Cromatografia= o metod fizic de separare, n care compuii de separat sunt distribuii

ntre dou faze: faza staionar i faza mobil

Cromatografia implic separarea amestecurilor pe baza diferenelor coeficientului de
distribuie a compuilor din prob ntre dou faze diferite
Coeficientul de distribuie: concentraia compusului A n faza staionar/concentraia
compusului A n faza mobil
Tipuri de cromatografie: 1. Cromatografia de lichide pe coloan
2. Cromatografia de gaze
3. Cromatografia pe strat subire
Cromatografia lichid/solid (cromatografia de adsorbie): A- faz normal
B- faz invers
Cromatografia lichid/lichid(cromatografia de partiie): A-faz normal
B- faz invers
Cromatografia de schimb ionic
Cromatografia de gel- permeaie
Faza normal: n acest tip de coloan, retenia este guvernat de ineraciunea dintre
prile polare ale fazei staionare i substana dizolvat. Ca retenia s aib loc n faza normal,
materialul trebuie s fie mai polar dect faza mobil( inndu-se cont i de prob).Mecanismul
de separare n LSC se bazeaz pe competiia compuilor din prob pentru situsurile active de pe
adsorbant( silica gel).
Faza invers: materialul este nepolar, iar solventul este polar (innd-se cont i de
prob). Retenia este rezultatul interaciunii compuilor nepolari ai substanei dizolvate i faza
staionar nepolar. Exemple de faze staionare: hidrocarburi nepolare, lichide ceroase,
hidrocarburi activate( C8, C18). Soleveni- amestecuri organice polare: ap-metanol, apacetonitril.
Suprafaa staionar solid este acoperit cu un al doilea lichid (faza staionar),
nemiscibil n faza mobil.
Excluderea mrimii: n HPLC coloana este alctuit din substane ce au anumite
dimensiuni ale porilor. Molecule mici penetreaz porii, pe cnd moleculele mari penetreaz
parial porii. Moleculele mari sunt eluate primele.
Cromatografia de gel-permeaie reprezint un mecanism de sortare a moleculelor din
soluie pe baza dimensiunilor lor. Moleculele mici sunt capabile s ptrund n mai muli pori i
deci sunt reinute mai mult timp.
Schimbul ionic: n acest tip de coloan compuii sunt separai pe baza forelor de
atracie ionic dintre molecule purttoare de grupri cu sarcin opus celor de pe faza
staionar. Separarea are loc ntre o faz mobil polar de obicei ap ce conine sruri sau
cantiti mici de alcooli i o faz staionar ce conine situsuri de fixare acide sau bazice.
Cromatografie de lichide de nalt presiune este una dintre cele mai utilizate tehnici
de identificare, cuantificare i purificare a amestecurilor de compui organici. n HPLC
compuii unui amestec sunt partiionai ntre-un adsorbant( faza staionar) i un solvent( faza
mobil).Faza staionar este alctuit din particule de dimensiuni mici incluse ntr-o coloan de
fier. Datorit dimensiunilor mici ale particulelor, presiunea este necesar pentru a accelera

trecerea fazei mobile prin faza staionar. Exist o varietate de faze staionare disponibile pt
HPLC. HPLC utilizat pentru separarea unor compui dizolvai n soluie. Instrumente HPLC:
un rezervor cu faz mobil, o pomp, un injector, o coloan de separare i un detector.Compuii
sunt separai prin injectarea probei n coloan. .
HPLC folosete o coloan ncrcat cu diferite materiale (faza staionar), o pomp ce
mpinge faza(ele) mobil(e) prin coloana i un detector care arat timpurile de retenie ale
moleculelor. Timpul de retenie depinde de interaciunea dintre faza staionar, moleculele de
analizat i solvenii utilizai.
O rafinare mai bun a metodei HPLC a dus la posibilitatea de a varia compozi ia fazei mobile
n timpul analizei; aceasta este cunoscut sub denumirea de gradient de eluie.
Metode HPLC
Cromatografia de adsorbie: -sau cromatografia solid-lichid. Faz solid este de obicei
silicagelul sau alumina ce au suprafee foarte polare. Faza mobil conine solveni mai pu ini
polari.
Cromatografia cu faz normal: Faza staionar este polar. Faza mobil este
reprezentat de un solvent nepolar precum hexan sau izopropil eter. Compusul cel mai puin
polar este eluat primul.
Cromatografia de faz invers utilizeaz o faz staionar nepolar( de asemenea ataat
sau legat de silica sau un alt suport). Solveni polari utilizai sunt apa, metanolul i
acetonitrilul. n acest tip de cromatografie compusul cel mai polar este eluat primul.
Cromatografia cu perechi de ioni- metod utilizat pentru a separa ioni. Poate separa
acizi, baze sau compui neutri.
Cromatografia de schimb ionic utilizeaz rini schimbtoare de ioni ca faz staionar.
Cromatografia de ioni separ ioni ai acizilor tari i baze. Aparatura utilizat difer de
cea utilizat la cromatografia de schimb ionic.
Mai mult de jumtate din gruprile silanol rmn nereacionate dup legarea de C18. O
metod utilizat pentru a reduce efectele acestor grupri silanol reziduale este un proces numit
end capping. Dup legarea pe C18 se utilizeaz mici grupri silan precum trimetilclorsilan
pentru a reaciona cu gruprile OH nereacionate.
Alte faze de legare: faze staionare de tip fenil prezint interaciuni slabe dipol-indus
dipol cu analii polari. Se folosesc pentru separarea unor molecule cu structuri asemntoare.
Amino-phase: cea mai polar, poate aciona ca un schimbtor slab de anioni( protonat la pH
sczut). Amino columns- retenia selectiv a compuilor aromatici
Coloanele de dioli sunt slab polare i sunt folosite n separarea pe faz normal. Dioli
sunt utili pentru probe ce conin mai muli compui cu polariti diferite i care au o reten ie
puternic pe silicagelul nemodificat.
Cel mai utilizat polimer n cromatografia cu faz invers este alctuit din polistiren
reticulat cu divinilbenzen. Principalul avantaj al utilizrii polimerilor poroi este c pot fi
utilizai n domeniul de pH 1-13 ( suporturile din silicagel tind s se dizolve la un pH mai mare
dect 9). Datorit aciditii suprafeei suporturilor de silicagel, suporturile din polimerii
reprezint o mai bun alegere n separarea compuilor bazici.
Proprietile coloanelor RP: suprafa hidrofob, forma i dimensiunile particulelor,
distribuia lor, porozitatea, dimensiunile porilor i suprafaa.
Dimensiunea particulelor: coloanele au o distribuie a dimensiunii particulelor.
Diametrul raportat al particulelor este o medie.

Mecanism RP: Analiii mai puini polari ( hidrofobi) sunt atrai ctre faza hidrofob.
Compuii hidrofobi sunt reinui mai mult timp i sunt extrai ultimii. Metanolul este un solvent
activ.
Msurtori clasice ale reteniei: factori de retenie, coeficientul de partiie, diagrame
Vant Hoff. Ofer doar informaii referitoare la cantitate.
Mecanisme propuse RP: teoria hidrofobic, teoria partiiei, teoria adsorbiei.
1. Teoria hidrofobic: -cromatografia de caviti n solvent creat prin poriunea hidrofob a
moleculei de analit.
- tensiunea de suprafa
- interaciunea funciilor polare cu analitul
- faza staionar este pasiv
2. Teoria partiiei: analitul este distribui ntre o faz mobil apoas i o faz staionar organic
-corelaiei ntre log P i retenie
- faza organica este ataat la un capt
- nu expilca efectele de selectivitate a formei
3. Teoria adsorbiei: - analiii ancoreaz pe suprafa, nu o ptrund
- interaciuni nepolare nre poriunea hidrofob a analitului i faza staionar
- interaciuni slabe: dipol-dipol, dipol-indus dipol, dipol indus-dipol indus
Parametrii importani n RP: - concentraia fazei mobile
- alegerea solventului
- pH-ul fazei mobile
- activitatea gruprilor silanol
Propritetile fazei mobile n LC:- puritate nalt
- cost rezonabil
- punct de topire ntre 20 i 50 C peste temperatura coloanei
-vscozitate sczut
- reactivitate sczut
- nemiscibil cu faza staionar
- compatibil cu detectorul
- sigur- inflamabilitate i toxicitate sczut
Solveni polari: ap>metanol> acetonitril> etanol> oxidipropionitril
Solveni nepolari: N-decan> N-hexan> N-pentan> ciclohexan
Selecia fazei mobile: k ntre 2-5 pentru doi compui n amestec
k ntre 0.5-20 pentru mai muli compui n amestec
Polaritatea analitului trebuie s se potriveasc cu polaritatea fazei staionare
Faza mobil trebuie s fie de polaritate diferit
Faza normal: solvent nepolar, faz staionar polar, compusul cel mai puin polar este extras
primul. Creterea polaritii fazei mobile conduce la scderea timpului de eluie.
Faza invers: solvent polar( metanol, acetonitril, ap), faz staionar nepolar. Compusul cel
mai polar este extras primul. Cea mai utilizat!
Sistemele de pompare- Cerine generale: - genereaz presiuni de pn la 6000 psi.
-debit de 0.1-1 ml/min
- rezisten la coroziune

a. Pompe cu piston b. Pompe cu cilindru c. Pompe pneumatice

Injectoare HPLC
Pentru a evita dipersarea volumului injectat n timpul transportului spre coloan trebuie
s utilizm un tub cu o lungime ct mai mic. Cnd se ncepe injectarea, un acumulator de aer
comprimat rotete valva, solventul se deplaseaz n coloan, iar acul injectorului este conectat
la sering. Presiunea aerului ridic acul, iar flaconul este mutat sub ac. Dup aceea acul este
cobort n flacon.
Coloanele HPLC reprezint unul dintre cele mai importante componente ale
cromatografului deoarece separarea compuilor din prob este efectuat atunci cnd compuii
strpung coloana. Aparatul de cromatografie lichid de nalt performan este realizat din
tuburi din oel inoxidabil cu un diametru de 3-5 mm i o lungime ntre 10 i 30 cm. De obicei
coloane sunt umplute cu silica gel deoarece forma particulelor, proprietile suprafeei i
structura porilor contribuie la o mai bun separare. Silicagelul este umectat la fiecare faz
mobil posibil, este inert fa de majoritatea compuilor i are o arie activ mare ce poate fi
modificat uor cu ap sau ali ageni. Poate fi utilizat pentru separarea a numeroi compui.
Criteriile de performan care afecteaz calitatea rezultatului includ: exactitatea,
precizia( reproductibilitatea i repetabilitatea), fineea, selectivitatea, liniaritatea, dinamica i
stabilitatea.
Criteriile de performan pentru economia includ: costul de achiziie, instalare i
ntreinere, timpul de analiz, factorii de siguran, costurile de funcionare- consumabilele,
gazul, pregtirea angajailor, rata de transfer( randamentul) a probei.
Detectori HLPLC: a. Generali- sunt sensibili la proprietile fazei mobile ce variaz n
prezena subst dizolvate( ex- indicele de refracie)
b. Specifici- sunt sensibili la anumite proprieti ale subst dizolvate( neposedate de faza mobilex adsorbia n UV-VIS)
c. Micti detector LC-MS
Detectori comuni: detector de indice de refracie, detector de conductivitate, detectori de difuzie
a luminii.
Detector de proprietate a analitului: detector UV, detector de fluorescen, detector
amperometric,
Detector de indice de refracie: unul dintre puini detectori universali disponibili n LC
Principiu: msoar o proprietate general a fazei mobile ce trece prn coloan- spre exemplu
indicele de refracie. Aceast proprietate se modific odat cu modificrile aprute n
compoziia fazei mobile. Prin detectarea acestei modificri subst dizolvate pot fi detectate.
Avantaje: msoar o proprietate general, aproximativ universal, semnale comparabile pt
diferii analii, detecteaz specii fr cromofori.
Dezavantaje: dependent de temperatur, sensibilitate sczut, detecteaz specii fr cromofori.
Detector de conductivitate- detector universal pt compui ionici.Msoar capacitatea
unei soluii de a conduce curentul atunci cnd este plasat ntr-un cmp electric( dependent de
numrul de ioni sau compui ionici prezeni n soluie).
I=C*E (I-curentul, C- conductivitatea, E- tria cmpului electric)
Aplicaii: orice compus ionic sau slab ionic. Aceste detector este utilizat pe scar larg n
cromatografia ionic.

Sensibilitatea: depinde de mrimea i sarcina compusului de interes. Compuii mici i puternic

ncrcai au tendina de a produce un rspuns mai mare dect compuii mari i slab ncrcai.
Limita de detecie: 10-6 M
Liniaritatea: 104fold
avantaje: msoar o proprietate general, comun pt LC de schimb ionic, detecteaz specii fr
cromofori, simplu i robust
dezavantaje: o sensibilitate destul de bun, faz mobil fr sruri sau soluii tampon.
Detector de difuzie a luminii:
Avantaje: msoar o proprietate general, aprox universal( c. nevolatili), nu detecteaz lichide,
msoar specii fr cromofori.
Dezavantaje: semnalul nu este liniar cu concetraia, sensibilitate destul de bun, faz mobil
fr sruri sau soluii tampon
Detector de absorban-UV/VIS
-msoarea capacitatea unei subsane de a absorbi lumina la o anumit lungime de und.
Absorbana este descris prin intermediul legii Lamber-Beer: A= *l*c unde -coeficient de
absorbie molar a substanei, c- concentraia, lungimea cuviei, A- absorbana luminii la o
anumit lungime de und
Design: Exist trei tipuri de detectoare UV-VIS: cu lungime de und fix sau variabil,
detector de diode.
La un detector cu lungime de und fix doar absorbana unei singure lungimi de und este
monitorizat de sistem. Aceast lungime de und este deobicei 254 nm.
La un detector cu lungime de und variabil o singur lungime de und este monitorizat la un
moment dat, dar orice lungime de und ntr-un domeniu spectral larg poate fi selectat.
Lungimile de und care pot fi monitorizate pot varia de la 190 nm pn la 900 nm.
Aplicaii: detectorul de absorbie poate fi folosit pentru a detecta orice compus care
absoarbe la lungimea de und dat. Detectorul de abosbie poate fi corelat cu un gradient de
eluie.
Sensibilitatea: Rspunsul unui detector de absorban depinde de coeficientul de
absorbie molar
Limita de detecie: 10-8M
Liniaritatea: 105 fold range
Avantaje: o proprietate general, aprox universal( trebuie s aib cromofori), potenial de a
furniza informaii calitative, simplu i robust
Dezavantaje: sensibilitate destul de bun, limitat cu lampa de Hg, scap anumii analii
Detectorul de fluorescen este un exemplu de un detector selectiv, cu limite de detecie mai
mici dect cele din IR sau UV-VIS.
F = I (1-e- l c) = I l c
F-intensitatea fluorescenei,
randament cuantic de fluorescen
I- intensitatea luminii excitate
Limita de detecie: 10-10 M
Liniaritatea: 103- 104 fold

Avantaje: msoar o proprietate selectiv, puternic selectiv, sensibilitate ridicat, poate interoga
volume mici de prob.
Dezavantaje: nu este universal i are aplicaii limitate.
Detectorul electrochimic este folosit pentru a detecta un compus supus unei reacii
electrochimice
Principiu: msoar capacitatea unei subst de a se supune fie oxidrii( pierderii de e -), fie
reducerii( ctig de e-).
Un mod in care o astfel de reactie poate fi monitorizat este prin msurarea schimbriilor n
curent sub un cmp electric constant. O alt modalitate este de a msura schimbarea produs n
cmpul electric atunci cnd un curent constant este prezent.
Aplicaii: detectoarele pot fi folosite pentru a detecta orice substan care poate fi supus
oxidrii sau reducerii.
Detectarea prin reducere: aldehide, cetone, nitrili, acizi conjugai
Detectarea prin oxidare: fenoli, peroxizi, purine,dioli
Sensibilitatea: depinde de gradul de oxidare sau reducere care se produce la un potenial dat al
electrodului.
Limita de detecie: 10-11M
Liniaritatea: 106-fold
Avantaje: msoar o anumit proprietate, f selectiv-depinde de potenialul de reducere,
sensibilitate ridicat
Dezavantaje: neuniversal, trebuie s aib electrolii n faza mobil, faza mobil trebuie s fie
apoas, fr gradient
Spectrometria de mas este una dintre cele mai versatile i mai cuprinztoare tehnici de
analiz utilizate n prezent de ctre farmaciti i biochimiti. Msoar masele moleculelor,
fragmente de molecule i atomi. Asigur detectarea ultra-sensibil, necesitnd numai civa
picomoli pentru a obine informaii cu privire la structura i masa molecular a unui compus.
n toate cazurile, energia este transferat compuilor pentru a efectua ionizarea ducnd
la formarea ionului molecular al compusului.
Spectrul de mas al fiecrui compus este unic i poate fi utilizat ca o amprent chimic,
iar mpreun cu timpul de retenie contribuie la caracterizarea compusului. Primul pas n
spectrometria de mas este convertirea moleculelor analitului n specii ionice n faz
gazoas.Energia n excess transferat moleculelor conduce la fragmentare. Analizorul separ
speciile ionice pe baza raportului mas(m)/sarcin(z). Datele sunt nregistrate i apoi
transformate ntr-un spectru de mas.
Metode ionice: -ionizarea prin impact electronic
- ionizarea chimic
-ionizarea de tip electrospray la presiune atmosferic
Tehnica HPLC este utlizat n chimie i biochimie n analiza diferitelor amestecuri de compui,
purificarea compuilor chimici, dezvoltarea unor procese pentru sinteza de compui chimici,
izolarea produilor naturali sau caracterizarea anumitor proprieti. Este de asemenea utilizat
n controlul calitii pt a asigura puritatea materialelor prime, pentru a mbunti i controla
randamentul proceselor, pt a evalua stabilitatea produselor i pt a monitoriza degradarea lor.

Mai este utilizat pentru analiza poluanilor din aer i ap, pt monitorizarea materialelor ce ar
putea periclita sigurana si sntatea sau pt monitorizarea nivelului de pesticide din mediu.