LP5 – Electroforeza proteinelor

serice
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice

A. Introducere

Rolurile proteinelor:
- rol structural în arhitectura celulelor, organelor și țesuturilor;
- menținerea presiunii osmotice;
- cataliza reacțiilor biochimice;
- menținerea echilibrului acido-basic;
- coagularea sângelui (fibrinogen);
- apărarea gazdei împotriva agenților patogeni (imunoglobuline, complement);
- transportul metaboliților (transferină, albumină);
- reglarea metabolismului celular (hormoni);
- prevenirea proteolizei (α1-antitripsină);
- menținerea presiunii osmotice (albumină).
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice
A. Introducere

Proteinele serice reprezintă cea mai abundentă componentă a plasmei, aceasta conținând aproximativ
6-7 g proteine totale/dL.
Au fost caracterizate peste 300 de proteine individuale, însă numai 10 dintre aceste proteine reprezintă
90% din totalul proteinelor serice.
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice
A. Introducere

În funcție de tipul și de abundența lor, proteinele identificate în plasmă pot fi împărțite în trei
categorii:
1. Proteine specifice plasmei: albumina, transferina, fibrinogenul, IgA, IgM, apolipoproteina A1,
apolipoproteina B, proteina reactivă C, plasminogenul;
2. Proteine de origine tisulară - acestea sunt eliberate în sânge în urma unor leziuni, ischemie,
necroze, infecții virale, infecții bacteriene, etc. (feritina, mioglobina, tiroglobulina, alfa-fetoproteina,
antigenul specific prostatei, proteina carcinoembrionară, troponina I.
3. Proteine ale sistemului imunitar (interleukine, citokine: troponina T, Interleukina-8, factorul
tisular, interferonul alfa, IL-2, IL-4, TNF alfa, interferonul gama, IL-1 beta, IL-12, IL-5, IL-10 și IL-
6). Aceste proteine modulează activitatea sistemului imunitar și provin fie de la celulele imune fie de
la țesuturi. Cantitatea lor în plasma poate varia foarte mult în anumite stări patologice sau fiziologice.
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice
A. Introducere
Termenul de electroforeză se referă la orice tehnică care se bazează pe deplasarea particulelor
încărcate (ioni, molecule, macromolecule) în câmp electric într-un sistem lichid, gel sau solid.
Orice particulă încărcată electric într-un mediu apos la un anumit pH, atunci când este plasată
într-un câmp electric constant, va începe să migreze către electrodul aflat la polul opus. Viteza de
mișcare a particulelor va fi direct proporțională cu tensiunea aplicată și sarcina particulei, dar
invers proporțională cu dimensiunea particulei.
Electroforeza proteinelor serice este utilizată pe scară largă în medicina clinică pentru a ajuta la
diagnosticarea diferitelor afecțiuni, cum ar fi inflamații acute și cronice, gammapatii monoclonale,
nefropatii, boli hepatice etc.
În electroforeza în gel de agaroză, în condiții nedenaturante, proteinele își păstrează conformația
originală (nativă) și structura oligomerică (structura cuaternară), sarcina și activitatea biologică, iar în
tampon ușor alcalin migrează către electrodul încărcat pozitiv.
Metoda permite separarea electroforetică a proteinelor serice în 5 fracţiuni (albumina și
globuline: alfa1, alfa2, beta și gama) la pH 9,2 sau în 6 fracţiuni (albumina și globuline: alfa1, alfa2,
beta1, beta2 și gama) la pH 8,5.
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice
A. Introducere

Agaroza este un polimer glucidic linear, obținut prin purificarea agarului prin înlăturarea
agaropectinei – polimer glucidic ramificat. Gelul format din agaroza poate fi considerat ca o rețea
tridimensională de pori umpluți cu un lichid (tamponul de migrare).
Dimensiunea porilor gelului, poate fi ușor controlată în funcție de concentrația gelului. Dacă porii
sunt prea mari, separarea proteinelor va fi aceeași ca în soluția liberă, adică în funcție de densitatea de
sarcină de suprafață; la oprirea curentului electric, proteinele vor difuza, amestecându-se.
Pe de altă parte, un gel cu pori mici va prezenta un obstacol mecanic în calea mișcării proteinelor.
În acest caz gelul va acționa ca o „sită moleculară”, încetinind mișcarea proteinelor cu atât mai
puternic cu cât proteinele sunt mai mari.
Un parametru important în electroforeză este rezoluția = numărul de benzi de proteine
distincte obținute în urma separării unui amestec complex.
Într-o configurație electroforetică simplă, în care proteinele migrează către electrodul opus,
separarea zonelor proteice este însoțită de lărgirea lor din cauza difuziei proteinelor în gel. O
modalitate de a depăși această limită de rezoluție este să se aplice o tensiune mai mare în timpul
rulării.
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice

A. Introducere

În general, viteza de migrare a particulelor încărcate într-un câmp electric este:

 direct proporțională cu intensitatea câmpului, sarcina particulei și temperatura mediului,
 invers proporțională cu dimensiunea particulelor și rezistența mediului.
Tensiunea mai mare are ca rezultat o migrare mai rapidă a particulelor dar are și inconvenientul că
se generează o cantitate semnificativă de căldură. Această căldură rezultată din trecerea curentului
electric prin suportul de gel crește exponențial cu intensitatea curentului electric.
Pentru proteine, porii din agaroză sunt prea mari pentru separarea după mărimea moleculară -
separarea proteinelor în electroforeza nondenaturantă are loc în funcție de densitatea lor de sarcină la
suprafață.
Condiția de bază a separării electroforetice a unor molecule este ca acestea să posede sarcină
electrică globală nenulă. Totuși proteinele sunt amfoliți, adică poartă atât grupări cu sarcini electrice
positive, cât și negative, iar pH-ul mediului (în acest caz pH-ul tamponului de migrare) determină dacă
sarcina globală a proteinei de separat este pozitivă, negativă sau nulă.
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice

A. Introducere

Proteinele conțin numeroase grupări ionizabile, fiecare cu propria sa constantă de disociere, de

care depinde starea de protonare, în funcție de pH-ul mediului. În general grupările carboxil sunt
protonate și deci neîncărcate în mediu acid, în timp ce la pH neutru sau alcalin poartă sarcini negative.
În schimb, grupările amino sunt protonate și deci încărcate pozitiv în mediu neutru sau mediu acid, în
timp ce în mediu alcalin sunt neprotonate și fără sarcină electrică.
LP5 - Electroforeza proteinelor serice
A. Introducere

Condiția de bază a separării electroforetice a unor molecule este ca acestea să posede sarcină
electrică globală nenulă.
Punctul izoelectric (pI) este o valoare a pH-ului la care numărul sarcinilor pozitive și negative ale
proteinei sunt egale, iar sarcina netă a proteinei este zero. Valoarea pI este determinată de structura
primară a proteinei şi prin urmare este diferită pentru proteine diferite.
Majoritatea proteinelor animale au punct izoelectric în intervalul slab acid, pI=5-6. Prin urmare, în
tamponul electroforetic ușor alcalin (pH aproximativ 8,5), cele mai multe proteine sunt polianioni,
deplasându-se de la catod (-) către anod (+). Există și o minoritate de proteine care în aceste condiții se
vor deplasa în sens invers, însă sunt neglijabile ca proporție cantitativă.
În procesul electroforetic intervine o mărime caracteristică - mobilitatea electroforetică care
reprezintă viteza de deplasare a unei particule încărcată electric corespunzătoare unui câmp
electric de un 1 volt/cm.
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice
B. Principiul metodei electroforezei proteinelor serice în gel de agaroză
Proteinele serice de analizat sunt depuse în godeurile unui gel de agaroză, submersat în tampon de
migrare (o soluție tamponată la pH 8,5 și bună conducătoare de curent electric). Acestea sunt
amestecate în prealabil cu o soluție de tampon de încărcare, care conține glicerol ce dă densitatea mare
probelor și un colorant, ce va constitui frontul de migrare, care se va deplasa în aceeași direcție cu
proteinele.
Gelul de agaroză cu probele proteice încărcate în godeuri se introduce în câmp electric. Proteinele
încep să se deplaseze spre anod (electrodul pozitiv) cu viteze dependente de mobilitatea
electroforetică, care depinde în principal de numărul de sarcini electrice pozitive de suprafață ale
proteinei.
Revelarea separării electroforetice a proteinelor în gel se
realizează prin colorare cu coloranți specifici (ex. Amido
black, Comassie briliant blue R250, Ponceau red, etc.).
Astfel se obţin spoturi colorate, cu poziţii decalate, datorită
mobilităţilor electroforetice diferite ale fracţiunilor proteice.
Documentul analitic obţinut se numeşte electroforegramă.
Electroforegrama proteinelor serice pe suport de gel de agaroză,
reprezentând profilele de separare specie-specifice ale unor probe de ser
provenite de la animale sănătoase. Probele sunt seruri de a – oaie, b –
vacă, c – porc, d – câine, e – pisică, f – cal.
LP5 - Electroforeza proteinelor serice

B. Principiul metodei electroforezei proteinelor

serice în gel de agaroză
Electroforegramele pot fi analizate semicantitativ,
prelevând imaginea digitală și procesând-o cu aplicații
software specifice (ex. Image J este un soft freeware,
Image Lab – soft dezvoltat de corporația BioRad),
pentru analiza densitometrică a benzilor specifice.
Se obțin astfel imagini care au aspectul unor vârfuri
și văi, vârfurile corespunzând zonelor din gel unde se
regăsesc cantitativ mai multe proteine și văile unde
proteinele sunt foarte puține sau lipsesc.
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice
B. Principiul metodei electroforezei proteinelor serice în gel de agaroză
Reactivi și aparatură:
1. Agaroză 0,5%
2. Soluţie tampon de migrare pH 8,6 (soluție stoc), obţinută astfel: 3,68 g acid dietilbarbituric (veronal) şi
20,6 g dietilbarbiturat de sodiu (medinal, veronal sodic) se dizolvă în apă distilată, eventual prin încălzire pe baie
de apă la 80-90°C, urmată de răcire și aducere la volumul final de 1000 mL.
3. Soluţie tampon de migrare (soluţie de lucru) pH 8,6, pentru migrarea rapidă, care se obţine prin amestecarea
unei părti apă distilată cu două părţi soluţie stoc (în volume).
4. Soluție de încărcare glicerol 30% în tampon de migrare (soluție de lucru), în care se dizolvă 2-3 mg de
albastru de bromfenol.
5. Soluţie pentru colorare: 20 mg Coomassie Brilliant Blue R-250 se dizolvă într-un amestec de 10:40:50
mL acid acetic glacial: metanol: apă distilată. După dizolvare se filtrează pentru a îndepărta eventualele cristale de
colorant nedizolvate.
6. Soluţie de spălare: 10:40:50 mL acid acetic glacial: metanol: apă distilată.
7. Sursă de alimentare (3-300 V, 4-400 mA), celulă de electroforeză confecţionată din material plastic care
conţine două electrozi de platină la extremități şi o punte în zona centrală, unde va fi turnat un gel de agaroză în
care se încarcă probele de analizat.
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice
B. Principiul metodei electroforezei proteinelor serice în gel de agaroză
Tehnica de lucru:
1. Pregătirea gelului - se cântăresc 0,25 g agaroză într-un pahar Erlenmeyer termorezistent peste
care se adaugă 50 mL tampon de migrare şi se aduce la fierbere, pentru solubilizarea agarozei. Paharul
poate fi acoperit cu parafilm – în care se pot perfora 1-2 mici orificii) pentru a preveni pierderea
volumului prin evaporare. Cât timp agaroza este caldă (DAR NU FIERBINTE!) se toarnă în suportul
gelului, între cele două bariere metalice şi se aşează pieptănul, care ajută la formarea godeurilor. După
ce gelul s-a răcit și a polimerizat (în max. 30 min. după turnare), se scoate pieptănul și se îndepărtează
barierele metalice, iar gelul este submersat în tampon de migrare.
2. Pregătirea și încărcarea probelor - se pregătesc probele, prin omogenizarea a 7 μL de ser cu
13 μL de soluție de încărcare. Probele astfel pregătite se pipetează în godeuri (câte 20 μl).
3. Desfășurarea electroforezei - aparatul de electroforeză se închide cu capacul și se leagă la sursa
de curent care debitează o tensiune de 100 V constantă timp de ~ 30 min. Când frontul de migrare s-a
deplasat aproximativ 2,5-3,0 cm față de punctul de pornire (godeurile) se întrerupe alimentarea cu
curent electric.
4. Colorarea gelului - se scoate gelul din celula de electroforeză cu grijă și se introduce în tăvița
de colorare. Se imersează gelul în soluție de colorare, timp de 5 min., cu omogenizare continuă.
LP5 - Electroforeza proteinelor serice
B. Principiul metodei electroforezei
proteinelor serice în gel de agaroză
Tehnica de lucru:
5. Decolorarea gelului - după colorarea
gelului, se îndepărtează soluția de colorare,
se clătește gelul de 2-3 ori cu apă distilată
și se imersează în soluție de decolorare,
timp de 10 minute cu omogenizare
continuă. Se schimbă soluția de decolorare
de minimum două ori, la intervale de câte
10 min. Operațiunea de decolorare se poate
efectua până când se obţine fondul gelului
transparent și există un contrast bun între
acesta și zonele unde s-au separat
proteinele serice.
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice
B. Principiul metodei electroforezei proteinelor serice în gel de agaroză
Tehnica de lucru:
6. Vizualizarea electroforegramei și interpretarea rezultatelor - se plasează gelul pe un fundal
luminos uniform și se fotografiază. Imaginea astfel obținută poate fi procesată cu programe de
densitometrie. Astfel, programul va analiza benzile proteice separate în gel (proteine individuale sau
grupuri de proteine cu aceeași mobilitate electroforetică), atribuindu-le câte o linie la jumătatea benzii
și o valoare densitometrică, în corelație cu intensitatea colorației și cu aria benzii (cu cât sunt mai
multe proteine în același loc în gel, cu atât colorația va fi mai intensă iar banda va fi mai groasă).

Pe baza acestor valori, programul va construi o

densitogramă, în locul benzilor, fiind reprezentate vârfuri, a
căror înățime este cu atât mai mare cu cât benzile au fost mai
intense, respectiv a căror bază are lățimea cu atât mai mare cu
cât benzile au un aspect mai difuz. În acest tip de program se
pot calcula ariile de sub fiecare vârf și se poate face o analiză
densitometrică semicantitativă (relativă).
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice
C. Interpretarea rezultatelor

În medicina umană și veterinară, analiza electroforetică a proteinelor sangvine este recomandată în

cele mai multe cazuri după identificarea unui dezechilibru între cantitatea de albumina (A) și
globuline totale (G) sangvine.
Proteinele serice toale se pot doza cu metoda Biuretului, iar albuminele se pot determina prin
reacția lor cu verdele de bromocresol, globulinele fiind calculate din diferența dintre concentrația
proteinelor totale și a albuminelor.
Anomaliile identificate în rezultatele testelor proteinelor serice impun studiul suplimentar al
proteinelor prin electroforeză.
Cazurile când se înregistrează o scădere a raportului A/G și profile electroforetice anormale ale
proteinelor serice pot fi cauzate de scăderea albuminei. Scăderea raportului A/G și profile
electroforetice anormale ale proteinelor serice pot fi cauzate și de creșterea globulinelor. Creșterile α1,
dar în principal a α2-globulinelor sunt observate frecvent și sunt asociate cu bolile inflamatorii acute.
 LP5 - Electroforeza proteinelor serice
C. Interpretarea rezultatelor
Exemple de densitograme tipice și anormale pentru a servi drept modele în interpretare. a)
Densitograma asociată unei probe de ser prelevată de la un câine sănătos, b) Densitograma asociată
unei probe de ser prelevată de la o pisică cu gamopatie policlonală. Un vârf cu bază largă este prezent
în regiunea γ (săgeată). c) Densitograma asociată unei probe de ser prelevată de la o pisică cu o
gamapatie monoclonală IgG cauzată de mielom multiplu - un vârf înalt și îngust este prezent în
regiunea γ (săgeată);
d) Densitograma asociată unei probe de ser prelevată
de la un câine cu mielom multiplu. Se observă două
vârfuri (săgeată). Foarte puține proteine se observă în
regiunea γ sugerând imunodeficiența concomitentă a
celorlalte clase de imunoglobuline;
e) Densitograma asociată unei probe de ser prelevată
de la un câine cu o gamapatie oligoclonală restrânsă din
cauza infecției cu Ehrlichia canis. Se observă un vârf
înalt și îngust (săgeată) suprapus pe o bază policlonală
largă în regiunea γ.