UNIVERSITATEA “OVIDIUS” CONSTANTA

FACULTATEA DE: FARMACIE

SPECIALIZAREA:FARMACIE

ELECTROFOREZA CAPILARA DE INALTA PERFORMANTA

Coordonator

Professor:

Absolventa:

Stoichici Gabriela
 CAPITOLUL 1

-NOTIUNI INTRODUCTIVE DESPRE ELECTROFOREZA-

Electroforeza este o metoda ce se bazeaza pe migrarea

componentilor dintr-o proba,supusa unei diferente de potential,intr-o
solutie(ex: molecule mari de proteine intr-un electrolit tampon) sau
printr-un suport solid poros(hartie cromatografica,gel,etc),separarea
explicandu-se prin vitezele de migrare diferite ale componentilor
incarcati electric pozitiv sau negativ(purtatori de sarcini),care sunt
atrasi de polii opusi ai campului electric,proportional cu
natura,marimea si sarcina lor.

Aceasta metoda de analiza se aplica ionilor metalici

macroionilor coloidali,cum sunt proteinele a caror masa moleculara
este de ordinul 105 – 106 , dar si altor componente care pot fi
transformati(prin derivatizare) in particule incarcate electric,prin
formare de complecsi chelate etc.Trebuie precizat ca electroforeza
aplicata ionilor relativ mici se numeste”ionoforeza”, termenul de
“electroforeza” pastrandu-se si utilizandu-se pentru deplasarea in
camp electric a particulelor coloidale,micelelor sau a unor
macromolecule.
 Sarcinile particulelor care se pot separa provin din procesele de
ionizare ale compusilor metalici(deci a sarcinilor simple) care in solutie
sunt electroliti tari,deci practic total disociati.De asemenea,complecsii
cationici si cei anionici sunt purtatori de sarcini ,ca si ionii proveniti din
electrolitii slabi,cum sunt acizii carboxilici,bazele organice si moleculele
organice amfotere,cazuri in care ionizarea este un proces mai
complicat.

Spre ex: aminoacizii pot exista in functie de pH-ul mediului ca

si cationic,anioni sau zwitterioni,acestia din urma fiind amfiioni,care au
o sarcina pozitiva si una negativa(amfiionii se gasesc la
punctul”izoionic” sau”izoelectric”,stare definita de Michaelis,stare in
care acest tip de ioni nu migreaza,deoarece migrarea electroforetica
este nula.

In cazul mediilor chimice mai simple,pH-ul la punctual izoionic

este egal cu pH-ul la punctual izoelectric,asa cum este in cazul solutiilor
continand amfiioni,numiti si switterioni.In cazu mediilor complexe,cum
sunt cele care contin proteine,de care sunt legate grupari carboxilice,in
afara de efectul amfiionilor interni au loc si interactii intre grupele
carboxilice si unii cationici minerali prezenti,cum sunt ionii Na + ,K+ ,Ca2+
etc.In astfel de cazuri,punctul izoionic nu mai corespunde cu pH-ul la
care migrararea electroforetica este egala cu zero.De aceea a fost
necesara introducerea conceptuui de punct izoelectric care este egal cu
pH-ul la care,indifferent de ionii prezenti,migrararea eletroforetica este
egala cu zero.Intre cele doua valori ale pH-ului exista o diferenta ce
depinde de natura solutiei si de concentratia sa in electroliti,deci de
conditiile mediului chimic.

Spre ex:, in cazul albuminei serice punctual izoionic in apa pura este
la pH=5,37, iar punctual izoelectric in apa pura este la pH=4,4.

Deplasarea particulelor purtatoare de sarcini electrice,in

camp electric,se face cu o viteza caracteristica fiecarei specii,in conditii
experimentale date.Aceasta viteza se numeste”mobilitatea
electroforetica”si se exprima in m/secunda,dar intr-un camp electric
exprima in m2/volt/secunda(sau m2xV-1xS-1).Se mai utilizeaza si un
submultiplu exprimat in cm2/V/s.

Pentru determinari electroforetice se pot utiliza doua tipuri

de metode si anume “eletroforeza de frontiera” si eletroforeza zonala
sau pe suport.

1)Electroforeza de frontiera,mai putin importanta,dar

utilizata inca pentru unele studii fundamentale privitoare la natura si
puritatea proteinelor,consta in migrarea proteinelor intr-o solutie
tampon de electroliti,utilizand un aparat simplu format dintr-o celula in
forma de “U”, cu sectiunea patrata,construita din sticla transparenta
,astfel incat sa se poata observa migrarea proteinelor cu un
spectrometru sau cu un spectrofotometru,
 Se introduce in celula cele trei proteine existente intr-o solutie
apoasa de electroliti si apoi, cu multa atentie,se umplu bratele celulei in
mod egal cu solutie de electrolit suport,astfel incat sa nu se amestece
fazele(a), dupa care se inchid cele doua brate perfect
etans,observandu-se cele doua frontiere foarte nete intre solutia de
proteine si solutiile de electroliti din cele doua brate(in fapt,frontierele
sunt cele doua suprafete-intefete de separare a fazelor)

Apoi se leaga cei doi electrozi ai celulei la o sursa de current

continuu(generator sau redresor)si se aplica o diferenta de potential de
100-150 volti.

Se constata ca are loc o migrare a proteinelor spre polul

pozitiv,dar cu viteze diferite,determinate de natura
lor(marime,forma,sarcina etc).Se observa ca proteinele A si C care au
mobilitati net diferite(extreme) se gasesc in stare aproape pura,fiind
separate de zone intermediare,desigur ca in fiecare zona se stabileste
un gradient de concentratie.Asa cum s-a spus,trebuie sa se lucreze
extreme de atent,deoarece frontierele greu de localizat tind sa se
extinda sub actiunea difuziei si a convectiei.Daca se asigura stabilitatea
termica a continutului celulei si a intregului aparat se pot limita aceste
fenomene.Evident ca separarile prin eletroforeza de frontiera au o
durata mai mare,separarile fiind cu atat mai fine si deci mai fragile,cu
cat mobilitatile particulelor au valori mai apropiate.Totusi masuratorile
facute prin aceasta tehnica sunt foarte precise.

2)Electroforeza zonala

In aceasta metoda migrarea componentilor de separate este

stabilizata de faptul ca lichidul in care se produce,se gaseste intr-un
suport sau mediu poros cum sunt acetatul de celuloza sub forma de
folii,hartia de filtru special preparata pentru electroforeza sau un
gel(ex. De agaroza,agar etc).Pe astfel de suporturi se pot localiza mai
usor diferitele zone de migrare sau zone de concentratie,fiecare zona
continand un anumit component de analizat.Cu ajutorul acestei tehnici
se pot obtine separari foarte bune,din cantitati foarte mici de
probe,daca se lucreaza atent si cu substante pure(apa,eletroliti etc).De
remarcat ca hartia se utilizeaza mai putin desi separarile pe acetat de
celuloza,care are o structura mai omogena,sunt mai rapide si de buna
calitate.

3)Factorii care influenteaza electroforeza

a) Natura moleculelor separate

In primul rand influenteaza marimea moleculelor,stiut fiind ca,la

sarcini egale migreaza mai repede moleculele mai mici,insa ionii cu
diametre mici sunt de regula solvatati,iar deplasarea ansamblului
molecula-solvent depinde se de celelalte substante dizolvate in
solutie.Asa se explica faptul ca unii metalici mici,solvatati,au practic o
mobilitate de acelasi ordin de marime cu proteinele incarcate electric.

Influenteaza de asemenea mobilitatea,natura si sarcina speciilor

implicate,mediul chimic in care se gasesc si care prin pH-ul lui
influenteaza gradul de ionizare al analitilor,forta ionica etc.La aceasta se
mai adauga posibilitatea formarii unor complecsi de asociatie ionica.

Spre ex:,prezenta in solutie a ionului clorura poate conduce la

formarea HgCl2 neionizata,dar si a FeCl2+ ,FeCl2+ ,FeCl3 si FeCl4- ,deci
complecsi cationici si anionici,sau moleculele neuter de FeCl 3 care insa
pot hidroliza.

b)Aparatura,respectiv suportul,poate influenta migrarea,deoarece

acesta are o putere adsorbanta,ceea ce poate incetini migrarea si poate
largi zonele,ceea ce se traduce prin aparitia cozilor(trenelor) pe
electroforegrama.Puterea adsorbata a suportului se poate datora
prezentei la suprafata lui a unor grupari functionale capabile sa formeze
legaturi(ionice, de hydrogen,van der Waals) cu moleculele solventului si
ale substantelor de separate.De altfel se stie ca suprafetele solide
dobandesc o sarcina negativa,fata de care dispun(orienteaza) sarcinile
pozitive ale solventului si ale particulelor incarcate pozitiv,astfel ca
acestea pot fi retinute,sau cel putin intarziate.Astfel de efecte au loc
mai ales pe hartie ca suport si intr-o masura mult mai mica pe acetat de
celuloza.

c)Curentul electric

Deplasarea eletroforetica a unei specii care se separa este

proportional cu mobilitatea,cu campul electric si cu timpul de trecere a
campului electric.

d)Influenta pH-ului

In cazul acizilor si a bazelor tari si in cazul sarurilor,deci electrolitilor

tari,pH-ul nu influenteaza migrarea lor.

In schimb,influenta pH-ului este mai mare in cazul compusilor

organici,cum sunt acizii carboxilici si bazele animate si chiar a
substantelor amfotere.In acest ultim caz,migrarea este posibila numai
daca pH-ul solutiei de electroliti are o valoare diferita de punctual(pH-
ul)izoionic.

e)Natura solutiei
 Natura solutiei este determinate de natura
sarurilor,acizilor,bazelor si a altor substante existente in aceasta,toate
aceste substante influentand mult mobilitatea.Compozitia chimica a
solutiei influenteaza mibilitatea speciilor de analiti care trebuie
separate,chiar si in cazul in care pH-ul si forta ionica sunt aceleasi.

4)Imunoeletroforeza

Separarile electroforetice pot fi imbunatatite substantial prin

asocierea eletroforezei cu diferite alte tehnici intre care cromatografia
pe gel,pe hartie,pe strat subtire,rezultand tehnici noi cunoscute sub
denumirea de “cromatoelectroforeza”

Imunoeletroforeza este o astfel de metoda in care se imbina

migrarea eletroforetica cu precipitarea antigen_anticorp in mediu de
geloza.Aceasta tehnica este utilizata la fractionarea si identificarea
proteinelor serice,in acest scop se utilizeaza un suport de masa
plastic(polimer) acoperit cu geloza praparata cu ajutorul unui tampon
potrivit.Suportul se uneste(se leaga) la cele doua compartimente
anodic si catodic,utilizand punti de hartie
cromatografica(eletroforetica)

In masa de geloza se scobesc doua godeuri(adancituri) pentru

primirea sarurilor de analizat si un sant central in care se introduce
serul unui animal imunizat cu antigene umane.In prima etapa se pun
serurile de analizat in godeuri si anume intr-unul se introduce serul
bolnav,iar in al doilea serul etalon si apoi se face separarea
eletroforetica.Apoi,se pune serul imunizat in santul central,lasandu-se
in repaus 24 h ,timp in care se produce difuzia in geloza a proteinelor
separate din serurile initiale si proteinele serului imunizat.La contactul
anticorpilor din serul imunizat cu proteinele serice antigene,acestea din
urma formeaza arcuri caracteristice de precipitare.

5)Electroforeza prin izofocalizare

Electroforeza prin izofocalizare,numita si electrofocalizare

(EF),consta in migrarea substantelor cu puncte izoelectrice diferite intr-
un mediu gelificat,care are intre cele doua extremitati ale sale un
gradient continuu de pH.Cele mai mari valori ale pH-ului se gasesc in
partea catodului,iar cele mai mici in partea anodului.Aceasta tehnica se
aplica amfolitilor care migreaza in gel pana in momentul in care ating o
zona cu pH corespunzator punctului lor izoelectric.Ca urmare,sarcina
lor devine nula si ei se imobilizeaza prin focalizare(concentrare) intr-o
banda ingusta.In astfel de cazuri fenomenele de difuzie sunt
reduse.Gradientul de pH se poate obtine in doua moduri:

- Cu un amestec de amfoliti(ex:acizi policarboxilici cu

polyamine),sub actiunea unui camp electric ce se exercita intre
doi electrozi,pozitionati la extremitatile suprafetei gelificate,deci
in zonele de pH extreme(cu pH mai mare la catod si mai mic la
anod)care se ordoneaza in gel dupa migrarea lor in functie de
punctul lor izoelectric.
 - Prin grefarea acestor amfoliti pe moleculele de acrilamida prin
legatura de natura covalenta.

6)Electroforeza bidimensionala

Electroforeza prin izofocalizare,eficienta pentru separarea

izoformelor proteinelor,se poate imbunatati cupland-o cu eletroforeza
practicata prin migrare intr-o directie perpendicular cu prima(analogie
cu alutia cromatografica bidimensionala pe strat subtire).A doua
migrare se poate face in laurisulfat de sodiu (SDS, care este
dodecilsulfat de sodiu), care este un detergent anionic,care poate rupe
legaturile in care sunt implicate grupari amino protonate ale
moleculelor.Acest detergent confera moleculelor o structura
discoidala,aducand numeroase sarcini negative.

O astfel de migrare pe un gel de poliacrilamida tratata ca mai sus

permite o “adevarata cernere” si separare a moleculelor,in functie de
marimea lor,deoarece mibilitatea asociatilor proteina-SDS este invers
proportional cu logaritmul masei lor.
 CAPITOLUL 2

- ELECTROFOREZA CAPILARA-

ELECTROFOREZA CAPILARA

Electroforeza capilara este o familie de tehnici relationate care

utilizeaza capilarele inguste de bor (20-200 µm i.d.) pentru a separa cu
inalta eficienta atat moleculele mari cat si cele mici. Aceste separari
sunt facilitate de utilizarea unei tensiuni inalte care poate genera EOF si
EPF in solutia tampon si intre speciile ionice respectiv in interiorul
capilarului . Proprietatile separarii si electroferograma corespunzatoare
au caracteristicile asemanatoare cu legatura dintre traditionala
electroforeza cu gel din poliacrilamid (PAGE) si moderna cromatografie
lichida de inalta performanta(HPLC).

CE ofera un format nou pentru cromatografie lichidă şi

electroforeză pentru ca:
• foloseşte tuburi capilare în care se produce separarea electroforetica;
• utilizeaza intensitati foarte mari ale câmpului electric, de multe ori
mai mari de 500 V/cm;
• foloseste tehnologia detectoarelor moderne, astfel încât
electroferograma seamănă adesea o cromatogramă;
• are eficienţă aproape ca cea a cromatografiei în fază gazoasă în
coloană capilară sau chiar mai mare;
• necesită minute pentru cantitati destul de substantiale de probă;
• este uşor de automatizat pentru analiza cantitativă precisă şi uşurinţa
de utilizare;
• consumă cantităţi limitate de reactivi;
• se aplică la o selecţie mai largă de analiti comparativ cu alte tehnici
analitice de separare.
Configurarea instrumentalului de baza pentru CE este relativ simpla.
Tot ce se cere este un capilar din siliciu topit cu o fereastra pentru
vizionare optica, un generator reglabil pentru tensiunea de alimentare,
doua ansambluri de electrozi, doua rezervoare de solutie tampon, si un
detector UV. Capetele capilarului sunt introduse in rezervoarele cu
solutia tampon si fereastra pentru vizionare optica este aliniata cu
detectorul. Dupa umplerea capilarului cu solutia tampon proba se
poate introduce prin scufundarea unui capat al capilarului in solutia
proba si ridicarea capilarului scufundat cu un picior (unitate de masura
a distantei 1 ft = 0.305 m) sau cam asa ceva mai sus de lateralele
detectorului rezervorului cu solutie tampon. Aproape toate lucrările
facute inainte de 1988 în CE au fost efectuate pe dispozitivele facute in
casa în urma acestei configuraţii de bază. Desi relativ uşor de utilizat
pentru experimentare, aceste sisteme timpurii au fost incomode pentru
analize de rutină şi prea imprecise pentru analiza cantitativă.

O diagrama a unui instrument modern P/ACE™ 2000 Series este

ilustrata in figura 1. Comparativ cu începutul dezvoltarii acestor
instrumente, cel prezentat oferă un control complet automatizat,pe
calculator, al tuturor operaţiunilor,presiune şi injectare electrocinetica,
un colector de fractiune şi un autosampler (sampler=aparat pentru
luarea probelor, analizor), metode de dezvoltare automatizate, control
precis al temperaturii, precum şi un sistem avansat de disipare a
căldurii. Automatizarea este critică pentru CE, deoarece operaţiunile
repetabile sunt necesare pentru o analiză cantitativă precisă.

Configuraţia de bază a sistemului de electroforeza capilara P/ACE.

 TERMINOLOGIA FOLOSITA PENTRU ELECTROFOREZA

Există câteva diferenţe semnificative între nomenclatura

cromatografiei şi electroforeza capilară. De exemplu, un termen
fundamental în cromatografie este timpul de retenţie. În electroforeză,
în conditii ideale, nimic nu este păstrat, astfel încât termenul analog
devine timpul migraţiei. Timpul de migrare (tm) este timpul de care are
nevoie o substanta dizolvata pentru a trece de la începutul capilarului la
fereastra detectorului.

Alţi termeni fundamentali sunt definiti mai jos. Acestia includ

mobilitatea electroforetica,µep (cm2/Vs), viteza electroforetica vep
(cm/s) , intensitatea câmpului electric, E (V/cm).

1)

Mai multe caracteristici importante pot fi văzute din această

ecuaţie:

1) vitezele sunt termeni masurati. Acestea sunt calculate prin

impartirea timpului de migrare la lungimea capilarelor pana la
detector, Ld.
2) Mobilităţile sunt determinate prin împărţirea vitezei la intensitatea
campului. Mobilitatea este independentă de tensiune şi lungimea
capilarelor dar este foarte dependentă de tipul pH-ului precum şi de
temperatura solutiei tampon.

3) Două lungimi ale capilarului sunt importante: lungimea pana la

detector, , si lungimea totală, . În timp ce separarea măsurabila are loc
în segmentul capilar, , intensitatea câmpului este calculat prin
împărţirea tensiunii la lungimea întregului capilar . Diferenta de
lungime Lt - Ld, este necesara pentru

realizarea conexiunii la rezervorul tampon. Pentru sistemul P/ACE,

această lungime este de 7cm. Prin inversarea configuraţiei sistemului,
această lungime de 7cm de capilar poate fi utilizata pentru efectuarea
separărilor foarte rapide.

Ecuaţia 1 este folositoare doar pentru determinarea mobilitatii

aparente. Pentru a calcula mobilitatea reală, fenomenul de curgere
electroosmotica trebuie să să fie contabilizat. Pentru a efectua
electroforeze reproductibile , fluxul electroosmotic trebuie să fie atent
controlat.
 ELECTROOSMOZA

Unul din procesele fundamentale care conduce CE este

electroosmoza. Acest fenomen este o consecinta a sarcinei de pe
suprafata peretelui capilarului. Capilarele din siliciu topit (cuart) care
sunt de obicei folosite pentru separari au grupuri silanol ionizabile in
contact cu solutia tompon continuta de capilar. Acest pI=1.5 este
pentru siliciul topit. Gradul de ionizare este controlat in principal de pH-
ul solutiei tampon. Fluxul electroosmotic se defineste astfel:

(2)

unde este constanta dielectrica, este vascozitatea solutiei tampon si

este potentialul zeta masurat la planul de forfecare aproape de
interfata lichid-solid.

Peretele incarcat negativ atrage ionii incarcati pozitiv aflati in

solutia tampon creand un dublu strat electric. Atunci când este aplicată
o tensiune capilarului, cationii din porţiunea difuzata a stratului dublu
migreaza în direcţia catodului si transportă apa cu ei. Rezultatul este un
flux net al soluţiei tampon în direcţia electrodului negativ. Acest flux
electroosmotic poate fi destul de robust, cu o viteza liniară în jur de 2
mm/s la un pH de 9 în 20 mm borat. Pentru un capilar de 50m, aceasta
se traduce

într-un volum al fluxului de aproximativ 4 NL/s. La pH=3 EOF este mult

mai mic, de aproximativ 0,5 NL/s.
Potenţialul zeta este legat de inversul sarcinii pe unitatea de suprafaţă,
numărul electronilor de valenţă, si de rădăcina pătrată a concentratiei
electrolitului. Deoarece aceasta este o relaţie inversă, creşterea
concentraţiei electrolitului scade EOF.

Aşa cum vom vedea mai târziu, fluxul electroosmotic trebuie să fie
controlat sau chiar suprimat pentru a rula anumite moduri de CE. Pe de
altă parte, EOF face posibila analiza simultană de cationi, anionii, şi
specii neutre într-o analiză unică. La pH neutru spre alcalin, EOF este
suficient de puternic , mai puternic decât migraţia electroforetică, astfel
încât toate speciile sunt atrase spre electrodul negativ. Ordinea
migraţiei este: cationii,speciile neutre, şi anionii.

Efectul pH-ului asupra EOF este ilustrat în figura 2. Imaginaţi-vă că

un ion amfoter cum ar fi un peptid este separat în fiecare din cele două
situatii descrise în figură. La pH ridicat, EOF este mare şi peptida este
incarcata negativ. În ciuda migraţiei electroforetice a peptidei spre
electrodul pozitiv (anod), EOF este copleşitor, şi peptida migrează spre
electrodul negativ (catod). La pH scăzut, peptida este încărcată pozitiv şi
EOF este foarte mic. Astfel, migraţia electroforetică a peptidei şi EOF se
indreapta spre electrodul negativ. În capilarele de siliciu topit netratate
majoritatea substanţelor dizolvate migrează spre electrodul negativ
indiferent de sarcina atunci când pH-ul solutiei tampon este mai mare
de 7,0. La solutiile tampon cu pH acid cei mai multi ioni amfoteri şi
cationii vor migra, de asemenea, spre electrodul negativ.
efectul pH-ului asupra fluxului electroosmotic

Pentru a asigura că un sistem este controlat în mod corespunzător,

este adesea necesar să se

măsoare EOF. Acest lucru este realizat prin injectarea unei substante
dizolvate neutre şi măsurarea timpului necesar pentru a ajunge la
detector. Substantele dizolvate, cum ar fi metanol, acetonă şi oxid de
mesityl sunt frecvent utilizate. În cromatografia capilară electrocinetica
micelara (MECC) ,tehnica despre care urmează să discutam mai târziu,
o cerinţă ar fi ca marcatorii solutiei dizolvate nepartitionate in micele se
impun de asemenea.

Pentru a efectua tehnici, cum ar fi focalizarea izoelectrica (IEF) sau

izotacoforeza(PTI), EOF trebuie să fie suprimat. Acest lucru este posibil
dacă este folosit un capilar fara sarcina de exemplu teflonul sau alt
capilar corespunzator filmat . Aditivi ,cum ar fi metilceluloză ,sunt, de
asemenea, eficienti în suprimarea EOF. Suprimarea EOF va fi discutata
mai târziu.

( teflon este o marcă de E.I. Du Pont de Nemours & Co)

MODURI ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE

Electroforeza capilară cuprinde o familie de tehnici care au

caracteristici diferite de operare si separare. Tehnicile sunt:

• zona de electroforeză capilară

• focalizare izoelectrica

• electroforeză capilară cu gel

• izotacoforeza

• cromatografie capilară electrocinetica micelara

Fiecare dintre aceste moduri de CE vor fi analizate în următoarele

secţiuni.

Zona de electroforeza capilara

Zona de electroforeză capilară (CZE), cunoscuta şi ca soluţie libera

de electroforeza capilară, este cea mai simplă formă de CE. Mecanismul
de separare se bazează pe diferenţele în raportul sarcina-masă. Sunt
fundamentale pentru CZE omogenitatea soluţiei tampon şi intensitatea
câmpului constantă pe tot parcursul lungimii capilarului.
După administrarea şi aplicarea de tensiune, componentele unui
amestec de probe individuale, în zone discrete aşa cum se arată în
figura 5., pot fi aproximate. Parametrul fundamental, mobilitatea
electroforetică poate fi aproximat cu teoria de la Debeye-Huckel-Henry

Zona electroforezei capilare

Sarcina neta este de obicei dependenta de pH. De exemplu, cu pH-

ul din gama de 4-10, sarcina neta a sodiului este constantă cum este si
mobilitatea sa. Alte specii, cum ar fi acetat sau glutamat sunt incărcate
negativ cu pH-ul din gama de mai sus au mobilităţi negative (migrează
spre electrodul pozitiv). La pH alcalin, migraţia lor neta va fi în
continuare spre electrodul negativ din cauza EOF. Ionii amfoteri cum ar
fi aminoacizii, proteinele si peptidele care prezintă inversarea sarcinii
lor,a pI-ului, de asemenea,

schimbări în direcţia de mobilitate electroforetică.

Separările de molecule mari şi mici se poate realiza prin CZE. Chiar

şi moleculele mici, în cazul în care diferenţele raportului sarcina-masă
poate sa nu fie mare, pot fi încă separabile.
Capilarele. Capilarele cu un diametru intern de 25-75µm sunt cele
folosite de obicei. Siliciul topit(cuart) este materialul ales datorita
transparentei UV, durabilitatii, (cand este imbracat cu poliamida), si a
potentialului zeta. Functionalizate si umplute cu gel capilarele devin
disponibile si pot fi acoperite in alte sectiuni.

Un nou capilar trebuie sa fie conditionat înainte de a putea fi

folosit. Se trateaza capilarul timp de 10 minute cu 0,1 M de hidroxid de
sodiu, 5 min cu apă, şi 10 min cu solutia tampon. Această procedură
pentru condiţionat este importanta pentru a se asigura că suprafaţa
capilarului este completa şi uniform încărcata. Pentru unele metode
este necesar a regenera această suprafaţă , astfel ca intre timp se
clateste cu 0,1 M de hidroxid de sodiu şi, în cazuri extreme, 1 M de
hidroxid de sodiu.

Procedura de regenerare este frecvent necesară în cazul în care

timpul de migraţie se schimba frecvent. Acest lucru este cel mai des
intalnit atunci când se utilizează solutii tampon cu pH-ul intre 2-6.
Regenerarea este rareori necesara, atunci când se lucrează cu pH 9, cu
excepţia procedurii de pornire zilnica, sau a cazului în care proba sau
componentele matricei aderă la peretii capilarelor.

Nu toate încercările de a stoca o capilară din silice topită sunt de

succes, de ex cu cat sunt mai mici capilarele,cu atat sunt mai predispuse
la colmatari. În timp ce acest lucru nu este foarte grav pentru tevile din
dioxid de siliciu goale, deteriorarea capilarelor poate fi costisitoare
atunci când se utilizează

capilare modificate chimic. Următoarea procedură va maximiza şansele

de a stoca cu succes un capilar.
1) Se clăteşte capilarul cu 0,1 M de NaOH pentru câteva minute.

(Nu face acest lucru cu capilare-chimic modificate.)

2) Se spală timp de 5 minute cu apă distilată.

3) Se pune un flacon gol, descăpăcite la capătul de ieşire şi se sufla N2

prin capilare timp de 5 minute.

4) Scoateţi cartuşul capilarului de la instrument.

Efectul pH-ului. La un pH ridicat în cazul în care EOF este

substanţial, ordinea de migraţiei va fi cationi, specii neutre şi anioni.
Nici una dintre moleculele neutre nu va fi separata, deoarece sarcina
netă este zero. Anionii vor migra în continuare spre catod, deoarece
EOF este mai mare decât migratia electroforetică.

La pH mai mic în cazul în care EOF este redus foarte mult, atât
cationi şi anioni pot fi încă măsurati, deşi nu într-un termen unic. Pentru
a măsura anioni, anodul trebuie să fie dincolo de fereastra detectorului.
De asemenea, pentru a măsura cationi, catodul trebuie să se afle
dincolo de fereastra detectorului. Configurarea electrica optima este
realizata pur şi simplu prin inversarea polarităţii a electrozilor.

Impactul pH-ului asupra analitului poate fi, de asemenea, substantial,

mai ales pentru compuşi complecşi, cum ar fi ionii amfoteri (peptidele).
Sarcina acestor compuşi este dependentă de pH, precum şi
selectivitatea de separare este afectată în mod substanţial de
modificarea pH-ului. Ca o regulă, selectaţi un pH care este cu cel puţin
două unităţi mai mare sau mai mic fata de p a analitului pentru a
asigura ionizarea completă. La un pH extrem de alcalin, EOF poate fi
atât de rapid incat pot sa apara separari incomplete.

Anumite proteine pot fi separate la pH acid. In aceste condiţii,

peretele capilar este neacoperit. Proteinele în aceste condiţii vor fi
încărcate pozitiv şi nu vor interacţiona electrostatic cu peretele, deşi
interacţiunile hidrofobe pot apărea în continuare. Limitarea acestei
tehnici este precipitarea proteinelor. La pI din proteine, simetria benzii
tinde să fie slaba.

Solutiile tampon. O mare varietate de solutii tampon (tabelul 1) pot

fi folosite în CZE. O solutie

tampon este cea mai eficientă daca pH-ul are o unitate sau doua
diferenta fata de pI-ul sau. De exemplu,

pH-ul fosfatului este utilizat la aproximativ pH 2,5 şi pH 7, şi boratul la

pH-ul 9. Concentratia solutiei tampon tipice este 50-100 mM.

Solutiile tampon cu ioni amfoteri cum ar fi bicina(2-(bi(2-

hidroxietil)amino)acetic acid), tricina(N-(2-hidroxi-1,1-
bi(hidroximetil)etil)glicina), CAPS(N-ciclohexil-3-aminopropanesulfonic
acid), MES(2-(N-morpholino)etanosulfonic acid), şi
Tris((HOCH2)3CNH2.) sunt de asemenea, frecvente, în special pentru
separarea proteinelor si peptidelor. Avantajul solutiilor tampon cu ioni
amfoteri este conductivitatea scăzuta atunci când solutia tampon este
utilizata în jurul pI-ului. Avantajul aceasta este fluxul mic curent şi astfel
reducerea caldurii Joule. În anumite preparate tampon, în special cele
destinate separarii de proteine, saruri cum ar fi clorura, fosfatul şi
sulfatul se adaugă la mediul tampon. Aceste săruri adaugate afecteaza
structura proteinei, care, la rândul său, poate avea un impact asupra
separarii. Concentraţia de sare are ,de asemenea, efecte asupra EOF
datorate în parte unei perturbari a sarcinii dublului strat al peretilor
capilarelor. Limitarea majoră a cantităţii de sare care poate fi adăugata
la un preparat tampon este căldura prin efectul Joule.
Diversi aditivi tampon (tabelul 2) pot fi utilizati pentru a schimba
selectivitatea de separare. Aditivii tampon pot modifica, printre
altele,mobilitatea electroforetică. Cu alte cuvinte, doi compuşi care au

mobilităţi identice într-un sistem tampon simplu pot fi diferenţiati cu un

aditiv. Alţi aditivi, cum ar fi agenţii tensioactivi sau ciclodextrinele,
formează un mediu eterogen care defineşte noi clase de CE, despre
care vom discuta mai târziu. Toate solutiile tampon trebuie să fie
filtrate prin filtre de 0.45- m

înainte de utilizare.
 Tabelul 2. Aditivii tampon pentru CZE

ADITIVI FUNCTIE

Saruri anorganice Schimbari in conformatia proteinelor

Solventi organici Dizolvant, modifica fluxul electroosmotic

Uree Dizolva proteinele si denatureaza

oligonucleotidele

Acizi sulfonici Agenti de asociere ionica, agenti de

interactiune hidrofobica

Acizi tensioactivi Inverseaza sarcina peretelui capilar

Derivati de celuloza Reduce EOF, asigura un mediu de

sortare

Amine acopera grupurile silanol libere

Legatura cu peretele capilar. O problemă cu CZE este “lipirea”

electrostatică a substantelor cationice pe pereţii tubulaturii. Acest efect
este observat la proteine atunci când operează într-o solutie tampon

care are un pH mai mic decat al analitului. Această problemă poate fi

depăşită functionand cu cel puţin două unităţi ale pH-ului mai mult
decat pH -ul proteinei, dar în unele cazuri, pH-ul mai mare nu poate fi

optim pentru separare. În ciuda acestor probleme, proteinele, în special

cele de dimensiuni similare, pot fi cel mai bine separate în soluţie
libera. Utilizarea capilarelor tratate este unul din modurile, care pot
servi la reducerea “lipirii” de perete.

O altă procedură recent dezvoltata implică utilizarea unei

concentratii mari de fosfat a solutiei tampon pentru a ecrana sarcina pe
interiorul peretelui capilarului şi capilare scurte (20 cm), cu teava
mica(25µm) manevrate in campuri electrice de intensitate mare care
permit separarea rapida , astfel minimizand timpul de şedere a
proteinelor în capilar. Această abordare are nevoie de un excelent
sistem de control al temperaturii capilarului, în vederea eliminarii
căldurii generată de tensiuni şi curenţi mari.

Acoperirea capilarului. Reducerea sau eliminarea EOF poate fi utila

pentru a permite separările electroforetice directe care trebuie
efectuate. Mai convingătoare este capacitatea de a elimina adsorbţia
substantei dizolvate. O varietate a invelisurilor este posibilă inclusiv
unele faze utilizate pentru o cromatografie în fază gazoasă în coloană
capilară. Utilizarea acoperiri hidrofile poate fi utila în suprimarea
adsorbţiei compusilor hidrofobi. De asemenea poate fi suprimata si
“lipirea” electrostatica. Acoperirea hidofobica, coroborata cu
surfactanti neionici, ca aditivii tampon, pare promiţătoare, de
asemenea, multe companii au început să introducă capilare cu faza
combinata. Aceste capilare ar trebui să extindă în continuare gama de
compuşi pentru care separarea prin CZE este aplicabila.
Focalizare izoelectrica

Premisa fundamentală a focalizarii izoelectrice (IEF) este că o

moleculă va migra atât timp cât este incarcata cu sarcina electrica. Cand
devine neutra, se va opri din migratia în câmpul electric. IEF este
condusa într-un gradient al pH-ului în cazul în care pH-ul este mic la
anod şi ridicat la catod (Figura 7). Gradientul pH-ului este generat cu o
serie de substanţe chimice cunoscute sub numele de transportatori
amfoliti de amfoteri. Atunci când este aplicată o tensiune, amestecul
amfolit se separă în capilare. Amfolitii care sunt încărcaţi pozitiv, vor
migra spre catod în timp ce cei incarcati negativ migrează spre anod.PH-
ul, apoi va scădea la sectiunea anodica şi va creşte la sectiunea
catodică. În cele din urmă, migraţia amfolitului va înceta atunci când
fiecare amfolit ajunge la punctul său izoelectric şi nu mai este incarcat
electric. Iniţial, o substanta dizolvata cu o sarcina negativa va migra
spre anod, în cazul în care întâmpină o scădere a pH-ului solutiei
tampon. În cele din urmă, substanta dizolvata intalneste o zona cu un
pH unde sarcina sa electrica devine zero , punctul izoelectric (pI), si
migratia se opreste. Cu cat este mai mare numarul de amfoliti din
solutie cu atat mai lina este panta pH-ului.
Focalizarea izoelectrica

PH-ul solutiei tampon trebuie să fie mai mic decât pI-ul celor mai multi
amfoliti acizi pentru a preveni migraţia în interiorul analitului. De
asemenea, catolitul trebuie să aibă un pH mai mare decât amfolitul cel
mai de bază.

Este evident că EOF şi alte forţe convective trebuie să fie suprimate

pentru ca IEF să fie eficientă. Peretii capilarelor pot fi acoperiti cu
metilceluloza sau poliacrilamida pentru a suprima EOF. Acoperirea
tinde să suprime absorbtia proteinelor, de asemenea. IEF este în
general utilizata pentru separari de înaltă rezoluţie a proteinelor şi
polipeptidelor, dar ar putea fi folosita pentru orice substanţă
amfoterica, cu condiţia ca o serie de amfoliti sa faca parte din gama pI-
ului utilizat.
Electroforeză capilară cu gel

Electroforeza tradiţională cu gel este efectuata într-un mediu

anticonvectiv cum ar fi poliacrilamida sau agaroza. Compoziţia mediului
poate, de asemenea,servi ca o sită moleculară pentru a efectua
separările dupa dimensiuni (figura 9). În plus, gelul suprima EOF. Din
cauza unei lungi istorii a acestei tehnici, adaptarea la CE este foarte de
dorit. Acest lucru este deosebit de valoros pentru separările ADN
deoarece nici o alta tehnica până în prezent nu a furnizat astfel de
separări dramatice. Coloanele capilare cu gel , au început să fie
introduse pe piata din numeroase surse pentru comercializare.
Capilarele din poliacrilamida umplute cu gel sunt de obicei folosite, deşi
noi formule polimer cu o mai mare stabilitate in câmpul electric aplicat
vor fi introduse în scurt timp. Gelurile de agaroză nu sunt în măsură să
reziste incalzirii produse de înaltă tensiune utilizata în electroforeza
capilară cu gel(CGE).

Electroforeza capilara cu gel.

Există două clase fundamentale de geluri care pot fi utilizate în CGE.

Acestea sunt ilustrate în figura 10. Gelurile fizice obţin structura lor
poroasa datorita legăturii de polimeri şi sunt destul de brute fata de
schimbările din mediului. Hidroxipropilmetilceluloza si polimerii similari
pot fi folositi pentru a forma geluri fizice. Gelurile chimice utilizeaza
legaturi covalente pentru a forma structura poroasa. Aceste geluri sunt
mai puţin brute, şi este dificil de a schimba solutiile tampon odata ce se
formează geluri. În CZE şi alte forme de "deschideri-tubulare" ale CE,
capilarul este umplut cu un tampon de presurizare. Pentru
capilarele cu umplute cu gel, aceasta tehnica ar duce la extrudarea
gelului.Ureea şi de alţi agenţi, cum ar fi un tampon Tris-borat-EDTA, se
adaugă înainte de polimerizare. Poliacrilamida reticulară este, de obicei
selectata ca agent formator de gel.

Geluri fizice si chimice.

CGE se efectueaza de obicei in capilare de 50 - 100µm cu lungime de

la 10cm la 1 m. O mai bună rezoluţie este găsita pentru capilarele mai
lungi, dar timpul de desfasurare este uneori excesiv. Compoziţia gelului
din capilar este mai bine manipulata pentru a optimiza rezoluţia. De
exemplu , creşterea concentraţiei de gel îmbunătăţeşte rezoluţia dar
scade intervalul masei moleculare accesibile. Tensiunea este oarecum
limita, deoarece intensitatea câmpului peste 500 V/cm poate provoca
încălzirea capilarelor şi, în final, goluri.

Proteine.- Proteinele denaturate cu 2-mercaptoetanol

functioneaza, de obicei, cu un sistem de prindere SDS-PAGE. În aceste
condiţii, toate proteinele au aceleaşi raport sarcina-masă, deoarece
sarcina initiala este eclipsata de legatura SDS.Într-adevăr, o cantitate
constanta de SDS, 1,4 g, este adsorbit pe fiecare gram de proteine. SDS
este anionic; prin urmare, toate proteinele devin încărcate negativ şi
migrează spre anod. Proteinele se desfasoara (cu condiţia ca legăturile
disulfit sa fie rupte) şi devin ca un stalp de referinta in structura
permitand cernerea uniforma pentru separarea moleculară dupa
dimensiune. Un tampon tipic este de 90 mM Tris-fosfat,pH-ul 8.6, 0.1
SDS%. O diagrama de calibrare a mobilitatii in functie de greutatea
moleculară permit misiuni in functie de dimensiune ale diferitelor
fragmente. Injectarile electrocinetice sunt utilizate în CGE, deoarece
injectarea sub presiuni-mediate ar duce la extrudarea gelului. Capilarele
scurte de 10-20 cm sunt folosite iar intensitatea câmpului se apropie de
400 V/cm. În aceste condiţii, există o corelaţie liniară între mobilitate şi
greutate moleculară. Jurnalul de mobilitate functie de procentul
compoziţiei monomer (T%) al gelului este, de asemenea liniar.
Proteinele sunt de obicei denaturate în SDS 1% şi 2% -mercaptoetanol
pentru 30 min la 90 C. Ca şi în electroforeză convenţionala placa-gel,
migraţia scade pe măsură ce creşte dimensiunea porilor (mai mic % T).
Timpul de separare poate fi, de asemenea, redus prin utilizarea unei
tensiuni mai mari, cu condiţia ca disiparea căldurii sa fie optima.
Capilarele scurte pot fi folosite şi la aceeasi intensitate a campului
electric pentru a accelera în continuare separarea.

ADN-ul. Separarea oligonucleotidelor şi a produselor secvenţă de ADN a

fost realizată în geluri de poliacrilamidă. Pentru restricţionarea
fragmentelor şi a oligonucleotidelor mai mari, geluri cu foarte putine
valente (crosslinker, cross-link = legatura ce leaga un polimer de altul)
sau deloc par a fi cele mai eficiente datorită dimensiunii mai mari a
porilor de gel. Separarea deoxioligonucleotidelor, cum ar fi poli( este
uşor de realizat într-un 8% T gel cu un tampon constând in 100 mM
Tris-borat, pH 8.3 cu 2 mM EDTA şi 7 M uree, în 35 min cu unitatea de
baza a rezolutiei. Determinarea purităţii sintetice a oligonucleotidelor
este o aplicaţie importantă a CGE. Figura 11 prezinta separarea unui
homopolimer sintetic 50-mer timidină cu o intensificare de modulo 5.
Secvenţele de eşec sunt bine separate, cu unitatea de bază ca rezolutie.
CGE a timidinei sintetice homopolimer cu modulo 5 amplificare. Solutia
tampon,25mMTris, 25mMacid boric, 7M uree; gelul, poliacrilamida,
7.5%T, 3.3%C. Prin amabilitatea A.Paulus si J.Ohms, Beckman
Instruments,Inc.

ADN-ul dublu catenar poate fi separat fizic cu geluri. Capilarele cu

suprafata modificata sunt cele mai bine utilizate, deoarece fluxul de
electroosmotic este complet suprimat. În aceste condiţii, timpul de
migrare al fragmentelor este direct legat de numărul de baze prezente.
Figura 12 prezinta separarea unei restricţii digestive Hae III de øX174
ADN. Aceste separări sunt foarte eficiente, deoarece randamentele de
vârf reprezinta 118 perechi de bază produce 2.000.000 placi teoretice
pe metru. Utilizarea de bromură de etidiu ca un aditiv tampon
îmbunatateste separarea, permitand o buna rezoluţie a vârfurilor care
reprezintă 261 şi 271 de perechi de baze. Rezoluţia acestui sistem este
de 3 perechi de baze. Printre alte aplicaţii utile pentru acest sistem sunt
separările al PCR-ADN amplificat, precum şi lichidele de restrictie
digestiva.
Separarea restrictiei digestive Hae III cu øX174 DNA

prin CGE cu un gel fizic..Solutia tampon, 89 mM Tris-borat, 2 mM EDTA,

pH 8.5, 0.5% hidroxipropilmetilceluloza, 10 µM bromura de etidiu;

capilarul, DB-17invelis, 100 µm x50 cm (lungimea pana la detector);

intensitatea campului, 175 V/cm; detectarea, 260 nm;

concentratia probei, 10 µg/mL.

 Electroforeză capilara cu gel este încă în fază incipientă. În timp
ce majoritatea laboratoarelor academic isi produc propriile capilare fie
cu legatura covalenta a poliacrilamidei cu peretele capilarului sau prin
invelirea capilarelor cu geluri, este de aşteptat ca majoritatea
utilizatorilor vor achiziţiona de la furnizori capilarele comerciale. De
asemenea, soluţiile tampon optimizate pentru separarea ADN-ului în
formatul unui gel fizic sunt, de asemenea, furnizate de către
producători. Una dintre multe forţe care dirijeaza dezvoltarea
capilarelor umplute cu gel este secvenţierea ADN-ului. Speranta este ca
un instrument CE multiplex cu geluri va forma baza unui instrument la
scară genomica

Izotacoforeza

Înainte de 1981, izotacoforeza (PTI) a fost folosit cel mai des folosita
tehnica din electroforezele capilare, deşi capilarele au fost destul de
mari (250-500 m), fata de standardele de azi. Un instrument
comercial,

LKB Tachophor, a fost introdus la mijlocul anilor 1970.

Ca IEF, ITP se bazează pe fluxul de electroosmotic zero, şi pe un

sistem tampon eterogen. Capilarul este umplut cu un electrolit de
conducere, care are o mobilitate mai mare decât oricare dintre
componentele probei care urmează să fie determinata. Apoi proba este
injectata. Un electrolit de încheiere ocupă rezervorul opus, şi
mobilitatea ionica a acelui electrolit este mai mică decât oricare dintre

componentele eşantionului. Separarea va avea loc în diferenţa dintre

electroliţii de conducere şi cei de încheiere in baza mobilităţi
individuale ale analitilor. Aşa cum se arată în figura 13, limitele zonei
stabile se formeaza între componentele individuale, care rezultă din
separari extrem de eficiente. Ambele specii, anionii şi cationii ar putea fi
determinati, dar nu în acelaşi timp.

Izotacoforeza anionica.
 În instrumentele timpurii, detectarea se facea prin
conductibilitate sau cu conductibilitate diferenţiala. Detectarea datorita
conductibilitatii a dat un model scara-pas dupa fiecare ion individual
trecut de electrozi. Conductivitatea diferentiala ar putea restaura
izotacoferograma la o serie de vârfuri convenţionale. Detectarea
directă UV , de asemenea, oferă un aspect familiar electroferogramei în
prezenţa distanţierelor. Un distantier este un o substanta dizolvata
neabsorbanta cu o valoare a mobilitatii care se încadrează între
mobilităţi de două vârfuri, care trebuie rezolvate. Dezavantajul ITP este
că dacă nu se folosesc distanţierele, benzile adiacente sunt în contact
intre ele. O a doua problemă este că, în comparaţie cu CZE, selecţia şi
optimizarea solutiei tampon sunt mai complicate. De exemplu, pentru a
determina cationii, electrolitul catodic de conducere ar putea conţine
un acid extrem de mobil (H +), în timp ce electrolitul anodic de
încheiere s-ar putea conţina un acid slab, cum ar fi acidul propionic.
Cele mai multe dintre aceste puncte sunt ilustrate în figura 14 pentru
ITP unor anioni. Graficul de jos este urmarirea conductivitatii directe
(reprezentat ca rezistenta) în timp ce graficul superior reprezintă
conductivitatea diferentiala.
ITP-ul unui amestec de anioni cu detectarea folosind conductivitatea

Capilarul, 105 µm de ex:fluorurat cu copolimer etilenă-

propilenă;conducator, 10 mM acid hidrocloric titrat la pH6.0 cu
histidina, 2 mM hidroxietilceluloza;terminal(de incheiere), 5 mM MES;
curentul, 10 µA.

Cheie: R, semnal pe aparatu de masura al conductivitatii (rezistenta în

creştere); L, clorură; 1, sulfat; 2, cloratul;3, cromat; 4, malonat; 5,
adipat; 6, benzoat;7, impuritate; 8, acetat; 9, ß-bromopropionat; 10,
naftalină-2-sulfonat; 11, glutamat;12, enantat; T, MES. Reprodus în
parte din J. Chromatogr., 267, 67 (1983) (fig. 3).

Izotacoforeza are două caracteristici, a căror combinaţie duce la

metodele electroforetice unice: toate benzile se misca cu aceeasi viteza
şi benzile sunt focalizate. De exemplu, benzile foarte mobile au
conductivitate mare si, ca rezultat al acestui lucru, au o cădere de
tensiune joasa de-a lungul benzii. Având în vedere că mobilitatea este
produsul conductibilitatii şi căderii de tensiune, şi conductibilitatea şi
căderea de tensiune sunt invers proporţionale, benzile de viteza
individuale sunt auto-normalizatoare. Focalizarea este, de asemenea, o
consecinţă a normalizarii vitezei. De exemplu, dacă o banda difuzează
într-o zona vecina, aceasta va accelera sau va frana datorita campului
electric intalnit şi va reveni in locul initial.

Lucrand cu instrumentele moderne a fost un succes, atât cu

capilare tratate cat şi netratate din siliciu topit. EOF poate fi suprimata
cu 0,25% hidroxipropilmetilceluloză. Un electrolit conducator bun este
de 5 mM acid fosforic. Valină (100 mm, ajustata la pH apropiat cu
amina primara) este un electrolit util de încheiere. La începutul unei
separări, curentul poate fi destul de mare, deoarece electrolitul extrem
de mobil umple complet capilarele. Pe masura ce separarea
progreseaza, curentul întotdeauna scade la cel mai puţin mobil analit
de incheiere care intră în capilare.

Au existat unele publicaţii recente care folosesc ITP ca un pas de

preconcentrare pentru CZE. Pentru că ITP este o tehnica de focalizare,
utilizarea capilarelor cu diametru mare nu provoacă deteriorarea
rezoluţiei asa cum se intampla pentru CZE.
CROMATOGRAFIA CAPILARA ELECTROCINETICA MICELARA

Poate cel mai intrigant mod al CE pentru determinarea moleculelor mici

este MECC. Utilizarea soluţiilor tensioactive care formează micele poate
da naştere la separari care seamana cu faza inversa a LC , cu beneficiile
CE. Spre deosebire de IEF sau ITP, MECC se bazeaza pe o EOF robustă şi
controlabila.

Micelele. Micelele sunt agregate amfifile ale moleculelor cunoscute sub

numele de tensioactivi. Acestea sunt molecule cu lanţ lung (10-50 de
unităţi de carbon) şi sunt caracterizate ca având o coada lunga
hidrofoba şi cap un grup hidrofil. Micelele normale sunt formate în
soluţie apoasă cu cozi hidrofobe indreptate spre interior şi cap hidrofilic
indreptat spre exteriorul soluţiei apoase. O schema este prezentata în
Figura 15. Forma micelei este o consecinţă a efectului hidrofob, anume,
acestea se formeaza pentru a reduce energia libera a sistemului. Coada
hidrofoba a tensioactivului nu poate fi dizolvata în soluţie apoasă. Pe
langa concentratia tensioactivului cunoscuta si sub numele de
concentraţia critică a micelei (CMC), agregatul este pe deplin format.

Modificările fizice, cum ar fi tensiunea superficială, vâscozitatea, şi

capacitatea de a difuza lumina însoţesc formarea micelei. Micelele
inverse, care formeaza solventi organici, nu au fost studiate în MECC.
Cromatografia capilara electrocinetica micelara

Exista patru mari clase de tensioactivi: anionici, cationici, amfoteri si

nonionici, exemple care se regasesc in tabelul 4. Din acestea patru
primele doua sunt cele mai folosite in MECC. Ambi compusi sintetic si
natural care apar au fost folosite pentru MECC. Varietatile sintetice
includ SDS anionic şi bromura de cetiltrimetilamoniu cationica(CTAB).
Compusii naturali, cum ar fi sărurile biliare (taurocolat de sodiu, etc)
sunt de asemenea utili.

Tabelul 4. Tensioactivi, Clase si Proprietati

Tensioactiv Tipul CMC Agregarea

SDS anionic 8.1x 62

CTAB cationic 9.2x 170

Brij-35 nonionic 1.0x 40

Sulfobetaina amfoter 3.3x 55

SDS=sulfat de sodiu dodecil; CTAB=bromura de cetiltrimetilamoniu;
Brij-35=polioxietilena-23eter lauril;

Sulfobetaina=N-dodecil-N, N-dimetilamoniu-3-propan-1 acid sulfonic.

SDS este cel mai utilizat de agent tensioactiv în MECC. Este disponibil în
forme extrem de purificate şi este ieftin. Greutatea sa moleculara este
de 288 şi CMC este de 8 mM. Numărul de agregare (numărul de
molecule/micelle) este 62.

Micelele au capacitatea de a organiza analiţii la nivel molecular

bazandu-se pe interacţiunile hidrofobe şi electrostatice. Chiar şi
moleculele neutre se pot lega la micele, deoarece nucleul hidrofob are
o mare putere de dizolvare. Solutiile tensioactive au fost folosite în
spectroscopie şi cromatografie pentru a profita de aceste proprietati
unice micelare.

De exemplu, fosforescenta la temperatura camerei este uşor

observabila în mediile micelare deoarece mediul micelar previne multe
dintre mecanisme de călire normale de la operare. Cu mai multa
insemnatate în ceea ce priveşte MECC, aceste aceleaşi soluţii
tensioactive pot servi drept modificatori ai fazei mobile cromatografice.
Cromatografia micelara poate sa mimeze o faza inversă a LC în care
creşterea concentraţiei tensioactivului creşte puterea de eluţie a fazei
mobile. Analitul se poate partiţiona între micele si faza compacta,
micele şi faza staţionară, sau în faza compacta şi fază staţionară. Astfel,
"pseudo-faza" sau LC micelara are mai mult echilibru al complexului
decât LC convenţionala. Acest echilibru cu trei faze poate fi asemănat
cu cromatografia ionilor-pereche în multe cazuri. În anumite aspecte,
mecanismul MECC, din cauzaca este doar un echilibru cu două faze,
este mai simplu decat cromatografia micelara. Factorul complicator în
MECC este că mobilitatea electroforetică a analitului contribuie adesea
la separarea intregului.

Selectarea modului de electroforeza capilara

Tabelul 6 poate fi utilizat pentru a ajuta la modul de selectare al celei

mai avantajoase metode de electroforeză ca punct de plecare în
metodele de dezvoltare. Cota cea mai înaltă în fiecare categorie din
diagramă este de natură să producă rezultate acceptabile în cel mai
scurt interval de timp.
Tabelul 6.Selectarea modului de electroforeza capilara
Ioni mici Molecule mici Peptide Proteine Oligonucleotide ADN
CZE MECC CZE CZE CGE CGE
ITP CZE MECC CGE MECC
ITP IEF IEF
CGE ITP
ITP

Abordări ale metodelor de dezvoltare ale CZE şi MECC

Înainte de a încerca o noua separare, culegerea de informaţii este

foarte utila. Este compusul solubil în apă la concentraţii de până la1
mg/mL? Este solubil la toate pH-urile lui? În cazul în care solubilitatea
apoasă este o problema, vor rezolva problema cantităţile mici (până la
25%) din metanol sau acetonitril-l? Se vor dizolva moleculele mici
folosind 100 SDS mm? Pentru proteine, va fi de ajutor 7 M uree sau un
agent de dispersie, cum ar fi etilen glicol? Este instabil analitul la
anumite pH-uri ale lui? Este compusul labil termic? Care este lungimea
de undă maximă de absorbţie UV? Cât de multe componente sunt
aşteptate în amestec? Care este concentraţia preconizată a fiecărui
component?
Dezvoltarea unei metode cu ajutorul CZE

Un număr mare de opţiuni şi instrumente pentru dezvoltarea

metodelor sunt disponibile pentru CZE. In acest exercitiu, procesul de
separare a unei proteine noi va fi revizuit. Pentru condiţiile de pornire,
utilizaţi un capilar de 75 de cm incalzit la 25 C conectat la 20 kV cu
detectorul stabilit la 214 nm. Se injecteaza prima transa de 1 mg/ml din
soluţie. Folosiţi un tampon de 100 mm la pH-ul adecvat.

1)acid stabil- se va utiliza un tampon cu pH-ul de mai mic pI;

acid labil - selectaţi un pH de cel puţin 1 unitate de mai mare decat pI.

2)problema solubilitatii – se adăuga un modificator cum ar fi ureea sau

etilen glicol.

3) problema adsorbţiei - utilizarea un aditiv, cum ar fi un acid sulfonic,

de sare, sau trecerea la tratamentul capilarului.

4) eficienţă bună, proastă separare - ajustarea pH-ului.

5) slaba eficienţă - creşterea rezistentei ionice a solutiei tampon, se

adaugă o sare în care proteina este stabilă.

În majoritatea cazurilor, se va putea obţine o bună separare într-un

interval de timp relativ scurt. Unele probe pot fi destul de dificile şi va
trebui acordam o perioadă considerabilă de timp pentru selectarea cu
atenţie a solutiilor tampon şi a aditivilor tampon.
Dezvoltarea unei metode cu ajutorul MECC

MECC este un mecanism de separare bun pentru moleculele mici.

Greutate moleculară maxima nu a fost încă stabilita. Proteinele nu sunt
bine separate prin această tehnică.

Condiţiile bune de pornire sunt 100 mM SDS în pH 7, 50 mm

fosfatoborat ca solutie tampon, după care ajustările concentraţiei SDS,
a pH-ului, şi modificatori organici pot fi necesari. Unele linii directoare
sunt:

1) timp mare al separarii, o buna rezoluţie - creşterea pH-ului, scăderea

SDS.

2) timp mare al separarii, o proastă rezoluţie - utilizarea modificatorilor

organici.

3) timp de separare scurt rezolutie slaba – cresterea SDS.

4) timp de separare scurt,rezolutie moderata – scaderea a ph-ului,

creştere a SDS.

Utilizarea modificatorilor organici este deosebit de puternica în MECC.

Acetonitril este solventul ales în primul rând, deoarece are un impact
redus asupra EOF. Alcooli pot fi de asemenea utili, dar timpul de
separare poate deveni foarte lung. În condiţiile corespunzătoare,
puterea optima şi capacitatea de vârf

depăşesc cu mult HPLC. Este nevoie de nu mai mult de câteva zile

pentru a dezvolta cele mai multe separări.
Metode de dezvoltare automatizate

Sistemele P/ACE ™ 2050 şi 2100 au capacitatea de a efectua separări

multiple cu o varietate de soluţii tampon. Această caracteristică oferă
posibilitatea de dezvoltare automata, dezvoltarea metodelor cu
procese nesupravegheate, deoarece noile solutii tampon pot fi folosite
pentru fiecare proces în ambele rezervoare, anod şi catod. În acest
mod, parametrii cum ar fi pH-ul, concentraţia solutiei tampon, tipul de
aditiv, şi concentraţia tensioactivilor, printre alţi factori, pot fi optimizati
într-un mod logic şi sistematic.

Exista cateva indicatii care se vor dovedi utile pentru a asigura eficienta
generaţiei de aplicaţii informatice:

1) Efectuaţi câteva separări preliminare pentru a obţine in general o

înţelegere a problemei.

2) Setaţi timpul de functionare pentru timpul maxim de separare la care

va puteti aştepta.

De exemplu, cu MECC, acest lucru ar corespunde cu cea mai mare

concentraţie a tensioactivului utilizat.

3) Unele solutii tampon, cum ar fi fosfatul, modifica permanent chimica

peretelui; folositi aceste solutii la sfarsit.

4) Atunci când se face trecerea de la CZE la MECC, lasati suficient timp

(cel puţin 0,5 h) pentru capilar să se echilibreze cu soluţia tensioactiva.

5) Programati clatiri cu 0,1 M de hidroxid de sodiu între fiecare dintre

procese. 6) La stabilirea temperaturii optime, acordati timp suficient
pentru a permite echilibrarea termica. 7) Modificati pe rand cate o
singură variabilă experimentala.
 CAPITOLUL 3

APLICATIILE ELECTROFOREZEI CAPILARE(EC) IN

ANALIZELE FARMACEUTICE

In cea mai simpla forma a sa electroforeza este denumita

“electroforeza zonei capilare”. Conditiile folosite in acest tip de analiza
sunt relativ simple iar faza mobila utilizata consta intr-un tampon cu
diferiti aditivi. Multe aplicatii se concentreaza pe separarea critica care
este dificil de obtinut cu HPLC. In multe cazuri este greu de explicat in
totalitate tipurile de efecte produse de aditivii din tampon.

Separarea atenololului si a impuritatilor legate de acesta in special

datorita sarcinilor electrice

Β-blocant-ul atenolol este aratat in figura 14.6 cu principalele lui

impuritati cunoscute. Aceste impuritati nu sunt usor separate de
atenolol cu ajutorul HPLC datorita similaritatii structurilor lor.

Separarea are loc folosind capilare de 0.05mm x 50cm la 15kV cu un

tampon de fosfat/borat. Figura 14.6 evidentiaza separarea, la un pH
optim de 9.7 al atenololului(50µg/ml) , de impuritatile sale tintuite in
solutie la concentratia de 5µg/ml. Pentru elutie se intampla asa cum se
poate prezice dinspre grupurile ionizabile catre molecule. Atenololul
(AT) elueaza primul deoarece este incarcat pozitiv pe grupul de amine
secundare de baza(pKa 9.6). Dimerul (TA) este si el incarcat cu sarcina
pozitiva dar este amina tertiara si are valoare pKa mai mica decat a
atenololului. Este si un ion mai mare astfel mobilitatea va fi mai mica
decat a atenololului. (marimea era suficienta pentru producerea
separarii acestor doua molecule la un pH de 6.5 cand amandoua, si
atenololul si dimerul ar fi complet incarcati electric ).
Diolul (D) este un compus neutru si astfel ar trebui sa elueze in acelasi
ritm cu EOF care va creste odata cu pH-ul. Totusi, in lucrarea din
discutie timpul de elutie al diolului creste odata cu pH-ul; aceasta se
datoreaza combinatiei complexe cu boratul din zona tampon care tinde
sa formeze un complex incarcat negativ cu un diol. Acidul blocant
(BA)este incarcat atat pozitiv cat si negativ , care mai mult sau mai putin
se neutralizeaza reciproc intr-o variatie a pH-ului destul de mare, cum
creste pH-ul spre valoarea pKa a grupului de amine(cca 9.5) sarcina
negativa a grupului acidic devine predominanta; desi moleculele vor
avea in continuare o oarecare sarcina pozitiva, sarcina negativa globala
va determina moleculele sa ramana in urma EOF. In cele din urma
fenolul(PPA) este neutru pana cand valoarea sa pKa(cca 9.7 - 10) este
atinsa si la valori mai mari ale pH-ului va dezvolta o sarcina negativa
incetinind ritmul migrarii; acestea sunt conform figurii 14.6.

Separarea in special datorita razei ionice

Schimbari foarte mici in structura moleculara pot duce la diferente

remarcabile ale timpului de retentie in CE. O separare impresionanta a
unui medicament anti-depresiv experimental GR50360 de o parte a
impuritatilor s-a realizat folosind izopropanol/0.01 M tampon de fosfat
cu pH 7.0 . In acest caz separarea se datoreaza marimilor si formelor
mari moleculare odata cu pH=7.0 medicamentul si impuritatile acestuia
vor fi incarcate intr-o masura similara.
Figura 14.7 eidentiaza separarea tuturor celor 6 componente prin CE. Izomerul cis al GR50360 are o
forma moleculara complet diferita de izomerul trans, rezultand intr-o raza ionica mai mica si astfel
ruleaza mai devreme decat izomerul trans. Altfel compusii eluteaza in ordinea marimii moleculare
compusii perfluorati (desfluorocompound) fiind primii dintre derivatii lui GR50360 care se eluteaza.
Prezenta izopropanolului in faza mobila incetineste EOF suficient pentru ca separarea sa aiba loc fara
probleme.
Analiza medicamentelor non-steroidiene si anti-inflamatoare (AINS)
cu electroforeza capilara si separarea anionilor pe baza razelor ionice

AINS contine in general grupuri de acid carboxilic care ionizate

devin anioni. In CE folosind un capilar nemodificat EOF are directia
indreptata spre catod si mobilitatea globala a ionilor este data de EOF –
mobilitatea anionilor care se indreapta spre anod. In acest exemplu
tamponul folosit in in analiza este proiectat cu grija pentru continutul
sau ionic spre a evita electro- difuzia. Glicina a fost considerata ca fiind
potrivita din punct de vedere al mobilitatii pentru analiza compusilor
din aceasta clasa deoarece, desi este o molecula mica cu un grup de
acid carboxilic care este complet ionizat la pH-ul analizei (9.1) poarta
totusi o sarcina partial pozitiva reducand mobilitatea globala spre anod,
iprimand o mobilitate asemanatoare acelei unor mari acizi AINS
lipofili.Componenta cationica din tampon are un efect important in
rezolutia componentelor unui amestec care contine patru AINS.
Trietanolamina a fost desemnata ca fiind cea mai buna componenta
cationica deoarece a redus EOF din cauza mobilitatii ionilor sai relativ
scazuta si de asemenea prin cresterea vascozitatii in solutia tampon.
Figura 14.8 arata separarea unui amestec care contine cinci AINS,
anume: sulindac(S), indometacin (I), piroxicam (P), acid tiaprofenic ( T),
si aclofenac (A). Toate medicamentele sunt incarcate complet la un pH
de 9.1 si separarea s-a obtinut mai mult sau mai putin in concordanta
cu marimea moleculara, aclofenac-ul, cea mai mica molecula, este cea
care migreaza cel mai repede in directia opusa EOF.
Separarea peptidelor

Un punct forte al CE este acela ca poate separa peptidele .

Folosirea peptidelor in scop terapeutic creste rapid si dimensiunile
mari ale acestora si polaritatea creeaza probleme in incercarea de a le
separa. Pentru ca peptidele poarta de obicei doua sau mai multe
sarcini cei mai importanti factori care trebuie optimizati pentru
separarea peptidelor sunt pH-ul si concentratia solutiei tampon.
Valoarea pl a peptidelor este pH-ul cand sarcinile pozitive si negative
sunt perfect echilibrate. Un exemplu este dat de separarea hormonului
adrenocorticotrofic (ACTH) de trei dintre fragmentele sale. Tabelul 14.2
arata valorile maselor moleculare si valorile pl ale ACTH si ale celor trei
fragmente . Valoarea pl da cateva indicatii referitoare la numarul
relativ al grupuriloe acide si bazice din peptide. O valoare pl mare
indica o peptida cu un numar mare de reziduri bazice cum ar fi lizina si
arginina, pe cand o valoare scazuta a pl inclina balanta in favoarea
reziduurilor acide cum sunt acizi glutamic si aspartic. In acest exemplu
dat, conditiile (pH 3.8)au fost alese pentru a fi predominante reziduurile
bazice desi la acest pH reziduurile acide poarta inca o cantitate
apreciabila de sarcina negativa inhiband migratia spre catod. In acest
exemplu separarea este conforma cu echilibrul intre caracterele bazice
si acide ale peptidelor. Peptida cea mai bazica eluteaza prima intrucat
cea mai putin bazica peptida eluteaza ultima. Astfel, in acest caz, gradul
de incarcare pozitiva a peptidei predomina in detrimentul razei ionice
pentru determinarea vitezei de migrare deci ACTH migreaza mai rapid
decat fragmentul 3 in ciuda faptului ca are o masa moleculara mai
mare. Separarea a fost optimizata crescand rezistenta solutiei tampon
cum se poate vedea din figura 14.9 si cresterea rezistentei solutiei
tampon a dat un timp de migratie marit prin efectele sale in reducerea
EOF. Alt efect important datorat cresterii rezistentei solutiei tampon in
acest caz este reducerea interactiunii acestor predominant bazice
peptide(in special fragmentele 1,2 si ACTH) cu grupurile silanol de pe
peretele capilarului astfel rezultand un varf mai bine conturat.

In acest studiu elegant s-a ajuns la concluzia ca pentru toate peptidele

studiate cea mai buna separare este aceea realizata in solutii tampon
cu rezistenta mare(0.05-0.1M), permitand astfel manipularea EOF fara
a schimba pH-ul potrivit pentru zona tampon. S-a concluzionat si ca
valorile pH-ului acid intre 2.2 – 3.8 au fost cele mai bune pentru
analiza peptidelor bazice si neutre pe cata vreme peptidele acide se
separa cel mai bine la un pH de 7.0.
Folosirea aditivilor in solutiile tampon

Aditivi folositi in zona tampon pot produce o selectivitate mai mare

cand separarea in solutii simple nu este posibila.

Aplicarea ciclodextrinelor pentru imbunatatirea separarii

Ciclodextrinele sunt compusi neutri care migreaza cu acelasi ritm ca

EOF. Acestea au mari cavitati hidrofobe in structura lor , cavitati in care
se potrivesc moleculele. Usurinta cu care se potrivesc moleculele in
cavitatile ciclodextrinelor este dependenta de stereochimia acestora,
ciclodextrinele au fost folosite ca aditivi atat in separarile chiral , unde
enantiomerii opusi formeaza complexe tranzitorii de diastereomeri cu
ciclodextrinele active optic, cat si in separarile non-chiral unde
ciclodextrinele afecteaza diastereoizomerii intr-o masura diferita.

Separarea pilocarpinei de epimerul sau

Pilocarpina(P), un medicamet folosit in tratamentul glaucomului,

poate contine epimerul sau, izopilocarpina(I) ca impuritate. Intr-un
studiu nu a fost posibila separarea completa a pilocarpinei de
izopilocarpina variind pH-ul solutiei tampon. PH-ul optim pentru
separare trebuie sa fie 6.9 si ambi compusi trebuie sa fie cca 50%
ionizati dar chiar si la acest pH separarea nu este completa.
Introducerea a 0.01M -ciclodextrina in tamponul utilizat a dus la
separarea de baza a diastereoizomerilor. Figura 14.10 A arata separarea
celor doi epimeri obtinuta in urma adaosului de ciclodextrina in
tamponul utilizat. In acest exemplu au fost folosite capilare pe peretele
carora grupurile silanol au fost partial blocate de un invelis, reducand
sarcina negativa de pe perete reducand astfel EOF lasand mai mult timp
pentru desfasurarea separarii. In exemplul de fata separarea are loc
datorita diferitelor grade de complexare a aditivilor ciclodextrine cu
cei doi diastereoizomeri.
Separarea anestezicelor locale chirale

Ciclodextrinele sunt folosite in GC si HPLC pentru a efectua

separarea enantiomerilor si sunt de asemenea foarte eficienti in
aplicatiile CE. Aplicatiile CE separarilor chirale vor suferi o crestere
rapida in urmatorii ani pentru ca inalta eficienta care poate fi obtinuta
in separarile pentru care se foloseste aceasta tehnica si datorita
costului scazut al aditivilor chirali comparat cu costul coloanelor
folosite in GC si HPLC . O serie de enantiomeri ai anestezicelor locale au
fost separati folosind CE utilizand o solutie tampon de fosfat cu pH de
3.0 care contine trietanolamina ca aditiv cationic si 10mM de dimetil β-
ciclodextrina. Adaugarea aditivilor cationici inverseaza EOF (vezi tabelul
14.1) spre anod , totusi anaitii inca migreaza spre catod, avand o
mobilitate globala in aceasta directie mai mare decat a EOF spre anod.
Acest lucru a permis o crestere a timpului de interactiune a analitilor cu
ciclodextrina care migreaza spre anodcu EOF. Utilizarea β-ciclodextrinei
metilice creste interactiunea analitilor lipofili cu acest selector chiral
comparat chiar cu β-ciclodextrina.
Separarea izomerilor R si S a unei serii de anestezici locali relationati
structural. Separari considerabile au fost obtinute pentru compusii din
aceasta serie unde s-a propus ca pentru potrivirea porţiunii hidrofobe
de analit în ciclodextrin sa fie optima cand unul dintre substituenti de la
centrul chiral este capabil sa interactioneze cu grupurile de hidroxid
chiral in ritmul cavitatilor ciclodextrinei. Tabelul 14.3arata asocierea
constantelor calculate pentru interactiunea perechilor enantiometrice
cu dimetilciclodextrina. Cu cat mai mare valoare lui K, cu atat mai multi
enantiomeri sunt retrasi de către selector, care in acest caz migreaza
spre anod. Valorile din 61alcu evidentiaza si mobilitatea 61alculate
pentru fiecare analit in solutie libera cu cea mai mare parte a
substituentului N-alchil.
Cromatografie electrocinetica micelara(MECC)

Extinderea tehnicii de baza a CE permite separarea componentelor

neutre , dar a fost si larg folosit in obtinerea separarii speciilor de ioni.
In MECC, un tensioactiv(detergent) este adaugat fazei mobile la o
concentratie mai mare decat concentratia critica a micelei. Detergentii
folositi pot fi anionici, cationici sau neutri. Micelele actioneaza intr-un
mod analog fazei stationare din HPLC. Micelele anionice migreaza in
directia opuse celei obisnuite a EOF , adica spre catod. Micelele
cationice migreaza cu EOF si micelele neutre migreaza la aceeasi viteza
cu EOF. Prezenta detergentului in zona tampon are un efect asupra
ritmului si asupra directiei EOF prin interactiunea cu peretele capilarului
astfel incat baza finala pentru separare prin MECC poate fi datorata
unui numar de mecanisme. Interactiunea analitului cu micelele poate fi
modificata folosind detergenti organici in zona tampon care va reduce
partitionarea analitului in micele; in acelasi timp asemenea modificatori
organici tind sa reduca EOF.

Separarea cefotaxim-ului de impuritatile relationate

Penicilinele si cefalosporinele sunt compusi reactivi si pot contine un

numar de degradanti.Selectivitatea inalta a CE poate fi foarte
avantajoasa acolo unde se cere separarea unei mixturi complexe. Unele
impuritati pot fi neutre si separarea impuritatilor neutre una de cealalta
necesita partitionarea in micele incarcate cu sarcina care migreaza la
viteze diferite de EOF . la aceasta aplicatie in special sodiu dodecil
sulfat(SDS), un detergent anionica fost folosit pentru functionarea
MECC. PH-ul zonei tampon e de 7.2, adica destul de scazut pentru a
evita promovarea degradarii cefotaxim-ului care este inutilizabil ca
baza. Figura arata urma MECC obtinuta de la C care contine 0.2% w/w
din fiecare impuritate iar figura 14.14B arata o proba din C
necompromisa. Compusul care migreaza cel mai lent este compusul
neutru L , lactona , care ar trebui sa aiba o mare afinitate pentru
sarcinile negative si SDS hidrofob. Celelalte impuritati sunt reprezentate
de acizii carboxilicicare sunt comple incarcati cu sarcina la pH de 7.2,
astfel purtand o sarcina negativa care va provoca un anumit grad de
respingere intre analiti s micelele incarcate cu sarcina negativa. Anti-
izomerul lui C eluteaza tarziu datorita stereochimiei proprii, prin
urmare raza sa ionica si coeficientul de separare sunt foarte diferite de
cele ale lui C(aceasta este in concordanta cu lipsa efectului antibiotic
pentru anti-izomer ). Metoda MECC este capabila sa produca separarea
a tuturor celor 7 impuritati la nivelul de 0.2%. A demonstrat o precizie
comparabila cu cea a metodei HPLC dezbatute mai sus dar este mai
rapida decat metoda HPLC.
Analiza flavonoidelor prin MECC

Flavonoidele sut produse naturale care pot fi gasite in anumite

ierburi medicinale populare cum ar fi Ginkgo biloba. Ele sunt fenoli care
nu sunt incarcati cu sarcini electrice pana cand pH-ul zonei tampon nu
ajunge la o valoare mare. Separarea prin MECC are loc folosind 0.04M
SDS in 0.02M solutie tampon de borat cu un pH de 8.2. La acest pH
flavonoidele studiate sunt mai mult sau mai putin fara sarcina si in
absenta partitionarii diferentiale migreaza in acelasi ritm cu EOF.
Prezenta lui SDS in zona tampon incetineste viteza de migratie a acestor
compusi conform cu peterea de a se fragmenta in micele SDS , care se
deplaseaza spre anod in timp ce EOF se indreapta spre catod. Figura
14.15 arata structurile strans legate de flavonoide in timp ce figura
14.16 arata separarea obtinuta pentru un model de amestec din acesti
compusi.

Metoda da o buna precizie si o separare rapida a amestecului .

Cromatografia acestor tipuri de compusi cere in mod normal utilizarea
gradientului HPLC cu un timp de elutie indelungat.