Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
- prin legaturi de H
- forte electrostatice
- Adsorbtie fizica - legaturi hidrofobe
- van der Waals
- in hidrogeluri Atasare ne-covalenta
- Entrapare fizica - dispersate in matrice
(incorporare) - realizare sistem de tip bariera
Avantaje:
- metoda simpla si usor de aplicat
- este o metoda “delicata” care nu afecteaza structura fragila a biomoleculelor
Dezavantaje:
- Imposibilitatea de a controla conformatia si orientarea peptidelor dupa adsorbtie substrat,
desorbtie peptide, cinetica de difuzie
- Eficiente pe termen scurt
Etraparea fizica:
- reprezinta incapsularea / incorporarea biomoleculelor (ex. medicamente) in biomaterial
- strategie pentru eliberare controlata medicamente din hidrogel
- medicamentul nu este legat covalent, este retinut de un sistem de tip bariera pentru a
controla cinetica de eliberare a biomoleculelor
Atasare covalenta: Conditii:
- Imobilizarea covalenta de biomolecule functionale pe biomateriale se poate realiza numai
pe suprafete care contin grupari de tip –OH, -COOH, -NH2, -SH, –CH=CH2
- Aceste grupari reactive pot exista de novo pe suprafata biomaterialelor sau daca suprafata
polimerica nu le contine, este necesara modificarea suprafetelor prin:
Radiatii ionizante
Descarcari in plasma
Copolimerizare grefata
O astfel de metoda presupune obtinerea de material biomimetice care induc un raspuns tisular
specific.
Dupa atasare moleculele biologice vor interactiona cu domenii specifice de pe suprafata celulelor.
Atasarea biomoleculelor se face dupa sinteza materialelor polimerice sau in timpul sintezei
materialelor polimerice.
Dupa extragere si purificare, enzimele pot fi fixate prin:
- Adsorbtie simpla
- Entrapare in matrice/microcapsule pt sisteme de tip bariera
- Prin legaturi chimice cu material de tip:
Polimeri naturali (celuloza)
Material sintetice (PEG (hidrofil), polistiren (hidrofob)
Substraturi minerale: argila, sticla
- biosenzori
Domenii de utilizare - eliberare controlata
- analiza proteina
3. Descrieti comparativ plasma, serul sanguin si principalele proteine plasmatice implicate.
- sangele – 6-8% greutatea corpului
- 2 faze:
plasma (faza lichida)- 55-60%
elementele figurate (faza solida)- 40-45% din volumul total sange
Elemente figurate:
a) Eritrocite - hematii/celule rosii -contin hemoglobina – proteina cu rol in transportul gazelor
respiratorii (O2 , CO2 ) - membrana eritrocitelor – contine doua tipuri de proteine – ce definesc
cele 4 grupe sanguine
b) Leucocite - celule albe - sunt considerate celulele sistemului imun -secreta anticorpi, au functii
in inflamatii, fagocitoza, reactii alergice si reactii antigen-anticorp - pot fi granulocite sau
agranulocite (limfocite si monocite)
c) Trombocite - plachete sangvine - nu au nucleu -rol important in hemostaza primara si in
mentinerea integritatii vaselor: adera la nivelul leziunii vasculare si elibereaza factori care
provoaca transformarea fibrinogenului in fibrin
Plasma contine: 90-92% apa, 8-10% faza organica (6-8% - proteine plasmatice, sub 1% - saruri,
lipide, zaharuri)
Serul sanguin este partea lichida a sangelui care nu contine fibrinogen (factori ai coagularii) si nici
celule sanguine (globule rosii, albe), spre deosebire de plasma (coagulanta) care contine
fibrinogen.
Serul contine doar albumina si imunoglobulina, iar plasma sangvina e formata din: 90-92% apa,
8-10% faza organica si saruri/lipide/zaharuri.
Proteine plasmatice
Albumina serica (Alb)
- Aprox. 60% din totalul proteinelor plasmatice
- Are cea mai mica dimensiune si este produsa de ficat
- Rol principal - asigura in proportie de 80% presiunea osmotica a sangelui
- Adsoarbe la suprafata implantului
Imunoglobuline (Ig)
- Aprox. 36% din totalul de proteine plasmatice
- Produse de limfocitele B (din maduva osoasa)
- Cunoscute sub denumirea de anticorpi
- Sunt produse de sistemul imun la diferiti antigeni
- Rol in protectia naturala a organismului
- 5 tipuri: IgA, IgD, IgE, IgG (cea mai raspandita din serul sangvin (75-80% din totalul Ig);
cea mai importanta in lupta contra infectiilor bacteriale si virale; singura care traverseaza
placenta), IgM
Fibrinogenul (Fibr)
- Sintetizat de hepatocite
- 2 functii importante:
Intervine in procesul de coagulare (factorul plasmatic I al coagularii)
Adsorbtia fibrinogenului la suprafata unui material perturba procesul de coagulare a
sangelui (Fibr distrus in fragmente mici de fibrina sub actiunea trombinei, apoi
trombocitele se ataseaza la fragmentele de fibrina → cheagul solid insolubil in sange)
Plasma = Ser + Factori de coagulare (Fibr)
- contine 3 tipuri de proteine: ALBUMINA, GLOBULINE si FIBRINOGEN
- Sangele se recolteaza in tuburi cu anticoagulant
- Sangele e centrifugat, anticoagulantul inhiband formarea de cheaguri
Ser = Plasma – Factori de coagulare (Fibr) = Alb + Ig
- contine 2 tipuri de proteine: ALBUMINA si GLOBULINE
- Sangele este recoltat in tuburi fara anticoagulant
- Se asteapta la temperature camerei aprox. 30 de min procesul natural de coagulare
- Se centrifugheaza
- Dupa ce se separa fibrinogenul, deasupra ramane serul
4. Descrieti mecanismul general al coagularii sangelui declansat la contactul biomaterial - fluid
sanguin.
Coagularea = este un proces complex in urma caruia, un coloid de consistenta lichida [sol] (sange,
lapte, latex) se transforma intr-un cheag (gel), cu o separare de o parte lichida (ser, zer, apa).
- Proces REVERSIBIL
Coagularea ireversibila a sangelui, a laptelui se realizeaza in prezenta de Ca sau in prezenta de
tripsina gastrica (enzima).
!sangele nu contine tripsina
Coagulare (hemoliza) – consta in separarea sangelui in 2 componente: coagul/cheag (retea de fibrin
in care sunt prinse elementele figurate) , ser
D.p.d.v. chimic are loc transformarea Fibr (solubil) în fibrină (insolubilă) sub acţiunea enzimei
TROMBINA
Mecanismul coagularii actioneaza in cascada, numai atunci cand se indeplinesc anumite conditii
si implica factori ai coagularii:
- 13 factori plasmatici (F I F XIII)
- 7 factori trombocitari sau plachetari (f1 f7)
Acesti factori isi desfasoara activitatea de coagulare doar cand sunt activati. In mod normal, se
gasesc in forma inactiva.
Coagularea sangelui = mecanism complex ce se desfasoara pe 2 cai:
- Cale intrinseca – mai lunga (7-12 min), determinata numai de factori plasmatici, este
declanşată de contactul cu fibrele de colagen şi de alţi factori nelezionali
- Cale extrinseca – mai scurta, mai rapida (5-12 secunde), declansata de leziuni
Cele două căi ale coagulării pot fi despărţite doar la modul teoretic, ele desfăşurându-se simultan
şi întrepătruns.
HEMOSTAZA = coagulare sange (oprire sangerare)
FIBRINOLIZA = fenomen invers coagularii (distrugere retea de fibrina formata)
- are ca efect eliminare fragmente de cheag si depozite de fibrina. Se realizeaza prin mecanism
enzimatic, fiind catalizata de plasmina (sau fibrinolizina). Acestea scindeaza fibrina in fragmente
polipeptidice mici, solubile, care nu mai pot forma retele covalente
Echilibrul intre fenomenele de coagulare (hemostaza) si cele care impiedica coagularea
(fibrinoliza) asigura functia circulatorie a sangelui.
ANTICOAGULANTE ENDOGENE - Sangele contine si factori inhibitori ai coagularii care reduc
viteza procesului de coagulare: ex. Heparina
ANTICOAGULANTE EXOGENE CU APLICATII TERAPEUTICE - Coagularea sangelui la
nivelul implantului poate fi controlata prin administrarea de anticoagulanti:
- heparina (inhiba atat activitatea factorului X cat si actiunea enzimatica a trombinei deja formate)
- EDTA, citraţi sau oxalaţi de sodiu sau potasiu, fluorura de sodiu (inhibă calciul - factorul IV),
- cumarine - compusi naturali (se gasesc in portocale, pastarnac, musetel)
5. Interactiunea biomaterialelor cu fluidul sanguin: principia generale si trombogenitate.
Suprafetele care vin in contact direct cu sangele au o misiune mult mai complexa decat alte
material (grefe vasculare, sisteme de dializa).
Coagularea sangelui reprezinta un mecanism vital de aparare impotriva sangerarii, dar trebuie
evitata atunci cand se folosesc biomateriale.
La caracteristicile cunoscute (biocompatibil, fezabil, biostabil, sterilizabil), unui material care intra
in contact cu sangele se adauga cerintele:
- Sa nu genereze trombi si emboli prin coagulare (tromboza)
- Sa nu altereze proteinele plasmatice (inflatie)
- Sa nu determine distrugerea celulelor sanguine (hemoliza)
Trombogenicitate = proprietatea unui material de a induce formarea de tromb; component
esentiala a biocompatibilitatii
Un material cu trombogenitate scazuta este caracterizat prin:
- Adeziune scazuta a proteinelor plasmatice
- Adeziune scazuta a plachetelor
Ex. de materiale polimerice folosite ca si grefe vasculare:
- Poliesteri (vase de sange cu diametru mediu spre mare)
- Teflon (vase de sange cu diametru mediu spre mare)
- Poliuretan (vase de sange cu diamentru mic)
- Cauciun sintetic (vase de sange cu diamentru mic)
6. Raspunsul trombotic la contactul biomaterial/sange: faza proteica, faza celulara, raspuns
organizational.
Depinde de 4 componente:
- De biomaterial – prin natura acestuia (compozitia chimica) si respective prin morfologie
- De natura aplicatiei: cateter, sistem pentru eliberare controlata medicamente
- De prezenta sau absenta unor agenti antitrombogenici (heparina)
- De starea pacientului
La contactul material-sange se declanseaza o serie de mecanisme care duc la formarea de
cheaguri. Astfel, are loc un raspuns trombotic constituent din 3 faze: faza proteica, faza
celulara, raspuns organizational.
1. Faza proteica
- sunt implicate proteine plasmatice
- are loc o adsorbtie competitive de protein plasmatice la biomaterial = efectul Vroman
- 3 tipuri de proteine plasmatice:
a) albumina (BSA)
b) IgG
c) Fibrinogen
Difera prin concentratia plasmatica, cat si prin masa moleculara => scade concentratia plasmatica
si creste masa moleculara
- Initial, suprafata biomaterialului este acoperita de albumina si imunoglobulinele de tip G
datorita concentratiei plasmatice mari. Ulterior sunt inlocuite cu proteine cu afinitate mai
mare pt material: fibrinogenul
- Albumina inhiba procesele de coagulare si aderarea plachetelor
- Fibrinogenul activeaza aderarea plachetelor
2. Faza celulara
- Initial are loc aderarea si aglutinarea plachetelor (primele minute)
- Leucocitele (in special neutrofilele) se infiltreaza la locul de aderare a plachetelor
- Se declanseaza procese de coagulare (transformarea (polimerizarea) fibrinogenului in fibrina,
sub actiunea trombinei)
- In urmatoarele ore, alte tipuri de leucocite, PMN si monocite se infiltreaza si cresc masa
trombusului
3. Raspunsul organizational = reorganizarea trombusului (retractie cheag, proliferare fibro-
celulara)
- alte tipuri de celule vor interveni (din structura vasului de sange)
- cele endoteliale si fibromusculare vor inlocui proteinele plasmatice adsorbite, isi sintetizeaza
propria matrice in care sa se dezvolte si raman atasate
- dureaza 48h dupa interventie
- in functie de tipul de implant, aceasta organizare poate dura intre cateva saptamani si luni
(grefe vasculare sintetice de diametru mare)
7. Obtinerea de material cu trombogenitate redusa prin cresterea hidrofilicitatii suprafetelor.
STRATEGII DE IMBUNATATIRE A BIOCOMPATIBILITATII MATERIALE
POLIMERICE / SANGE = realizare de materiale netrombogene / cu trombogenicitate redusa
a) Obtinerea de suprafete pasive (inerte)
b) Obtinerea de suprafete active
“PASIVAREA SUPRAFETEI” - modificarea suprafetei unor materiale polimerice sintetice
(ex. poliuretani, polietilena) pentru a impiedica adsorbtia proteinelor la contactul dintre
materialul polimeric si mediul biologic (implicit este impiedicat fenomenul de coagulare si
activarea plachetelor)
1. Hidrofilizare
2. Pasivare prin acoperire cu albumina (Alb)
3. Imobilizare de fosforil-colina
4. Endotelializare
HIDROFILIZARE – pentru a “inactiva” suprafata biomaterialului
- Adeziunea proteinelor si respectiv proliferarea celulara sunt influentate de raportul hidrofil /
hidrofob.
- O metoda uzuala de imbunatatire a hemocompatibilitatii biomaterialelor o reprezinta cresterea
hidrofilicitatii suprafetelor polimerice – HIDROGELURI:
Nu adsorb proteinele plasmatice si nu promoveaza adeziunea celulara cu formarea de
trombus, datorita afinitatii crescute fata de apa si respectiv a energiei interfaciale scazute
(spre deosebite de suprafetele hidrofobe)
Ulterior, deoarece polimerii hidrofili prezinta proprietati mecanice slabe se prefera
acoperirea altor polimeri cu proprietati mecanice mai bune cu polimeri hidrofili, apoi se
realizeaza o reticulare a hidrogelurilor pentru a controla gonflarea
Hidrofilizare cu PEG/PEO
- Incorporarea PEG/PEO intr-un biomaterial polimeric reduce adeziunea proteinelor plasmatice si
a plachetelor, in comparatie cu un substrat hidrofob nemodificat prin 2 mecanisme:
efect de impiedicare sterica (repulsie) a proteinelor si celulelor sangvine (Aderarea
proteinelor la biomaterial si Inhibarea aderarii proteinelor (efect de impiedicare sterica
datorita lanturilor de PEG)
fenomen de hidratare = lanturile hidrofile retin moleculele de apa la suprafata; Acest
continut crescut de apa este defavorabil pentru aderarea proteinelor plasmatice sau
celulelor (trombocite / leucocite) → PROTEIN-REPELLENT SURFACES (neaderente
pentru proteine)
Exemple de polimeri a caror suprafata poate fi modificata cu PEG/PEO: Polistiren (PS);
Poliuretan (PU); Polisulfona; Polimetilmetacrilat (PMMA) etc.
Dezavantaje:
- dificil de realizat in strat uniform - deoarece primele molecule imobilizate vor respinge atasarea
altor molecule de PEG prin impiedicare sterica (se pot folosi solventi speciali)
- prezenta celui mai mic defect in stratul polimeric poate declansa coagularea sau inflamatia
- deoarece absoarbe apa, acest tip de substrat nu este stabil, are tendinta sa se gonfleze si sa se
dezlipeasca de pe suprafata implantului
8. Obtinerea de materiale cu trombogenitate redusa prin acoperire cu albumina
Pasivare prin acoperire cu albumina (Alb):
- nu promoveaza adsorbtia de alte proteine plasmatice - scade trombogenicitate material
- nu are secvente peptidice pentru interactia cu celulele (plachete sau leucocite) sau receptori pentru
enzimele care declanseaza cascada coagularii
Dezavantaje:
- daca Alb este legata fizic la biomaterial, la contactul cu sangele, alte proteine plasmatice vor
adsorbi si vor inlocui Alb la suprafata biomaterialului (efect Vroman)
- imobilizare covalenta Alb pe suprafata biomaterial → denaturare Alb
9. Strategii de obtinere a unor suprafete active capabile sa controleze mecanismul coagularii.
Heparinizarea suprafetelor pentru imbunatatirea hemocompatibilitatii materialelor polimerice.
a) Obtinerea de suprafete pasive (inerte)
b) Obtinerea de suprafete active => incorporare biomolecule active specific pe o suprafata
polimerica pentru a produce o reactive favorabila si
pen pt a controla trombogenicitatea
Strategii:
- incorporare agenti antitrombotici = HEPARINA – previne activarea trombinei
- incorporare enziime fibrinolitice – ditrug cheagurile de fibrin
- incorporare agenti de antiagregare plachetara – ex. Prostacicline
Heparinizarea suprafetelor – este o metoda pt a imbunatati hemocompatibilitatea si este cea
mai populara metoda pt scaderea trombogenicitatii materialelor; se genereaza un strat de
heparina pe suprafata biomaterialelor
Efectele heparinei:
- inhiba coagularea sangelui
- inhiba adeziunea plachetelor
Metode de heparinizare:
1. compoundarea heparinei cu polimeri (amestec fizic) folosit in grefele vasculare
2. legarea ionica a heparinei care contine grupari anionice (-) la materiale care contin functii
cationice (+)
3. legarea covalenta a heparinei la suprafete polimerice
Dezavantaje:
- metodele 1 si 2 – instabilitate – Hep elueaza in timp si lasa suprafata neprotejata
- metoda 3 – imobilizare covalenta Hep – se poate pierde eficienta catalitica a Hep imobilizata
covalent
Avantaje:
- metoda 3 - prelungeste activitatea Hep
!! Doar in conformatia nativa Hep este capabila sa-si exercite functia (interactiune cu
antitrombina III)
10. Tehnici de antiseptie (dezinfectie si sterilizare). Cuantificare sterilizare.
ANTISEPSIE = ansamblu de tehnici / procedee fizico – chimice prin care se distrug sau sunt
inhibate microorganismele patogene (bacterii, virusuri, fungi) de pe suprafeţe care vin în contact
direct sau indirect cu organismul
ASEPTIC = nu prezintă microorganisme sau germeni infecţioşi;
Ex. implant, substanţă farmaceutică, suturi, mediu gazos, sala de operatie etc.
Se realizează prin TEHNICI DE ANTISEPSIE:
1. DEZINFECTIE
2. STERILIZARE
❖ agent mutagen - ataca grupele amino din ADN → aberatii cromozomiale etc.
❖ inflamabil (temp. fierbere 11ºC) si exploziv, de aceea se amesteca cu alte gaze (N2 , CO2 ,
ozon, peroxid de hidrogen vaporizat)
❖ timp mare de sterilizare (biomaterialele trebuie AERATE dupa sterilizare (“spalare” cu aer
steril), pentru a elimina gazele reziduale absorbite la suprafata)
UTILIZARE:
- majoritatea implanturilor, grefe (cardiace, vasculare, ortopedice), lentile de contact, fire si mănuşi
chirurgicale, instrumente telescopice, echipamente medicale sensibile la căldură
13. Sterilizarea cu radiatii
- radiaţii de energii diferite, ionizante sau neionizante (ex.: radiaţii gamma, radiatii X, UV,
microunde, laser, IR).
- Sunt necesare dozimetre pentru controlul dozei optime care va asigura sterilizarea eficientă, fără
a distruge suprafaţa implantului.
Sterilizarea cu radiatii neionizante - UV - radiatii neionizante, cu putere de penetrare mica - Se
folosesc radiatii UV-B sau UV-C, produse de lampi cu vapori de Hg
Conditii: 15-30°C, umiditate max. 60%;
Aplicatii: sterilizare suprafeţe netede şi încăperi (nise de laborator, săli de operaţie, blocuri sterile),
conservarea apei distillate
Sterilizarea cu radiatii ionizante – radiatii gamma - radiatii gamma produse in urma dezintegrarii
unei surse radioactive; Gradul SAL scade logaritmic cu cresterea dozei de radiatii
MECANISM: determina alterarea ireversibila a principalelor componente celulare si
microorganismele mor. La dezintegrare, apar si electroni (energie de cca 315 keV), care participa
la procesul de sterilizare, intrerupand viata celulara.
!!! Doza standard de sterilizare cu radiatii ionizante γ = 25 kGy
APLICATII:
✓ se aplica in general pentru formulari farmaceutice, seringi, ace etc. (slide 96)
AVANTAJE:
procedeu eficace, rapid de sterilizare, netoxic, fara reziduuri, bine controlat prin dozimetrie
putere mare de penetrare - permite sterilizarea produselor în ambalajul final ! Se reduce
considerabil posibilitatea contaminării post-sterilizare a produsului medical
DEZAVANTAJE:
pret de cost foarte mare
modificari structurale ale materialelor polimerilor: daca polimerul este resorbabil,
proprietatile de degradare vor fi modificate, acest fapt avand consecinte importante asupra
comportarii in vivo schimbari ale proprietatile mecanice (ex. poliacetali si poliamide;
policarbonati si polipropilena)
radiatiile raman in material si se pot elimina in organism
14. Controlul/validarea procesului de sterilizare
Validarea procesului de sterilizare = demonstrarea absenţei dezvoltării bacteriilor şi monitorizare
parametri proces de sterilizare
• metode fizice – control temperatura (termometru), presiune (manometru), timp de expunere
• metode chimice: se folosesc substanţe cu punct de topire apropiat de temperatura la care se face
sterilizarea (ex. acid benzoic 120°C)
• metode biologice = bioindicatori: preparate standard de spori bacterieni specifice diferitelor tipuri
de sterilizări.
- furnizează dovezi directe că s-au atins condiţiile letale necesare sterilizării în timpul
tratamentului; Ex. fiole Stearotest – suspensie de spori de Bacillus stearothermophilus; atingerea
temperaturii de 121°C duce la distrugerea sporilor, indicatorul din fiole virează – isi schimba
culoarea.
15. Testarea biocompatibilitatii prin teste de laborator in vitro.
In vitro = experiment in mediu controlat, in eprubeta/vas Petri; conditiile de testare nu coincide cu
cele din interiorul organismului
Caracteristici – testare biocompatibilitate:
Creste relevanta experimentelor: de laborator (in vitro), preclinice (in vivo), teste clinice
(in vivo)
Cu cat riscul este mai mare cu atat testele biologice pe care ar trebui sa le treaca materialul
ar trebui sa fie mai numeroase
Teste de biocompatibilitate - ordine foarte precisa, in conditii de pH, temperatura etc.,
similare organism uman
Anumite teste se pot realiza atat in vitro cat si in vivo, ele sunt complementare
Testele se fac cu materiale de referinta (de control)
Testele in vitro
- permit obtinerea de informatii rapid si ieftine
- conduce la reducerea numarului de animale sacrificate in acest scop
- constau in interactia in vitro a biomaterialului cu celulele (considerate a fi cele mai simple
organisme)
CULTURI CELULARE:
1. dupa aderenta celulelor la substrat - forma pe care o iau celulele dupa proliferare reflecta de
fapt tesutul din care provin.
a) Celule aderente:
- celulele sunt plasate in placi ce favorizeaza atasarea (ex. placi colagenate)
- cresc in monostrat confluent: odata ce devin confluente, celulele nu se mai dezvolta (inhibitie de
contact)
- doua tipuri de morfologii: celule epiteliale (poligonale) si celule fibroblastice (alungite)
b) Celule neaderente (in suspensie):
- sunt sferice si plutesc in mediul de cultura (sub forma de celule individuale sau sub forma de
mici “insule”)
Exemple:
culturi derivate din sange (ex. limfocite)
linii celulare (accesibile comercial) – adaptate sa creasca in suspensie, pentru a se obtine
concentratii mai mari de celule
culturi de celule de insecte
2. dupa tipul celulelor cultivate
a) Culturi de celule primare
- sunt obtinute prin disocierea enzimatica a unui tesut (proteaze si colagenaze)
- pot fi preluate de la: embrioni, animale nou-nascute, animale adulte
- cele mai utilizate culturi celulare: primate, om, rozatoare (soareci, sobolani, hamsteri), pasari
Avantaje culturi primare:
- proprietati mult mai apropiate de celulele organismului (stare fiziologica normala) → rezultate
mai elocvente
- exemple de culturi de celule primare: celule umane din maduva osoasa; celule umane fibroblaste
gingivale; osteoblaste din craniu sobolan; celule epiteliale /fibroblaste sobolan
b) Linii celulare continue (clonate)
Celule transformate - se diferentiaza de celule normale; se divid si cresc continuu
Avantaje linii celulare:
- permit standardizarea lucrarilor efectuate in mai multe laboratoare (verificare reproductibilitate)
- relativ usor de mentinut; schimbarea mediului de cultura se realizeaza usor
- fiind clone, celulele sint identice genetic isi mentin caracteristicile genetice si morfologice pe
parcursul unei vieti foarte lungi (pana la infinit).
16. Testarea biocompatibilitatii prin teste preclinice in vivo
- se folosesc animale vii
- pentru verificare cerinte de biocompatibilitate - sunt obligatorii inainte de testele clinice
Avantaje:
- reprezinta o aproximatie mai buna decat testele de laborator
- folosesc cele mai adecvate animale ca model
Dezavantaje:
- necesita protocoale si timp
- sunt scumpe
- rezultate uneori dificil de interpretat; ridica anumite probleme de etica
Modele animale pentru evaluarea in vivo a dispozitivelor medicale
Chirurgie cardio-vasculara
- valve cardiace: oaie
- grefe vasculare: caine, porc
- stenturi: porc, caine
- inima artificiala: vitel
Ortopedie/chirurgie osoasa
- substitut osos: iepure, caine, porc, sobolani
- proteza totala de sold/genunchi: caine, capra, primate
- implant craniofacial: iepure, porc, caine, primate
- cartilaj: iepure, caine
- ligament si tendoane: caine, oaie
Neurologie
- regenerare nervi periferici: sobolani, pisica, primate
- stimulare electrica: sobolani pisica, primate
Oftalmologie
- lentile de contact: iepure
- lentil intraoculare: iepure, maimute
Testele preclinice – presupun introducerea unui esantion din biomaterial sau extract din acesta in
organismul animal, pe diferite cai:
a) ORALA (ingestie sau inhalare)
b) INJECTII
c) IMPLANTARE propriu-zisa: in tesut moale, intramuscular, subcutanat, intraperitoneal,
intramedular (femur, tibie), transcortical (femur, craniu)
17. Testarea biocompatibilitatii prin teste clinice in vivo
- sunt cele mai relevante in testarea biocompatibilitatii unui material
- demonstreaza adevarata performanta a unui biomaterial
- nu pot fi standardizate
- implica probleme controversate de etica
- sunt foarte scumpe
- trebuie facute numai dupa teste preclinice pe animale
- se aplica pe VOLUNTARI
- implantarea unui biomaterial in organism se face intr-o regiune cat mai apropiata de aplicatia
pentru care este proiectat
In cele mai multe teste clinice se utilizeaza EFECTUL PLACEBO – un grup de pacienti este supus
medicatiei/implantului de testat + un grup de pacienti (de control / referinta) este tratat cu placebo
EFECTUL PLACEBO = raspuns observabil si masurabil al organismului la o terapie placebo (o
medicatie inerta – ex. pilula de amidon sau zahar, sau un act chirurgical inofensiv)
- este benefic si NU se datoreaza tratamentului aplicat = putere de autoinsanatosire
EFECT NOCEBO (anti placebo) - Credinta pacientului ca un anumit medicament/biomaterial ii
face rau declanseaza uneori efecte terapeutice negative
18. Evaluarea initiala a biocompatibilitatii prin teste de citotoxicitate
1. TESTE DE CITOTOXICITATE
Definitie: Capacitatea potential a unui dispozitiv medical de a induce efecte subletale sau letale la
nivel celular.
Caracteristici generale:
- metode simple, ieftine, standardizate de detectare a efectelor adverse generate de un biomaterial
asupra celulelor
- se refera la efectele toxice provocate de prezenta unui material la nivel celular.
Principiul metodei:
- substantele toxice sunt eliberate de material in mediul de cultura al celulelor → difuzeaza prin
membrana celulelor → celulele isi schimba marimea, forma, gradul de proliferare, lizeaza, se
dezintegreaza
Toxicitatea materialului prezent in mediul de cultura se verifica prin raportul intre nr. de celule
moarte si nr. total de celule, la anumite intervale de timp (24, 48 si 72 h).
Citotoxicitatea unui material poate fi efectuata prin 3 tipuri de teste functie de modul in care
materialul este expus celulelor:
a) contact direct cu suprafata biomaterialului
- Piese din materialul de testat sunt plasate direct pe suprafata stratului de celule, care este acoperit
cu o pelicula din mediul de cultura.
- Substantele toxice eliberate din materialul testat pot scadea viteza cresterii celulelor sau pot
provoca diferite leziuni
b) contact indirect, difuzie in mediu de agar
se obtine mai intai un monostrat confluent de cellule
se acopera cu un strat de agar;
se asteapta sa se solidifice;
peste se plaseaza o piesa din materialul de testat.
Substantele toxice solubilizate (cu M<100Da) din material vor difuza prin stratul subtire de agar
si vor omori sau leza celulele din monostrat
AGAR = polimer coloidal special derivat dintr-o alga rosie; exista tipuri diferite de agar, diferite
prin masa moleculara sau gradul de polimerizare
c) metoda elutiei - expunerea celulelor pe extracte din biomaterialul de analizat
- Se prepara mai intai un extract (eluat) din biomaterialul (de testat de regula in sol. NaCl)
- Extractul este plasat in diferite concentratii pe un monostrat de celule;
- Se evalueaza toxicitatea la diferiti timpi de incubare la 37°C (48 h)
- Celule vii sau moarte, pot fi vizualizate prin utilizarea de coloratii diverse
Coloratii utile in aprecierea proliferarii, viabilitatii si citotoxicitatii celulare:
Coloratie Hematoxilin – Eozina: Celulele vii sunt fixate si marcate cu un marker
citochimic:
hematoxilina - nuclei albastri;
eozina – citoplasma roz/rosu
Celulele moarte isi pierd aderenta de placa de cultura si se pierd în timpul procesului de
fixare
Testul cu Trypan Blue (TB) – colorant ce patrunde in celula cand membrana este lezata.
Celule moarte colorate în albastru, cele vii incolore.
Testul MTT – sare de tetrazoliu (galbena) redusa de enzime mitocondriale la un formazan
(albastru)
Testul cu Rosu Neutru (NR) – colorant cationic ce penetreaza membranele celulare
(difuzie) si se acumuleaza intracelular în lisosomi, in matricea lisosomala. Celulele vii
incorporeaza NR; citotoxicitate = scadere în preluarea si legarea NR
19. Evaluarea initial a biocompatibilitatii prin teste de iritare piele/reactii alergice
Principiul metodei - testul consta in investigarea daca DM (ca atare sau extracte) induce o reactie
a sistemului imun la expuneri repetate;
Caracteristici generale -sunt teste in vivo, atat pe animale (prin teste preclinice) cat si pe oameni
(teste clinice); - teste adaptate si pentru realizare in vitro
Reactia alergica:
- raspuns al sistemului imun al organismului prin reactii alergice in prezenta unor alergeni
- expunerea la alergeni – se face pe diferite cai specializate: oral (inhalare, ingestie), dermic, ocular,
intravenos, intramuscular, subcutanat, intradermal, intraperitoneal
Teste in vivo pe animale (preclinice)
- teste de iritabilitate primara - implica un contact intre biomaterial si mucoase, respectiv cu o piele
intacta sau ochi
Teste in vivo pe oameni (clinice)
Reactiile alergice ale organismului la interactia cu alergeni pot fi clasificate dupa:
- manifestare
Raspunsuri locale ale tesutului (reactii de iritare): eritem (roseata), inflamatie (edem),
durere si chiar distrugere tesuturi
Raspunsuri sistemice: simptome respiratorii, astm, anxietate, dureri de cap, palpitatii,
urticarie, voma, soc anafilactic
- mod de producere: imediat sau cu intarziere
- reversibilitate: reversibile sau ireversibile
Teste in vitro
❖ organismul raspunde la un anumit alergen printr-un nivel crescut de anticorpi (IgE) in plasma
sanguina, care stimuleaza eliberarea de histamina si declanseaza reactii alergice ale organismului
❖ se foloseste sange prelevat de la animale / om si se masoara cantitatea de anticorpi care se
formeaza, ca un indicator al efectelor alergice provocate de material/extract
Dupa tehnica de identificare si masurare a complexului anticorp – antigen, testele pot fi:
RAST (radio allergo sorbent testing)
FAST (fluorescent allergo sorbent testing)
ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay)
Exemplu: Au şi Ag nu provoacă alergii; nu pot fi modelate în stare pură, li se adaugă alte metale,
precum Ni, extrem de reactiv şi dăunător pielii sensibile
20. Evaluarea initial a biocompatibilitatii prin teste de toxicitate sistemica
Caracteristici generale: Teste special concepute pentru evaluarea toxicitatii cauzata de compusii
secundari proveniti de la biomateriale
- un biomaterial poate fi biocompatibil in forma bruta, insa componentele dizolvate sau produsii
formati prin reactia dintre componentele eliberate si gazda organica, ar putea sa nu fie
biocompatibili
- teste preclinice in vivo – extractul din material se administreaza injectabil (intravenos sau
intraperitoneal) pe sobolani, soareci, iepuri, caini, porci guinea
Semne clinice toxicitate – diferite functie de nivelul de toxicitate al materialului:
Nici un raspuns (nu apar simptome)
Raspuns slab (dispnee, temperatura, durere)
Raspuns moderat (iritatie abdominala, dispnee evidenta, ptoza, diaree, scadere usoara in
greutate)
Raspuns puternic (simptome severe: cianoza, tremur, pierdere masiva in greutate)
Raspuns fatal (deces)
Starea de sanatate – se verifica la anumite intervale de timp:
4- 24 h (toxicitate sistemica acuta)
14-28 zile (toxicitate subacuta sau subcronica)
dupa 3 luni (toxicitate cronica)
Testul de toxicitate sistemica se recomanda a fi completat cu testul de pirogenitate – avand in
vedere ca anumite substante pirogene (endotoxine, substante chimice etc.) se introduc in organism
prin catetere, seringi, componente de implant
CHIMIOTERAPIA CANCERULUI
Efectele citotoxice ale acestor medicamente sunt maxime fata de celulele care prolifereaza rapid
(canceroase dar si din maduva osoasa, tractul digestiv, foliculii de par si gonade). Exista si
toxicitati particulare.
Exemple:
Vincristine - produce efecte neurologice (disparitia reflexelor, neuropatii); alkaloid,
inhibitor mitotic
Doxorubicin- produce efecte cardiace cumulative ca stopul cardiac; utilizat in regresia unor
tumori canceroase
Metotrexat – produce leziuni renale si hepatice; antimetabolite, antifolat
21. Evaluarea initiala a biocompatibilitatii prin teste de genotoxicitate
Caracteristici generale: Efectele mutagene ale unui biomaterial se pot urmari prin teste de
mutagenitate, atat in vitro cat si in vivo
Mutatia = schimbare ireversibila in materialul genetic al celulei (in codul moleculei de ADN) care
se propaga prin generarea ulterioara a celulei (mutageneza)
a) Pentru testele in vitro se pot folosi diferite culturi de celule precum si celule bacteriene (E. Coli,
Salmonella)
Cel mai simplu test de mutagenitate in vitro - testul Ames (1975)
- foloseste tulpini de Salmonella, o bacterie foarte sensibila la mutatii si cu o permeabilitate
crescuta a peretelui celular la molecule mari
- este gold standard test – evidentiaza rapid si cu acuratete de 90% daca un agent chimic este
mutagen (mutagenul poate fi si cancerigen; cancerul incepe cu o mutatie)
Dezavantaj: Salmonella (procariot) – nu este un model perfect pentru om – s-a adaptat un model
pentru celulele eucariote (drojdie)
b) Pentru testele in vivo pe animale se recomanda folosirea de soareci si sobolani deoarece prezinta
similitudini cu genomul uman, iar mecanismul unor boli este asemanator
Testele de mutagenitate sunt obligatorii pentru toate biomaterialele care stau mai mult de 30 zile
in organism si uneori sunt denumite teste de genotoxicitate – avand in vedere ca este vorba de
efectele toxice ale unui material asupra materialului genetic al organismului
22. Evaluarea initiala a biocompatibilitatii prin teste de hemocompatibilitate
- se completeaza cu teste de hemocompatibilitate
- sunt obligatorii pentru biomaterialele folosite la proteze si valve cardiace, grefe musculare,
catetetre, membrane de dializa, fire de sutura etc
Testele de hemocompatibilitate monitorizeaza 3 aspecte importante:
Efectul biomaterialului asupra proteinelor plasmatice: albumine, fibrinogen, globuline
Aderenta de elemente celulare ale sangelui la suprafata materialului
Activarea enzimelor:transaminaze, dehidrogenaze,acid fosfataze, la interfata sange-
suprafata
- Se foloseste sange uman sau animal (se recomanda iepurii) preparat dupa un anumit protocol, in
functie de parametrii ce trebuie determinati
• Se poate lucra cu:
sange integral
sange integral + anticoagulant
plasma sanguina fara celule sanguine
plasma sanguina bogata intr-un anumit tip de celule – ex. trombocite
- Folosirea unui anumit anticoagulant este importanta si se alege dupa scopul urmarit:
EDTA (acid etilendiaminotetraacetic) formeaza un complex solubil cu Ca2+ din sange
- nu poate fi utilizat pentru studii de coagulare deoarece afecteaza functia fibrinogenului;
- in prezenta EDTA, viabilitatea leucocitelor nu se mentine un timp suficient pentru analize
Heparina – considerat a fi un anticoagulant de referinta
- impiedica formarea fibrinei
- indicata in analiza morfologiei eritrocitelor, in studii enzimatice si culturi de celule
Dezavantaj: relativ scumpa si produce aglutinarea trombocitelor
Citrat de sodiu - inlatura Ca2+ prin formarea unui complex solubil citrat-calciu si este
indicat in studii de coagulare
Pentru teste de hemocompatibilitate in vitro se procedeaza astfel:
colectare sange din vena sau artera si eventual tratare cu anticoagulant (EDTA/ Heparina/
Citrat de sodiu)
plasare sange in contact cu materialul de testat in sisteme de incubare statice sau dinamice
(sangele este pompat in camera de incubare sub forma unei curgeri laminare), timpi de
incubare de 60, 120 si 240 min, 37°C
separare plasma sanguina/celule prin centrifugare
analiza plasmei si a celulelor - prin diferite procedee
!!! recomandare: masuratorile sa nu depaseasca 2 ore, dupa acest timp sangele isi modifica
proprietatile
Testele de hemocompatibilitate determina anumiti parametri ce evidentiaza modificari in:
1. Timpi de coagulare
ex: timp Quick - caracterizeaza coagularea extrinseca (valori normale 10-15 sec)
2. Parametri de trombogeneza – se refera la agregarea si aderenta de trombocite la suprafata
materialului
Analiza trombocitelor este foarte importanta deoarece acestea sunt foarte sensibile la suprafete
straine si elibereaza factori procoagulanti
3. Reactiile imune ale organismului la interactia sange-implant se urmaresc prin analiza celulelor,
in special a limfocitelor, in jurul implantului
Din leucocitele prezente pe implant se poate izola si purifica ADN-ul genomic, din analiza caruia
se obtin informatii despre efectele mutagene ale materialului