Totalizarea nr.

3
TEMA5: REACTIILE SEROLOGICE: REACTIA DE HEMOLIZA, REACTIA DE FIXARE A CPMPLEMENTULUI,
REACTIA DE IMUNOFLUORESCENTA, ANALIZA RADIOIMUNA, REACTIA IMUNOENZIMATICA, REACTIA DE
IMOBILIZARE

1.Lizinele si proprietatile lor.Reactiile de liza imuna.

Lizina este un aminoacid esential necesar organismului pentru producerea de proteine. Stimularea procesului de
producere a anticorpilor la nivelul sistemului imunitar, alaturi de producerea hormonilor si a enzimelor din organism.
De asemenea lizina preceda formarea L-carnitinei, necesara la randul sau pentru convertirea alimentelor in energie
si scaderea nivelului de colesterol rau (LDL) si a trigliceridelor.Se utilizeaza in tratamentul herpesului.

Componentele reactiilor de liza:

Ag(cellule bacteriene,hemati,etc)

Ac(lizine –IgG si IgM)

Complement ser proaspat de cobia sau ser de cobia liofilizat.

2.Reacţia de hemoliză (RHL).Componente si obtinerea lor. Efectuarea, citirea,

interpretarea. Utilizarea
- Ag – hematii de berbec, suspensie de 3%

- Ac – ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic)

- Complement

Principiul reacţiei: complexele Ag-Ac formate fixează C şi-l activează pe cale clasică, provocând hemoliza.

Intensitatea hemolizei se apreciază vizual (++++) sau prin măsurarea densităţii optice a hemoglobinei eliberate.

Utilizarea practică a RHL: pentru dozarea C, precum şi în montarea reacţiei de fixare a complementului

3. Reactia de fixare a complentului. Componentele reactiei si mecanismul ei. Tehnica

efectuarii reactiei de fixare a complementului. Lectura si interpretarea rezultatelor RFC.
Este o reacţie complexă, constituită din 2 sisteme Ag-Ac şi cu participarea C.

În RFC participă Ig capabile să fixeze C – IgM şi IgG.

RFC se utilizează în diagnosticul virozelor, infecţiilor bacteriene, etc

Toate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate în prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru.

Reacţia este însoţită de martori ai tuturor componenţilor.

Componentele reactiei:

1.Reactivul immunologic de referinta, antigen sau anticorp, in functie de indicatia reactiei.

2.Hematii de berbec.

3.Ser hemolytic antioaie.

4.Complement de cobia.

5.Placi standart din material plastic cu godeuri.

6. Pipete cu volum 0,1ml.

7. Eprubete, pipete gradate.

Tehnica efectuarii:

Reacţia se efectuează în 2 etape utilizând 2 sisteme.

I etapă – Sistemul de bază este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul bolnavului
sau serul imun) şi complement în doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37° C sau menţinut 16-18 ore
la 4° C. Dacă Ac se combină cu Ag omolog va avea loc şi fixarea C (efect frecvent invizibil).
II etapă – la sistemul de bază se adaogă sistemul indicator (hemolitic), constituit din hematii de berbec (Ag2)
combinate cu Ac specifici (Ac2). Peste 1h incubare la 37° C reacţia este terminată.

Interpretarea rezultatelor: dacă complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se observă (rezultat
pozitiv). Dacă Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul rămâne disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-
Ac2, provocând hemoliza (rezultat negativ)

4. Determinarea titrului complementului in serul sanguin. Importanta practica.

5. Reactia de imobilizare a bacteriilor. Componentele. Tehnica reactiei. Citirea reactiei.
Unii anticorpi anti-bacterieni pot provoca imobilizarea bacteriilor mobile (vibrioni, spirochete)

6. Reactia de imunofluorescenta Coons. (RIF directa si indirecta). Componentele. Tehnica.

Interpretarea reactiei.
Metoda directă (numai în scop de seroidentificare). Din materialul ce conţine Ag (material nativ, cultură pură, biopsie
tisulară) se prepară un frotiu, peste care se aplică serul imun specific cu Ac marcaţi cu fluorocrom. Peste 20 min de
incubare într-o cameră umedă preparatul este studiat la microscopul luminiscent. În caz de reacţie pozitivă se
observă luminiscenţă locală. Inconvenient – necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice pentru fiecare Ag.

Metoda indirectă. Poate fi utilizată pentru sero-identificare şi sero-diagnostic.

Pe frotiul ce conţine Ag se aplică Ac corespunzători nemarcaţi. Peste 20 min se spală minuţios preparatul, apoi se
adaogă anti-Ig fluorescentă, care se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat în numeroase
reacţii.

Anti-Ig se obţine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Ig.

Tehnica fondată pe fixarea C: Markerul fluorescent este un ser anti-complement care se va lega de complementul
fixat pe complexul Ag-Ac.

RIF se utilizează pentru identificarea rapidă a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic.

7.Reactia imunoenzimatica(elisa,elfa)directa indirecta.citirea si interpretarea

rezultatelor.Western-blot.Aplicarea practica.
Tehnica ELISA

În cazul utilizării sistemelor de fază solidă pentru separarea moleculelor libere şi a celor marcate, tehnica
este denumită ELISA (enzime linked immunosorbent asssay). Tehnica imunoenzimatică ELISA este bazată pe
reacţia Ag-Ac.

Sistemul de analiză constă din mai multe reacţii:

- Ag sau Ac este imobilizat pe suport solid (plăci de pastic cu godeuri)

- Ag sau Ac din proba de testat se leagă specific de reactantul imobilizat

- reactantul marcat enzimatic reacţionează cu complexul reactant imobilizat-Ag (sau Ac) din probă.

Reactantul marcat enzimatic format din Ag (sau Ac) conjugat cu o enzimă este activ atât imunologic cât şi enzimatic
şi reacţionează atât cu Ag (sau Ac) din probă imobilizat pe suportul solid cât şi cu substratul corespunzător enzimei.
 Vizualizarea reacţiei dintre reactantul enzimatic şi complexul Ag-Ac iniţial se realizează prin adăugarea unui
substrat corespunzător enzimei utilizate.

Formarea complexului este identificată prin reacţia de culoare care apare la adăugarea substratului specific (p-
nitrofenilfosfat disodic pentru fosfataza alcalină şi tetrametilbenzidina pentru peroxidază).

Intensitatea culorii indică prezenţa sau absenţa Ag, respectiv Ac din probă (se citeşte spectrofotometric folosind un
cititor de plăci ELISA).

Tehnica ELISA se poate folosi pentru evidenţierea Ac (boliinfecţioase, autoimune) sau a Ag (boli infecţioase,
neoplazice, endocrinologice, farmacologie).

Tehnica imunoblot (western blot) permite identificarea Ag dintr-un amestec.

I etapă – electroforeza în gel a probei de Ag

II etapă – transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloză

III etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv Ac dirijaţi contra Ag, apoi conjugatul marcat cu enzimă, care permite
depistarea Ac fixaţi. După o spălare se adaogă substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formează zone colorate
distincte. Utilizare: depistarea Ac anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali Proteinele sunt separate electroforetic în
gel poliacrilamid. Sub acţiunea câmpului electric are loc difuzia proteinelor conform greutăţii moleculare, aranjându-
se în zone liniare subţiri diferite: mai aproape de start se aranjează proteinele cu masă moleculară mare (120-150
kDa), la final se aranjează proteinele cu masă moleculară mică (5-10kDa).

Apoi lamela de gel este transferată pe o foaie de nitroceluloză amplasată între electrozii unei surse de curent
continuu. Sub acţiunea câmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloză, unde se fixează foarte
bine pe hârtie.

Proteinele fixate sunt marcate cu o enzimă (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase) incoloră.

8.Analiza radio-imuna (ARI).Importanta practica.

Analiza radioimună (ARI)

Principiul este identic cu cel al RIE

Ag se fixează la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaogă Ac testaţi care se vor combina cu Ag omolog.
După spălarea godeurilor, se adaugă un ligand radiomarcat (anti-Ig). După eliminarea excesului de izotopi prin
spălare, se măsoară radio-activitatea: ea este proporţională cu concentraţia Ac dozaţi.
Reacţia de neutralizare (RN): formarea complexelor Ag-

Ac duce la neutralizarea efectului biologic al Ag (neutralizarea toxinelor, enzimelor, virusurilor).

Reacţia de imobilizare

Unii anticorpi anti-bacterieni pot provoca imobilizarea bacteriilor mobile (vibrioni, spirochete)