OBŢINERE A UNUI PREPARAT MICROSCOPIC PENTRU

EXAMENUL CITOLOGIC ÎN MICROSCOPIA FOTONICĂ

Studiul celulei în microscopia fotonică se face pe preparate microscopice de două tipuri:
1-preparate microscopice permanente, care rezistă în timp.
2-preparate microscopice temporare, proaspete.

In functie de tipul tesutului si proprietatile acestuia, preparatele microscopice sunt

realizate prin metoda efectuării secţiunilor fine sau prin metoda etalării materialului biologic în
monostrat.

Obtinerea preparatelor permanente prin efectuarea secţiunilor fine

Etapele de lucru si importanta acestora:

1-Recoltarea materialului biologic, care presupune obţinerea unui fragment de ţesut de
la animale de experienţă sau prin biopsie, precum şi alte acte operatorii. Recoltarea este o etapă
hotărâtoare pentru calitatea preparatului microscopic. În cursul recoltării, materialului biologic
va fi manevrat rapid şi cu maximă atenţie, pentru a menţine nealterată structura lui. Ţesutul se
fasonează în piese mici (1-4 mm) cu suprafeţele plane şi paralele, cu ajutorul lamei de ras
ascuţite.

2-Fixarea materialului recoltat. Tehnica de fixare este selectată în funcţie de tehnica

prin care va fi secţionat ţesutul, precum şi în funcţie de fenomenele celulare, pe care dorim să le
urmărim. Scopul fixării este conservarea constituenţilor celulari, în mod special a proteinelor,
într-o stare cât mai apropiată de cea vie.
Fixarea se realizează prin agenţi fizici sau agenţi chimici.

Fixarea prin agenţi fizici:

- Desicare la temperatura laboratorului, nu este o fixare propriu zisa, dar este o etapa
intermediara in fixarea unui preparat optinut prin metoda etalarii materialulu biologic
in monostrat si este combinata cu cu o fixare chimică ulterioară, realizată în timpul
colorării preparatului
- Fixarea prin desicare la temperatură scăzută (criodesicarea). Este o metodă care
permite menţinerea proteinelor tisulare în stare ne-retractată, apropiată de starea
proaspătă. Acesta se desfăşoară în două etape:
1) inghetarea rapidă a pieselor tisulare la -500C -700C;
2) desicarea sub vid, pentru eliminarea apei prezente sub formă de ghiaţă.
- Fixarea prin inghetare – substituţie. Această metodă este asemănătoare cu cea
precedentă, conform primei etape de lucru. Diferenţa este determinată de metoda
deshidratării, realizată prin imersia ţesuturilor inghetate în soluţii de etanol, eter sau
glicol, răcit la –200C - -500C (în funcţie de concentraţia soluţiei). La un exces de
solvent organic toată apa este extrasă din ţesut fără ca aceasta să revină în stare
lichidă.
 Fixarea prin agenţi chimici:
Agenţii chimici sunt cel mai des folosiţi în etapele de fixare. Acestia realizeaza o fixare
profunda si definitivă, superioară celei obţinute prin agenţi fizici. În funcţie de acţiunea
fixatorilor chimici asupra proteinelor din probă, aceştia pot fi coagulanţi (metanol, etanol,
acetonă, acid nitric, acid clorhidric, trioxid de crom etc.) şi necoagulanţi (acid acetic, tetraoxid
de osmiu, bicromat de potasiu, formaldehidă). Această propritate se va lua în calcul atunci când
se va alege fixatorul. De asemenea, se va ţine seama de acţiunea agenţilor chimici fixatori asupra
glucidelor şi lipidelor tisulare, gradul de pentrare a piesei, retracţia materialuli biologic fixat,
modificările morfologice ale organitelor celulare şi altele.
Fixatorii chimici utilizaţi pot fi simpli sau sub formă de amestecuri fixatoare şi vor fi
selectato, în funcţie de natura ţesutului, detaliile structurale care vor fi evidenţiate şi coloraţia
care se va aplica.
Fixatori simpli:
- Etanol 70% – 100 %, folosit în special pentru fixarea glicogenului şi a elementelor
minerale insolubile în alcool;
- Formaldehidă (formol) – 10% - 15%, cel mai des folosit, atât simplu cât şi în
amestecuri;
Amestecurile fixatoare pot fi grupate în:
- Amestecuri cromo - osmice, folosite pentru conservarea foarte bună a structurilor
nucleare, centriolilor, fusului de diviziune, diferenţierilor plasmalemei,
- Amestecurile cromice, fără osmiu, folosite în conservarea mitocondriilor, aparatului
Golgi şi a granulelor de secreţie,
- Amestecuri pe bază de metale grele, în afară de crom şi osmiu (nitrat de uranil, nitrat
de cobalt etc), folosite la conservarea mitocondriilor şi care permit impregnarea
argentică a aparatului Golgi.
- Amestecuri cromo – acetice, folosite pentru buna fixare a nucleului si a veziculelor de
secreţie.
Există şi alte amestecuri, în afară de cele descrise. Aproate în toate toate amestcurile,
mai puţin cele cromo-osmice, se regăseşte formaldehida.

3-Includerea în parafină.
Este o etapa in premergatoare sectionarii preparatului si are ca scop impregnarea
ţesuturilor fixate intr-un blocuri cu proprietati plastice, insolubile în apă sau alcooli, solide la
temperatura camerei, dar care poate fi topite la temperaturi relativ scazute (55-600C).
Pentru includerea ţesuturilor în blocuri de parafină, acestea sunt mai întâi deshidratate în
băi de alcool cu concentraţie crescatoare 60% – 70% – 80% - 95% – 100%, iar apoi clarificate în
băi succesive de solvent organic (toluen, xilen, benzen, cloroform). Clarificarea are ca scop
inlocuirea alcoolului din tesut cu un solventul organic, in care este solubilă parafina.
Impregnarea propriu-zisă se face cu parafină menţinută în stare lichidă, într-un termostat
sau baie de apa la 56 0C. Pentru a evita prezenţa urmelor de solvent organic, piesele se trec prin 3
băi succesive de parafină înainte de turnarea blocului. Durata impregnării variază în funcţie de
mărimea piesei, fiind în jur de 6 ore.
Turnarea blocului se face în forme speciale, alcătuite din două bare (barele Leuckhardt,
fabricate din carton, aluminiu sau plastic) frânte sub un unghi drept, din care, prin alăturare se
formează un spaţiu dreptunghiular. Liniile moderne si automatizate de impregnare cu parafina,
folosesc grile speciale.
 4-Secţionarea materialului biologic
Sectionarea se efectuiază cu ajutorul microtomului de parafină (dacă piesele au fost
incluse în parafină) sau cu ajutorul criomicrotomului (dacă piesele au fost îngheţate).
Microtomul poate fi cu mişcare verticală (cuţitul fix, iar piesa este fixată pe un dispozitiv care se
deplasează de sus în jos) şi cu mişcare orizontală (piesa este fixată pe un supor imobil, iar cuţitul
s deplasează în plan orizontal).

5-Etalarea şi lipirea secţiunilor pe lamă

Etalarea sectiunilor pe lama de sicla se face diferit, în funcţie de etapele anterioare
parcurse. În general, pentru intinderea perfecta a secţiunilor de parafină, acestea sunt puse fie la
suprafaţa apei încălzite sub punctul de topire a parafinei, de unde se trec pe o lamă de sticlă pe
care s-a aplicat în prealabil o peliculă subţire de gelatină, fie sunt puse direct pe lama unsă cu
gelatină. În al doilea caz, peste panglica de secţiuni, pusa pe lama de sticla, se picură câteva
picături de apă, iar lama se pune pe o plită încălzită, sub punctul de topire a parafinei. După
intinderea secţiunilor, acestea pot fi separate cate una, cu ajutorul a două ace.
După întinderea completă a secţiunilor, se îndepărtează apa în exces, iar secţiunile puse
înclinat pe un stativ de lemn sunt pastrate în incubator, la 370C timp de 24 ore

6-Colorarea secţiunilor etalate pe lamă

Colorarea o etapă specifică şi determinantă pentru evidenţierea structurilor sau a
proceselor biochimice celulare.
Pentru colorarea secţiunilor la parafină, acestea sunt deparafinate în băi succesive cu
solvenţi ai parafinei, trecând lama cu preparatul prin băi de xilol, toluien sau altele. După
deparafinare preparatul se rehidratează, aplicând băile cu alcool în sens crescator (100% - 95% -
80% - 70% - 60%). Dacă colorantul este o solutie apoasa, înainte de colorare lama va fi trecută
prin apă distilată, dacă colorantul este alcoolic, atunci se omite trecerea prin apă distilată.
Colorarea propriu-zisă se face prin tehnici de colorare specifică a structurilor ce urmează
a fi evidenţiate.
 Coloranţii utilizaţi în tehnicile de colorare au în primul rând grupări chimice specifice ce
conferă culoare – grupări cromofore şi grupări ce permit fixarea permanentă pe structura de
colorat – grupări auxocrome.
Coloranţii pot fi clasificaţi după origine în:
- naturali (de origine vegetală sau animală);
- sintetici.
După natura auxocromilor:
- coloranţi acizi (anionici) - eozina;
- coloranţi bazici (cationici) – tionina, violet de metil, hematoxilina;
- coloranţi neutri – eozinatul de albastru de metilen, eozinatul de azur de metilen.

Tehnicile de colorare se clasifică

După numărul coloranţilor utilizaţi în:
- simple
- combinate
După utilizarea adjuvanţilor în:
- directe
- indirecte (prin mordansare),
După modul de aplicare a colorantului:
- post-mortem
- vitale (aplicarea colorantului pe tesutul viu).

Cele mai des întâlnite tehnici de colorare sunt cele combinate şi directe. În urma acestor
tehnici, nucleii celular prezintă afinitate pentru coloranţii bazici (hematoxilină, albastru de
toluidină, safranină), în special datorită proprietăţilor acide ale AND-ului nuclear.
Citoplasma nestructurată este, în general, o structură cu afinitate pentru coloranţii acizi
Organitele celulare sunt structuri cu afinitate tinctorială diferită şi specifică.
-Mitocondriile pot fi evidenţiate cu verde lumină, cu o diferenţiere în prealabil cu acid
picric, care accentuiază colorarea si o vireaza în roşu.
-RER este o structură cu afinitate pentru coloranţii bazici (albastru d toluidină), datorită
corpusculilor ribosomali de natură acidă.
-Aparatul Golgi este pus în evidenţă prin impregnare cu NO3Ag la întuneric, rezultând o
colorare în negru a acestui organit.

7-Montarea lamelei pe secţiunile colorate

Montarea lamelei are ca scop protecţia mecanică, menţinerea transparenţei şi oferirea
unui indice de refracţie avantajos pentru examinarea in microscopia fotonica.
Lamela se montează pe preparatul colorat cu ajutorul unor medii de montare alese în
funcţie de tipul preparatului. În general mediile de montare se clasifică în:
- medii apoase (glicerină gelatinată etc);
- medii miscibile cu alcoolul (euparolul);
- medii anhidre (balsam de Canada sau alte răşini sintetice).

8-Etichetarea preparatului
Etichetarea se face pe lama portobiect, pe faţa cu secţiunea colorată.