ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE.

DETERMINAREA FRACȚIUNILOR
ELECTROFORETICE ALE PROTEINELOR SERICE

Proteinele serice , principalul constituent al plasmei, reprezintă 75% din reziduu uscat al sângelui.
Sunt polipeptide alcătuite din α-aminoacizi legați covalent cu GM între 500-1milion de Daltoni.
Îndeplinesc multiple roluri funcționale în organism:

 rol nutritiv în metabolismul proteic

 mențin volemia sângelui
 mențin balanța azotată a organismului
 mențin echilibrul acido-bazic al corpului, proteinele reprezentând 1/6 din sistemele tampon ale
plasmei
 realizează presiunea coloid-osmotică a plasmei
 rol în homeostazia tensională
 rol de transportor: ioni, hormoni, bilirubină indirectă, medicamente
 rol de enzime
 rol în apărarea specifică( imunglobuline) și nespecifică (complement) a organismului
 rol în coagularea și fibrinoliza sângelui
 etc.

Obiective educaționale:

1. Descrierea fracțiunilor electroforetice ale proteinelor serice.

2. Calculul fracțiunilor electroforetice ale proteinelor serice.
3. Interpretarea rezultatelor obținute la calcularea fracțiunilor electroforetice ale proteinelor
serice.
4. Interpretarea unei proteinograme.

Principiul lucrării:

Fracționarea proteinelor plasmatice este o metodă necesară pentru studiul funcțiilor și structurilor
proteinelor serice. Se bazează pe proprietățile fizico-chimice ale proteinelor- încărcare electrică,
densitate, solubilitate, afinitate pentru diverse molecule. Există mai multe metode de fracționare:
tehnica de precipitare a proteinelor folosind săruri neutre (sulfat de amoniu), tehnica de precipitare a
proteinelor cu etanol la rece(metoda Cohn), ultracentrifigarea. Cel mai des folosit procedeu de
fracționare, care ajută medicul curant la stabilirea diagnosticului sau servește pentru scopuri preparative
este electroforeza. Metoda se bazează pe migrarea cu viteză inegală a componentelor proteice serice
într-un câmp electric continuu, în funcție de încărcarea lor electrică, de intensitatea curentului electric și
de forma moleculei.

Proteinele sunt substanțe amfotere a căror disociere și încărcare electrică depinde de pH-ul
mediului în care sunt suspendate și de punctul lor izoelectric. Toate proteinele serice au un punct
izoelectric mai scăzut de pH 8,6-9. Suspendarea lor într-un mediu tampon cu pH=8,6-9 sau mai alcalin,
face ca moleculele proteice să se încarce negativ. Cum punctul izoelectric al fracțiunilor proteice din ser
este variat și încărcarea lor electrică negativă va fi diferită, cu atât mai mare cu cât punctul izoelectric
este mai îndepărtat de pH-ul soluției tampon. Puse într-un câmp electric continuu moleculele proteice
vor migra spre anod(+) dacă sarcina electrică predominantă e negativă și spre catod(-) dacă încărcătura
lor electrică e pozitivă. Puse într-un mediu acid moleculele proteice se vor comporta ca niște baze și vor
migra spre catod(-), iar într-un mediu alcalin sau o soluție tampon proteinele se vor comporta ca niște
acizi și vor migra spre anod(+). Însă, cum încărcătură lor electrică diferă pentru diversele molecule,
viteza lor de migrare nu va fi identică. După un interval de timp se vor separa între ele grupuri
moleculare cu viteze egale sau apropiate.

În concluzie, viteza de migrarea a fracțiunilor proteice este influențată de : încărcătura lor

electrică, de mărimea și forma moleculei si de caracteristicile mediului în care se face migrarea.

Mediile de migrare sunt variate: amidon, hârtie de filtru, gel de agar, agar-agar, agaroză,
acrilamidă etc. În practica curentă este folosit ca suport pentru migrare hârtia de filtru. Prin
electroforeză se separă 5 fracțiuni proteice: albumine, α1 globuline, α2 globuline, β globuline (β1 , β2)
și ϒ globuline.

Material necesar:

 ser sangvin
 soluție tampon veronal-acetat cu pH=8,6
 soluție de colorare amido-negru 10B
 soluție de decolorare
 soluție pentru diafanizarea hârtiei de filtru
 aparat de electroforeză
 redresor
 micropipetă
 fotodensimetru.

Tehnica lucrării:

După pregătirea benzilor de hârtie de filtru și marcarea lor, se introduc în aparatul de

electroforeză. Se lasă curentul electric continuu să treacă prin fiecare bandă 30 de minute pentru
stabilirea echilibrului ionic. Se aplica, după întreruperea curentului electric, cu micropipeta 0,01ml ser
pe linia de start . Are loc migrarea proteinelor în câmp electric (intensitate de 0,8-1,2 mA și tensiune de
120-150V). După 10-16 ore de migrare se scot benzile, se usucă la 100 grade C, timp de 10 min,
proteinele se denaturează prin uscare și se fixează pe benzile de hârtie de filtru. Se introduc benzile în
soluția de colorare care se schimbă la 20-30 minute, și se colorează până fondul hârtiei devine incolor,
rămânând colorate doar spoturile reprezentând fracțiunile proteice.

Evaluarea procentuală a fracțiunilor proteice:

În urma colorării benzilor, pe hârtia de filtru apar 5 spoturi colorate ce corespund în ordinea
vitezei de migrare albuminelor, α1 globulinelor, α2 globulinelor, β globulinelor (β1 , β2), ϒ
globulinelor. Cantitatea de colorant fixată pe fiecare fracțiune este direct proporțională cu cantitatea de
proteină existentă în fracțiune, iar cantitatea totală de colorant este direct proporțională cu cantitatea
totală de proteine încărcate.

Pornind de la premizele de mai sus, se poate face evaluarea procentuală a fiecărei fracțiuni
proteice din serul analizat.

Evaluarea poate fi facută prin doua procedee:

 evaluarea colorantului în volume egale de soluție

Prin fotometrarea soluțiilor obținute pentru fiecare spot se obțin extincțiile corespunzătoare fiecărei
fracțiuni: EA- extincția pentru spotul reprezentând albuminele; Eα1 - extincția pentru spotul α1
globuline; Eα2 extincția pentru spotul α2 globuline; Eβ- extincția pentru spotul β globuline; Eϒ
extincția pentru spotul ϒ globuline. Ținând seama de relația de proporționalitate direct între cantitatea
de proteină și cantitatea de colorant, putem spune că suma totală a extincțiilor este proporțională cu
cantitatea totală de proteine, iar extincția obținută pentru fiecare fracțiune în parte, cu cantitatea de
proteină conținută de acea fracțiune. Se poate, astfel, calcula cât reprezintă în procente fiecare fracțiune
în parte din totalul proteinelor. De exemplu:

EA
albumine %= ×100
EA + E α 1+ E α 2+ Eβ + E ϒ

 evaluare prin fotometrare directă

Se poate face prin fotometrare directă discontinuă sau cu ajutorul unui integrator.

Prin fotometrare directă discontinuă se pot citi direct valorile de extincție după ce electroforeza este
trecută milimetru cu milimetru prin fața unei fante de 1 mm a unui fotodensitometru. Reprezentarea
grafică pe hârtie milimetrică a valorilor citite permite trasarea unei curbe ca în figura:
Calculul procentual al fiecărei fracțiuni proteice se face asemănător metodei precedente cu deosebirea
că extincția fiecărei fracțiuni este reprezentată de suma extincțiilor obținute pentru fiecare milimetru
fotometrat din suprafața spotului ce reprezintă fracțiunea respectivă. De exemplu: pentru albumină
extincția este egală cu suma extincțiilor fiecărui milimetru din spotul de albumină trecut prin dreptul
fantei.

Determinarea concentrației procentuale a fracțiunilor proteice se face mult mai operativ cu ajutorul
integratorului. Aparatul înregistrează simultan și curba de integrare a suprafețelor înscrise între
porțiunea electroforeogramei corespunzătoare fiecărei fracțiuni și linia de zero a aparatului.

În principiu, calcularea valorilor procentuale a fracțiunilor proteice serice se bazează pe existența unei
proporționalități directe între suprafața totală a electroforeogramei și cantitatea totală de proteine
precum și între cantitatea de proteină conținută de fiecare fracțiune și suprafața circumscrisă de curba ce
o reprezintă.

Pentru calcularea procentuală se procedează în felul următor:

 la capătul liniei de integrare se duce o perpendiculară pe linia de O, care intersectează

linia de integrare în punctul A
  cu ajutorul unui compas se ia o deschidere de 10 cm și se descrie un arc de cerc cu
centrul în punctul A care intersectează linia de O în punctul B. Prin unirea celor două
puncte se obține o dreaptă AB de 10 cm.
 prin linii perpendiculare pe linia O se delimitează între ele fracțiunile electroforetice ca
în figura.
 la intersecția perpendicularelor cu curba de integrare se notează punctele c, d, e, f.
 prin linii paralele cu linia O se proiectează punctele c, d, e, f de pe curba de integrare pe
dreapta AB, operație prin care se delimitează 5 segmente: BC, CD, DE, EF și FA a căror
lungime este direct proporțională cu suprafața delimitată de curbele în formă de clopot
de pe electroforeogramă, corespunzătoare albuminelor, α1, α2, β si ϒ globulinelor. Cum
lungimea dreptei AB a fost luată inițial de 10 cm (100 mm), prin măsurarea fiecărui
segment în mm obținem direct valoarea procentuală a fiecărei fracțiuni.

Interpretare rezultate:

Structura și funțiile cele mai importante ale celor 5 fracțiuni proteice:

 albumine- Albumina și preAlbumina; realizează presiunea coloid-osmotică a

plasmei, transportă hormoni tiroidieni, bilirubină indirectă, Mg, Zn, Ca,
medicamente.
 α1 globuline- α1glicoproteina acidă, antitripsina, chimotripsina, antichimotripsina;
rol de inhibitor enzimatic, rol în imunoreglare, transportă hormoni steroizi, vitamina
B12.
 α2 globuline- α2 macroglobulina, ceruloplasmina, antitrombina 3, haptoglobina,
vitronectina; rol în adeziune, leagă Hb, Cu.
 β globuline- β lipoproteina, proteina C reactivă, transferina, hemopexina,
transcobalamina, C3 complement, fibronectina; fixează hemul, Fe, B12, rol în
adeziune.
 ϒ globuline- imunglobulinele A, M, D, E, G; rol în imunitate ( infecții acute și
cronice, reacții parazitare și alergii, transplante).

Valorile procentuale și absolute normale ale celor 5 fracțiuni proteice:

Fracțiuni proteice Valori procentuale Valori absolute

Albumine 45-60% 4,5g%
α1 globuline 3-5% 0,3g%
α2 globuline 7-12% 0,47g%
β globuline 10-14% 0,9g%
ϒ globuline 18-23% 1,45g%
Raportul dintre Albumine și globuline este 1,5.

Modificarea cantitativă și/sau calitativă a proteinelor plasmatice interesând una sau mai multe
fracțiuni proteice cu modificarea raportului dintre acestea poartă numele de disproteinemie.

Exemple de disproteinemii caracteristice:

 Fracțiuni proteice Proteinemia 6,5-8 g%
Infecții acute ↑ α globuline ↓ Albumine valori normale
Infecții cronice ↑ ϒ globuline valori crescute
Hepatopatii cronice ↑ β, ϒ globuline ↓↓↓ Albumine valori scazute
Nefroze ↑ α, β globuline ↓ Albumine valori scazute
Pierderi de proteine ↑ α2, β globuline ↓↓ Albumine valori scazute
Interpretarea corectă a unei electroforeze nu se poate face numai pe baza valorilor relative și este
absolut obligatorie cunoașterea proteinemiei- valori normale 6,5-8g%.

În patologie există și boli caracterizate prin lipsa genetică sau dobândită a unei/ mai multe
fracțiuni proteice (agamaglobulinemie, atransferinemie, ahaptoglobulinemie).

Electroforeograme patologice:

Discuții:

1. Rolul funcțional al proteinelor plasmatice.

2. Interpretarea de proteinograme fiziologice, patologice.
 CONVULSII CU INSULINĂ LA ȘOARECI

Insulina este principalul hormon anabolic și anticatabolic al organismului, fiind secretat de

celulele β insulare Langerhans. Controlează toate tipurile de metabolism intermediar: glucidic, lipidic și
protidic. Hormonul produce hipoglicemie datorită intensificării pătrunderii glucozei în celule și
stimulează glicoliza, înglobarea glucozei în glicogen la nivelul ficatului și fibrei musculare și
transformarea glucozei în lipide și proteine.

Principiul lucrării:

În condiții fiziologice sistemul nervos utilizează ca sursă energetică aproape exclusiv glucoza.
Insulina este un hormon hipoglicemiant, iar hipoglicemia instalată determină , în primul rând, perturbări
în activitatea sistemului nervos central care duc la starea de șoc hipoglicemic.

Obiective educaționale:

1. Descrierea tehnicii de lucru pentru punerea în evidență a convulsiilor cu insulină la șoricei.

2. Efectuarea practic a lucrării pentru punerea în evidență a convulsiilor cu insulină la șoricei.
3. Interpretarea rezultatelor obținute la punerea în evidență a convulsiilor cu insulină la șoricei.

Material necesar:

 șoareci
 seringi
 2UI insulina
 0,2 ml glucoză 10%

Tehnica lucrării:

Se folosește un lot de 4 șoareci cu greutate între 15-20 g care au fost menținuți a jeun timp de 24
de ore.

Fiecărui animal i se administrează prin injectare subcutanată 2 UI Insulină.

Lotul este ținut sub permanentă observație și se notează efectele insulinei. Inițial, apare o stare
de hiperexcitabilitate, iritabilitate care se poate evidenția dacă animalele sunt lăsate să cadă de la o
înălțime de 2-3 cm. Apoi se instalează o alterare a stării generale cu letargie, tahicardie, tremurături și
animalele intră în șoc hipoglicemic. În final apar convulsii.

Se injectează subcutan câte 0,2 ml glucoză 10% și se observă dispariția convulsiilor și revenirea
din starea de șoc. Dacă animalele nu-și revin sau recad în starea de șoc se repetă administrarea glucozei.

Interpretare rezultate:

Valoarea fiziologică a glicemiei plasmatice este la oameni între 80-120 mg%. Hipoglicemia se
instalează la valori ale glicemiei cuprinse între 50-70 mg%, manifestându-se pe plan clinic tabloul
șocului hipoglicemic cu letargie, oboseală musculară, transpirații, senzație de gol în stomac, tremurături,
tahicardie, tulburări nervoase (cefalee), vorbire neclară (dizartrie), tulburări de vedere (scotoame),
halucinații și, în final, convulsii. Manifestările se datorează perturbărilor funcțiilor sistemului nervos
central, care folosește ca sursă energetică exclusiv glucoza.

La o valoare a glicemiei sub 40mg% se instalează coma hipoglicemică, o comă liniștită.

Există cauze multiple ale hipoglicemiei: înfometarea, cura de slăbire(anorexia psihogenă),

malabsorbția și maldigestia de glucide, intoleranța la fructoză, galactoză, afecțiuni hepatice, insuficiența
endocrină(hipofizară, corticosuprarenaliană), tumori abdominale secretante de peptide
hipoglicemiante(somatomedine), insulinomul, alcoolismul cronic. Cea mai frecventă cauză rămâne
abuzul de antidiabetice orale și insulină.

Discuții:

1. Hormonii pancreasului endocrin.

2. Diabetul zaharat.

EFECTUL INSULINEI ȘI ALOXANULUI ASUPRA GLICEMIEI LA ȘOBOLAN

Insulina este un hormon polipeptidic sintetizat la nivelul reticulului endoplasmic al celulelor B

din insulele Langerhans pancreatice. Principala acțiune a sa este aceea de a produce scăderea
concentrației plasmatice a glucozei în organism, pe plan clinic instalându-se șocul hipoglicemic.

Perturbări ale structurii, respectiv funcției insulinei cu suprimarea secreției acestui hormon
determină apariția diabetului zaharat. Diabetul zaharat este o boală de natură metabolică manifestată sub
două forme:

 Diabet zaharat insulinodependent (de tip I, juvenil)- generat de producere insuficientă

a insulinei la nivelul pancreasului endocrin
 Diabet zaharat insulinorezistent (de tip II, al adultului)- pancreasul endocrin produce
o cantitate suficientă de insulină, dar organismul nu răspunde în mod eficient la aceasta.

Există și procedee chimice de producere a diabetului zaharat experimental prin administrarea

unor substanțe care distrug selectiv celulele B insulare- aloxanul, streptozotocina.

Obiectivul lucrării practice este de a evidenția efectul insulinei pe șobolanul sănătos și pe cel cu
diabet zaharat indus experimental prin injectare de aloxan.

Principiul lucrării:

Se recoltează sânge de la un șobolan sănătos și apoi de la un șobolan diabetic, înainte și după

administrarea de insulina și se evaluează nivelul glicemiei.

Obiective educaționale:

1. Descrierea tehnicii de lucru pentru punerea în evidență a efectelor insulinei și aloxanului

asupra glicemiei la șobolan.
 2. Efectuarea pe simulator a lucrării pentru punerea în evidență a efectelor insulinei și
aloxanului asupra glicemiei la șobolan.
3. Interpretarea rezultatelor obținute la punerea în evidență a efectelor insulinei și aloxanului
asupra glicemiei la șobolan.

Material necesar:

 programul de simulare

Tehnica lucrării:

Se recoltează o probă de sânge care se analizează și se înregistrează nivelul glicemiei.

Se administrează insulină după care se recoltează o altă probă de sânge care se analizează și se
înregistrează iar nivelul glicemiei.

Se administrează aloxan pentru producerea diabetului zaharat experimental, se recoltează sânge,

se analizează proba și se înregistrează nivelul glicemiei.

Se administrează șobolanului și aloxan și insulină, se recoltează o altă probă de sânge care se

analizează și se notează nivelul glicemiei.

Interpretare rezultate:

Valoarea glicemiei din sângele șobolanului injectat cu insulină a fost mai scăzută comparativ cu
valoarea glicemiei șobolanului martor, sănătos, evidențiindu-se efectul hipoglicemiant al hormonului.

Aloxanul a produs prin distrucția celulelor B insulare suprimarea secreției de insulină cu apariția
diabetului zaharat experimental. Valoarea glicemiei șobolanului diabetic a fost mai crescută comparativ
cu valoarea glicemiei șobolanului sănătos.

La șobolanul diabetic injectat și cu insulină valoarea glicemiei obținute după recoltarea și

analizarea probei de sânge este mai mică comparativ cu valoarea glicemiei șobolanului diabetic însă nu
atinge pragul valorii de la șobolanul sănătos.

Discuții:

1. Hormonii pancreasului endocrin.

ȚESUTURI EXCITABILE-NEURONUL
 DETERMINAREA PRAGULUI DE EXCITABILITATE, SUMAȚIA TEMPORALĂ ȘI
EFECTUL UNOR SUBSTANȚE ANESTEZICE ȘI AL TEMPERATURII SCĂZUTE ASUPRA
CONDUCERII NERVOASE

Organismul uman este alcătuit dintr-o multitudine de celule excitabile cum sunt celulele
nervoase și celulele musculare. Neuronul reprezintă unitatea funcțională a sistemului nervos și prezintă
trei proprietăți esențiale: excitabilitatea, conductibilitatea, degenerescența și/sau regenerarea.

Excitabilitatea este proprietatea celulei nervoase de a elabora influx nervos sub acțiunea unui
stimul. Stimulul reprezintă orice factor fizic, chimic, biologic capabil să determine o excitație în
anumite condiții:

 să aibă o anumită intensitate- valoare prag; stimulii cu o intensitate mai scăzută decât
valoarea prag = stimuli subliminali
 să acționeze cu o anumită bruschețe
 să aibă o anumită densitate pe unitatea de suprafață
 să acționeze pe o anumită perioadă de timp.

Cei mai utilizați stimuli în fiziologie sunt stimulii electrici care prezintă mai multe
caracteristici: nu provoacă leziuni la intensități reduse, pot să fie localizați și marcați, iar durata
stimulării poate fi modificată după dorință.

Obiective educaționale:

1. Definirea și clasificarea tipurilor de stimuli în funcție de intensitatea lor.

2. Definirea pragului de excitabilitate, enumerarea și explicarea etapelor unui potențial de
acțiune.
3. Definirea și explicarea sumației temporale și spațiale.
4. Explicarea rolului tecii de mielină și interpretarea efectului prezenței mielinei asupra vitezei
de conducere.
5. Explicarea modului în care influențează diametrul fibrelor nervoase viteza de conducere.
6. Explicarea mecanismului prin care unele anestezice și temperatura scăzută influențează
conductibilitatea.

Pragul de excitabilitate . Fenomenul de sumație temporală.

Pragul de excitabilitate reprezintă intensitatea minimă a unui stimul care este capabil să
genereze instalarea și propagarea unui influx nervos.

Aplicarea mai multori stimuli subliminali dar cu o frecvență crescută, determină totuși instalarea
influxului nervos, ca urmare a sumării condițiilor generate de fiecare stimul subliminal în parte,
fenomen numit sumație temporală.

Obiectivul lucrării practice este de a determina pragul de excitabilitate și demonstra fenomenul

de sumație temporală.

Principiul lucrării:
 Se aplică stimuli electrici cu intensitate crescândă asupra unui nerv, determinându-se intensitatea
minimă la care apare un răspuns-influx nervos.

Se micșorează apoi intensitatea stimulilor, aplicându-se în schimb o salvă de astfel de stimuli

electrici cu frecvență crescută.

Material necesar:

 programul de simulare

Tehnica lucrării:

Se aplică un singur stimul electric cu intensitate crescândă pe un nerv și se notează valoare

minimă la care apare influxul nervos.

Se aplică o salvă de stimuli cu intensitate mai mică dar frecvență crescută și se observă apariția
răspunsului nervos.

Interpretare rezultate:

Un singur stimul electric este capabil să genereze influx nervos, iar valoarea minimă a
intensității stimului la care a apărut răspuns reprezintă valoarea prag de excitabilitate.

O salvă de stimuli cu intensitate mai mică decât valoarea prag, subliminali, dar cu o frecvență
crescută, sunt capabili să genereze la rândul lor influx nervos, fenomen numit sumație temporală.

Efectul temperaturii și al unor anestezice asupra excitabilității neuronului.

Obiectivul lucrării practice este de a demonstra efectul temperaturii și al substanțelor anestezice

asupra excitabilității nervului și a vitezei influxului nervos.

Principiul lucrării:

Se aplică un stimul electric pe un nerv în condițiile aplicării pe nerv a lidocainei, eterului etilic,
cristalelor de gheață și se observă influența asupra răspunsului și asupra vitezei influxului nervos.

Material necesar:

 programul de simulare

Tehnica lucrării:

Se aplică un stimul electric pe nervul sciatic de broască și se determină timpul și viteza

influxului nervos.

Se repetă experimentul în condițiile aplicării pe nerv a lidocainei, eterului etilic, cristalelor de

gheață și se observă efectul asupra timpului și vitezei influxului nervos.

Interpretare rezultate:

Substanțele anestezice acționează prin blocarea canalelor de Na, prin urmare nu se va genera
influx nervos, potențial de acțiune, iar viteza va fi zero.
 Cristalele de gheață acționează prin încetinirea mișcării browniene a ionilor implicați în
generarea influxului nervos, a potențialului de acțiune, prin urmare va apărea un răspuns nervos
întârziat și mai lent.

Discuții:

1. Potențialul de membrană și de acțiune în neuron.