ENZIMOLOGIE SPECIALA

Tehnici de fractionare
 Cromatografia de schimb ionic
• Cromatografia este tehnica de separare care distribuie
componentele unui amestec între două faze: una
staţionară fixă şi una mobilă

• Metodele LC pot exploata diferite principii de separare:

mărimea, sarcina, hidrofobicitatea şi afinitatea pentru
liganzi particulari

• Cromatografia de schimb ionic reprezinta procesul de

separare a compusilor ionici ca urmare a interactiei
lor cu grupari ionice fixe din faza stationara
 Cromatografia de schimb ionic
Schimbatorii de ioni
• Sunt structuri insolubile, inerte chimic, de care
se leaga electrostatic ionii mobili de schimb;

• Clasificare:
– Anioniti : matrice cu grupari incarcate pozitiv de
care se leaga ionii negativi;
– Cationiti: matrice cu grupari incarcate negativi
de care se leaga ionii pozitiv.
Cromatografia de schimb ionic
 Cromatografia de schimb ionic
Schimbatori de ioni
• Ca suport pot fi utilizate răşini sintetice schimbătoare de ioni, silicaţi,
polizaharide modificate etc.
• Grupari chimice:
- anioniti: amino
- cationiti: hidroxil, fenol, sulfonil, carboxil

• Capacitatea unui schimbător de ioni de a-şi schimba ionii săi mobili cu ionii
din mediu poartă numele de capacitate de schimb şi depinde de:
- numărul de grupe polare raportat la 1 gram substanţă uscată;
- accesibilitatea acestora;
- natura ionilor de schimb;
- natura chimică;
- taria ionică;
- pH-ul eluentului.
Cromatografia de schimb ionic
 Cromatografia de schimb ionic
Tipul Grupare ionica Ionii solutiei Domeniul de pH Produs
schimbatorului tampon comercial
de ioni
Cation puternic Acid Sulfonic Na+, H+, Li+ 4-13 SP Sepharose®
(SP) SP Sephadex®
Cation slab Acid carboxilic Na+, H+, Li+ 6-10 CM Sepharose®
(CM) CM Sephadex®
Anion Amina Cl-, CH3COO-, 2-12 Q Sepharose®
puternic quaternara SO42- QAE Sephadex®
(Q)
Anion slab Amina primara/ Cl-, CH3COO-, 2-9 DEAE Sepharose®
secundara/ SO42- DEAE Cellulose
tertiara
(DEAE)
 Cromatografia de schimb ionic
Proprietatile materialului cromatografic pentru cromatografia
de schimb ionic:
 stabil chimic
 insolubil in apa si solutii apoase
 capacitate mare de a se imbiba in solutii apoase si de a
forma geluri (grad de reticulare)
 stabil la temperatura, pH si in timp
 dimensiuni constante ale particulelor
 continut mare de grupari ionizabile (grupele sulfonice si
cele de amoniu quaternar se ionizeaza puternic in timp
ce grupele carboxil si amino sunt mai putin ionizate)
 capacitate ridicata de schimb ionic
 selectivitate
 Cromatografia de schimb ionic
Factori care influenteaza interactia enzimelor cu
schimbatorii de ioni:
- Sarcina neta a enzimei si distributia sarcinilor
electrice la exteriorul moleculei globulare;
- este dependenta de pH-ul mediului;
- pentru a se lega la un anionit enzimele trebuie sa aiba
sarcina “-” cand se gasesc la pH˃pHiz;
- pentru a se lega la un cationit enzimele trebuie sa aiba
sarcina “+” cand se gasesc la pH˂pHiz;
- Taria ionica si natura ionilor din solvent: pentru a
favoriza legarea enzimelor la schimbatorii de ioni se
folosesc tampoane cu concentratie mica (0.01 M)
 Cromatografia de schimb ionic
Suporturile frecvent utilizate în cromatografia prin
schimb ionic
- unii derivaţi ai celulozei (AE-celuloza, DEAE-celuloza,
TEAE-celuloza, PAB-celuloza, ECTEOLA-celuloza, CM-
celuloza, PEI-celuloza, SE-celuloza etc.),
- diferite tipuri de Sephadex (DEAE-Sephadex, CM-
Sephadex, SP-Sephadex etc.)
- unii copolimeri ai stirenului cu divinilbenzenul (Dowex),
ai acidului metacrilic cu divinilbenzenul
- derivati de poliacrilamida polimerizata in prezenta de
metilen-bis-acrilamida
 Cromatografia de schimb ionic
PRINCIPIU:

 Se realizeaza adsorbtia selectiva si reversibila a enzimelor in functie de

sarcina electrica
- intre sarcinile electrice ale enzimei si ale schimbatorului de ioni se
stabilesc legaturi electrostatice si interactii de tip Van der Waals

 Desorbtia se realizeaza prin:

- modificarea sarcinii enzimelor sau a distributiei lor, scazand interactia
cu schimbatorul de ioni (se modifica pH-ul eluentului)
- folosirea ionilor competitivi ce cresc competitia cu moleculele de
enzima (creste taria ionica a eluentului)

Fractionarea se realizeaza în funcţie de încărcarea electrică a fiecărei

enzime în parte, iar îndepărtarea lor treptată se face cu un eluent
adecvat. Metoda eluţiei în gradient este cel mai des utilizata.
 Cromatografia de schimb ionic
Elutia:
Cromatografia de schimb ionic
Cromatografia de schimb ionic
Cromatografia de schimb ionic
Cromatografia de schimb ionic
 Electroforeza
= Tehnica de separare a moleculelor cu sarcina electrica
ce migreaza intr-un mediu vascos (lichid sau gel) sub
actiunea unui camp electric
• Viteza de deplasare a particulelor in camp electric
depinde de sarcina q, coeficientul de frecare f si
diferenta de potential E:
Eq
v=
f
Mobilitatea particulelor este reprezentata de raportul v/E
v q
µ= =
E f
Mobilitatea moleculelor depinde de sarcina electrica,
dimensiunea si forma lor, fiind constanta in conditii
electroforetice definite
 Electroforeza
1. Sarcina electrica a enzimelor
• reprezinta suma sarcinilor tuturor gruparilor din
structura, la o anumita valoare de pH;
• moleculele cu sarcina negativa (anioni) de vor deplasa
catre polul pozitiv (anod)
• moleculele cu sarcina pozitiva (cationi) de vor deplasa
catre polul negativ (catod)

2. Dimensiunea moleculelor
• Moleculele cu dimensiuni mai mici se vor deplasa mai
usor/repede decat cele mari
 Electroforeza
3. Materialul electroforetic
O matrice ce actioneaza ca o sita pentru
separarea moleculelor
- Gel de agaroza – are pori mari fiind potrivit
pentru separarea moleculelor mari
- Gel de poliacrilamida - are pori mici fiind
potrivit pentru separarea moleculelor mici
Electroforeza
Electroforeza
Electroforeza
 Electroforeza

• Dupa separare compusii pot fi localizati pe suport prin:

- colorare cu coloranti specifici;
- determinari de fluorescenta dupa iradiere;
- radiografierea compusilor marcati radioactiv.

• In scopuri preparative compusii pot fi eluati dupa

mediul suport si recuperati in forma purificata
 Electroforeza
Factori care influenteaza separarile electroforetice:
 Sarcina electrica a proteinelor;
 Dimensiunea proteinelor
 Campul electric (diferenta de potential);
 Fortele de frecare; porozitatea gelului (concentratia)
 Solubilitatea proteinelor
– doar proteinele solubile in apa pot fi analizate prin
electroforeza
– pentru cresterea solubilitatii se adauga detergenti
 Temperatura
- caldura poate produce denaturare termica si evaporarea
tamponului
 PENTRU NOTA 5
Cromatografia de schimb ionic este tehnica de separare a compusilor
ca urmare a interactiei lor cu grupari ionice fixe din faza stationara
Factori care influenteaza interactia enzimelor cu schimbatorii de ioni:
 Sarcina neta a enzimei
 Taria ionica si natura ionilor din solvent

Electroforeza este tehnica de separare a moleculelor cu sarcina electrica ce

migreaza intr-un mediu vascos (lichid sau gel) sub actiunea unui camp
electric
Factori care influenteaza separarea electroforetica a enzimelor:
 Sarcina electrica;
 Dimensiunea
 Campul electric (diferenta de potential);
 Fortele de frecare din gel (concentratia)
 Solubilitatea
 Temperatura