Universitatea din Craiova

Facultatea de stiinte
Cimia Compusilor Biologic Activi, Anul

Electroforeza totala. Separarea si determinarea

aminoacizilor. Coulometria

Masterand: Guiu Nicoleta Lavinia

 Electroforeza totala. Separarea si determinarea aminoacizilor

Definitie.Principii Generale. Electroforeza este o metoda eficienta de separare si

determinare calitativa si cantitativa a componentelor unui amestec de analizat, ce se bazeaza pe
migrarea diferentiata a particulelor sub actiunea unui camp electric, fara ca acestea sa sufere reactii
la electrozi. Ca rezultat al migrarii cu viteze diferite, amestecul este separate in zone de substante
individuale ce ocupa pozitii diferite de-a lungul schemei de migrare. Separarea poate fi rezultatul
unui process cinetic sau al unui process de transfer la echilibru, datorat variatiilor proprietatilor
sistemului electrolitic.

Electroforeza zonala se bazeaza pe migrarea particulelor incarcate cu sarcini electrice sub

actiunea unui camp electric, intr-un mediu solid sau gel, impregnate cu electroliti. In electroforeza
zonala (continua) curentul electric este condus de electroloti. Sistemul electrolitic (electrolitul ca
atare) functioneaza ca un sistem tampon care are o zona de Ph operational si care actioneaza prin o
tamponare a mobilitatilor effective. In timpul separarii ionii probei migreaza in Solutia
electrolitului a carui concentratie este mult mai mare decat a ionilor probei, conducand in
intregime curentul electric. Zonele componentelor migreaza cu viteze diferite ca urmare a
diferentelor de mobilitate, separarea electroforetica este deci strict dependent de viteza.
Electroforeza zonala se efectueaza pe suporturi poroase care evita anomaliile create de unii
factori perturbatori: gradientul de concentratie, de densitate, prezenti in cazul migrarii libere. In
acest caz se realizeaza separarea integral a componentilor sub forma de zone bine delimitate. Ca
mediu de stabilizare se pot folosi o serie de suporturi: hartia de filtru, pulberi,geluri.
 Principiul metodei: proba continand amestecul de aminoacizi (α-alanina, serina, glicina,
metionina, triptofan si leucina) este supusa separarii prin electroforeza zonala la Ph = 5.6 (tampon
acetat). Componentele separate sunt evidentiate prin pulverizare cu ninhidrina, iar identificarea lor
se face prin compararea distantei lor de migrare cu cea a etaloanelor, preparate in aceleasi conditii
Reactivi si aparatura:
1. Solutii apoase 0.1 % din cei sase aminoacizi studiati (solutii etalon de α-aminoacizi);
2. Solutii proba de α- aminiacizi;
3. Solutie tampon acetat Ph = 5.6;
4. Solutie ninhidrina 0.2% in acetone
5. Benzi de hartie cromatografica (4 x 30 cm);
6. Aparat pentru electroforeza Carl Zeiss Jena;
7. Densitometru.
Etapele de lucru.
- pregatirea mediului suport pentru migrare (benzi de hartie cromatografica) si plasarea lui in
aparatul de electroforeza dupa impregnare prealabila cu electrolitul tampon: se pregatesc benzi
de hartie cromatografica de 4 cm latime si 30 cm lungime care apoi sunt bine umezite cu Solutia
tampon acetat ( pH = 5.6). Excesul se indeparteaza prin presare usoara intre doua coli de hartie
de filtru;
- imersarea capetelor benzii in rezervoarele cu solutie de electrolit in care sunt introdusi si
electrozii: benzile sunt apoi intinse pe o rama cu ajutorul unui suport auxiliar din material plastic.
Rama cu benzi se introduce in camera de electroforeza, avand grija sa se imerseze capetele
fiecarei benzi in rezervoarele cu electrolit (tampon acetat Ph = 5.6) care contin cei doi electrozi;
- aplicatea unei tensiuni electrice ( a unei diferente de potential) pentru instalarea unei stari de
echilibru in system: se aplica o difetenta de potential (200 V) timp de 3 – 4 minute si apoi se
intrerupe curentul electric;
- introducerea probei de analizat: se introduce probele de analizat si etaloanele pe benzile de
hartie sub forma de banda. Se aplica o diferenta de potential ( 200V) timp de 40-50 min;
- realizarea separarii intre componentele probei de analizat pe baza mobilitatilor lor
electroforetice, intr-un anumit interval de timp ( procesul se mai numeste developare
electroforetica sau electromigrare). Dupa incheierea procesului de electromigrare, se intrerupe
curentul electric, sescoate imediat cadrul cu benzi din camera de electroforeza;
 -uscarea suportului ( benzilor de hartie cromatografica ), benzile se usuca la temperature
camerei si apoi in etuva 15 – 20 min pentru fixare;
- tratarea cu reactiv adecvat ( de obicei se pulverizeaza fin nihidrina solutie) pentru vizualizarea
componentelor separate;
- uscarea benzilor: se usuca benzile din nou la etuva (100̊ timp de 10 – 15 min);
- identificarea componentelor probei se face prin comparare a distantei lor de migrare cu distanta
de migrare a etaloanelor;
- evaluarea directa (cantitativa) a fractiilor densitometrice sau decuparea fractiilor in sectiuni
corespunzatoare care se prelucreaza separate prin evaluare si dozare, prin metode fizice sau
chimice.
Identificarea speciilor separate se realizeaza prin determinari de culoare, absorbanta,
fluorescent in domeniul UV, sau prin reactii chimice cu reactivi adecvati.
Se aplica un reactive adecvat unei clase de component, dupa care fiecare zona se testeaza cu
reactivi specifici pentru obtinerea unor informatii mai precise pentru fiecare component in parte.
Cea mai indicate metoda de identificare practicata in laboratoare, consta in imersarea sau
pulverizarea benzilor electroforetice cu solutiile unor coloranti , alesi in functie de natura probei.
Avantajele electroforezei :
1. Versatilitate în identificarea analiților din probe
Electroforeza este un test de diagnostic versatil în care acesta poate fi utilizat pentru
ambele tipuri de compuși macromoleculari , proteine și acizi nucleici, pentru realizarea efectivă
a separărilor din amestecuri multicomponente sau pentru a amprenta separarea proteinelor.
Acest sistem este adesea utilizat în domeniul medical pentru a diagnostica o varietate de tulburari
sanguine genetice, cum ar fi anemia celulelor seceră si talasemie fie în unul sau două teste
dimensionale de proteine separate, si de a identifica markeri genetici. Electroforeza a fost, de
asemenea, utilizat pentru a determina diferite specii de pești precum și determinarea
trăsaturivaloroase la diferite tipuri de soia și grâu prin analiza și separarea ADN-
component. Prin electroforeză pot fi separați ușor comnpuși chimici ce nu pot fi identificați și
separați decât anevoios - prin alte metode instrumentale.

2. Costul scăzut al aparatului de electroforeză, simplitatea lui constructivă,

ușurința mare de manipulare și utilizare.
 3. Precizia mare a rezultatelor. Electroforeza este extrem de precisă. Când
procesul este efectuat corect, se pot separa proteinele prezente într-o celulă în mai mult de 1.500
părți distincte, specifice. Sistemul este foarte selectiv în care este capabil să observe diferențe în
probele de ADN, chiar dacă aceste eșantioane diferă prin cât mai puțin de două perechi de baze.
Dezavasntaje: sistemul de solvenți trebuie reîmprospătat și schimbat des, periodic, interval mare de
timp pentru realizarea separărilor și identificării componentelor dintr-o proba.
Coulometria. Determinarea coulometrică a acidului ascorbic.
Definiţie. Principii generale. În analiza coulometrică aubstanţa de analizat este supusă
electrolizei, iar concentraţia acesteia se calculează din cantitatea de electricitate consumată, pe
baza legii lui Faraday: m = M.Q/n.F, în care m = masa substanţei transformată electrochimic; M =
masa moleculară a substanţei;
Q = cantitatea de electricitate; n = numărul de electroni implicaţi în reacţia electrochimică; F =
numărul lui Faraday (96500 Coulombi).
Cantitatea de electricitate (Q) consumată în coulometrie poate contribui fie la oxidarea sau
reducerea cantitativă a substanţei analizate, fie la obţinerea reactivului ce va
reacţiona stoechiometric cu substanţa de analizat.
Analiza coulometrică se poate realiza în două moduri:
- la o valoare constantă a potenţialului (coulometrie potenţiostatică);
- la o valoare constantă a curentului (coulometrie amperostatică);
Condiţia ca o reacţie electrochimică să fie utilizată în analiza cantitativă este ca, practic,
toată cantitatea de electricitate să se consume numai pentru transformarea substanţei ce
se dozează (să nu aibă loc reacţii electrochimice secundare).
Analiza coulometrică prezintă o serie de avantaje faţă de alte metode fizico-chimice de
analiză: nu se utilizează etaloane, se pot utiliza reactivi puţin stabili.
În acelaşi timp metoda prezintă selectivitate şi sensibilitate, fiind reproductibilă.
Titrarea coulometrică se bazează pe generarea electrochimică a titrantului care
va reacţiona cantitativ cu substanţa de determinat.
Principul metodei: acidul ascorbic reactioneaza cu iodul generat electrochimic din KI
conform reactiei:
2Iˉ ↔ I2 + 2e
 In solutie, are loc reactia: acidul ascorbic se transforma prin oxidare cu solutia de iod in
acid dehidroascorbic:

2HI
Reactivi şi aparatură.
- instalaţie coulometrică cu indicare vizuală a punctului de echivalenţă, prevăzută cu integrator
electronic de curent;
- agitator magnetic;
-1
- soluţie reactiv auxiliar, soluţie de KI, 2 x10 mol/L
- soluţie amidon 1%
- proba de analizat: acid ascorbic.

Mod de lucru
Se cântăreşte la balanţa analitică o cantitate de probă (acid ascorbic) a g = 0,1 g şi se
aduce cantitativ într-un balon cotat de 100 mL cu apă distilată; din această soluţie se măsoară 1 mL
cu pipeta şi se aduce în celula de electroliză. Se adaugă apoi 10 mL soluţie de KI, 2 x10 mol/L,
circa 50 mL apă distilată, 0,5 mL soluţie amidon 1%.

Se imersează electrozii de platină (generator şi auxiliar) în celula electrolitică, se

porneşteagitatorul magnetic, se conetează cei doi electrozi la sursa de curent (electrodul generator
la polul pozitiv) şi se porneşte integratorul. În mometul în care soluţia se colorează în albastru, se
opreşte integratorul şi se notează cantitatea de iod afişată, consumată pâna la atingerea punctului
de echivalenţă (m = x mg I2).

Calcule.
a = g probă acid ascorbic;
m1 = g I2 generate electrochimic până la punctul de echivalenţă
(se calculează transformând m din mg în g).
1Eg I2(M I2/2).............................................1Eg acid ascorbic (Macid ascorbic / 2)
m1 g I2..............................................X g acid ascorbic
de unde X = (m1 x Eg acid ascorbic)/ Eg I2 = cantitatea de acid ascorbic corespuzătoare la m1 g I2
generate electrochimic până la echivalenţă din reacţia de titrare coulometrică
Dar: X g acid ascorbic.....................................1 mL probă
X1 g acid ascorbic....................................100 mL probă
De unde X1 = 100 x X g acid ascorbic din 100 mL soluţie probă (V b.c.)
1 g acid ascorbic............................................a g probă
% acid ascorbic.................................................100 g probă
Rezultă că % acid ascorbic = (100 x X1) / a.
Bibliografie:
1. https://www.studocu.com/ro/document/universitatea-de-medicina-si-farmacie-gr-t-popa/
chimie-organica/electroforeza
2. https://ro.wikipedia.org/wiki/Electroforez%C4%83
3. https://www.wikiwand.com/ro/Electroforeza_proteinelor_serice