Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
SPECTROFOTOMETRE,CROMATOGRAFE SI
ELECTROFOREZE UTILIZATE IN
LABORATOARE
Hartia indicatoare de ph
Fabricata prin impregnarea hrtiei de filtru de calitate
ridicat cu soluii indicatoare sau soluii indicatoare
mixte.
Aparatura
Pentru etalonarea aparatului se folosesc de obicei doua solutii tampon care au pH-
ul cel mai apropiat de cel presupus la proba ce se analizeaza.
Cu 10-15 minute inainte de determinare, se deschide aparatul. Se aduce la zero,
conform instructiunilor insotitoare.Se aduce solutia tampon la temperatura de
20C, regland si aparatul pentru aceasta temperatura (din butonul de reglarea
temperaturii).
Se introduc electrozii in solutia tampon; daca acul indicator nu arata exact pH-ul
acelei solutii, se aduce la acea valoare (conform instructiunilor aparatului).
Se indeparteaza solutia tampon, se spala electrozii cu apa si se tamponeaza usor cu
hartie de filtru. Se introduc apoi electrozii in extractul apos al probei de cercetat;
dupa 1-2minute se masoara temperatura lichidului, se regleaza aparatul la acea
temperatura si se citeste pH-ul.
Dupa efectuarea determinarii electrozii se spala cu apa apoi cel de calomel se
introduce in solutia saturata de clorura de potasiu, iar cel de sticla in apa distilata.
SPECTROFOTOMETRE
Un spectrofotometru sau un colorimetru
utilizeaza transmiterea luminii printr-o solutie pentru determinarea concentratiei
unui solut in solutia respectiva. Spectrofotometrul difera de colorimetru prin modul
in care lumina este separata in lungimile de unda componente.
Spectrofotometrul utilizeaza o prisma pentru separarea luminii, iar colorimetrul
utilizeaza filtre. Ambele se bazeaza pe un model simplu de trecere a luminii de
lungime de unda cunoscuta printr-o proba si masurarea cantitatii de energie
luminoasa care este transmisa.
Aceasta se realizeaza prin plasarea unei fotocelule in partea opusa a probei
respective. O raza de lumina este formata din fotoni; cand un foton intalneste o
molecula de analit, exista sanse ca analitul sa absoarba fotonul. Aceasta absorbtie
reduce numarul de fotoni din raza de lumina, astfel reducand intensitatea
luminoasa.Toate moleculele absorb energie radianta la anumite lungimi de unda.
Cele care absorb energie in spectrul vizibil sunt cunoscute ca pigmenti. Proteinele
si acizii nucleici absorb lumina in domeniul ultraviolet. Un spectrofotometru
implica o sursa de lumina, o prisma, un suport pentru probe si o fotocelula.
Acestea sunt conectate la un sistem electric sau mecanic care controleaza
intensitatea luminii,lungimea de unda si conversia energiei primite la nivelul
fotocelulei in fluctuatii voltmetrice.Fluctuatiile voltmetrice sunt apoi proiectate pe
o scala metrica/digitala si valorile sunt inregistrate intr-un computer.
Intensitatea culorii dintr-o proba depinde de cantitatea de solut din proba
respectiva.Transmisia luminii nu este o functie liniara, ci mai degraba
exponentiala. Transmitanta este procentul relativ de lumina care a trecut prin
proba. Transmitanta procentuala este transformata intr-o functie logaritmica
inversa cunoscuta ca absorbanta (sau densitate optica).
Legea Beer-Lambert: absorbanta este minus log10 din transmitanta (A = - log10T).
Aceasta valoare este mai utila decat transmitanta deoarece proiectia absorbantei
versus concentratie determina o linie dreapa, absorbanta crescand odata cu
cresterea concentratiei (transmitanta scade odata cu cresterea concentratiei de
analit). Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesara stabilirea unei serii
cunoscute de dilutii a unor cantitati cunoscute de solut. Una din acestea nu contine
solut si este cunoscuta ca blank. Este utilizata pentru ajustarea instrumentului sa
citeasca 100% transmitanta pentru absorbanta 0. O valoare a transmitantei de 0%
(absorbanta infinita) este stabilita prin plasarea unei bariere intre sursa de lumina si
fotocelula. Toate celelalte masuratori sunt apoi effectuate prin simpla plasare a
probelor in calea luminii. Dupa inregistrarea absorbantei pentru o serie de probe
standard este efectuata o dreapta absorbanta versus concentratie. Panta dreptei
reprezinta coeficientul de extinctie. Aceasta valoare este o constanta si este
utilizata pentru conversia oricarei absorbante masurate in concentratia
corespunzatoare (C = A/ ). Un spectrofotometru poate utiliza atat lumina vizibila
(de obicei avand ca sursa de lumina o lampa cu tugsten/halogen), cat si lumina UV.
Singura modificare necesara este inlocuirea tuburilor de sticla cu cuvete de quartz
(sticla absoarbe lumina UV si nu este potrivita pentru un spectrofotometru UV).
Majoritatea testelor de chimie clinica efectuate pe analizorul automat sunt teste
colorimetrice, distingandu-se urmatoarele tipuri de teste:
- teste enzimatice colorimetrice in care substanta de analizat este tratata cu una sau
mai multe enzime specifice, in urma reactiei rezultand hidrogen peroxid, care in
prezenta unui substrat,sub actiunea peroxidazei duce la formarea unui pigment
iminoquinonic care este determinat fotometric, intensitatea culorii formate fiind
proportionala cu concentratia analitului respectiv(ex: determinarea acidului uric cu
utilizarea uricazei);
- teste colorimetrice in care substanta de analizat se cupleaza specific cu reactivul
cu formarea unui produs conjugat colorat care este determinat fotometric (ex.:
bilirubina se cupleaza cu ionul diazoniu in mediu puternic acid cu formarea
azobilirubinei de culoare rosie); in cazul determinarii enzimelor, acestea cliveaza
enzimatic un substrat specific,produsul rezultat fiind colorat/ se cupleaza cu un
cromogen si formeaza un complex colorat;
- teste UV: NADH/NADPH care este fie produs, fie consumat in timpul reactiilor
care au loc este determinat fotometric in lumina ultravioleta, concentratia sa fiind
direct, respectiv invers proportionala cu concentratia analitului de determinat (ex:
determinarea ALT si AST).
- teste kinetice: produsul final este determinat kinetic (in timp fix), ceea ce ofera o
linearitate mai mare (ex.: test kinetic UV pentru determinarea ureei).
CROMATOGRAF
ELECTROFOREZA
Valori normale
- albumine: 52 - 62% sau 3,64 - 4,34 grame;
- globuline: 38 - 48% sau 2,66 - 3,36 grame;
- alfa-1-globuline: 2 - 5% sau 0,14 - 0,35 grame;
- alfa-2-globuline: 6 - 9% sau 0,42 - 0,63 grame;
- beta-globuline: 8 - 11% sau 0,56 - 0,77 grame;
- gamma-globuline: 14 - 21% sau 0,98 - 1,47 grame.
BIBLIOGRAFIE
1.doc.slide.us
2. documents.tips
3.www.aparatelaborator.ro