Sunteți pe pagina 1din 75

UNIVERSITATEA “OVIDIUS” CONSTANTA

FACULTATEA DE: FARMACIE

SPECIALIZAREA:FARMACIE

ELECTROFOREZA CAPILARA DE INALTA


PERFORMANTA

Coordonator

Professor:

Absolventa:

Stoichici Gabriela
CAPITOLUL 1
-NOTIUNI INTRODUCTIVE DESPRE
ELECTROFOREZA-

Electroforeza este o metoda ce se bazeaza pe


migrarea componentilor dintr-o proba,supusa unei
diferente de potential,intr-o solutie(ex: molecule mari de
proteine intr-un electrolit tampon) sau printr-un suport
solid poros(hartie cromatografica,gel,etc),separarea
explicandu-se prin vitezele de migrare diferite ale
componentilor incarcati electric pozitiv sau
negativ(purtatori de sarcini),care sunt atrasi de polii opusi
ai campului electric,proportional cu natura,marimea si
sarcina lor.

Aceasta metoda de analiza se aplica ionilor


metalici macroionilor coloidali,cum sunt proteinele a caror
masa moleculara este de ordinul 105 – 106 , dar si altor
componente care pot fi transformati(prin derivatizare) in
particule incarcate electric,prin formare de complecsi
chelate etc.Trebuie precizat ca electroforeza aplicata
ionilor relativ mici se numeste”ionoforeza”, termenul de
“electroforeza” pastrandu-se si utilizandu-se pentru
deplasarea in camp electric a particulelor
coloidale,micelelor sau a unor macromolecule.

Sarcinile particulelor care se pot separa provin


din procesele de ionizare ale compusilor metalici(deci a
sarcinilor simple) care in solutie sunt electroliti tari,deci
practic total disociati.De asemenea,complecsii cationici si
cei anionici sunt purtatori de sarcini ,ca si ionii proveniti
din electrolitii slabi,cum sunt acizii carboxilici,bazele
organice si moleculele organice amfotere,cazuri in care
ionizarea este un proces mai complicat.

Spre ex: aminoacizii pot exista in functie de


pH-ul mediului ca si cationic,anioni sau zwitterioni,acestia
din urma fiind amfiioni,care au o sarcina pozitiva si una
negativa(amfiionii se gasesc la punctul”izoionic”
sau”izoelectric”,stare definita de Michaelis,stare in care
acest tip de ioni nu migreaza,deoarece migrarea
electroforetica este nula.

In cazul mediilor chimice mai simple,pH-ul la


punctual izoionic este egal cu pH-ul la punctual
izoelectric,asa cum este in cazul solutiilor continand
amfiioni,numiti si switterioni.In cazu mediilor
complexe,cum sunt cele care contin proteine,de care sunt
legate grupari carboxilice,in afara de efectul amfiionilor
interni au loc si interactii intre grupele carboxilice si unii
cationici minerali prezenti,cum sunt ionii Na+ ,K+ ,Ca2+
etc.In astfel de cazuri,punctul izoionic nu mai corespunde
cu pH-ul la care migrararea electroforetica este egala cu
zero.De aceea a fost necesara introducerea conceptuui
de punct izoelectric care este egal cu pH-ul la
care,indifferent de ionii prezenti,migrararea eletroforetica
este egala cu zero.Intre cele doua valori ale pH-ului exista
o diferenta ce depinde de natura solutiei si de
concentratia sa in electroliti,deci de conditiile mediului
chimic.

Spre ex:, in cazul albuminei serice punctual izoionic


in apa pura este la pH=5,37, iar punctual izoelectric in
apa pura este la pH=4,4.
Deplasarea particulelor purtatoare de sarcini
electrice,in camp electric,se face cu o viteza
caracteristica fiecarei specii,in conditii experimentale
date.Aceasta viteza se numeste”mobilitatea
electroforetica”si se exprima in m/secunda,dar intr-un
camp electric exprima in m2/volt/secunda(sau m2xV-1xS-
1
).Se mai utilizeaza si un submultiplu exprimat in cm2/V/s.

Pentru determinari electroforetice se pot


utiliza doua tipuri de metode si anume “eletroforeza de
frontiera” si eletroforeza zonala sau pe suport.
1)Electroforeza de frontiera,mai putin
importanta,dar utilizata inca pentru unele studii
fundamentale privitoare la natura si puritatea
proteinelor,consta in migrarea proteinelor intr-o solutie
tampon de electroliti,utilizand un aparat simplu format
dintr-o celula in forma de “U”, cu sectiunea
patrata,construita din sticla transparenta ,astfel incat sa
se poata observa migrarea proteinelor cu un
spectrometru sau cu un spectrofotometru,

Se introduce in celula cele trei proteine existente


intr-o solutie apoasa de electroliti si apoi, cu multa
atentie,se umplu bratele celulei in mod egal cu solutie de
electrolit suport,astfel incat sa nu se amestece fazele(a),
dupa care se inchid cele doua brate perfect
etans,observandu-se cele doua frontiere foarte nete intre
solutia de proteine si solutiile de electroliti din cele doua
brate(in fapt,frontierele sunt cele doua suprafete-intefete
de separare a fazelor)
Apoi se leaga cei doi electrozi ai celulei la o sursa
de current continuu(generator sau redresor)si se aplica o
diferenta de potential de 100-150 volti.

Se constata ca are loc o migrare a proteinelor


spre polul pozitiv,dar cu viteze diferite,determinate de
natura lor(marime,forma,sarcina etc).Se observa ca
proteinele A si C care au mobilitati net diferite(extreme)
se gasesc in stare aproape pura,fiind separate de zone
intermediare,desigur ca in fiecare zona se stabileste un
gradient de concentratie.Asa cum s-a spus,trebuie sa se
lucreze extreme de atent,deoarece frontierele greu de
localizat tind sa se extinda sub actiunea difuziei si a
convectiei.Daca se asigura stabilitatea termica a
continutului celulei si a intregului aparat se pot limita
aceste fenomene.Evident ca separarile prin eletroforeza
de frontiera au o durata mai mare,separarile fiind cu atat
mai fine si deci mai fragile,cu cat mobilitatile particulelor
au valori mai apropiate.Totusi masuratorile facute prin
aceasta tehnica sunt foarte precise.

2)Electroforeza zonala
In aceasta metoda migrarea componentilor de
separate este stabilizata de faptul ca lichidul in care se
produce,se gaseste intr-un suport sau mediu poros cum
sunt acetatul de celuloza sub forma de folii,hartia de filtru
special preparata pentru electroforeza sau un gel(ex. De
agaroza,agar etc).Pe astfel de suporturi se pot localiza
mai usor diferitele zone de migrare sau zone de
concentratie,fiecare zona continand un anumit
component de analizat.Cu ajutorul acestei tehnici se pot
obtine separari foarte bune,din cantitati foarte mici de
probe,daca se lucreaza atent si cu substante
pure(apa,eletroliti etc).De remarcat ca hartia se utilizeaza
mai putin desi separarile pe acetat de celuloza,care are o
structura mai omogena,sunt mai rapide si de buna
calitate.

3)Factorii care influenteaza electroforeza


a) Natura moleculelor separate
In primul rand influenteaza marimea
moleculelor,stiut fiind ca,la sarcini egale migreaza mai
repede moleculele mai mici,insa ionii cu diametre mici
sunt de regula solvatati,iar deplasarea ansamblului
molecula-solvent depinde se de celelalte substante
dizolvate in solutie.Asa se explica faptul ca unii metalici
mici,solvatati,au practic o mobilitate de acelasi ordin de
marime cu proteinele incarcate electric.

Influenteaza de asemenea mobilitatea,natura si


sarcina speciilor implicate,mediul chimic in care se
gasesc si care prin pH-ul lui influenteaza gradul de
ionizare al analitilor,forta ionica etc.La aceasta se mai
adauga posibilitatea formarii unor complecsi de asociatie
ionica.

Spre ex:,prezenta in solutie a ionului clorura poate


conduce la formarea HgCl2 neionizata,dar si a FeCl2+
,FeCl2+ ,FeCl3 si FeCl4- ,deci complecsi cationici si
anionici,sau moleculele neuter de FeCl3 care insa pot
hidroliza.

b)Aparatura,respectiv suportul,poate influenta


migrarea,deoarece acesta are o putere adsorbanta,ceea
ce poate incetini migrarea si poate largi zonele,ceea ce
se traduce prin aparitia cozilor(trenelor) pe
electroforegrama.Puterea adsorbata a suportului se poate
datora prezentei la suprafata lui a unor grupari
functionale capabile sa formeze legaturi(ionice, de
hydrogen,van der Waals) cu moleculele solventului si ale
substantelor de separate.De altfel se stie ca suprafetele
solide dobandesc o sarcina negativa,fata de care
dispun(orienteaza) sarcinile pozitive ale solventului si ale
particulelor incarcate pozitiv,astfel ca acestea pot fi
retinute,sau cel putin intarziate.Astfel de efecte au loc
mai ales pe hartie ca suport si intr-o masura mult mai
mica pe acetat de celuloza.
c)Curentul electric
Deplasarea eletroforetica a unei specii care se separa
este proportional cu mobilitatea,cu campul electric si cu
timpul de trecere a campului electric.

d)Influenta pH-ului

In cazul acizilor si a bazelor tari si in cazul


sarurilor,deci electrolitilor tari,pH-ul nu influenteaza
migrarea lor.
In schimb,influenta pH-ului este mai mare in cazul
compusilor organici,cum sunt acizii carboxilici si bazele
animate si chiar a substantelor amfotere.In acest ultim
caz,migrarea este posibila numai daca pH-ul solutiei de
electroliti are o valoare diferita de punctual(pH-
ul)izoionic.

e)Natura solutiei

Natura solutiei este determinate de natura


sarurilor,acizilor,bazelor si a altor substante existente in
aceasta,toate aceste substante influentand mult
mobilitatea.Compozitia chimica a solutiei influenteaza
mibilitatea speciilor de analiti care trebuie separate,chiar
si in cazul in care pH-ul si forta ionica sunt aceleasi.

4)Imunoeletroforeza

Separarile electroforetice pot fi imbunatatite


substantial prin asocierea eletroforezei cu diferite alte
tehnici intre care cromatografia pe gel,pe hartie,pe strat
subtire,rezultand tehnici noi cunoscute sub denumirea de
“cromatoelectroforeza”
Imunoeletroforeza este o astfel de metoda in care se
imbina migrarea eletroforetica cu precipitarea
antigen_anticorp in mediu de geloza.Aceasta tehnica este
utilizata la fractionarea si identificarea proteinelor
serice,in acest scop se utilizeaza un suport de masa
plastic(polimer) acoperit cu geloza praparata cu ajutorul
unui tampon potrivit.Suportul se uneste(se leaga) la cele
doua compartimente anodic si catodic,utilizand punti de
hartie cromatografica(eletroforetica)

In masa de geloza se scobesc doua


godeuri(adancituri) pentru primirea sarurilor de analizat si
un sant central in care se introduce serul unui animal
imunizat cu antigene umane.In prima etapa se pun
serurile de analizat in godeuri si anume intr-unul se
introduce serul bolnav,iar in al doilea serul etalon si apoi
se face separarea eletroforetica.Apoi,se pune serul
imunizat in santul central,lasandu-se in repaus 24 h ,timp
in care se produce difuzia in geloza a proteinelor separate
din serurile initiale si proteinele serului imunizat.La
contactul anticorpilor din serul imunizat cu proteinele
serice antigene,acestea din urma formeaza arcuri
caracteristice de precipitare.

5)Electroforeza prin izofocalizare

Electroforeza prin izofocalizare,numita si


electrofocalizare (EF),consta in migrarea substantelor cu
puncte izoelectrice diferite intr-un mediu gelificat,care
are intre cele doua extremitati ale sale un gradient
continuu de pH.Cele mai mari valori ale pH-ului se gasesc
in partea catodului,iar cele mai mici in partea
anodului.Aceasta tehnica se aplica amfolitilor care
migreaza in gel pana in momentul in care ating o zona cu
pH corespunzator punctului lor izoelectric.Ca
urmare,sarcina lor devine nula si ei se imobilizeaza prin
focalizare(concentrare) intr-o banda ingusta.In astfel de
cazuri fenomenele de difuzie sunt reduse.Gradientul de
pH se poate obtine in doua moduri:

- Cu un amestec de amfoliti(ex:acizi policarboxilici cu


polyamine),sub actiunea unui camp electric ce se
exercita intre doi electrozi,pozitionati la extremitatile
suprafetei gelificate,deci in zonele de pH extreme(cu
pH mai mare la catod si mai mic la anod)care se
ordoneaza in gel dupa migrarea lor in functie de
punctul lor izoelectric.
- Prin grefarea acestor amfoliti pe moleculele de
acrilamida prin legatura de natura covalenta.

6)Electroforeza bidimensionala

Electroforeza prin izofocalizare,eficienta pentru


separarea izoformelor proteinelor,se poate imbunatati
cupland-o cu eletroforeza practicata prin migrare intr-o
directie perpendicular cu prima(analogie cu alutia
cromatografica bidimensionala pe strat subtire).A doua
migrare se poate face in laurisulfat de sodiu (SDS, care
este dodecilsulfat de sodiu), care este un detergent
anionic,care poate rupe legaturile in care sunt implicate
grupari amino protonate ale moleculelor.Acest detergent
confera moleculelor o structura discoidala,aducand
numeroase sarcini negative.
O astfel de migrare pe un gel de poliacrilamida
tratata ca mai sus permite o “adevarata cernere” si
separare a moleculelor,in functie de marimea
lor,deoarece mibilitatea asociatilor proteina-SDS este
invers proportional cu logaritmul masei lor.

CAPITOLUL 2
- ELECTROFOREZA CAPILARA-

ELECTROFOREZA CAPILARA
Electroforeza capilara este o familie de tehnici
relationate care utilizeaza capilarele inguste de bor (20-
200 µm i.d.) pentru a separa cu inalta eficienta atat
moleculele mari cat si cele mici. Aceste separari sunt
facilitate de utilizarea unei tensiuni inalte care poate
genera EOF si EPF in solutia tampon si intre speciile
ionice respectiv in interiorul capilarului . Proprietatile
separarii si electroferograma corespunzatoare au
caracteristicile asemanatoare cu legatura dintre
traditionala electroforeza cu gel din poliacrilamid (PAGE)
si moderna cromatografie lichida de inalta
performanta(HPLC).
CE ofera un format nou pentru cromatografie lichidă
şi electroforeză pentru ca:
• foloseşte tuburi capilare în care se produce separarea
electroforetica;
• utilizeaza intensitati foarte mari ale câmpului electric,
de multe ori mai mari de 500 V/cm;
• foloseste tehnologia detectoarelor moderne, astfel încât
electroferograma seamănă adesea o cromatogramă;
• are eficienţă aproape ca cea a cromatografiei în fază
gazoasă în coloană capilară sau chiar mai mare;
• necesită minute pentru cantitati destul de substantiale
de probă;
• este uşor de automatizat pentru analiza cantitativă
precisă şi uşurinţa de utilizare;
• consumă cantităţi limitate de reactivi;
• se aplică la o selecţie mai largă de analiti comparativ cu
alte tehnici analitice de separare.
Configurarea instrumentalului de baza pentru CE este
relativ simpla. Tot ce se cere este un capilar din siliciu
topit cu o fereastra pentru vizionare optica, un generator
reglabil pentru tensiunea de alimentare, doua ansambluri
de electrozi, doua rezervoare de solutie tampon, si un
detector UV. Capetele capilarului sunt introduse in
rezervoarele cu solutia tampon si fereastra pentru
vizionare optica este aliniata cu detectorul. Dupa
umplerea capilarului cu solutia tampon proba se poate
introduce prin scufundarea unui capat al capilarului in
solutia proba si ridicarea capilarului scufundat cu un
picior (unitate de masura a distantei 1 ft = 0.305 m) sau
cam asa ceva mai sus de lateralele detectorului
rezervorului cu solutie tampon. Aproape toate lucrările
facute inainte de 1988 în CE au fost efectuate pe
dispozitivele facute in casa în urma acestei configuraţii de
bază. Desi relativ uşor de utilizat pentru experimentare,
aceste sisteme timpurii au fost incomode pentru analize
de rutină şi prea imprecise pentru analiza cantitativă.
O diagrama a unui instrument modern P/ACE™ 2000
Series este ilustrata in figura 1. Comparativ cu începutul
dezvoltarii acestor instrumente, cel prezentat oferă un
control complet automatizat,pe calculator, al tuturor
operaţiunilor,presiune şi injectare electrocinetica, un
colector de fractiune şi un autosampler (sampler=aparat
pentru luarea probelor, analizor), metode de dezvoltare
automatizate, control precis al temperaturii, precum şi un
sistem avansat de disipare a căldurii. Automatizarea este
critică pentru CE, deoarece operaţiunile repetabile sunt
necesare pentru o analiză cantitativă precisă.
Configuraţia de bază a sistemului de electroforeza
capilara P/ACE.

TERMINOLOGIA FOLOSITA PENTRU


ELECTROFOREZA
Există câteva diferenţe semnificative între
nomenclatura cromatografiei şi electroforeza capilară.
De exemplu, un termen fundamental în cromatografie
este timpul de retenţie. În electroforeză, în conditii ideale,
nimic nu este păstrat, astfel încât termenul analog devine
timpul migraţiei. Timpul de migrare (tm) este timpul de
care are nevoie o substanta dizolvata pentru a trece de la
începutul capilarului la fereastra detectorului.
Alţi termeni fundamentali sunt definiti mai jos.
Acestia includ mobilitatea electroforetica,µep (cm2/Vs),
viteza electroforetica vep (cm/s) , intensitatea câmpului
electric, E (V/cm).

1)

Mai multe caracteristici importante pot fi văzute din


această ecuaţie:
1) vitezele sunt termeni masurati. Acestea sunt calculate
prin impartirea timpului de migrare la lungimea
capilarelor pana la detector, Ld.
2) Mobilităţile sunt determinate prin împărţirea vitezei la
intensitatea campului. Mobilitatea este independentă de
tensiune şi lungimea capilarelor dar este foarte
dependentă de tipul pH-ului precum şi de temperatura
solutiei tampon.
3) Două lungimi ale capilarului sunt importante: lungimea
pana la detector, , si lungimea totală, . În timp ce
separarea măsurabila are loc în segmentul capilar, ,
intensitatea câmpului este calculat prin împărţirea
tensiunii la lungimea întregului capilar . Diferenta de
lungime Lt - Ld, este necesara pentru
realizarea conexiunii la rezervorul tampon. Pentru
sistemul P/ACE, această lungime este de 7cm. Prin
inversarea configuraţiei sistemului, această lungime de
7cm de capilar poate fi utilizata pentru efectuarea
separărilor foarte rapide.
Ecuaţia 1 este folositoare doar pentru determinarea
mobilitatii aparente. Pentru a calcula mobilitatea reală,
fenomenul de curgere electroosmotica trebuie să să fie
contabilizat. Pentru a efectua electroforeze reproductibile
, fluxul electroosmotic trebuie să fie atent controlat.

ELECTROOSMOZA
Unul din procesele fundamentale care conduce CE
este electroosmoza. Acest fenomen este o consecinta a
sarcinei de pe suprafata peretelui capilarului. Capilarele
din siliciu topit (cuart) care sunt de obicei folosite pentru
separari au grupuri silanol ionizabile in contact cu solutia
tompon continuta de capilar. Acest pI=1.5 este pentru
siliciul topit. Gradul de ionizare este controlat in principal
de pH-ul solutiei tampon. Fluxul electroosmotic se
defineste astfel:

(2)

unde este constanta dielectrica, este vascozitatea


solutiei tampon si este potentialul zeta masurat la planul
de forfecare aproape de interfata lichid-solid.
Peretele incarcat negativ atrage ionii incarcati pozitiv
aflati in solutia tampon creand un dublu strat electric.
Atunci când este aplicată o tensiune capilarului, cationii
din porţiunea difuzata a stratului dublu migreaza în
direcţia catodului si transportă apa cu ei. Rezultatul este
un flux net al soluţiei tampon în direcţia electrodului
negativ. Acest flux electroosmotic poate fi destul de
robust, cu o viteza liniară în jur de 2 mm/s la un pH de 9
în 20 mm borat. Pentru un capilar de 50 m, aceasta se
traduce
într-un volum al fluxului de aproximativ 4 NL/s. La pH=3
EOF este mult mai mic, de aproximativ 0,5 NL/s.
Potenţialul zeta este legat de inversul sarcinii pe unitatea
de suprafaţă, numărul electronilor de valenţă, si de
rădăcina pătrată a concentratiei electrolitului. Deoarece
aceasta este o relaţie inversă, creşterea concentraţiei
electrolitului scade EOF.
Aşa cum vom vedea mai târziu, fluxul electroosmotic
trebuie să fie controlat sau chiar suprimat pentru a rula
anumite moduri de CE. Pe de altă parte, EOF face posibila
analiza simultană de cationi, anionii, şi specii neutre într-
o analiză unică. La pH neutru spre alcalin, EOF este
suficient de puternic , mai puternic decât migraţia
electroforetică, astfel încât toate speciile sunt atrase spre
electrodul negativ. Ordinea migraţiei este:
cationii,speciile neutre, şi anionii.
Efectul pH-ului asupra EOF este ilustrat în figura 2.
Imaginaţi-vă că un ion amfoter cum ar fi un peptid este
separat în fiecare din cele două situatii descrise în figură.
La pH ridicat, EOF este mare şi peptida este incarcata
negativ. În ciuda migraţiei electroforetice a peptidei spre
electrodul pozitiv (anod), EOF este copleşitor, şi peptida
migrează spre electrodul negativ (catod). La pH scăzut,
peptida este încărcată pozitiv şi EOF este foarte mic.
Astfel, migraţia electroforetică a peptidei şi EOF se
indreapta spre electrodul negativ. În capilarele de siliciu
topit netratate majoritatea substanţelor dizolvate
migrează spre electrodul negativ indiferent de sarcina
atunci când pH-ul solutiei tampon este mai mare de 7,0.
La solutiile tampon cu pH acid cei mai multi ioni amfoteri
şi cationii vor migra, de asemenea, spre electrodul
negativ.
efectul pH-ului asupra fluxului electroosmotic

Pentru a asigura că un sistem este controlat în mod


corespunzător, este adesea necesar să se
măsoare EOF. Acest lucru este realizat prin injectarea
unei substante dizolvate neutre şi măsurarea timpului
necesar pentru a ajunge la detector. Substantele
dizolvate, cum ar fi metanol, acetonă şi oxid de mesityl
sunt frecvent utilizate. În cromatografia capilară
electrocinetica micelara (MECC) ,tehnica despre care
urmează să discutam mai târziu, o cerinţă ar fi ca
marcatorii solutiei dizolvate nepartitionate in micele se
impun de asemenea.
Pentru a efectua tehnici, cum ar fi focalizarea
izoelectrica (IEF) sau izotacoforeza(PTI), EOF trebuie să
fie suprimat. Acest lucru este posibil dacă este folosit un
capilar fara sarcina de exemplu teflonul sau alt capilar
corespunzator filmat . Aditivi ,cum ar fi metilceluloză
,sunt, de asemenea, eficienti în suprimarea EOF.
Suprimarea EOF va fi discutata mai târziu.
( teflon este o marcă de E.I. Du Pont de Nemours & Co)

MODURI ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE

Electroforeza capilară cuprinde o familie de tehnici


care au caracteristici diferite de operare si separare.
Tehnicile sunt:
• zona de electroforeză capilară
• focalizare izoelectrica
• electroforeză capilară cu gel
• izotacoforeza
• cromatografie capilară electrocinetica micelara
Fiecare dintre aceste moduri de CE vor fi analizate în
următoarele secţiuni.
Zona de electroforeza capilara
Zona de electroforeză capilară (CZE), cunoscuta şi ca
soluţie libera de electroforeza capilară, este cea mai
simplă formă de CE. Mecanismul de separare se bazează
pe diferenţele în raportul sarcina-masă. Sunt
fundamentale pentru CZE omogenitatea soluţiei tampon
şi intensitatea câmpului constantă pe tot parcursul
lungimii capilarului.
După administrarea şi aplicarea de tensiune,
componentele unui amestec de probe individuale, în zone
discrete aşa cum se arată în figura 5., pot fi aproximate.
Parametrul fundamental, mobilitatea electroforetică
poate fi aproximat cu teoria de la Debeye-Huckel-Henry

Zona electroforezei capilare

Sarcina neta este de obicei dependenta de pH. De


exemplu, cu pH-ul din gama de 4-10, sarcina neta a
sodiului este constantă cum este si mobilitatea sa. Alte
specii, cum ar fi acetat sau glutamat sunt incărcate
negativ cu pH-ul din gama de mai sus au mobilităţi
negative (migrează spre electrodul pozitiv). La pH alcalin,
migraţia lor neta va fi în continuare spre electrodul
negativ din cauza EOF. Ionii amfoteri cum ar fi
aminoacizii, proteinele si peptidele care prezintă
inversarea sarcinii lor,a pI-ului, de asemenea,
schimbări în direcţia de mobilitate electroforetică.
Separările de molecule mari şi mici se poate realiza
prin CZE. Chiar şi moleculele mici, în cazul în care
diferenţele raportului sarcina-masă poate sa nu fie mare,
pot fi încă separabile.
Capilarele. Capilarele cu un diametru intern de 25-75µm
sunt cele folosite de obicei. Siliciul topit(cuart) este
materialul ales datorita transparentei UV, durabilitatii,
(cand este imbracat cu poliamida), si a potentialului zeta.
Functionalizate si umplute cu gel capilarele devin
disponibile si pot fi acoperite in alte sectiuni.
Un nou capilar trebuie sa fie conditionat înainte de
a putea fi folosit. Se trateaza capilarul timp de 10 minute
cu 0,1 M de hidroxid de sodiu, 5 min cu apă, şi 10 min cu
solutia tampon. Această procedură pentru condiţionat
este importanta pentru a se asigura că suprafaţa
capilarului este completa şi uniform încărcata. Pentru
unele metode este necesar a regenera această
suprafaţă , astfel ca intre timp se clateste cu 0,1 M de
hidroxid de sodiu şi, în cazuri extreme, 1 M de hidroxid de
sodiu.
Procedura de regenerare este frecvent necesară
în cazul în care timpul de migraţie se schimba frecvent.
Acest lucru este cel mai des intalnit atunci când se
utilizează solutii tampon cu pH-ul intre 2-6. Regenerarea
este rareori necesara, atunci când se lucrează cu pH 9, cu
excepţia procedurii de pornire zilnica, sau a cazului în
care proba sau componentele matricei aderă la peretii
capilarelor.
Nu toate încercările de a stoca o capilară din silice
topită sunt de succes, de ex cu cat sunt mai mici
capilarele,cu atat sunt mai predispuse la colmatari. În
timp ce acest lucru nu este foarte grav pentru tevile din
dioxid de siliciu goale, deteriorarea capilarelor poate fi
costisitoare atunci când se utilizează
capilare modificate chimic. Următoarea procedură va
maximiza şansele de a stoca cu succes un capilar.
1) Se clăteşte capilarul cu 0,1 M de NaOH pentru câteva
minute.
(Nu face acest lucru cu capilare-chimic modificate.)
2) Se spală timp de 5 minute cu apă distilată.
3) Se pune un flacon gol, descăpăcite la capătul de ieşire
şi se sufla N2 prin capilare timp de 5 minute.
4) Scoateţi cartuşul capilarului de la instrument.

Efectul pH-ului. La un pH ridicat în cazul în care EOF


este substanţial, ordinea de migraţiei va fi cationi, specii
neutre şi anioni. Nici una dintre moleculele neutre nu va fi
separata, deoarece sarcina netă este zero. Anionii vor
migra în continuare spre catod, deoarece EOF este mai
mare decât migratia electroforetică.
La pH mai mic în cazul în care EOF este redus foarte
mult, atât cationi şi anioni pot fi încă măsurati, deşi nu
într-un termen unic. Pentru a măsura anioni, anodul
trebuie să fie dincolo de fereastra detectorului. De
asemenea, pentru a măsura cationi, catodul trebuie să se
afle dincolo de fereastra detectorului. Configurarea
electrica optima este realizata pur şi simplu prin
inversarea polarităţii a electrozilor.
Impactul pH-ului asupra analitului poate fi, de asemenea,
substantial, mai ales pentru compuşi complecşi, cum ar fi
ionii amfoteri (peptidele). Sarcina acestor compuşi este
dependentă de pH, precum şi selectivitatea de separare
este afectată în mod substanţial de modificarea pH-ului.
Ca o regulă, selectaţi un pH care este cu cel puţin două
unităţi mai mare sau mai mic fata de p a analitului
pentru a asigura ionizarea completă. La un pH extrem de
alcalin, EOF poate fi atât de rapid incat pot sa apara
separari incomplete.
Anumite proteine pot fi separate la pH acid. In
aceste condiţii, peretele capilar este neacoperit.
Proteinele în aceste condiţii vor fi încărcate pozitiv şi nu
vor interacţiona electrostatic cu peretele, deşi
interacţiunile hidrofobe pot apărea în continuare.
Limitarea acestei tehnici este precipitarea proteinelor. La
pI din proteine, simetria benzii tinde să fie slaba.
Solutiile tampon. O mare varietate de solutii tampon
(tabelul 1) pot fi folosite în CZE. O solutie
tampon este cea mai eficientă daca pH-ul are o unitate
sau doua diferenta fata de pI-ul sau. De exemplu,
pH-ul fosfatului este utilizat la aproximativ pH 2,5 şi pH 7,
şi boratul la pH-ul 9. Concentratia solutiei tampon tipice
este 50-100 mM.
Solutiile tampon cu ioni amfoteri cum ar fi bicina(2-
(bi(2-hidroxietil)amino)acetic acid), tricina(N-(2-hidroxi-
1,1-bi(hidroximetil)etil)glicina), CAPS(N-ciclohexil-3-
aminopropanesulfonic acid), MES(2-(N-
morpholino)etanosulfonic acid), şi Tris((HOCH2)3CNH2.)
sunt de asemenea, frecvente, în special pentru separarea
proteinelor si peptidelor. Avantajul solutiilor tampon cu
ioni amfoteri este conductivitatea scăzuta atunci când
solutia tampon este utilizata în jurul pI-ului. Avantajul
aceasta este fluxul mic curent şi astfel reducerea caldurii
Joule. În anumite preparate tampon, în special cele
destinate separarii de proteine, saruri cum ar fi clorura,
fosfatul şi sulfatul se adaugă la mediul tampon. Aceste
săruri adaugate afecteaza structura proteinei, care, la
rândul său, poate avea un impact asupra separarii.
Concentraţia de sare are ,de asemenea, efecte asupra
EOF datorate în parte unei perturbari a sarcinii dublului
strat al peretilor capilarelor. Limitarea majoră a cantităţii
de sare care poate fi adăugata la un preparat tampon
este căldura prin efectul Joule.
Diversi aditivi tampon (tabelul 2) pot fi utilizati pentru a
schimba selectivitatea de separare. Aditivii tampon pot
modifica, printre altele,mobilitatea electroforetică. Cu alte
cuvinte, doi compuşi care au
mobilităţi identice într-un sistem tampon simplu pot fi
diferenţiati cu un aditiv. Alţi aditivi, cum ar fi agenţii
tensioactivi sau ciclodextrinele, formează un mediu
eterogen care defineşte noi clase de CE, despre care vom
discuta mai târziu. Toate solutiile tampon trebuie să fie
filtrate prin filtre de 0.45- m
înainte de utilizare.

Tabelul 2. Aditivii tampon pentru CZE


ADITIVI FUNCTIE
Saruri anorganice Schimbari in conformatia
proteinelor
Solventi organici Dizolvant, modifica fluxul
electroosmotic
Uree Dizolva proteinele si
denatureaza oligonucleotidele
Acizi sulfonici Agenti de asociere ionica,
agenti de interactiune hidrofobica
Acizi tensioactivi Inverseaza sarcina peretelui
capilar
Derivati de celuloza Reduce EOF, asigura un
mediu de sortare
Amine acopera grupurile silanol libere

Legatura cu peretele capilar. O problemă cu CZE este


“lipirea” electrostatică a substantelor cationice pe pereţii
tubulaturii. Acest efect este observat la proteine atunci
când operează într-o solutie tampon
care are un pH mai mic decat al analitului. Această
problemă poate fi depăşită functionand cu cel puţin două
unităţi ale pH-ului mai mult decat pH -ul proteinei, dar în
unele cazuri, pH-ul mai mare nu poate fi
optim pentru separare. În ciuda acestor probleme,
proteinele, în special cele de dimensiuni similare, pot fi
cel mai bine separate în soluţie libera. Utilizarea
capilarelor tratate este unul din modurile, care pot servi
la reducerea “lipirii” de perete.
O altă procedură recent dezvoltata implică
utilizarea unei concentratii mari de fosfat a solutiei
tampon pentru a ecrana sarcina pe interiorul peretelui
capilarului şi capilare scurte (20 cm), cu teava
mica(25µm) manevrate in campuri electrice de
intensitate mare care permit separarea rapida , astfel
minimizand timpul de şedere a proteinelor în capilar.
Această abordare are nevoie de un excelent sistem de
control al temperaturii capilarului, în vederea eliminarii
căldurii generată de tensiuni şi curenţi mari.
Acoperirea capilarului. Reducerea sau eliminarea
EOF poate fi utila pentru a permite separările
electroforetice directe care trebuie efectuate. Mai
convingătoare este capacitatea de a elimina adsorbţia
substantei dizolvate. O varietate a invelisurilor este
posibilă inclusiv unele faze utilizate pentru o
cromatografie în fază gazoasă în coloană capilară.
Utilizarea acoperiri hidrofile poate fi utila în suprimarea
adsorbţiei compusilor hidrofobi. De asemenea poate fi
suprimata si “lipirea” electrostatica. Acoperirea
hidofobica, coroborata cu surfactanti neionici, ca aditivii
tampon, pare promiţătoare, de asemenea, multe
companii au început să introducă capilare cu faza
combinata. Aceste capilare ar trebui să extindă în
continuare gama de compuşi pentru care separarea prin
CZE este aplicabila.
Focalizare izoelectrica
Premisa fundamentală a focalizarii izoelectrice
(IEF) este că o moleculă va migra atât timp cât este
incarcata cu sarcina electrica. Cand devine neutra, se va
opri din migratia în câmpul electric. IEF este condusa într-
un gradient al pH-ului în cazul în care pH-ul este mic la
anod şi ridicat la catod (Figura 7). Gradientul pH-ului este
generat cu o serie de substanţe chimice cunoscute sub
numele de transportatori amfoliti de amfoteri. Atunci
când este aplicată o tensiune, amestecul amfolit se
separă în capilare. Amfolitii care sunt încărcaţi pozitiv, vor
migra spre catod în timp ce cei incarcati negativ
migrează spre anod.PH-ul, apoi va scădea la sectiunea
anodica şi va creşte la sectiunea catodică. În cele din
urmă, migraţia amfolitului va înceta atunci când fiecare
amfolit ajunge la punctul său izoelectric şi nu mai este
incarcat electric. Iniţial, o substanta dizolvata cu o sarcina
negativa va migra spre anod, în cazul în care întâmpină o
scădere a pH-ului solutiei tampon. În cele din urmă,
substanta dizolvata intalneste o zona cu un pH unde
sarcina sa electrica devine zero , punctul izoelectric (pI),
si migratia se opreste. Cu cat este mai mare numarul de
amfoliti din solutie cu atat mai lina este panta pH-ului.
Focalizarea izoelectrica

PH-ul solutiei tampon trebuie să fie mai mic decât pI-ul


celor mai multi amfoliti acizi pentru a preveni migraţia în
interiorul analitului. De asemenea, catolitul trebuie să
aibă un pH mai mare decât amfolitul cel mai de bază.
Este evident că EOF şi alte forţe convective trebuie să
fie suprimate pentru ca IEF să fie eficientă. Peretii
capilarelor pot fi acoperiti cu metilceluloza sau
poliacrilamida pentru a suprima EOF. Acoperirea tinde să
suprime absorbtia proteinelor, de asemenea. IEF este în
general utilizata pentru separari de înaltă rezoluţie a
proteinelor şi polipeptidelor, dar ar putea fi folosita pentru
orice substanţă amfoterica, cu condiţia ca o serie de
amfoliti sa faca parte din gama pI-ului utilizat.
Electroforeză capilară cu gel

Electroforeza tradiţională cu gel este efectuata


într-un mediu anticonvectiv cum ar fi poliacrilamida sau
agaroza. Compoziţia mediului poate, de asemenea,servi
ca o sită moleculară pentru a efectua separările dupa
dimensiuni (figura 9). În plus, gelul suprima EOF. Din
cauza unei lungi istorii a acestei tehnici, adaptarea la CE
este foarte de dorit. Acest lucru este deosebit de valoros
pentru separările ADN deoarece nici o alta tehnica până
în prezent nu a furnizat astfel de separări dramatice.
Coloanele capilare cu gel , au început să fie introduse pe
piata din numeroase surse pentru comercializare.
Capilarele din poliacrilamida umplute cu gel sunt de
obicei folosite, deşi noi formule polimer cu o mai mare
stabilitate in câmpul electric aplicat vor fi introduse în
scurt timp. Gelurile de agaroză nu sunt în măsură să
reziste incalzirii produse de înaltă tensiune utilizata în
electroforeza capilară cu gel(CGE).
Electroforeza capilara cu gel.
Există două clase fundamentale de geluri care pot fi
utilizate în CGE. Acestea sunt ilustrate în figura 10.
Gelurile fizice obţin structura lor poroasa datorita legăturii
de polimeri şi sunt destul de brute fata de schimbările din
mediului. Hidroxipropilmetilceluloza si polimerii similari
pot fi folositi pentru a forma geluri fizice. Gelurile chimice
utilizeaza legaturi covalente pentru a forma structura
poroasa. Aceste geluri sunt mai puţin brute, şi este dificil
de a schimba solutiile tampon odata ce se formează
geluri. În CZE şi alte forme de "deschideri-tubulare" ale
CE, capilarul este umplut cu un tampon de presurizare.
Pentru
capilarele cu umplute cu gel, aceasta tehnica ar duce la
extrudarea gelului.Ureea şi de alţi agenţi, cum ar fi un
tampon Tris-borat-EDTA, se adaugă înainte de
polimerizare. Poliacrilamida reticulară este, de obicei
selectata ca agent formator de gel.

Geluri fizice si chimice.


CGE se efectueaza de obicei in capilare de 50 -
100µm cu lungime de la 10cm la 1 m. O mai bună
rezoluţie este găsita pentru capilarele mai lungi, dar
timpul de desfasurare este uneori excesiv. Compoziţia
gelului din capilar este mai bine manipulata pentru a
optimiza rezoluţia. De exemplu , creşterea concentraţiei
de gel îmbunătăţeşte rezoluţia dar scade intervalul masei
moleculare accesibile. Tensiunea este oarecum limita,
deoarece intensitatea câmpului peste 500 V/cm poate
provoca încălzirea capilarelor şi, în final, goluri.
Proteine.- Proteinele denaturate cu 2-
mercaptoetanol functioneaza, de obicei, cu un sistem de
prindere SDS-PAGE. În aceste condiţii, toate proteinele au
aceleaşi raport sarcina-masă, deoarece sarcina initiala
este eclipsata de legatura SDS.Într-adevăr, o cantitate
constanta de SDS, 1,4 g, este adsorbit pe fiecare gram de
proteine. SDS este anionic; prin urmare, toate proteinele
devin încărcate negativ şi migrează spre anod. Proteinele
se desfasoara (cu condiţia ca legăturile disulfit sa fie
rupte) şi devin ca un stalp de referinta in structura
permitand cernerea uniforma pentru separarea
moleculară dupa dimensiune. Un tampon tipic este de 90
mM Tris-fosfat,pH-ul 8.6, 0.1 SDS%. O diagrama de
calibrare a mobilitatii in functie de greutatea moleculară
permit misiuni in functie de dimensiune ale diferitelor
fragmente. Injectarile electrocinetice sunt utilizate în
CGE, deoarece injectarea sub presiuni-mediate ar duce la
extrudarea gelului. Capilarele scurte de 10-20 cm sunt
folosite iar intensitatea câmpului se apropie de 400 V/cm.
În aceste condiţii, există o corelaţie liniară între mobilitate
şi greutate moleculară. Jurnalul de mobilitate functie de
procentul compoziţiei monomer (T%) al gelului este, de
asemenea liniar. Proteinele sunt de obicei denaturate în
SDS 1% şi 2% β -mercaptoetanol pentru 30 min la 90 °C.
Ca şi în electroforeză convenţionala placa-gel, migraţia
scade pe măsură ce creşte dimensiunea porilor (mai mic
% T). Timpul de separare poate fi, de asemenea, redus
prin utilizarea unei tensiuni mai mari, cu condiţia ca
disiparea căldurii sa fie optima. Capilarele scurte pot fi
folosite şi la aceeasi intensitate a campului electric
pentru a accelera în continuare separarea.

ADN-ul. Separarea oligonucleotidelor şi a produselor


secvenţă de ADN a fost realizată în geluri de
poliacrilamidă. Pentru restricţionarea fragmentelor şi a
oligonucleotidelor mai mari, geluri cu foarte putine
valente (crosslinker, cross-link = legatura ce leaga un
polimer de altul) sau deloc par a fi cele mai eficiente
datorită dimensiunii mai mari a porilor de gel. Separarea
deoxioligonucleotidelor, cum ar fi poli( este uşor de
realizat într-un 8% T gel cu un tampon constând in 100
mM Tris-borat, pH 8.3 cu 2 mM EDTA şi 7 M uree, în 35
min cu unitatea de baza a rezolutiei. Determinarea
purităţii sintetice a oligonucleotidelor este o aplicaţie
importantă a CGE. Figura 11 prezinta separarea unui
homopolimer sintetic 50-mer timidină cu o intensificare
de modulo 5. Secvenţele de eşec sunt bine separate, cu
unitatea de bază ca rezolutie.

CGE a timidinei sintetice homopolimer cu modulo 5


amplificare. Solutia tampon,25mMTris, 25mMacid boric,
7M uree; gelul, poliacrilamida, 7.5%T, 3.3%C. Prin
amabilitatea A.Paulus si J.Ohms, Beckman
Instruments,Inc.
ADN-ul dublu catenar poate fi separat fizic cu geluri.
Capilarele cu suprafata modificata sunt cele mai bine
utilizate, deoarece fluxul de electroosmotic este complet
suprimat. În aceste condiţii, timpul de migrare al
fragmentelor este direct legat de numărul de baze
prezente. Figura 12 prezinta separarea unei restricţii
digestive Hae III de øX174 ADN. Aceste separări sunt
foarte eficiente, deoarece randamentele de vârf
reprezinta 118 perechi de bază produce 2.000.000 placi
teoretice pe metru. Utilizarea de bromură de etidiu ca un
aditiv tampon îmbunatateste separarea, permitand o
buna rezoluţie a vârfurilor care reprezintă 261 şi 271 de
perechi de baze. Rezoluţia acestui sistem este de 3
perechi de baze. Printre alte aplicaţii utile pentru acest
sistem sunt separările al PCR-ADN amplificat, precum şi
lichidele de restrictie digestiva.
Separarea restrictiei digestive Hae III cu øX174 DNA
prin CGE cu un gel fizic..Solutia tampon, 89 mM Tris-
borat, 2 mM EDTA,
pH 8.5, 0.5% hidroxipropilmetilceluloza, 10 µM bromura
de etidiu;
capilarul, DB-17invelis, 100 µm x50 cm (lungimea pana la
detector);
intensitatea campului, 175 V/cm; detectarea, 260 nm;
concentratia probei, 10 µg/mL.
Electroforeză capilara cu gel este încă în fază
incipientă. În timp ce majoritatea laboratoarelor academic
isi produc propriile capilare fie cu legatura covalenta a
poliacrilamidei cu peretele capilarului sau prin invelirea
capilarelor cu geluri, este de aşteptat ca majoritatea
utilizatorilor vor achiziţiona de la furnizori capilarele
comerciale. De asemenea, soluţiile tampon optimizate
pentru separarea ADN-ului în formatul unui gel fizic sunt,
de asemenea, furnizate de către producători. Una dintre
multe forţe care dirijeaza dezvoltarea capilarelor
umplute cu gel este secvenţierea ADN-ului. Speranta este
ca un instrument CE multiplex cu geluri va forma baza
unui instrument la scară genomica

Izotacoforeza
Înainte de 1981, izotacoforeza (PTI) a fost folosit cel mai
des folosita tehnica din electroforezele capilare, deşi
capilarele au fost destul de mari (250-500 m), fata de
standardele de azi. Un instrument comercial,
LKB Tachophor, a fost introdus la mijlocul anilor 1970.
Ca IEF, ITP se bazează pe fluxul de electroosmotic
zero, şi pe un sistem tampon eterogen. Capilarul este
umplut cu un electrolit de conducere, care are o
mobilitate mai mare decât oricare dintre componentele
probei care urmează să fie determinata. Apoi proba este
injectata. Un electrolit de încheiere ocupă rezervorul
opus, şi mobilitatea ionica a acelui electrolit este mai
mică decât oricare dintre
componentele eşantionului. Separarea va avea loc în
diferenţa dintre electroliţii de conducere şi cei de
încheiere in baza mobilităţi individuale ale analitilor. Aşa
cum se arată în figura 13, limitele zonei stabile se
formeaza între componentele individuale, care rezultă din
separari extrem de eficiente. Ambele specii, anionii şi
cationii ar putea fi determinati, dar nu în acelaşi timp.

Izotacoforeza anionica.
În instrumentele timpurii, detectarea se facea
prin conductibilitate sau cu conductibilitate diferenţiala.
Detectarea datorita conductibilitatii a dat un model scara-
pas dupa fiecare ion individual trecut de electrozi.
Conductivitatea diferentiala ar putea restaura
izotacoferograma la o serie de vârfuri convenţionale.
Detectarea directă UV , de asemenea, oferă un aspect
familiar electroferogramei în prezenţa distanţierelor. Un
distantier este un o substanta dizolvata neabsorbanta cu
o valoare a mobilitatii care se încadrează între mobilităţi
de două vârfuri, care trebuie rezolvate. Dezavantajul ITP
este că dacă nu se folosesc distanţierele, benzile
adiacente sunt în contact intre ele. O a doua problemă
este că, în comparaţie cu CZE, selecţia şi optimizarea
solutiei tampon sunt mai complicate. De exemplu, pentru
a determina cationii, electrolitul catodic de conducere ar
putea conţine un acid extrem de mobil (H +), în timp ce
electrolitul anodic de încheiere s-ar putea conţina un acid
slab, cum ar fi acidul propionic. Cele mai multe dintre
aceste puncte sunt ilustrate în figura 14 pentru ITP unor
anioni. Graficul de jos este urmarirea conductivitatii
directe (reprezentat ca rezistenta) în timp ce graficul
superior reprezintă conductivitatea diferentiala.
ITP-ul unui amestec de anioni cu detectarea folosind
conductivitatea
Capilarul, 105 µm de ex:fluorurat cu copolimer etilenă-
propilenă;conducator, 10 mM acid hidrocloric titrat la
pH6.0 cu histidina, 2 mM hidroxietilceluloza;terminal(de
incheiere), 5 mM MES; curentul, 10 µA.
Cheie: R, semnal pe aparatu de masura al conductivitatii
(rezistenta în creştere); L, clorură; 1, sulfat; 2, cloratul;3,
cromat; 4, malonat; 5, adipat; 6, benzoat;7, impuritate; 8,
acetat; 9, ß-bromopropionat; 10, naftalină-2-sulfonat; 11,
glutamat;12, enantat; T, MES. Reprodus în parte din J.
Chromatogr., 267, 67 (1983) (fig. 3).
Izotacoforeza are două caracteristici, a căror
combinaţie duce la metodele electroforetice unice: toate
benzile se misca cu aceeasi viteza şi benzile sunt
focalizate. De exemplu, benzile foarte mobile au
conductivitate mare si, ca rezultat al acestui lucru, au o
cădere de tensiune joasa de-a lungul benzii. Având în
vedere că mobilitatea este produsul conductibilitatii şi
căderii de tensiune, şi conductibilitatea şi căderea de
tensiune sunt invers proporţionale, benzile de viteza
individuale sunt auto-normalizatoare. Focalizarea este, de
asemenea, o consecinţă a normalizarii vitezei. De
exemplu, dacă o banda difuzează într-o zona vecina,
aceasta va accelera sau va frana datorita campului
electric intalnit şi va reveni in locul initial.
Lucrand cu instrumentele moderne a fost un succes,
atât cu capilare tratate cat şi netratate din siliciu topit.
EOF poate fi suprimata cu 0,25%
hidroxipropilmetilceluloză. Un electrolit conducator bun
este de 5 mM acid fosforic. Valină (100 mm, ajustata la
pH apropiat cu amina primara) este un electrolit util de
încheiere. La începutul unei separări, curentul poate fi
destul de mare, deoarece electrolitul extrem de mobil
umple complet capilarele. Pe masura ce separarea
progreseaza, curentul întotdeauna scade la cel mai puţin
mobil analit de incheiere care intră în capilare.
Au existat unele publicaţii recente care folosesc ITP
ca un pas de preconcentrare pentru CZE. Pentru că ITP
este o tehnica de focalizare, utilizarea capilarelor cu
diametru mare nu provoacă deteriorarea rezoluţiei asa
cum se intampla pentru CZE.

CROMATOGRAFIA CAPILARA ELECTROCINETICA MICELARA

Poate cel mai intrigant mod al CE pentru determinarea


moleculelor mici este MECC. Utilizarea soluţiilor
tensioactive care formează micele poate da naştere la
separari care seamana cu faza inversa a LC , cu
beneficiile CE. Spre deosebire de IEF sau ITP, MECC se
bazeaza pe o EOF robustă şi controlabila.
Micelele. Micelele sunt agregate amfifile ale moleculelor
cunoscute sub numele de tensioactivi. Acestea sunt
molecule cu lanţ lung (10-50 de unităţi de carbon) şi sunt
caracterizate ca având o coada lunga hidrofoba şi cap un
grup hidrofil. Micelele normale sunt formate în soluţie
apoasă cu cozi hidrofobe indreptate spre interior şi cap
hidrofilic indreptat spre exteriorul soluţiei apoase. O
schema este prezentata în Figura 15. Forma micelei este
o consecinţă a efectului hidrofob, anume, acestea se
formeaza pentru a reduce energia libera a sistemului.
Coada hidrofoba a tensioactivului nu poate fi dizolvata în
soluţie apoasă. Pe langa concentratia tensioactivului
cunoscuta si sub numele de concentraţia critică a micelei
(CMC), agregatul este pe deplin format.

Modificările fizice, cum ar fi tensiunea superficială,


vâscozitatea, şi capacitatea de a difuza lumina însoţesc
formarea micelei. Micelele inverse, care formeaza
solventi organici, nu au fost studiate în MECC.

Cromatografia capilara electrocinetica micelara


Exista patru mari clase de tensioactivi: anionici,
cationici, amfoteri si nonionici, exemple care se regasesc
in tabelul 4. Din acestea patru primele doua sunt cele mai
folosite in MECC. Ambi compusi sintetic si natural care
apar au fost folosite pentru MECC. Varietatile sintetice
includ SDS anionic şi bromura de cetiltrimetilamoniu
cationica(CTAB). Compusii naturali, cum ar fi sărurile
biliare (taurocolat de sodiu, etc) sunt de asemenea utili.
Tabelul 4. Tensioactivi, Clase si Proprietati
Tensioactiv Tipul CMC
Agregarea
SDS anionic 8.1x 62
CTAB cationic 9.2x 170
Brij-35 nonionic 1.0x 40
Sulfobetaina amfoter 3.3x 55

SDS=sulfat de sodiu dodecil; CTAB=bromura de


cetiltrimetilamoniu; Brij-35=polioxietilena-23eter lauril;
Sulfobetaina=N-dodecil-N, N-dimetilamoniu-3-propan-1
acid sulfonic.

SDS este cel mai utilizat de agent tensioactiv în MECC.


Este disponibil în forme extrem de purificate şi este ieftin.
Greutatea sa moleculara este de 288 şi CMC este de 8
mM. Numărul de agregare (numărul de molecule/micelle)
este 62.
Micelele au capacitatea de a organiza analiţii la nivel
molecular bazandu-se pe interacţiunile hidrofobe şi
electrostatice. Chiar şi moleculele neutre se pot lega la
micele, deoarece nucleul hidrofob are o mare putere de
dizolvare. Solutiile tensioactive au fost folosite în
spectroscopie şi cromatografie pentru a profita de aceste
proprietati unice micelare.
De exemplu, fosforescenta la temperatura camerei este
uşor observabila în mediile micelare deoarece mediul
micelar previne multe dintre mecanisme de călire
normale de la operare. Cu mai multa insemnatate în ceea
ce priveşte MECC, aceste aceleaşi soluţii tensioactive pot
servi drept modificatori ai fazei mobile cromatografice.
Cromatografia micelara poate sa mimeze o faza inversă
a LC în care creşterea concentraţiei tensioactivului creşte
puterea de eluţie a fazei mobile. Analitul se poate
partiţiona între micele si faza compacta, micele şi faza
staţionară, sau în faza compacta şi fază staţionară. Astfel,
"pseudo-faza" sau LC micelara are mai mult echilibru al
complexului decât LC convenţionala. Acest echilibru cu
trei faze poate fi asemănat cu cromatografia ionilor-
pereche în multe cazuri. În anumite aspecte, mecanismul
MECC, din cauzaca este doar un echilibru cu două faze,
este mai simplu decat cromatografia micelara. Factorul
complicator în MECC este că mobilitatea electroforetică a
analitului contribuie adesea la separarea intregului.
Selectarea modului de electroforeza capilara

Tabelul 6 poate fi utilizat pentru a ajuta la modul de


selectare al celei mai avantajoase metode de
electroforeză ca punct de plecare în metodele de
dezvoltare. Cota cea mai înaltă în fiecare categorie din
diagramă este de natură să producă rezultate acceptabile
în cel mai scurt interval de timp.

Tabelul 6.Selectarea modului de electroforeza capilara


Ioni mici Molecule mici Peptide Proteine Oligonucleotide ADN
CZE MECC CZE CZE CGE CGE
ITP CZE MECC CGE MECC
ITP IEF IEF
CGE ITP
ITP

Abordări ale metodelor de dezvoltare ale CZE şi MECC


Înainte de a încerca o noua separare, culegerea de
informaţii este foarte utila. Este compusul solubil în apă la
concentraţii de până la1 mg/mL? Este solubil la toate pH-
urile lui? În cazul în care solubilitatea apoasă este o
problema, vor rezolva problema cantităţile mici (până la
25%) din metanol sau acetonitril-l? Se vor dizolva
moleculele mici folosind 100 SDS mm? Pentru proteine,
va fi de ajutor 7 M uree sau un agent de dispersie, cum ar
fi etilen glicol? Este instabil analitul la anumite pH-uri ale
lui? Este compusul labil termic? Care este lungimea de
undă maximă de absorbţie UV? Cât de multe componente
sunt aşteptate în amestec? Care este concentraţia
preconizată a fiecărui component?

Dezvoltarea unei metode cu ajutorul CZE

Un număr mare de opţiuni şi instrumente pentru


dezvoltarea metodelor sunt disponibile pentru CZE. In
acest exercitiu, procesul de separare a unei proteine noi
va fi revizuit. Pentru condiţiile de pornire, utilizaţi un
capilar de 75 de cm incalzit la 25 C conectat la 20 kV cu
detectorul stabilit la 214 nm. Se injecteaza prima transa
de 1 mg/ml din soluţie. Folosiţi un tampon de 100 mm la
pH-ul adecvat.
1)acid stabil- se va utiliza un tampon cu pH-ul de mai mic
pI;
acid labil - selectaţi un pH de cel puţin 1 unitate de mai
mare decat pI.
2)problema solubilitatii – se adăuga un modificator cum
ar fi ureea sau etilen glicol.
3) problema adsorbţiei - utilizarea un aditiv, cum ar fi un
acid sulfonic, de sare, sau trecerea la tratamentul
capilarului.
4) eficienţă bună, proastă separare - ajustarea pH-ului.
5) slaba eficienţă - creşterea rezistentei ionice a solutiei
tampon, se adaugă o sare în care proteina este stabilă.
În majoritatea cazurilor, se va putea obţine o bună
separare într-un interval de timp relativ scurt. Unele
probe pot fi destul de dificile şi va trebui acordam o
perioadă considerabilă de timp pentru selectarea cu
atenţie a solutiilor tampon şi a aditivilor tampon.

Dezvoltarea unei metode cu ajutorul MECC


MECC este un mecanism de separare bun pentru
moleculele mici. Greutate moleculară maxima nu a fost
încă stabilita. Proteinele nu sunt bine separate prin
această tehnică.
Condiţiile bune de pornire sunt 100 mM SDS în pH 7, 50
mm fosfatoborat ca solutie tampon, după care ajustările
concentraţiei SDS, a pH-ului, şi modificatori organici pot fi
necesari. Unele linii directoare sunt:
1) timp mare al separarii, o buna rezoluţie - creşterea
pH-ului, scăderea SDS.
2) timp mare al separarii, o proastă rezoluţie - utilizarea
modificatorilor organici.
3) timp de separare scurt rezolutie slaba – cresterea SDS.
4) timp de separare scurt,rezolutie moderata – scaderea
a ph-ului, creştere a SDS.
Utilizarea modificatorilor organici este deosebit de
puternica în MECC. Acetonitril este solventul ales în
primul rând, deoarece are un impact redus asupra EOF.
Alcooli pot fi de asemenea utili, dar timpul de separare
poate deveni foarte lung. În condiţiile corespunzătoare,
puterea optima şi capacitatea de vârf
depăşesc cu mult HPLC. Este nevoie de nu mai mult de
câteva zile pentru a dezvolta cele mai multe separări.
Metode de dezvoltare automatizate
Sistemele P/ACE ™ 2050 şi 2100 au capacitatea de a
efectua separări multiple cu o varietate de soluţii tampon.
Această caracteristică oferă posibilitatea de dezvoltare
automata, dezvoltarea metodelor cu procese
nesupravegheate, deoarece noile solutii tampon pot fi
folosite pentru fiecare proces în ambele rezervoare, anod
şi catod. În acest mod, parametrii cum ar fi pH-ul,
concentraţia solutiei tampon, tipul de aditiv, şi
concentraţia tensioactivilor, printre alţi factori, pot fi
optimizati într-un mod logic şi sistematic.
Exista cateva indicatii care se vor dovedi utile pentru a
asigura eficienta generaţiei de aplicaţii informatice:
1) Efectuaţi câteva separări preliminare pentru a obţine in
general o înţelegere a problemei.
2) Setaţi timpul de functionare pentru timpul maxim de
separare la care va puteti aştepta.
De exemplu, cu MECC, acest lucru ar corespunde cu cea
mai mare concentraţie a tensioactivului utilizat.
3) Unele solutii tampon, cum ar fi fosfatul, modifica
permanent chimica peretelui; folositi aceste solutii la
sfarsit.
4) Atunci când se face trecerea de la CZE la MECC, lasati
suficient timp (cel puţin 0,5 h) pentru capilar să se
echilibreze cu soluţia tensioactiva.
5) Programati clatiri cu 0,1 M de hidroxid de sodiu între
fiecare dintre procese. 6) La stabilirea temperaturii
optime, acordati timp suficient pentru a permite
echilibrarea termica. 7) Modificati pe rand cate o singură
variabilă experimentala.
CAPITOLUL 3

APLICATIILE ELECTROFOREZEI
CAPILARE(EC) IN
ANALIZELE FARMACEUTICE

In cea mai simpla forma a sa electroforeza este


denumita “electroforeza zonei capilare”. Conditiile
folosite in acest tip de analiza sunt relativ simple iar faza
mobila utilizata consta intr-un tampon cu diferiti aditivi.
Multe aplicatii se concentreaza pe separarea critica care
este dificil de obtinut cu HPLC. In multe cazuri este greu
de explicat in totalitate tipurile de efecte produse de
aditivii din tampon.
Separarea atenololului si a impuritatilor legate de acesta
in special datorita sarcinilor electrice
Β-blocant-ul atenolol este aratat in figura 14.6 cu
principalele lui impuritati cunoscute. Aceste impuritati nu
sunt usor separate de atenolol cu ajutorul HPLC datorita
similaritatii structurilor lor.
Separarea are loc folosind capilare de 0.05mm x 50cm la
15kV cu un tampon de fosfat/borat. Figura 14.6
evidentiaza separarea, la un pH optim de 9.7 al
atenololului(50µg/ml) , de impuritatile sale tintuite in
solutie la concentratia de 5µg/ml. Pentru elutie se
intampla asa cum se poate prezice dinspre grupurile
ionizabile catre molecule. Atenololul (AT) elueaza primul
deoarece este incarcat pozitiv pe grupul de amine
secundare de baza(pKa 9.6). Dimerul (TA) este si el
incarcat cu sarcina pozitiva dar este amina tertiara si are
valoare pKa mai mica decat a atenololului. Este si un ion
mai mare astfel mobilitatea va fi mai mica decat a
atenololului. (marimea era suficienta pentru producerea
separarii acestor doua molecule la un pH de 6.5 cand
amandoua, si atenololul si dimerul ar fi complet incarcati
electric ).
Diolul (D) este un compus neutru si astfel ar trebui sa
elueze in acelasi ritm cu EOF care va creste odata cu pH-
ul. Totusi, in lucrarea din discutie timpul de elutie al
diolului creste odata cu pH-ul; aceasta se datoreaza
combinatiei complexe cu boratul din zona tampon care
tinde sa formeze un complex incarcat negativ cu un diol.
Acidul blocant (BA)este incarcat atat pozitiv cat si negativ
, care mai mult sau mai putin se neutralizeaza reciproc
intr-o variatie a pH-ului destul de mare, cum creste pH-ul
spre valoarea pKa a grupului de amine(cca 9.5) sarcina
negativa a grupului acidic devine predominanta; desi
moleculele vor avea in continuare o oarecare sarcina
pozitiva, sarcina negativa globala va determina
moleculele sa ramana in urma EOF. In cele din urma
fenolul(PPA) este neutru pana cand valoarea sa pKa(cca
9.7 - 10) este atinsa si la valori mai mari ale pH-ului va
dezvolta o sarcina negativa incetinind ritmul migrarii;
acestea sunt conform figurii 14.6.

Separarea in special datorita razei ionice


Schimbari foarte mici in structura moleculara pot duce la
diferente remarcabile ale timpului de retentie in CE. O
separare impresionanta a unui medicament anti-depresiv
experimental GR50360 de o parte a impuritatilor s-a
realizat folosind izopropanol/0.01 M tampon de fosfat cu
pH 7.0 . In acest caz separarea se datoreaza marimilor si
formelor mari moleculare odata cu pH=7.0 medicamentul
si impuritatile acestuia vor fi incarcate intr-o masura
similara.
Figura 14.7 eidentiaza separarea tuturor celor 6 componente prin CE. Izomerul cis al
GR50360 are o forma moleculara complet diferita de izomerul trans, rezultand intr-o
raza ionica mai mica si astfel ruleaza mai devreme decat izomerul trans. Altfel
compusii eluteaza in ordinea marimii moleculare compusii perfluorati
(desfluorocompound) fiind primii dintre derivatii lui GR50360 care se eluteaza.
Prezenta izopropanolului in faza mobila incetineste EOF suficient pentru ca
separarea sa aiba loc fara probleme.
Analiza medicamentelor non-steroidiene si anti-
inflamatoare (AINS) cu electroforeza capilara si
separarea anionilor pe baza razelor ionice

AINS contine in general grupuri de acid carboxilic


care ionizate devin anioni. In CE folosind un capilar
nemodificat EOF are directia indreptata spre catod si
mobilitatea globala a ionilor este data de EOF –
mobilitatea anionilor care se indreapta spre anod. In
acest exemplu tamponul folosit in in analiza este
proiectat cu grija pentru continutul sau ionic spre a evita
electro- difuzia. Glicina a fost considerata ca fiind
potrivita din punct de vedere al mobilitatii pentru analiza
compusilor din aceasta clasa deoarece, desi este o
molecula mica cu un grup de acid carboxilic care este
complet ionizat la pH-ul analizei (9.1) poarta totusi o
sarcina partial pozitiva reducand mobilitatea globala spre
anod, iprimand o mobilitate asemanatoare acelei unor
mari acizi AINS lipofili.Componenta cationica din tampon
are un efect important in rezolutia componentelor unui
amestec care contine patru AINS. Trietanolamina a fost
desemnata ca fiind cea mai buna componenta cationica
deoarece a redus EOF din cauza mobilitatii ionilor sai
relativ scazuta si de asemenea prin cresterea vascozitatii
in solutia tampon. Figura 14.8 arata separarea unui
amestec care contine cinci AINS, anume: sulindac(S),
indometacin (I), piroxicam (P), acid tiaprofenic ( T), si
aclofenac (A). Toate medicamentele sunt incarcate
complet la un pH de 9.1 si separarea s-a obtinut mai mult
sau mai putin in concordanta cu marimea moleculara,
aclofenac-ul, cea mai mica molecula, este cea care
migreaza cel mai repede in directia opusa EOF.
Separarea peptidelor
Un punct forte al CE este acela ca poate separa
peptidele . Folosirea peptidelor in scop terapeutic creste
rapid si dimensiunile mari ale acestora si polaritatea
creeaza probleme in incercarea de a le separa. Pentru ca
peptidele poarta de obicei doua sau mai multe sarcini
cei mai importanti factori care trebuie optimizati pentru
separarea peptidelor sunt pH-ul si concentratia solutiei
tampon. Valoarea pl a peptidelor este pH-ul cand sarcinile
pozitive si negative sunt perfect echilibrate. Un exemplu
este dat de separarea hormonului adrenocorticotrofic
(ACTH) de trei dintre fragmentele sale. Tabelul 14.2 arata
valorile maselor moleculare si valorile pl ale ACTH si ale
celor trei fragmente . Valoarea pl da cateva indicatii
referitoare la numarul relativ al grupuriloe acide si
bazice din peptide. O valoare pl mare indica o peptida cu
un numar mare de reziduri bazice cum ar fi lizina si
arginina, pe cand o valoare scazuta a pl inclina balanta in
favoarea reziduurilor acide cum sunt acizi glutamic si
aspartic. In acest exemplu dat, conditiile (pH 3.8)au fost
alese pentru a fi predominante reziduurile bazice desi la
acest pH reziduurile acide poarta inca o cantitate
apreciabila de sarcina negativa inhiband migratia spre
catod. In acest exemplu separarea este conforma cu
echilibrul intre caracterele bazice si acide ale peptidelor.
Peptida cea mai bazica eluteaza prima intrucat cea mai
putin bazica peptida eluteaza ultima. Astfel, in acest caz,
gradul de incarcare pozitiva a peptidei predomina in
detrimentul razei ionice pentru determinarea vitezei de
migrare deci ACTH migreaza mai rapid decat fragmentul
3 in ciuda faptului ca are o masa moleculara mai mare.
Separarea a fost optimizata crescand rezistenta solutiei
tampon cum se poate vedea din figura 14.9 si cresterea
rezistentei solutiei tampon a dat un timp de migratie
marit prin efectele sale in reducerea

EOF. Alt efect important datorat cresterii rezistentei


solutiei tampon in acest caz este reducerea interactiunii
acestor predominant bazice peptide(in special
fragmentele 1,2 si ACTH) cu grupurile silanol de pe
peretele capilarului astfel rezultand un varf mai bine
conturat.
In acest studiu elegant s-a ajuns la concluzia ca pentru
toate peptidele studiate cea mai buna separare este
aceea realizata in solutii tampon cu rezistenta mare(0.05-
0.1M), permitand astfel manipularea EOF fara a schimba
pH-ul potrivit pentru zona tampon. S-a concluzionat si ca
valorile pH-ului acid intre 2.2 – 3.8 au fost cele mai
bune pentru analiza peptidelor bazice si neutre pe cata
vreme peptidele acide se separa cel mai bine la un pH de
7.0.
Folosirea aditivilor in solutiile tampon
Aditivi folositi in zona tampon pot produce o selectivitate
mai mare cand separarea in solutii simple nu este
posibila.

Aplicarea ciclodextrinelor pentru imbunatatirea separarii


Ciclodextrinele sunt compusi neutri care migreaza cu
acelasi ritm ca EOF. Acestea au mari cavitati hidrofobe in
structura lor , cavitati in care se potrivesc moleculele.
Usurinta cu care se potrivesc moleculele in cavitatile
ciclodextrinelor este dependenta de stereochimia
acestora, ciclodextrinele au fost folosite ca aditivi atat in
separarile chiral , unde enantiomerii opusi formeaza
complexe tranzitorii de diastereomeri cu ciclodextrinele
active optic, cat si in separarile non-chiral unde
ciclodextrinele afecteaza diastereoizomerii intr-o masura
diferita.
Separarea pilocarpinei de epimerul sau
Pilocarpina(P), un medicamet folosit in tratamentul
glaucomului, poate contine epimerul sau, izopilocarpina(I)
ca impuritate. Intr-un studiu nu a fost posibila separarea
completa a pilocarpinei de izopilocarpina variind pH-ul
solutiei tampon. PH-ul optim pentru separare trebuie sa
fie 6.9 si ambi compusi trebuie sa fie cca 50% ionizati dar
chiar si la acest pH separarea nu este completa.

Introducerea a 0.01M -ciclodextrina in tamponul utilizat a


dus la separarea de baza a diastereoizomerilor. Figura
14.10 A arata separarea celor doi epimeri obtinuta in
urma adaosului de ciclodextrina in tamponul utilizat. In
acest exemplu au fost folosite capilare pe peretele carora
grupurile silanol au fost partial blocate de un invelis,
reducand sarcina negativa de pe perete reducand astfel
EOF lasand mai mult timp pentru desfasurarea separarii.
In exemplul de fata separarea are loc datorita diferitelor
grade de complexare a aditivilor ciclodextrine cu cei doi
diastereoizomeri.

Separarea anestezicelor locale chirale

Ciclodextrinele sunt folosite in GC si HPLC pentru a


efectua separarea enantiomerilor si sunt de asemenea
foarte eficienti in aplicatiile CE. Aplicatiile CE separarilor
chirale vor suferi o crestere rapida in urmatorii ani
pentru ca inalta eficienta care poate fi obtinuta in
separarile pentru care se foloseste aceasta tehnica si
datorita costului scazut al aditivilor chirali comparat cu
costul coloanelor folosite in GC si HPLC . O serie de
enantiomeri ai anestezicelor locale au fost separati
folosind CE utilizand o solutie tampon de fosfat cu pH de
3.0 care contine trietanolamina ca aditiv cationic si 10mM
de dimetil β-ciclodextrina. Adaugarea aditivilor cationici
inverseaza EOF (vezi tabelul 14.1) spre anod , totusi
anaitii inca migreaza spre catod, avand o mobilitate
globala in aceasta directie mai mare decat a EOF spre
anod. Acest lucru a permis o crestere a timpului de
interactiune a analitilor cu ciclodextrina care migreaza
spre anodcu EOF. Utilizarea β-ciclodextrinei metilice
creste interactiunea analitilor lipofili cu acest selector
chiral comparat chiar cu β-ciclodextrina.

Separarea izomerilor R si S a unei serii de anestezici


locali relationati structural. Separari considerabile au fost
obtinute pentru compusii din aceasta serie unde s-a
propus ca pentru potrivirea porţiunii hidrofobe de analit
în ciclodextrin sa fie optima cand unul dintre substituenti
de la centrul chiral este capabil sa interactioneze cu
grupurile de hidroxid chiral in ritmul cavitatilor
ciclodextrinei. Tabelul 14.3arata asocierea constantelor
calculate pentru interactiunea perechilor enantiometrice
cu dimetilciclodextrina. Cu cat mai mare valoare lui K, cu
atat mai multi enantiomeri sunt retrasi de către selector,
care in acest caz migreaza spre anod. Valorile din 69alcu
evidentiaza si mobilitatea 69alculate pentru fiecare analit
in solutie libera cu cea mai mare parte a substituentului
N-alchil.

Cromatografie electrocinetica micelara(MECC)


Extinderea tehnicii de baza a CE permite separarea
componentelor neutre , dar a fost si larg folosit in
obtinerea separarii speciilor de ioni. In MECC, un
tensioactiv(detergent) este adaugat fazei mobile la o
concentratie mai mare decat concentratia critica a
micelei. Detergentii folositi pot fi anionici, cationici sau
neutri. Micelele actioneaza intr-un mod analog fazei
stationare din HPLC. Micelele anionice migreaza in
directia opuse celei obisnuite a EOF , adica spre catod.
Micelele cationice migreaza cu EOF si micelele neutre
migreaza la aceeasi viteza cu EOF. Prezenta
detergentului in zona tampon are un efect asupra ritmului
si asupra directiei EOF prin interactiunea cu peretele
capilarului astfel incat baza finala pentru separare prin
MECC poate fi datorata unui numar de mecanisme.
Interactiunea analitului cu micelele poate fi modificata
folosind detergenti organici in zona tampon care va
reduce partitionarea analitului in micele; in acelasi timp
asemenea modificatori organici tind sa reduca EOF.

Separarea cefotaxim-ului de impuritatile


relationate
Penicilinele si cefalosporinele sunt compusi reactivi si
pot contine un numar de degradanti.Selectivitatea inalta
a CE poate fi foarte avantajoasa acolo unde se cere
separarea unei mixturi complexe. Unele impuritati pot fi
neutre si separarea impuritatilor neutre una de cealalta
necesita partitionarea in micele incarcate cu sarcina care
migreaza la viteze diferite de EOF . la aceasta aplicatie in
special sodiu dodecil sulfat(SDS), un detergent anionica
fost folosit pentru functionarea MECC. PH-ul zonei tampon
e de 7.2, adica destul de scazut pentru a evita
promovarea degradarii cefotaxim-ului care este
inutilizabil ca baza. Figura arata urma MECC obtinuta de
la C care contine 0.2% w/w din fiecare impuritate iar
figura 14.14B arata o proba din C necompromisa.
Compusul care migreaza cel mai lent este compusul
neutru L , lactona , care ar trebui sa aiba o mare afinitate
pentru sarcinile negative si SDS hidrofob. Celelalte
impuritati sunt reprezentate de acizii carboxilicicare sunt
comple incarcati cu sarcina la pH de 7.2, astfel purtand o
sarcina negativa care va provoca un anumit grad de
respingere intre analiti s micelele incarcate cu sarcina
negativa. Anti-izomerul lui C eluteaza tarziu datorita
stereochimiei proprii, prin urmare raza sa ionica si
coeficientul de separare sunt foarte diferite de cele ale lui
C(aceasta este in concordanta cu lipsa efectului antibiotic
pentru anti-izomer ). Metoda MECC este capabila sa
produca separarea a tuturor celor 7 impuritati la nivelul
de 0.2%. A demonstrat o precizie comparabila cu cea a
metodei HPLC dezbatute mai sus dar este mai rapida
decat metoda HPLC.
Analiza flavonoidelor prin MECC
Flavonoidele sut produse naturale care pot fi gasite
in anumite ierburi medicinale populare cum ar fi Ginkgo
biloba. Ele sunt fenoli care nu sunt incarcati cu sarcini
electrice pana cand pH-ul zonei tampon nu ajunge la o
valoare mare. Separarea prin MECC are loc folosind
0.04M SDS in 0.02M solutie tampon de borat cu un pH de
8.2. La acest pH flavonoidele studiate sunt mai mult sau
mai putin fara sarcina si in absenta partitionarii
diferentiale migreaza in acelasi ritm cu EOF. Prezenta lui
SDS in zona tampon incetineste viteza de migratie a
acestor compusi conform cu peterea de a se fragmenta in
micele SDS , care se deplaseaza spre anod in timp ce EOF
se indreapta spre catod. Figura 14.15 arata structurile
strans legate de flavonoide in timp ce figura 14.16 arata
separarea obtinuta pentru un model de amestec din
acesti compusi.
Metoda da o buna precizie si o separare rapida a
amestecului . Cromatografia acestor tipuri de compusi
cere in mod normal utilizarea gradientului HPLC cu un
timp de elutie indelungat.