ENZIMOLOGIE SPECIALA

Imobilizarea enzimelor
• Imobilizarea chimica
 prin legaturi necovalente
– adsorbtia pe matrici insolubile in apa
 prin legaturi covalente
- fixarea moleculelor de enzima pe suport insolubil
- coreticulare – legarea incrucisata a enzimelor prin
intermediul unui agent multifunctional
• Imobilizarea fizica
 prin includerea (entraparea) enzimelor in interiorul retelei
tridimensionale a unui gel sau polimer
 prin microincapsularea (microentrapare) enzimei intr-o
microcapsula delimitata prin membrana semipermeabila
Imobilizarea enzimelor
 Metode chimice de imobilizare
2. Imobilizarea prin legare covalenta
2.1. Fixarea pe suport insolubil
Principiu: intre suport si enzima se stabilesc legaturi covalente

Enzima - grupari implicate in legarea covalenta:

-NH2, -COOH, -SH (Cys), -OH (Ser, Thr), ciclul
imidazolic al His, grupari fenolice (Tyr), ciclul
indolic al Trp

Suport - grupari implicate in legarea covalenta:

-NH2, =N-H, -OH, -COOH, -SH, ciclul imidazolic,
grupari fenolice
 Metode chimice de imobilizare
2. Imobilizarea prin legare covalenta
Compuşi naturali Polimeri sintetici
Suport Grupare funcţională Suport Grupare funcţională

Poliozide Poliacrilamida ―CO―NH2

Dextran ―OH Poliacrilaţi diversă
Agaroză ―OH Polimetacrilaţi diversă
Celuloză ―OH Copolimer etilenă – Anhidridă acidă
Carboxi-metil-celuloză ―COOH anhidridă maleică

Amino-etil-celuloză ―NH2 Polistiren diversă

p-aminobenzil celuloză Poliamide ―CO―NH―

Proteine
Colagen ―COOH
 Metode chimice de imobilizare
2. Imobilizarea prin legare covalenta
2.1. Fixarea pe suport insolubil
Implica 3 etape:
a. activarea suportului
b. cuplarea enzimei
c. indepartarea enzimei nelegate
 Metode chimice de imobilizare
2. Imobilizarea prin legare covalenta
Activarea suportului se face cu derivati silanici si
cianuri halogenate

• In general suporturile folosite pentru cuplarea covalentă a

enzimelor sunt activate sub formă de:
- derivaţi de diazoniu,
- azide,
- halogenuri
- izocianaţi
- imidocarbamaţi
 Metode chimice de imobilizare
2. Imobilizarea prin legare covalenta
Grupa funcţională Metoda de activare
enzimă suport
―NH2 Glutaraldehida
―NH2 ―OH Bromcian
―COOH Carbodiimidă
Sare de diazoniu
(cu NaNO2)

―SH ―SH Punţi disulfurice

(cu dipiridil 2, 2’ disulfura)
 Metode chimice de imobilizare
2. Imobilizarea prin legare covalenta
2.1. Fixarea pe suport insolubil
Avantaje – stabilitate ridicata a preparatului
- fixare de durata
- pot fi folosite multe tipuri de suport
- permite aplicatii diverse
Dezavantaje - mai dificil de realizat
- necesita activarea prealabila a gruparilor
functionale ale suportului sau utilizarea unui
agent de condensare
- denatureaza partial enzima deoarece implica
modificari structurale ale acesteia
Suport – anorganic: sticla
- organic - sintetic (poliacrilamida, nylon, alti polimeri)
- natural (celuloza, dextran, colagen)
 Metode chimice de imobilizare
3. Imobilizarea prin coreticulare
Principiu: Se stabilesc legaturi covalente intre moleculele de
enzima si moleculele unei alte proteine (de obicei BSA)
conducand la formarea unei retele
 Metode chimice de imobilizare
3. Imobilizarea prin coreticulare
• Pentru coreticulare se foloseste un reactiv bifunctional
(Ex. glutaraldehida)
• Prin aceasta metoda se obtin structuri cu masa
moleculara mare, insolubile, fiind posibila obtinerea de
produse membranare
• Asocierea cu o proteina inerta limiteaza fenomenele de
denaturare, crescand eficienta metodei

• Mod de lucru
Ex. enzima cu BSA si glutaraldehida (reactiv
bifunctional) se congeleaza rapid, iar apoi cresterea
temperaturii pana la 4◦C se face lent
 Metode chimice de imobilizare
3. Imobilizarea prin coreticulare
Principalii reactivi polifuncţionali
Nume Structură
Glutaraldehidă
Acid bis-diazobenzidin-2,2’-disulfonic

Acid difenil-4,4’-diizotiocianat-2,2’-
disulfonic

3-metoxi-4,4’-difenil diizocianat-
metan

1,5-difluoro-2,4-dinitro-benzen
 Metode chimice de imobilizare
3. Imobilizarea prin coreticulare
• Avantaje:
– Legatura solida enzima-enzima;
– Rezistenta la variatiile conditiilor de mediu (pH, tarie
ionica);
– Intervalul de temperatura optima este mai mare decat in
cazul enzimei libere
– Posibilitati diverse de utilizare

• Dezavantaje:
- Legatura covalenta poate conduce uneori la modificarea
structurii enzimei cu efect asupra activitatii acesteia;
- Nu se poate controla perfect reactia de cuplare;
- Cantitatea de enzima ce poate fi imobilizata este mica, ca
urmare AES obtinuta dupa imobilizare este redusa
- Utilizare de reactivi suplimentari (agenti de coreticulare)
 Metode fizice de imobilizare
1. Entraparea in reteaua tridimensionala a suportului
Principiu: enzimele sunt prinse in ochiurile unei retele, fara a
stabili cu aceasta legaturi chimice
 Metode fizice de imobilizare
1. Entraparea in reteaua tridimensionala a suportului

• Entraparea (includerea) este o metoda de

imobilizare prin polimerizare
- preparatul este dispersat in solutie de
monomeri, obtinandu-se un amestec omogen
(solutie sau emulsie)
- polimerizarea monomerilor conduce la
formarea unei retele in interiorul careia este prinsa
enzima
- se obtine un polimer insolubil in apa care
are inglobata enzima
 Metode fizice de imobilizare
1. Entraparea in reteaua tridimensionala a suportului
• Suporturi folosite pentru entrapare:
– Poliacrilamida
– Alginat de calciu
– Poliacetat de celuloza
– Agar
– Gelatina
– Caragenan

• Produsele obtinute pot fi sub forma:

- granule mici
- tuburi
- fibre
- filtre poroase
- membrane semipermeabile
 Metode fizice de imobilizare
1. Entraparea in reteaua tridimensionala a suportului

a. Entraparea in gel de poliacrilamida

- monomer: acrilamida
- agent de polimerizare: N,N’-metilenbisacrilamida

- Avantaj:
- porozitatea si proprietatile mecanice ale gelului pot fi controlate
prin concentratia N,N’-metilenbisacrilamidei
- Dezavantaj:
- toxicitatea monomerilor
- la polimerizare trebuie evitata inglobarea oxigenului
 Metode fizice de imobilizare
1. Entraparea in reteaua tridimensionala a suportului
b. Entraparea in gel de alginat de calciu
- avantaj:
- conditii de lucru blande (solutie de enzima + poliglucid + o picatura CaCl2 )
- dezavantaj:
- se obtin geluri laxe, fara rezistenta mecanica

c. Entraparea in gel polialcoolvinilic (PVA)

- prin metoda congelare-decongelare: rezulta criogel
- dezavantaj: doar pentru imobilizarea enzimelor cu molecule mari sau a
agregatelor enzimatice

d. Entraparea in fibre de poliacetat de celuloza

- amestecul triacetat de celuloza + CH2Cl2 + enzima se agita si emulsia se
extrudeaza sub presiune in baie de toluen, rezultand fibre ce sunt uscate sub vid
 Metode fizice de imobilizare
2. Microincapsularea
Principiu: se realizeaza prin captarea solutiei de enzima intr-un
compartiment limitat de o membrana selectiva care nu lasa sa treaca
decat moleculele mici, obtinuta prin copolimerizarea unui monomer
hidrofil cu unul hidrofob
 Metode fizice de imobilizare
2. Microincapsularea
• Consta in formarea unei membrane in jurul unei picaturi
de emulsie ce contine enzima, rezultand o microcapsula
• Microcapsula se obtine prin copolimerizarea unui
monomer hidrofob cu un monomer hidrofil
• Monomerul hidrofil este dizolvat impreuna cu enzima
intr-o faza apoasa aflata in emulsie intr-o faza organica
• Adaugarea monomerului hidrofob in faza organica
determina copolimerizarea la interfata, prinzand enzima
in interiorul microcapsulei
Metode fizice de imobilizare
2. Microincapsularea
 Metode fizice de imobilizare
2. Microincapsularea
• Ex: O solutie apoasa ce contine enzima si monomerul
hidrofil (1,6-diaminohexan) se emulsioneaza cu o solutie
organica (cloroform si ciclohexan). Cand se adauga
monomerul hidrofob (clorura de sebacoil) are loc
copolimerizarea la interfata, rezultand o membrana
polimerica de nylon

NH2 – (CH2)6 – NH2 + Cl – CO – (CH2)8 – CO – Cl

1,6 – diaminohexan clorură de sebacoil

- NH – (CH2)6 – NH – CO – (CH2)8 – CO – NH – (CH2)6 – NH – CO

– (CH2)8 – CO –....
 Metode fizice de imobilizare
2. Microincapsularea
• Avantaje:
– Mecanismele de obtinere sunt binecunoscute;
– Riscurile de denaturare sunt minime;
– Separare facila, prin centrifugare
– Nu au specificitate, aplicatiile fiind diverse
• Dezavantaje:
– La polimerizare poate fi afectata enzima datorita radicalilor
liberi sau a valorilor de pH
– Localizarea enzimei in microcapsula: limiteaza capacitatea de
actiune a biocatalizatorului
(porii membranei trebuie sa fie suficient de mici ca sa
mentina enzima in interior, dar si suficient de mari pentru a
permite accesul substratului)
– Proprietati mecanice slabe pentru utilizarea la nivel industrial
PENTRU NOTA 5
Imobilizarea chimica prin legare covalenta
1. PE SUPORT INSOLUBIL
Avantaj major: stabilitate ridicata a preparatului imobilizat
Dezavantaj major: denaturare partiala a enzimei
necesita etapa de activare prealabila a suportului
2. CORETICULARE
Avantaj major: stabilitate ridicata a preparatului imobilizat
Dezavantaj major: denaturare partiala enzimei

Imobilizare fizica prin ENTRAPARE si MICROINCAPSULARE

Avantaj major: denaturare minima a enzimei
Dezavantaj major: limitarea accesului substratului la enzima
• http://www.easybiologyclass.com/enzyme-
cell-immobilization-techniques/
• http://documents.tips/documents/enzime-
imobilizate.html#