LP2 Precipitarea proteinelor.

Determinarea punctului izoelectric al

proteinelor
LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea
punctului izoelectric al proteinelor

A. Considerații generale

• Proteinele sunt macromolecule, cu masă

moleculară de peste 10 kDa.
• Acestea sunt constituite din unul sau mai multe
lanțuri polipeptidice lungi formate din peste 100
de resturi de aminoacizi. Acești aminoacizi sunt
legați prin legătură peptidică, având un capăt
amino-terminal și unul carboxi-terminal.
• Fiind formate din resturi de aminoacizi,
principalele grupări care pot disocia sunt grupările
carboxil (–COOH) și grupările amino (–NH2).
• În funcţie de pH-ul mediului, proteinele pot fi
policationi, polianioni sau amfiioni (zwitterioni).
Numărul de sarcini pozitive şi negative ale unei
proteine este determinat de natura catenelor
laterale ale aminoacizilor constituenţi şi poate fi
evaluat prin titrare.
Tabel 1. Valorile pKa ale funcțiunilor ionizabile prezente în proteine
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor
• Valorile pKa (constanta de aciditate) ale acestor grupări variază în
funcţie de influenţele electronice locale exercitate de radicalii
aminoacizilor învecinaţi în urma plierii catenei polipeptidice.
• Fiind polielectroliţi, proteinele pot migra în câmp electric, direcţia
de migrare fiind determinată de sarcina netă a moleculei, care este
influenţată de pH. Pentru fiecare proteină există o valoare de pH la
care aceasta nu va mai migra în câmp electric, numită punct
izoelectric (pI), datorită faptului că numărul sarcinilor pozitive este
egal cu cel al sarcinilor negative, iar sarcina netă este zero.
• Ca urmare a acestui fapt, la valori ale pH < pI, proteinele au sarcini
nete pozitive şi vor migra spre electrodul negativ (catod), iar la
valori ale pH > pI, acestea vor avea sarcină netă negativă şi se vor
orienta spre electrodul pozitiv (anod).
Tabel 2. Valori ale punctului isoelectric al
proteinelor
LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

• La punctul izoelectric, proteinele au cea mai mică solubilitate şi precipită, având cea mai mare
capacitate de cristalizare.
• Când se cunoaşte compoziţia în aminoacizi a unei proteine, pI se poate estima cu formula:

(unde QpI este suma deviaţiei punctului izoelectric al aminoacizilor ionizaţi faţă de valoarea 7, iar n, m, q,
r şi s reprezintă numărul de aminoacizi):

• Fiind amfoliţi, proteinele interacţionează atât cu cationi, cât şi cu anioni. Astfel, acizii fosfotungstic,
picric,
tricloracetic, sulfosalicilic, percloric sunt folosiţi pentru precipitarea proteinelor, pentru că anionii acestora
formează săruri insolubile cu proteinele sub formă cationică (la valori de pH acid comparativ cu pI).
• De asemenea, ionii metalelor grele (Hg2+, Ag+ , Zn2+, Pb2+) sunt folosiţi pentru precipitarea
proteinelor la pH alcalin.
• Unii ioni metalici (Cu2+, Mn2+, Fe2+), nu formează cu proteinele săruri, ci complexe de coordinare cu
resturile imidazol şi amino din proteine.
LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

• Solubilitatea proteinelor într-un mediu de dispersie apos este influenţată pe de o parte, de distribuţia
resturilor de aminoacizi hidrofili şi hidrofobi expuse la suprafaţa proteinelor, şi pe de altă parte, de
pH-ul şi de tăria ionică a mediului.

• Astfel, dacă proteinele au la suprafaţa lor expuse un număr mare de grupări hidrofobe, stratul dublu
electric este extrem de instabil, iar forţele de repulsie sunt slabe, iar la pI, proteinele agregă datorită
faptului că forţele de atracţie (hidrofobe şi van der Waals) dintre macromolecule sunt puternice.

• În schimb, dacă proteinele au expuse la suprafaţă grupări ionice, stratul dublu electric este gros,
ecranând forţele de atracţie şi astfel proteinele au tendința de a se separa una de alta, fiind favorizate
să rămână în soluție.

• La variaţii mari de pH faţă de cel fiziologic, se modifică starea de ionizare a catenelor laterale ale
aminoacizilor, ceea ce schimbă distribuţia de sarcini la nivelul catenei polipeptidice şi posibilitatea
de formare a legăturilor ionice.

• Proteinele denaturate îşi pierd activităţile biologice caracteristice, iar proprietăţi fizice ca:
vâscozitatea, constanta de sedimentare şi absorbţia luminii sunt modificate.
LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor
B. Relevanța medicală a punctului izoelectric al proteinelor
• Proteinele cu formă sau structură anormală sunt deseori associate cu anumite patologii, atât în domeniul
veterinar cât și al medicinei umane, precum: Alzheimer, scleroza laterală amiotrofică, boli prionice, boala
Parkinson, amiloidoza etc.
• Formele anormale ale proteinelor sunt utilizate ca biomarkeri pentru anumite patologii și pot apărea din
cauza mutațiilor, plierii greșite a catenei polipeptidice posttranslațional, modificărilor posttranslaționale
excesive sau neobișnuite, cross-linkării și agregării proteinelor. Toate aceste deviații de la structura nativă
a proteinelor induc modificări ale proprietăților fizico-chimice, cum ar fi masa moleculară (MW) și pI.
• Punctul izoelectric prezintă un interes analitic deosebit, deoarece modificări minore ale secvenței de
aminoacizi sau a structurii secundare și terțiare, pot induce o modificare a pI (deoarece punctul izoelectric
al unei proteine poate fi estimat pe baza secvenței primare a proteinei).
• O observație interesantă în cazul pI teoretice calculate la nivel de proteom este că există un număr
comparabil de proteine cu pI în domeniul de pH acid și proteine cu pI în domeniul de pH alcalin, însă în
jurul pI≈7,4 acestea aproape că lipsesc.
• Unii cercetători cred că acestă penurie de proteine cu pI în jurul valorii pH-ului fiziologic se datorează
unei combinații de proprietăți fizico-chimice ale aminoacizilor și distribuției de MW și lungimi a
proteinelor, în timp ce alții consideră că este în concordanță cu tendința proteinelor de a evita pI egal cu
pH-ul mediului (când proteinele capătă încărcătură globală neutră şi devin predispuse la agregare).
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

• În cazul compartimentelor subcelulare, valorile pH-ului determinate experimental diferă semnificativ

(lizozom 4,8; vacuole 5,3; aparat Golgi 6,6; reticul endoplasmatic 7,1; citoplasmă 7,3; mitocondrie 7,5;
nucleu 7,7; peroxizom 8,2).
• Este improbabil să se găsească proteine cu pI egal cu valoarea pH-ului compartimentului subcelular
respectiv, deoarece acestea ar precipita și nu și-ar putea îndeplini funcția biologică.
• Plasma sanguină este menținută în mod normal, cu ajutorul mai multor sisteme tampon, într-un interval
îngust de pH (7,40±0,05). Astfel, pH-ul mediu al sângelui în general corespunde unui pI unde un număr
minim de proteine plasmatice au pI teoretic.

Fig.1 Distribuția pI teoretice ale proteinelor sangvine

 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

• Conform “ipotezei pI-pH”, domeniul de pI aflat în jurul pH-ului micromediului local este
îmbogățit în proteine anormale. Astfel, sângele fiind relativ ușor de prelevat, ipoteza pI-pH, ar
deschide noi căi pentru descoperirea biomarkerilor specifici anumitor patologii.
• Testarea ipotezei pI-pH necesită izolarea proteinelor într-un interval de pI îngust, care poate fi
efectuat în mod convenabil utilizând focalizarea izoelectrică (IEF), o tehnică de fracţionare
utilizată pe scară largă în studiile de proteomică, care utilizează un gradient de pH pentru a separa
proteinele, în funcție de punctul lor izoelectric. Când proteina ajunge în zona de pH care
corespunde punctului ei izoelectric, migrarea se oprește.
• IEF pe gel sau capilară este adesea folosită ca prima dintre dimensiunile separării moleculare (de
exemplu, în electroforeza 2D=IEF+SDS-PAGE).

Principiul electroforezei 2D: Când o proteină este plasată într-un mediu cu gradient de pH și supusă
unui câmp electric, se va deplasa inițial spre electrodul cu sarcina opusă. În timpul migrației prin
gradientul de pH, proteina fie va prelua, fie va pierde protoni. Pe măsură ce migrează, încărcarea
netă și mobilitatea sa vor scădea și proteina va încetini. În cele din urmă, proteina va ajunge în
punctul din gradientul de pH egal cu pI-ul său. Acolo, fiind neîncărcată electric, migrarea sa se va
opri.
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

Principiul electroforezei 2D
• Dacă această proteină ar ajunge să difuzeze într-o regiune cu pH mai scăzut, grupările sale ionizabile
devin protonate și proteina capătă sarcină pozitivă, fiind forțată înapoi spre catod.
• Dacă, pe de altă parte, proteina este poziționată la început într-o regiune de pH mai mare decât pI-ul său,
proteina va deveni încărcată negativ și se va deplasa spre anod. Astfel, proteinele sunt concentrate în
benzi fine în gradientul de pH, la valorile pI caracteristic individual. Această etapă de separare a
proteinelor după pI se numește isofocalizare (focalizarea izoelectrică).
• După isofocalizare probele pot fi tratate cu dodecilsulfat de sodiu (SDS) un detergent anionic, care va
încărca toate proteinele deja separate după pI cu o sarcină electrică negativă (se presupune că numărul de
molecule SDS legate este proporțional cu dimensiunea proteinelor).
• În teorie, raportul masă/încărcare va fi același pentru toate proteinele și astfel mobilitatea în timpul
electroforezei pe gel de poliacrilamidă (PAGE) va fi determinată de mobilitatea electroforetică a
proteinelor datorată în special masei moleculare.
• Separarea electroforetică a proteinelor folosind geluri de poliacrilamidă este o tehnică biochimică bine
stabilită.
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor
Principiul electroforezei 2D
• Gelurile de poliacrilamidă sunt formate prin polimerizarea unui amestec de
acrilamidă și bis-acrilamidă în prezența unei soluții tampon pentru a crea o
matrice de poliacrilamidă reticulată.
• Banda subțire de gel în gradient de pH ce conține proteinele izofocalizate
este plasată la punctul de start al unui gel de poliacrilamidă în gradient de
concentrație. Prin urmare, în câmp electric, proteinele mai mici vor migra
mai rapid iar cele de mari dimensiuni se vor deplasa cu dificultate mai mare.
• Proteinele cu același pI pot fi separate și diferențiate după mărimea lor
moleculară. În realitate, diverși factori, cum ar fi forma moleculei de
proteină sau afinitatea SDS anormală pot contribui la mobilitatea proteinei Figura 4. Principiul metodei 2-DE
în SDS-PAGE.

• În electroforeza 2D, un amestec de proteine complex (ilustrat în pasul 1) este mai întâi separat prin
focalizare izoelectrică de-a lungul unui gradient de pH pe un gel îngust (pasul 2). Acest gel îngust
este apoi suprapus pe o margine a unei plăci de gel de acrilamidă și supus SDS-PAGE utilizând un
câmp electric perpendicular (prezentat în pasul 3). În acest fel, amestecurile complexe de polipeptide
pot fi analizate pentru a separa proteinele individuale.
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor
C. Determinarea experimentală a punctului izoelectric al cazeinei

1. Fracțiile cazeinice
• Cazeinele sunt fosfoproteine și reprezintă principalele proteine din lapte.
• În laptele de vacă există câteva tipuri de cazeine. Cele mai răspândite
sunt cazeinele: αS1 (40 %), β (35 %), κ (12 %), αS2 (10 %) și γ (3–7 %).
Acestea se diferențiază prin structura primară, și deci și prin proprietățile
electrice. Fig.2. Structura submicelelor de cazeină
• Proteinele din lapte fac parte din două mari categorii, fracția cazeinică și
proteinele din zer. Cazeinele din laptele de bovine formează o structură
autoasamblată împreună cu fosfatul de calciu micelar (fig.2).
• Cazeinele α și β sunt prezente în interior și în întreaga structură, în timp
ce κ-cazeinele se găsesc mai ales pe suprafața micelelor. Într-o oarecare
măsură, micelele de cazeină sunt considerate sfere dure protejate de un
strat exterior de κ-cazeină.
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor
C. Determinarea experimentală a punctului izoelectric al cazeinei

• Cazeina este relativ hidrofobă, ceea ce o

face să fie slab solubilă în apă.
• Aceasta se găsește în lapte sub forma unei
suspensii de particule numite "micele de
cazeină„ care sunt ținute împreună datorită
ionilor de calciu, interacțiunilor hidrofobe
și legăturilor de hidrogen.
• Micelele de cazeină sunt constituite din
Fig. Structura cazeinei
submicele sferice (d = 12-15 nm), fiecare
conținând 20-25 molecule de cazeină. • Micelele de cazeină sunt extrem de stabile în condiţii
Aceste sub-micele sunt reunite prin normale, și încălzirea sau răcirea moderată nu
interacțiuni hidrofobe realizate între provoacă agregarea sau perturbarea structurii lor
proteine și punți de fosfat de calciu. interne. Cu toate acestea, o schimbare a condițiilor de
• Un strat „păros”, care constă din κ-cazeină, mediu ale laptelui, precum modificarea pH-ului
apare pe suprafața sub-micelelor și este laptelui, destabilizează integritatea micelară,
responsabil pentru stabilitatea acestora conducând la modificarea dimensiunii acestora.
(exercită repulsii electrostatice și sterice).
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor
• Aspectul alb al laptelui crud se datorează luminii difuzate de două tipuri de particule suspendate în
lactoserum (zer), globulele de grăsime și micelele de cazeină.
• Laptele conține aproximativ 3,3 g proteină/100 mL (2,7 g cazeină totală, 0,6 g proteină din zer). În plus,
anumite substanțe azotate neproteice sunt prezente în lapte: uree, creatinină, amoniac, peptide, nucleotide,
vitamine etc.
• Cazeina are un pH izoelectric mediu de 4,6, la care proteinele din lapte încep să precipite. Prin scăderea
pH-ului laptelui (aproximativ 6,6 pentru laptele proaspăt) până la 4,6, cazeina totală precipită lăsând în
soluție celelalte proteine din lapte, substanțele azotate neproteice și mineralele asociate micelelor de
cazeină.
• Tratamentul laptelui cu cheag (un extract de stomac de vițel care conține două proteaze implicate în
coagularea laptelui, chimozină și pepsină) este prima etapă a procesului de obținere a brânzei; acest
tratament duce la coagularea laptelui. Coagulatul obținut, după filtrarea zerului, constă în cazeină aproape
intactă la care sunt încă legate mineralele.
• pH-ul laptelui depinde de specia animalului care produce laptele. Laptele de la alte bovine și de la alte
mamifere variază ca și compoziție, dar are un pH similar.
• Din punct de vedere medical, pH-ul laptelui este crescut la vacile de lapte în lactație care prezintă mamită
subclinică sau infecție intramamară. Excepția face laptele produs în primele 4-7 zile după fătare, care
conține colostru, fiind un lapte bogat în proteine (în special imunoglobuline) și în grăsimi și este mai acid
decât în mod obișnuit.
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

• Severitatea infecției este pozitiv corelată cu scăderea pH-ul laptelui.

• Testarea pH-ului laptelui oferă o metodă precisă, ieftină și practică pentru diagnosticarea mamitei
subclinice sau a infecțiilor intramamare în ferme.

Tabel 3. Proporția, pI și masele moleculare ale fracțiilor proteice din laptele bovin
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor
2. Principiul metodei:
• Cazeina purificată este insolubilă în apă dar poate fi solubilizată în acetat de sodiu 0,1 N. Soluția de
cazeină astfel obținută este introdusă în soluții cu diferite valori de pH.
• Se observă pH-ul la care apare gradul maxim de turbiditate, cauzat de precipitarea proteinei. Această
valoare de pH corespunde pI al cazeinei.
• Cazeina este alcătuită din mai multe fracții proteice, care își găsesc pI în intervalul de pH 4,2-5,8.
Datorită proporțiilor diferite reprezentate de aceste fracții cazeinice, cel mai ușor de observat pI va fi cel
corespunzător fracției cu proporția cea mai însemnată.
Reactivi și materiale necesare:
• Soluție de acetat de sodiu (CH3-COONa), 0,1 N
• Soluție de acid acetic (CH3-COOH), 0,1 N
• Soluție de cazeină 1g/mL preparată în CH3-COONa 0,1 N
• Eprubete
• Pipete de 10 mL și pere de cauciuc cu trei valve
• Micropipetă cu capacitatea de 20-200 μL și vârfuri de unică folosință.
• Hârtie de pH cu precizie de 0,5 unități de pH, pentru domeniul acid și neutru.
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor
Modul de lucru pentru determinarea experimentală a punctului izoelectric al cazeinei:
• Se notează eprubete de la 1 la 9 și se realizează următoarea schemă experimentală (tabelul 4), cu un
interval de pH cuprins între 3,76 și 5,72.
• După adăugarea volumelor de acid acetic și acetat de sodiu, eprubetele se omogenizează.
• Se continuă cu adăugarea volumului de cazeină, și se lasă în repaus 10 min. pentru perfectarea precipitării.
• Se vor nota cu – absența precipitatului, + o slabă turbiditate a mediului, ++ turbiditate mai accentuată și
flocoane mici de precipitat cazeinic vizibile, +++ agregate proteice de mari dimensiuni, mediul are
turbiditate mică, toate proteinele fiind incluse în agregat.

Tabel 4. Mod de lucru pentru determinarea experimentală a punctului izoelectric al cazeinei

LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

3. Discuții și interpretarea rezultatelor

Fig. 3. Exemplu de rezultate experimentale și interpretarea lor. Precipitatul proteic apare în

alb, pe fundal întunecat. Imaginile sunt capturate de deasupra paharelor berzelius cu volum mic,
care au conținut soluțiile conform tabelului 4. Se observă apariția precipitatelor și se apreciază
cantitatea de precipitat din fiecare eprubetă. Urmăriți figura pentru un exemplu de evaluare a
precipitatelor. După completarea tabelului 4, utilizați hârtia de pH pentru a determina pH-ul
aproximativ în eprubetele care conțin cea mai semnificativă cantitate de precipitat cazeinic.
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

3. Discuții și interpretarea rezultatelor

• În mod obișnuit, dacă ați lucrat corect, ar trebui să puteți observa precipitate semnificative în mai multe
eprubete. Explicația aceastei observații este că în soluția de cazeină purificată nu există doar un singur
tip de proteină ci mai multe tipuri, fiecare cu pI-ul său specific.
• Cazeina este compusă din trei fracții principale, α- ,β- și κ-cazeina. În lapte, acestea se asamblează
formând micele de cazeină, cu α- ,β- cazeinele orientate către mediul hidrofob din miezul micelei și κ-
cazeina, o proteină hidrofilă, tapetând exteriorul micelei și asigurând o bună interacțiune cu mediul
apos înconjurător.
• Proporțiile din fiecare tip de subfracție cazeinică sunt specifice fiecărei specii de mamifere (pentru
bovine, tabelul 3).
• O mai bună discriminare a subfracțiilor cazeinice se poate face prin electroforeză 2D. Tehnica
presupune separarea proteinelor în două dimensiuni, mai întâi după pI și apoi în a doua dimensiune,
după masa moleculară. Pentru separarea în prima dimensiune, amestecul de proteine este încărcat într-
un gel de poliacrilamidă reticulată, de concentrație relativ mică, care prezintă și un gradient de pH
imobilizat, fiind supus unui câmp electric timp de mai multe ore.
 LP. 2 Precipitarea proteinelor. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

Fig.5. Electroforegramele 2DE ale cazeinei totale (a) și a beta-lactoglobulinei bovine (b)
• Fracția αs1-Csn a fost vizibilă ca un singur spot, alungit și a avut cel mai acid pI, între 4,2 și 4,6, în timp ce
fracția αs2-Csn a fost separată în 4 spoturi orizontale individuale, cu un pI variind de la 4,8 la 5,1 (fig.5a).
• β-Csn reprezintă proporția cea mai consistentă din cazeină și a fost vizibilă sub forma a opt sub-fracții
proteice, al căror pI a variat între 4,6 și 5,1.
• κ-Csn a apărut ca o serie de cinci pete orizontale la masa moleculară de 19 kDa. Acestea au format perechi
pe verticală cu patru spoturi mai grele. Izoformele κ-Csn au avut pI cel mai puțin acid, între 5,3 și 5,8.
• În condițiile puternic denaturante ale 2-DE, profilul Csn a evidențiat două spoturi subțiri alungite orizontal
cu greutăți moleculare și pI corespunzând dimerilor αs2-Csn și β-Csn (fig.5a).
• În cazul β-lactoglobulinei, care este o proteină individuală, se observă un profil de spoturi proeminente de
monomer dar și spoturi de dimeri și trimeri distincți, toate la același pI de 5,2 (fig. 2.5b). Existența dimerilor
și trimerilor poate fi explicată prin reticularea indusă de căldură pe parcursul purificării proteinei, fiind
rezistentă la condițiile de denaturare 2-DE.