori, însă noile metode de clasificare se raportează doar la două mari clase de metode şi anume
electroforeza în gel şi la electroforeza capilară.

A. Electroforeza în gel foloseşte, în general, volume de ordinul microlitrilor. Probele

traversează un suport din gel prin care trece un curent electric. Migrarea electroforetică este oprită
până la parcurgerea totală a gelului de către amestecul introdus în aparat. In urma migrării se
evidenţiază benzi ce indică prezenţa biomoleculelor, fiind luată în considerare distanţa de la locul
aplicării probei până la staţionarea fragmentului numit timp de migrare (dm). Timpul de migrare al
fiecărui component se poate compara cu un standard.
In acestă clasă sunt încadrate: SDS-PAGE, IEF, electroforeza 2D, izotachoforeza.
1) SDS-PAGE (sodium dodecilum suplhate- polyacrylamide gel electrophoresis) sau
electroforeza pe gel de poliacrilamidă.

La această tehnică este introdus detergentul anionic, dodecil sulfat de sodiu (SDS), în gel, în
tamponul de migrare cât şi în probe. SDS încarcă negativ moleculelor proteice, cantitatea de SDS,
necesară denaturării unui gram de proteine, fiind de aproximativ 1,4 g. După introducerea acestui
detergent anionic, fracţiile proteice vor migra într-un singur sens şi anume către anod (+). Tehnica
poate fi realizată atât vertical cât şi orizontal, în funcţie de aparat.

Figura II.3.5. Destabilizarea structurii proteice cu ajutorul SDS-ului

Gelul de poliacrilamidă este format din 2 geluri: unul cu ochiurile reţelei mai mari - gelul de
concentrare, iar altul cu porii mai mici - gelul de separare. Pentru a forma aceste geluri sunt necesare
două separatoare din sticlă („spacere”) ce vor fi prinse într-un suport cu rolul de a constitui o cavitate.
Gelul de separare, a cărui densitate este mai mare, va fi turnat primul în această cavitate, urmând după
polimerizarea acestuia să fie turnat cel de al doilea gel. In compoziţia gelului de separare intră un
sistem tampon fosfat cu un pH de 8.8, SDS 10%, amestec acrilamidă/bisacrilamidă de cel puţin 8%,
persulfat de amoniu şi TEMED. Fiecare ingredient are un rol bine determinat în formarea „sitei
moleculare” amintită anterior. Monomerul de acrilamidă polimerizează permiţând formarea unor
„ochiuri”, iar dimensiunea acestor ochiuri este reglată cu ajutorul agentului de reticulare N,N’-
metilenbisacrilamida. O concentraţie mare de bisacrilamidă va crea ochiuri mici, gelul căpătând o
rezistenţă mare. Persulfatul de amoniu (sau de potasiu) este considerat iniţiator în polimerizare şi
alături de catalizatorul TEMED (N,N,N’N,’-tetrametiletilendiamina) asigură formarea unui gel
uniform. Gelul de concentrare este turnat ulterior polimerizării celui de separare şi are un conţinut mai
mic în acrilamidă/bisacriamidă doar de 4%, iar tamponul fosfat are un pH mai mic decât cel anterior
(6.8). După oprirea migrării acest gel este îndepărtat şi aruncat.

Figura II.3.6. Formarea reţelei în gelul de poliacrilamidă

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Experienţa nr. 1. Separarea unor probe, ce conţin proteine serice umane, prin electroforeza
verticală

Materiale necesare:
1. Gel de poliacrilamida preparat
2. Tampon migrare glicina-SDS pH=7.4
3. Tuburi Eppendorf cu probe, ţinute pe gheaţă (probele sunt suspendate într-o soluţie ce conţine
mercaptoetanol, tiouree, albastru de bromfenol, glicerol, SDS)
4. Soluţie de colorare pe bază de Coomasie Brilliant Blue
5. Soluţie de decolorare pe bază de acid acetic glacial şi etanol
6. Sursă de curent
7. Tancul de migrare
8. Micropipetă cu vârfuri de unică folosinţă, mănuşi

Mod de lucru
Gelul, care are ataşat un „pieptene” necesar formării godeurilor, prins în suport va fi scos din
acesta şi introdus în compartimentul prevăzut cu electrozi. Se pot lucra două geluri concomitent sau
unul singur. In cazul introducerii unui singur gel există o placă de plastic destinată înlocuirii celui de
al doilea gel. In sistemul de prindere, prevăzut cu electrozi, se vor introduce gelul cu „pieptenele” spre
interior şi paralel placa de plastic formând o cavitate care nu este etanşă. Acest suport este introdus în
tancul de migrare astfel încât să se potrivească capacul ce va închide sistemul. Se scoate „pieptenele”
şi uşor se adaugă sistem tampon de migrare până în momentul în care gelul este acoperit cu lichid
(lichidul trebuie să pătrundă şi în spaţiile formate de pieptene, în godeuri). Cu ajutorul pipetei la care
s-a ataşat vârful, se prelevează un volum (10 μl) de probă şi cu atenţie se va elibera lichidul în primul
godeu. Se va proceda astfel cu toate probele până la epuizarea tuturor godeurilor. După pipetarea
probelor, în gel se va observa o delimitare de culoare albastră, indicator că probele rămân în spaţiile
destinate lor. Se închide sistemul şi se cuplează la sursa de curent. Se selectează programul care are
două etape, curentul fiind ajustat pentru ambele tipuri de geluri (etapa 1- 20-30 min la intensitate
constantă de 20 mA, etapa 2- 40-60 min la 180 V). După ce programul s-a finalizat, se opreşte sursa,
se scoate gelul din tanc şi se desprind usor cele două gemuleţe ce cuprind gelul. Gelul de concentrare
este îndepărtat, se marchează un colţ în gelul de separare pentru a şti care este prima proba aplicată şi
se cufundă gelul în soluţia de colorare pentru 20 de minute. După această etapă se scoate gelul de
culoare albastră şi se introduce în soluţia de decolorare unde va fi lăsat 12 ore sau chiar peste noapte.
După acest interval de timp se vor observa benzile proteinelor ce au migrat.

Figura II.3.7. Gel de poliacrilamidă cu 8 probe de proteine serice (1-8) şi martor (M)
2) IEF (isoelectric focusing) sau focalizarea izoelectrică.

Această tehnică presupune separarea amfionilor (zwiterionilor) pe bază punctelor izoelectrice

(pI). Compuşii migrează în câmp electric folosind gradientul de pH şi se opresc când pH-ul este egal
cu pI. Această tehnică este utilizată în medicina legală şi la teste de paternitate.
 3) Electroforeza 2D

Este destinată separării complexelor proteice şi urmăreşte migrarea în funcţie de pI şi de

dimensiunea biomoleculelor. Are o rezoluţie crescută deoarece sunt practic două metode de
electroforeză în gel. Prima oară se efectuează IEF, după care se roteşte gelul cu 90o şi se intocmeşte
SDS-PAGE, permiţând o separare net superioară celorlalte două electroforeze în gel.

4) Izotachoforeza

In această metodă particulele migrează cu aceeaşi viteza într-un sistem tampon discontinuu.
Separarea se realizează pe bază mobilităţilor electroforetice. In cadrul sistemului se găsesc doi
electroliţi, unul de dirijare „leading” şi unul de captare „trailing” a ionilor. Probele ionizate migrează
cu aceeaşi viteza între electrolitul de dirijare şi cel de captare, iar substanţele a căror mobilitate este
mare vor fi direcţionate către electrolitul „leading” şi cele cu mobilitate mică vor fi atrase de
electrolitul „trailing”. Izotachoforeza este aplicată în industrie (în controlul poluării, depistării ionilor
anorganici, detergenţilor în apă potabilă).

A. Electroforeză capilară este o metodă nouă, cu aplicabilitate mult mai largă şi o

sensibilitate mult crescută faţă de electroforeza în gel. Prezintă multe avantaje şi anume: se folosesc
volume mult mai mici faţă de electroforeza în gel, capilarul prin care sunt pompate probele poate fi
reutilizat după ce au fost efectuate calibrările, există posibilitatea constituirii unei baze de date, timpul
prelucrării probelor şi rezultatelor este mult mai mic şi bineînţeles calitatea electroforegramelor este
mult superioară. Diferenţe atât calitative cât şi cantitative fac din electroforeza capilară o alternativă
viabilă la electroforeza clasică.

Ca şi principiu electroforeza capilară se aseamănă cu HPLC (high performance liquid

chromatography) şi GC-MS (gas cromatografia cuplată cu spectrofotometrie de masă), existând un
capilar prin care toţi compuşii parcurg aceeasi distanţă într-un timp real, numit timp de migrare (t m).
In loc de clasicele benzi apar „picuri” ce reprezintă compuşii care au fost separaţi. Prezintă şi această
tehnică dezavantaje si anume faptul că aparatul are un cost ridicat fiind greu accesibil unui laborator
modest, însă un astfel de instrument poate fi folosit pe scară largă pentru detectarea narcoticelor in
urină, teste de dopaj, analiză calitativă si cantitativă a diverselor alimente, industria cosmetică,
biochimie, etc.

Figura II.3.8. Separare cu ajutorul electroforezei capilare

Electroforeza este o metodă des utilizată în toate laboratoarele. De cele mai multe ori ea este o
etapă dintr-un experiment vast în care sunt incluse şi metode prin care sunt analizate fracţiile separate
(blotare, spectrofotometrie de masă, cromatografie). Frecvent, benzile de interes sunt transferate pe un
suport (nitroceluloză) unde vor reacţiona cu un agent marcat chemiluminescent, colorimetric sau
fluorescent, proces numit blotare (blotting). Sunt trei tipuri de blotare:
1) Southern Blot este destinată fragmentelor de ADN ce reacţionează cu un compus radioactiv
(32P) sau chemiluminescent. La această procedură fragmentele de ADN supuse analizei vor fi
secţionate cu ajutorul unei enzime de restricţie şi separate prin electroforeză în gel de agaroză.
Fragmentele rezultate vor fi transferate pe o membrană specială. Pe membrană vor fi
imprimate aceleaşi benzi ce apar şi pe gel. Datorită folosirii unor compuşi radioactivi la acest
 tip de analiză, benzile vor fi uşor de detectat în domeniul razelor X. Southern Blot se foloseşte
pentru detecţia fragmentelor de restricţie, care pot fi plasmide sau clone bacteriofage.
2) Northern Blot este tehnica utilizată pentru detectarea secvenţelor specifice de ARN folosind o
probă marcată de ADN. Tehnica presupune separarea ARN-ului în gel de agaroză. După
migrare, benzile vor fi transferate pe membrană şi apoi vor fi incubate cu o probă de ADN
monocatenar. In urma incubării se vor forma perechi de baze pe ADN ce sunt complementare
cu secvenţa de ARN supusă analizei. Rezultă o moleculă alcătuită din două catene diferite,
una de ARN şi una de ADN complementar. Datorită marcării ADN-ului vizualizarea se poate
realiza cu uşurinţă în domeniul ultraviolet.
3) Western Blot este o metodă de cuantificare a proteinelor, ce se efectuează după migrarea
electroforetică a fracţiilor proteice, în gel de poliacrilamidă. Suportul, pe care sunt transferate
benzile, este tratat cu anticorpi marcaţi ce reacţionează cu proteine specifice (util în
screeningul HIV-ului in sânge). Detecţia benzilor se realizează colorimetric, fluorescent şi
chemiluminescent.