ENZIMOLOGIE SPECIALA

Tehnici de fractionare
 Focusare izoelectrica
= electrofocusare = IEF
Tehnica de separare a
proteinelor intr-un gradient de
pH creat anterior intre anod si
catod, sub influenta unui camp
electric
1. In gel se creeaza un gradient
stabil de pH, dupa aplicarea
unui camp electric
2. Se adauga solutia proteica
3. Proteinele migreaza in
campul electric si se
distribuie in gradientul de pH
potrivit pH-ului lor izoelectric
Focusare izoelectrica
 Cromatofocusarea

• Combina principiul cromatografiei de schimb

ionic cu focusarea izoelectrica
• Proteinele sunt separate ca urmare a formarii
unui gradient “interior de pH” pe o coloana de
schimbatori de ioni
• Se pot separa chiar si proteinele cu aceeasi
sarcina neta dar cu distributie diferita a sarcinilor
pe suprafata globului proteic
• Are o rezolutie foarte mare, putandu-se separa
proteine al caror pH izoelectric difera cu doar
0,02 unitati
 Cromatofocusarea

1. Se genereaza un
gradient de pH in faza
mobila;
2. Cand pH-ul fazei
mobile este identic cu
pH-ul isoelectric al
proteinei, sarcina
acesteia devine nula
3. Proteina se va
desprinde din
matricea materialului
cromatografic si va fi
eluate din coloana
Tehnici de fractionare
 Cromatografia de afinitate
• Se bazeaza pe legarea specifica a
proteinelor de interes de o
anumita molecula atasata
covalent la un suport inert;
• Moleculele atasate = liganzi; au
specificitate mare pentru un
anumit compus dintr-un amestec
pe care il leaga, restul
componentelor fiind eluate;
• Liganzi enzimatici: inhibitori
competitivi specifici, analogi ai
substratului, coenzime
 Cromatografia de afinitate
Material cromatografic
1. Matrice:
– porozitate mare
– neutra
– numar mare de grupari functionale (aflate la distanta
mare de suport)
– stabilitate chimica si fizica
Ex: agaroza 4% (SEPHAROSE 4B)
poliacrilamida
dextrani inretelati
celuloza
silice poroasa (HPLC)
 Cromatografia de afinitate
2. Liganzi:
- capabili sa formeze combinatii complexe reversibile cu
proteinele;
-asocierea cu proteinele suficient de puternica, dar si
usor disociabile prin schimbarea conditiilor de elutie;
- sa poata fi usor imobilizati pe matrice: sa posede cel
putin o grupare functionala prin care sa se lege covalent
la matrice
- Constanta de afinitate KA reflecta taria interactiei intre
proteina si ligand
- Pt ca o proteina sa fie adsorbita KA ≥ 105 – 106 M
- Pt. KA prea mari (1010 – 1011 M) devine dificila disocierea
 Cromatografia de afinitate
• Clasificare liganzi:
In functie de specificitate
Monospecifici
Cu specificitate de grup
In functie de masa moleculara
Cu masa moleculara mica
Cu masa moleculara mare

o Cu masa moleculara mica monospecifici: hormoni

steroizi, vitamine, inhibitori enzimatici;
o Cu masa moleculara mica cu specificitate de grup:
cofactori enzimatici (NAD+, NADP+, ATP), aminoacizi
o Cu masa moleculara mare monospecifici:
imunoadsorbanti;
o Cu masa moleculara mare cu specificitate de grup:
lectine (pt. glicoproteine), heparina
 Cromatografia de afinitate
3. Spacer
= grupare de distantare necesara in cazul proteinelor ce
nu se pot lega direct la ligand datorita unor interferente
sterice;
- Structura hidrocarbonata liniara ce are la capete 2
grupari functionale:
- 1 grupare (de obicei amino primara) se ataseaza matricei;
- 1 grupare ( de obicei carboxil sau amino) se ataseaza la
ligand.
Ex: hexametilendiamina
acid 6-aminohexanoic
Cromatografia de afinitate
 Cromatografia de afinitate
Desorbtia enzimelor:
- Legarea enzimei de ligand se face specific, prin legaturi
electrostatice, interactii hidrofobe, punti de hidrogen
- Desorbtia se face:
1. Nespecific prin modificarea conditiilor de elutie:
- pH – de obicei prin descrestere
- tarie ionica – cu NaCl 1M (in cazuri speciale 2M sau chiar
3M)
2. Specific cu agenti de elutie competitivi care se pot lega
fie la ligand fie la enzima
Ex. Elutie cu substrat (concentratii foarte mici 5 – 100 mM)
 Elutia de afinitate
• Metoda complementara cromatografiei de afinitate
La cromatografia de afinitate interactiile specifice apar la adsorbtia
enzimelor, iar la elutia de afinitate apar la desorbtia lor
- Materialul cromatografic - schimbatori de ioni
Adsorbtia se realizeaza pe baza sarcinii enzimei
Desorbtia se realizeaza prin elutie cu o solutie a substratului enzimei

Avantaje:
- se evita problemele legate de alegerea ligandului optim si
atasarea lui la matrice astfel incat sa nu blocheze gruparile
functionale implicate in interactia cu enzimele
- pret de cost
 Cromatografia cu liganzi colorati
• Se bazeaza pe interactiile ce apar intre unele proteine si
coloranti biomimetici
Ex. CIBACROM BLUE F36-A analog al cofactorilor ce au in
structura grupari adenil
PROCION RED HE-3B – se leaga la enzime NADP+ dependente
• Colorantul are in structura grupari aromatice, sulfonice,
amino
• Interactia cu proteinele prin legaturi electrostatice, interactii
hidrofobe si punti de hidrogen
• Desorbtia se face fie prin cresterea tariei ionice a agentului
de elutie, fie cu o solutie a substratului, a unui cofactor sau a
unui alt ligand
 Cromatografia covalenta
• Se bazeaza pe interactiile de tip covalent dintre compusii de separat si
faza stationara
• Se aplica in special enzimelor cu continut mare de cisteina (ureaza,
papaina)
• Gruparile –SH sunt cele mai reactive din structura enzimelor
– La pH neutru sau slab alcalin gruparile –SH sunt ionizate si se pot
oxida usor conducand la formarea puntilor disulfurice nereactive
Procesele redox de trecere a gruparilor –SH in punti disulfurice stau la baza
purificarii enzimelor prin interactii covalente
 Materialul cromatografic contine punti disulfurice
 Enzimele intracelulare contin grupari –SH , fara punti disulfurice, in timp
ce enzimele extracelulare contin grupari –SH ocazional, fiind
caracteristice puntile disulfurice
 Pentru desorbtie se adauga un agent tiolic in stare redusa
(Ex. 2-mercaptoetanol, ditieritrol)
PENTRU NOTA 5
Metodele ce se bazeaza pe
polaritatea/sarcina enzimelor sunt:
 cromatografia de schimb ionic
 electroforeza
 focusarea izoelectrica
 cromatofocusarea

Cromatografia de afinitate se bazeaza pe

legarea specifica a enzimelor de un ligand