CROMATOGRAFIA

Cromatografia cuprinde o familie de metode fizico-chimice de separare, analitică

sau preparativă, a amestecurilor complexe de molecule, bazate pe distribuţia repetată a
moleculelor între o fază mobilă şi una staţionară. Operarea acestor procese, cuplate cu
mişcarea fazei mobile, rezultă într-o migrare diferenţiată a moleculelor de-a lungul fazei
staţionare. Pe parcursul sistemului cromatografic se stabileşte de mai multe ori echilibrul
dintre cele două faze. Lungimea corespunzătoare stabilirii unui echilibru, referitoare la o
componentă a amestecului, se numeşte lungimea unui taler teoretic. Condiţia unei
separări bune este ca lungimea talerelor teoretice să fie mică pentru toate componentele
amestecului şi procesul, în totalitate, să cuprindă un număr cât mai mare de talere.

Cu toate că denumirea aminteşte de faptul că metodele cromatografice s-au folosit

prima dată la separarea substanţelor colorate, astăzi aceste metode constituie un instrument
util în chimia analitică a oricărei clase de substanţe chimice sau biologice.

Criterii de clasificare

Clasificare după starea fizică a fazelor staţionară şi mobilă care constituie

sistemul cromatografic

a) faza staţionară solidă:

- faza mobilă gaz: cromatografie gaz - solid (CGS)

- faza mobilă lichid: cromatografie lichid - solid (CLS)

a. faza staţionară lichidă:

- faza mobilă gaz: cromatografie gaz - lichid (CGL)

- faza mobilă lichid: cromatografie lichid - lichid (CLL)

Clasificare după natura interacţiunilor dintre componentele amestecului şi

fazele mobilă şi/sau staţionară

Distribuţia moleculelor între cele două faze este guvernată de una sau mai multe din
cele patru procese de bază: adsorbţia, schimbul ionic, repartiţia şi gel filtrarea. În acest caz
cromatografia poate fi:

a) Cromatografia de adsorbţie (CA)

În cromatografia de adsorbţie (Figura 16) faza staţionară este un solid iar faza mobilă
este o soluţie apoasă sau neapoasă. Pe măsură ce materialul se mişcă de-a lungul
coloanei, procesul de adsorbţie-desorbţie este repetat de multe ori. Viteza de mişcare a
moleculelor depinde de gradul lor de adsorbţie la suportul solid. Forţele implicate în
adsorbţie sunt interacţiuni dipol-dipol, forţe van der Waals, legături de hidrogen, interacţiuni
hidrofobe. Adsorbanţii disponibili sunt limitaţi, de exemplu răşini bazate pe polistiren (pentru
molecule nepolare), silice, oxid de aluminiu şi fosfat de calciu (pentru moleculele polare). Cei
mai mulţi dintre adsorbanţi trebuie activaţi prin încălzire la
110-120˚C înainte de utilizare deoarece capacitatea lor de adsorbţie scade în prezenţa apei
legate. Cromatografia de adsorbţie poate fi realizată în coloană sau pe strat subţire, folosind
o varietate mare de solvenţi organici.

Figura 16. Cromatografia de adsorbţie (faza staţionară polară)

b) Cromatografia de partiţie (CP)

În cromatografia de partiţie (de repartiţie) (Figura 17) distribuţia moleculelor între

fazele lichide, mobilă şi staţionară, se bazează pe solubilităţile moleculelor în cele două faze.
O substanţă, solubilă în două faze nemiscibile, se va distribui (va partiţiona) între aceste
două faze în acord cu solubilitatea ei. Coeficientul de partiţie (repartiţie) reprezintă raportul
concentraţiilor substanţei în cele două faze (solvenţi) şi este constant, indiferent de
concentraţia absolută.
Figura 17. Cromatografia de partiţie lichid – lichid cu fază inversă (faza staţionară
nepolară)

Substanţele care sunt mai solubile în faza mobilă vor trece rapid prin sistem în timp
ce cele mai solubile în faza staţionară vor fi încetinite. Faza staţionară lichidă este menţinută
pe loc de un solid poros, cum ar fi o hârtie de filtru (fibre de celuloză). În acest caz, hârtia de
filtru umedă (un strat polar de molecule de apă legate la grupările hidroxilice ale celulozei)
reprezintă faza staţionară normală, iar stratul de lichid de deasupra hârtiei umede (de
obicei un solvent organic relativ nepolar) reprezintă faza mobilă. Distribuţia moleculelor între
cele două faze are loc repetat pe măsură ce materialul se mişcă în susul sau în josul hârtiei.
Moleculele nepolare se vor mişca mai repede în acest sistem decât într-unul polar. În cazul
cromatografiei de partiţie cu fază inversă, faza staţionară este un solvent nepolar (exemplu
o hidrocarbură C18 ca octadecilsilanul) care este legat chimic la o matrice suport poroasă
(exemplu silice), în timp ce faza mobilă poate fi aleasă dintr-un număr mare de solvenţi, de
obicei apă sau o soluţie tampon apoasă, conţinând unul sau mai mulţi solvenţi organici -
exemplu acetonitril (ca în cromatografia de înaltă presiune cu fază inversă, FI-HPLC).

c) Cromatografia de schimb ionic (CSI)

În cromatografia de schimb ionic (Figura 18) moleculele sunt separate pe baza
sarcinii lor nete. Faza staţionară este o răşină schimbătoare de ioni (un polimer reticulat cu
multe grupări funcţionale încărcate electric) iar faza mobilă este o soluţie apoasă. Moleculele
sunt întârziate în mişcarea lor de-a lungul coloanei, depinzând de semnul şi mărimea sarcinii
lor. Are loc repetat legarea electrostatică a moleculelor la grupările cu sarcini opuse ale
răşinii schimbătoare de ioni şi ruperea acestor legături. Ideal, proba este aplicată pe coloană
la un pH la care moleculele au sarcina opusă celei a grupărilor răşinii, astfel încât moleculele
se leagă la coloană. pH-ul tamponului de eluţie este apoi schimbat, astfel schimbându-se şi
sarcina netă a moleculelor. Când moleculele şi grupările funcţionale ale răşinii poartă
sarcină de acelaşi semn, moleculele sunt respinse de grupările răşinii şi sunt eluate de pe
coloană. Moleculele pot fi, de asemenea, eluate de pe schimbătorul de ioni prin creşterea
tăriei ionice (concentraţiei) a eluentului.

Schimbătorii de ioni pot fi cationici sau anionici, depinzând de ionul pe care îl

schimbă. O răşină care are grefate grupări negative şi schimbă ioni pozitivi este un cationit
şi viceversa pentru un anionit. Fiecare tip de schimbător este clasificat ca puternic sau slab,
în funcţie de tăria ionizării grupărilor funcţionale. Un schimbător cu o grupare aminică
cuaternară este astfel un schimbător anionic bazic puternic, în timp ce grupări aminice
secundare alifatice sau aromatice duc la un schimbător anionic bazic slab. Un cationit acidic
puternic conţine grupări acidice sulfonice. Tabelul 3 prezintă o listă cu cei mai comuni
schimbători de ioni.

Tabel 3. Răşini schimbătoare de ioni

Denumire Grupă funcţională Matrice Clasă

Schimbători anionici

AG 1 tetrametilamoniu polistiren puternic

AG 3 amină terţiară polistiren slab

DEAE-celuloză dietilaminoetil celuloza slab

PEI-celuloză polietilenimină celuloza slab

DEAE-Sephadex dietilaminoetil dextran slab

QAE-Sephadex dietil-(2-hidroxipropil)- dextran puternic

aminoetil

Schimbători cationici

AG 50 sulfonil polistiren puternic

Bio-Rex 70 carboxil acrilic slab

CM-celuloză carboximetil celuloză slab

 P-celuloză fosfat celuloză intermediar

CM-Sephadex carboximetil dextran slab

SP-Sephadex sulfopropil dextran puternic

Abilitatea unui schimbător de ioni de a adsorbi contraioni este definită cantitativ de

capacitate. Capacitatea totală a unui schimbător de ioni este cantitatea de grupări
încărcate sau potenţial încărcate per unitate de masă de material uscat. Se exprimă de
obicei în miliechivalenţi de grupări ionizabile per miligram substanţă uscată şi poate fi
determinată experimental prin titrare. Capacitatea unui schimbător ionic este funcţie şi de
porozitatea răşinii. Matricea este reticulată prin legături covalente, formând o “sită
moleculară”, şi grupările funcţionale ionizate din interiorul matricei nu sunt accesibile
moleculelor mari, care nu pot intra în pori. Doar sarcinile de suprafaţă vor fi accesibile
acestor molecule pentru schimb.
Figura 18. Cromatografia de schimb ionic (cationit)

Porozitatea răşinii depinde de gradul ei de reticulare. Răşinile pur sintetice

(polistirenice sau acrilice) au o reticulare între 2 şi 16%, cu 8% fiind cele mai bune în acest
scop. Schimbătorii de ioni celulozici au reticulare redusă sau de loc, în timp ce cei bazaţi pe
dextran sunt disponibili în două grade de reticulare. Având în vedere diferitele opţiuni
experimentale, este dificil să se selecteze condiţiile cele mai potrivite pentru o anume
separare.

CSI poate fi utilizată pentru separarea unor amestecuri foarte variate de biomolecule
ionice: aminoacizi, peptide, proteine, nucleotide.

d) Cromatografia de gel-filtrare (CGF) (de excluziune sterică sau cernere

moleculară)

În acest tip de cromatografie (Figura 19), faza staţionară constă din particule sferice
de gel cu mărime şi porozitate controlată (polimeri reticulaţi) şi este în general folosită sub
formă de coloană. Faza mobilă este lichidul trecut prin coloană. Moleculele sunt fracţionate
pe baza mărimii şi formei lor. Aceşti doi parametri determină viteza şi extinderea difuziunii
moleculelor. Moleculele mai mici difuzează mai uşor în porii particulelor de gel decât cele cu
dimensiuni mari, având aceeaşi formă generală. Cu cât penetrarea în pori este mai mare, cu
atât mai întârziată va fi mişcarea moleculelor prin coloană. Mişcarea în interiorul şi în afara
particulelor de gel are loc repetat pe măsură ce materialul se mişcă prin coloană.
Moleculele care sunt mai mari decât porii particulelor de gel sunt excluse din gel şi se mişcă
mai rapid prin spaţiul dintre particulele de gel. Astfel, pentru moleculele care au aproximativ
aceeaşi formă, cu cât este mai mică masa lor moleculară, cu atât mişcarea lor este mai
înceată de-a lungul coloanei şi necesită un volum de eluţie mai mare. Principalul factor de
separare în gel-filtrare este masa moleculară a particulelor. Pe lângă aceasta, trebuie luaţi în
considerare (în unele cazuri) şi alţi factori, cum ar fi interacţiuni de sarcină, efecte de
adsorbţie.

Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un gel spre a fi utilizat în

cromatografia de gel-filtrare sunt:

- matricea gelului trebuie să fie inertă chimic;

- gelurile trebuie să fie stabile fizico-chimic;

- trebuie să prezinte un conţinut mic în grupări ionice pentru a evita efectele de

schimb ionic;

- să aibă grad de umectare mare;

- să poată fi obţinută o gamă largă de tipuri de gel cu aceeaşi constituţie chimică, dar
cu porozitate şi mărime a particulelor diferită, pentru a acoperi diferite domenii de
fracţionare;
 - mărimea particulelor şi distribuţia pe mărimi a particulelor să fie riguros controlată;

- granulele gelului să fie rigide, stratul cromatografic să nu se compacteze şi să

opună rezistenţă la eluţie (rezistenţă mecanică bună).
 Figura 19. Cromatografia de
gel filtrare

Diferite firme comerciale au produs o serie de geluri având la bază diferiţi polimeri.
Câteva exemple sunt prezentate în Tabelul 4.

Tabelul 4. Geluri utilizate în cromatografia de gel-filtrare

Denumire comercială Firma producătoare Tip de polimer

Sephadex G Pharmacia Fine Chemicals dextran

Bio-Gel P Bio-Rad poliacrilamidă

Sagavac SAG SERAVAC agar

Bio-Gel A Bio-Rad agaroză

Gelarose Litex agaroză

Sepharose B Pharmacia Fine Chemicals agaroză

Volumul total (Vt) al coloanei de gel filtrare are trei componente:

Vi = volumul din interiorul particulelor; volumul accesibil solventului; este cunoscut ca

volumul intern;

Vg = volumul cu care contribuie pereţii solizi şi lanţurile reticulate interne ale

particulelor de gel; volum inaccesibil solventului;

Vo = volumul de lichid din afara şi dintre particulele de gel; este cunoscut ca volumul
liber.

Deci :

Vt = Vi + Vg + Vo (1)

Volumul de eluţie (Ve) al unei specii de molecule este acel volum de eluent care
părăseşte coloana din momentul în care proba a penetrat coloana pentru prima dată şi până
în acel moment în care proba (molecula) apare în efluentul coloanei. În practică acest volum
este de obicei (dar nu întotdeauna) luat ca volumul eluat de pe coloană din momentul
aplicării probei până în momentul apariţiei peak-ului probei în fracţia de eluţie.
 Figura 20. Determinarea masei moleculare prin gel-filtrare. Graficul volumului
de eluţie în funcţie de logaritmul masei moleculare pentru proteine. Gel utilizat:
Sephadex G-75. Coloana: 1,10 x 24 centimetri. Eluent: tampon Tris 0,05M (pH 7.5),
conţinând KCl 0,1M.

Utilizând proteine cu aceeaşi formă generală şi cu mase moleculare cunoscute se poate

calibra o coloană de gel filtrare reprezentând grafic volumul de eluţie în funcţie de logaritmul masei
moleculare. Utilizând o coloană identică, se poate determina masa moleculară a unei proteine
necunoscute din volumul de eluţie (Figura 20).

O altă modalitate este de a reprezenta grafic V e/Vo în funcţie de logaritmul masei

moleculare. În acest caz, masa moleculară a unei proteine necunoscute poate fi determinată
utilizând o coloană având orice mărime dorită şi determinând valoarea V e/Vo pentru proteina
necunoscută.

e) Cromatografia de afinitate (CA)

Este cel mai selectiv tip de cromatografie şi constă în stabilirea unor legături între
componenta de separat şi un ligand. În cromatografia de afinitate, ligandul (o moleculă, un
grup, ion sau atom) este ataşat covalent la matrice (polimerul suport). Legătura dintre ligand
şi molecula de separat este strict specifică şi se bazează, de obicei, pe activitatea biologică
a moleculelor (antigen-anticorp, enzimă-substrat, hormon-proteină de transport sau receptor,
ADN sau ARN-secvenţă de baze complementare, etc).
 De exemplu, ligandul poate fi reactantul sau produsul la care enzima se leagă in vivo.
Pe măsură ce un amestec de proteine este trecut prin coloană, numai proteina ţintă se leagă
specific la matrice. Coloana este spălată apoi de câteva ori cu tamponul în care proteinele
au fost dizolvate pentru a elua proteinele care au fost legate nespecific. În final, proteina
ţintă este eluată prin trecerea prin coloană a unui solvent conţinând o concentraţie mare de
ligand liber, sau o soluţie salină concentrată.

În CA, ligandul trebuie să prezinte o interacţiune specifică dar reversibilă cu molecula

de purificat. Trebuie de asemenea să conţină o grupare funcţională reactivă, independentă
de cele ale centrului biospecific activ, care va permite ataşarea covalentă la matricea suport.
Aceasta nu trebuie să prezinte efecte de adsorbţie nespecifice şi să aibă suficiente grupări
funcţionale reactive pentru ataşarea ligandului. O matrice suport ideală este agaroza. Dacă
ligandul este mic şi molecula de purificat este mare, legarea poate fi restricţionată datorită
prezenţei prea apropiate a suprafeţei matricei. Această problemă poate fi rezolvată prin
introducerea unui “braţ distanţier” (exemplu o catenă hidrocarbonată cu 6 atomi de carbon)
între ligand şi matrice (Figura 21).
 Figura 21. Cromatografia de

afinitate

Un dezavantaj al CA este faptul că trebuie realizat un ligand diferit pentru fiecare

separare individuală, ceea ce duce la consum de timp iar procesul devine scump. Poate fi
mult mai practică utilizarea unor “adsorbanţi de grup” ce conţin liganzi cu afinitate pentru o
clasă de substanţe înrudite biochimic.

Exemple de adsorbanţi cu specificitate de grup includ:

• Lectinele (un grup de proteine produse de fungi, plante şi animale) leagă specific resturi
glucidice. Sunt foarte utile pentru purificarea macromoleculelor ce conţin glucide precum
glicoproteine, lipoproteine serice, proteine-receptor membranare.
• Proteina A (proteină membranară de suprafaţă din bacteria Staphylococcus aureus) are
afinitate pentru regiunea constantă (F c) a anticorpilor IgG ai multor specii de mamifere.
• Coloranţii imobilizaţi (exemplu Cibacron Blue F3G-A, disponibil ca suport de afinitate
sub denumirea de Blue Sepharose) se utilizează pentru purificarea unui număr mare de
enzime şi proteine. Aceşti coloranţi au similarităţi de structură cu cofactori nucleotidici ca
NAD şi NADP şi se utilizează pentru purificarea enzimelor care necesită aceşti cofactori.
• Poli(uridinil)-agaroza poate fi utilizată pentru izolarea de ARNm datorită cuplării
biospecifice a poli(uridinil) cu secvenţa terminală poli(adenil) caracteristică moleculelor de
ARNm. Poate fi de asemenea utilizat pentru izolarea proteinelor şi enzimelor care se
leagă la ARN, cum ar fi reverstranscriptazele.
Cromatografia de afinitate singură poate uneori să purifice o proteină de
1000-10000 de ori.

Clasificare după forma şi construcţia fazei staţionare

În funcţie de tipul fazei staţionare, cromatografia poate fi clasificată în:

 a) Cromatografia capilară

b) Cromatografia în strat subţire (CSS)

c) Cromatografia pe hârtie (CH)

Cromatografia pe hârtie este o formă specială a cromatografiei de partiţie care a avut

o utilizare largă între anii 1940-1960 într-o serie întreagă de domenii şi mai ales în biochimie.
În prezent a fost însă practic înlocuită cu cromatografia în strat subţire. Ca material de suport
se utilizează celuloza sub forma unei hârtii speciale, tăiată în formă de benzi dreptunghiulare
sau în formă de ic, în rondele întregi sau sectorizate. Acestea conţin faza staţionară, de
obicei apa, sau sunt uneori impregnate cu substanţe hidrofobe (cromatografie în fază
inversă).

În diferite variante de tehnici, faza mobilă irigă ascendent sau descendent hârtia. O
substanţă dată migrează cu atât mai repede cu cât are un coeficient de partiţie mai mare în
raport cu faza mobilă.

Proba (amestecul de componente de separat) se depune într-un punct de start, în

cantitate foarte mică (1-10 microlitri). Hârtia este uscată, apoi irigată (developată) cu un
solvent în sistem mono sau bidimensional.

După migrare, hârtia este din nou uscată, apoi substanţele sunt vizualizate (prin
reacţii de culoare, lumină UV) şi apar sub forma unor pete (spoturi) sau benzi, fapt care
permite evidenţierea calitativă a componentelor, evaluarea lor cantitativă şi obţinerea
componentelor în scop preparativ (prin decuparea spoturilor şi apoi eluare, sau prin
scurgerea continuă a componentelor în recipiente separate).

Aparatura este extrem de simplă şi uşor de întrebuinţat. Metoda prezintă însă o serie
de dezavantaje şi anume:

• durata mare a timpului de separare

• separarea defectuoasă a unor substanţe
• formarea de trenuri şi delimitări difuze ale spoturilor în urma interferenţei
unor efecte parazite de tipul schimbului ionic şi de adsorbţie.

Cu toate acestea cromatografia pe hârtie a cunoscut aplicaţii largi în analiza

amestecurilor de aminoacizi, zaharuri, componente lipidice, acizi organici, porfirine şi
pigmenţi biliari, alcaloizi, hormoni şi medicamente într-o serie întreagă de produse biologice
în scop de cercetare sau diagnostic.

Ambele (CSS şi CH) se pretează la cromatografia bidimensională.

Mişcarea substanţelor în cromatografia pe hârtie sau în strat subţire este

caracterizată de valoarea Rf (Retention factor = factorul de retenție). Aceasta reprezintă
raportul dintre distanţa parcursă de probă şi cea parcursă de solvent, amândouă măsurate
de la linia de origine (start) :
 (2)

Valoarea Rf este proporţională cu solubilitatea probei în faza mobilă.

Alternativ, se poate exprima mişcarea substanţelor raportând-o la un standard cu

mobilitate cunoscută, RX, unde:

(3)

d) Cromatografia pe coloană

Faza staţionară, în general sub formă de particule sferice (un adsorbent, o răşină sau
un gel) este conţinută într-un tub de sticlă, plastic sau oţel. Eluentul este introdus în coloană
cu ajutorul unei pompe debitoare sau se lasă să curgă prin coloană sub acţiunea gravitaţiei.

Amestecul de separat este introdus la acel capăt al coloanei unde pătrunde eluentul.
Efluentul, care se colectează la celălalt capăt al coloanei, se trece printr-un dispozitiv
analizor, care sesizează prezenţa componentelor. Componentele separate părăsesc
succesiv coloana şi pot fi colectate separat (Figura 22).
Figura 22. Componentele sistemului Figura 23. Caracteristicile peak-ului

cromatografic în coloană (stânga) la o separare cromatografică (dreapta)

Analizoarele (cu detectoarele) cele mai utilizate sunt:

1. pentru cromatografia de lichide:

• refractometru diferenţial
• detector fotometric (cel mai adesea UV dar şi vizibil)
• detector de fluorescenţă
• detectori electrochimici (amperometrici sau coulometrici)
1. pentru cromatografia de gaze:
• detector cu ionizare în flacără
• detector bazat pe conductivitatea termică
• detector cu captare de electroni
 Pentru evaluarea separării se construieşte un profil de eluţie (o cromatogramă) prin
reprezentarea grafică a cantităţilor de substanţe eluate în funcţie fie de timp, fie de volumul
de eluţie, fie de numărul de fracţii. Această reprezentare ar trebui să prezinte peak-uri
simetrice pentru fiecare substanţă (Figura 23).

Se poate exprima migrarea unei anumite substanţe la o viteză de migrare dată în

termeni de:

• timp de retenţie (tR) - reprezintă timpul necesar pentru eluţia maximă a unei
componente; se măsoară din momentul injecţiei probei în coloană până la apariţia
cantităţii maxime din respectiva substanţă, eluată din coloană;
• volum de retenţie (VR) - reprezintă volumul de solvent necesar pentru a elua
componenta respectivă, calculat tot din momentul introducerii probei în coloană.
Se poate calcula cu formula:

VR = FtR (4)

unde F = viteza de eluare

Eficienţa de separare a unei coloane este măsurată prin abilitatea de a distinge

între două substanţe similare, exprimată în termeni de:

• selectivitate - reprezintă diferenţa între timpii de retenţie a două peak-uri

(exemplu ta-tb).

• rezoluţie (RS) - reprezintă raportul dintre dublul selectivităţii şi suma lăţimii bazelor
(W) celor două peak-uri:

(5)

unde indicii a şi b se referă la substanţele a, respectiv b (Figura 25). Pentru cele mai multe
scopuri practice, valori RS de 1 sau mai mari sunt satisfăcătoare, corespunzând la o
separare a peak-urilor de 98% în cazul peak-urilor simetrice.

După compoziţia fazei mobile

În timpul separării prin cromatografie pe coloană se poate modifica compoziţia

eluentului (concentraţie, pH, compoziţie, etc) după un program bine stabilit. Acest mod de
lucru poartă numele de cromatografie prin gradient. Dacă în timpul separării nu se
schimbă compoziţia eluentului, cromatografia este izocratică.
 Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC)

Cromatografia pe coloană utilizează cantităţi mari de faze staţionare “moi”, care

necesită curgeri prin coloană a fazei mobile la presiune scăzută pentru a evita compresia;
separările necesită de obicei timp lung iar rezoluţia este scăzută (performanţă scăzută).

Rezoluţia metodelor cromatografice convenţionale este mult îmbunătăţită prin

utilizarea tehnicii HPLC. Matricea (suportul) în HPLC constă din particule sferice care sunt
mult mai mici şi mai uniforme ca dimensiune, şi mult mai strâns împachetate decât
particulele din coloanele cromatografice convenţionale. Eluentul este trecut prin coloană cu
o presiune mare (până la 400 bari). Astfel viteza, rezoluţia şi sensibilitatea sunt mult
crescute utilizând HPLC, deşi separarea se bazează pe aceleaşi principii care guvernează
cromatografia de schimb ionic, gel-filtrarea, cromatografia de afinitate, etc.

Coloanele HPLC sunt de obicei confecţionate din oţel inoxidabil, şi toate

componentele, valvele, etc, sunt realizate din materiale care rezistă la presiunile înalte
utilizate. Separarea unor macromolecule (în special proteine şi acizi nucleici) necesită, de
obicei, sisteme “biocompatibile”, în care componentele din oţel inoxidabil sunt înlocuite cu
titan, sticlă, fluoroplastice; se utilizează presiuni mai scăzute pentru a evita denaturarea,
exemplu sistemul Pharmacia FPLC.

Comparativ cu formele clasice ale cromatografiei de lichide (CH, CSS, CC), HPLC
prezintă o serie de avantaje:

• Rezoluţia şi viteza de analiză depăşesc cu mult metodele clasice;

• Coloanele HPLC pot fi reutilizate fără reîmpachetare sau regenerare;
• Reproductibilitatea este mult îmbunătăţită deoarece parametrii care afectează
eficienţa separării pot fi controlaţi îndeaproape;
• Manevrarea aparatului şi analiza datelor pot fi uşor automatizate;
• HPLC este adaptabil la proceduri preparative la scară mare;
• HPLC este utilizată pentru separarea unui număr foarte mare de biomolecule
nepolare, polare şi ionice, incluzând peptide, proteine, oligozaharide, vitamine.

Componentele unui sistem HPLC sunt prezentate în Figura 24.

 Figura 24. Componentele unui sistem HPLC

Cromatografia de gaz (CG)

CG clasică utilizează coloane de oţel cu diametrul intern de 1-2 milimetri şi cu

lungime de 2-3 metri, umplute cu particule solide, acoperite cu filmul fazei staţionare.

CG modernă utilizează coloane cromatografice capilare (diametrul intern 0,1-0,5

milimetri) cu lungime de până la 50 metri (Figura 25).

Faza staţionară este în general un polimer siliconic reticulat, depus sub formă de
film pe peretele interior al capilarei; la temperaturile de operare acesta se comportă într -o
manieră similară unui film de lichid, dar este mult mai robust.

Faza mobilă (“gazul purtător”) este de obicei azot sau heliu. Separarea selectivă se
realizează prin partiţia diferenţiată a componentelor individuale între gazul purtător şi faza
polimerică siliconică.
 Figura 25. Componentele unui sistem gaz-cromatografic

Separarea majorităţii biomoleculelor este influenţată de temperatura coloanei, care

poate să fie constantă în timpul analizei (izotermă-de obicei 50-250˚C) sau, mai adesea,
poate să crească după un program (exemplu de la 50˚C la 250˚C, crescând cu 10˚C pe
minut).

Temperatura este asigurată prin plasarea coloanei într-un cuptor termostatat.

Probele sunt injectate în “capul” coloanei printr-un sistem de injecţie conţinând un septum,
sub forma unei soluţii foarte diluate. Datorită temperaturii ridicate toate componentele
soluţiei sunt vaporizate, preluate de gazul purtător şi trecute prin coloana cromatografică
pentru separare. Ieşirea din coloană se poate monitoriza cu sistemele prezentate. Sistemele
de detecţie spectrometrice includ spectrometria de masă (CG-SM) şi spectroscopia în
infraroşu (CG-IR).

CG poate fi utilizată în cazul probelor capabile de volatilizare la temperatura de

operare a coloanei, exemplu acizi graşi cu catenă scurtă. Alte substanţe necesită modificări
chimice pentru a obţine produşi mai volatili (exemplu acizii graşi saturaţi cu catenă lungă
sunt analizaţi de obicei sub forma esterilor lor metilici în timp ce monozaharidele sunt
convertite în derivaţii lor trimetilsilil).

Aplicaţie practică

A. Cromatografia pe hârtie a aminoacizilor

Principiu

Aminoacizii dintr-un amestec se pot separa prin CH, conform metodei prezentate.
 Reactivi

1. Amestec de aminoacizi: soluţie 0,3% de histidina si fenilalanina.

2. Eluent: amestec de n-butanol, acetonă, acid acetic, apă, în raport volumetric de
3,5 : 3,5 : 1,0 : 2,0.
3. Soluţie de ninhidrină: 0,2% în n-butanol cu 1% acid acetic. Se foloseşte pentru
vizualizarea aminoacizilor migraţi.
4. Hârtie Whatman nr.1 (mijlocie lentă), tăiată în fâşii de 12 x 2,5 centimetri.

Materiale şi aparatură

• cameră cromatografică;
• pulverizator;
• sursă de aer cald;
• reşou electric sau etuvă;
• cilindru gradat, micropipetă.

Mod de lucru

În camera cromatografică se introduc 10 mililitri eluent. Se ataşează capacul. Se

agită uşor, în plan orizontal, pentru a crea o atmosferă saturată în vapori de eluent.

Pe hârtia cromatografică se trasează uşor, cu creionul, la 1,5 centimetri de la bază, o

dreaptă.

Se aplica o picătură (aprox.5 microlitri) din soluţia de aminoacizi, iar langa se aplica
si o picatura de solutie etalon de fenilalanina, utilizând micropipeta (cele 2 picaturi sa fie egal
distantate fata de marginile hartiei). Se usucă imediat hârtia cu uscătorul de păr. Se
suspendă banda de hârtie în camera cromatografică în aşa fel încât să pătrundă în eluent
circa 5 milimetri. Dreapta trasată, unde s-a depus soluţia de aminoacizi, nu are voie să
pătrundă în eluent. Se menţine hârtia în camera acoperită până când frontul solventului
ajunge la circa 2 centimetri de partea superioară a hârtiei. Se scoate hârtia din cameră. Se
marchează, cu creionul, frontul solventului. Se usucă cu uscătorul de păr. Se pulverizează
hârtia cu soluţia de ninhidrină. Se încălzeşte deasupra reşoului (sau în etuvă la 100˚C) până
apar spoturile violete ce marchează prezenţa aminoacizilor.

Calcul

Se calculează valorile Rf pentru cei doi aminoacizi. Ordinea de migrare, în funcţie de

hidrofobicitatea aminoacizilor, de la cel mai rapid la cel mai lent, este: fenilalanina si
histidina.
 Importanţă clinică

Niveluri crescute ale aminoacizilor plasmatici pot indica tulburări ereditare în

metabolismul aminoacizilor. Aminoacizii din sânge sunt filtraţi la nivelul glomerulului renal,
de aceea niveluri crescute de aminoacizi în sânge se însoţesc de o eliminare renală
crescută (aminoacidurie). Absenţa unor enzime specifice în calea de metabolizare a
aminoacizilor se exprimă sub forma aşa numitelor ”erori înnăscute de metabolism”.
Cuantificarea unuia sau mai multor dintre aceşti metaboliţi este utilă pentru diagnosticarea
acestor boli.
Cromatografia este folosită pentru dozarea aminoacizilor din plasmă, cât şi pentru
punerea în evidenţă a hiperaminoaciduriilor în cadrul erorilor înnăscute de metabolism
(cistinurii, fenilalaninurii, glicinurii, etc) sau în cadrul unor afecţiuni renale ca diabetul gluco-
aminat, nefroze, acidoza tubulară; unele avitaminoze, rahitism

Interpretarea rezultatelor

Cromatografierea pe hârtie se execută conform tehnicii prezentate anterior. Pentru

identificarea precisă a aminoacidului eluat se execută, în acelaşi timp, cromatografierea unor
soluţii etalon din respectivii aminoacizi şi se determină valorile Rf corespunzătoare. Se
compară valorile Rf ale aminoacizilor din fracţii cu aceste valori. Fracţiile care conţin
aminoacizii se păstrează.