Universitatea Politehnica din Bucureşti

Facultatea de Inginerie Chimică și

Biotehnologii

SEPARAREA AMINOACIZILOR PRIN CROMATOGRAFIE ÎN

STRAT SUBȚIRE

Profesor coordonator: Student:

Conf. dr. ing. Paul Catalin BALAURE 

Maicanu Florentina Andreea

IIPCB, an III

CUPRINS
Principiul metodei.......................................................................................................................3
Reactivi, materiale și aparatură necesare....................................................................................3
Mod de lucru...............................................................................................................................4
Prelucrarea datelor......................................................................................................................4
Concluzii.....................................................................................................................................5

2
Principiul metodei
În funcție de structura chimică, aminoacizii au afinități diferite pentru cele două faze
ale sistemului, faza mobilă și faza staționară. Pe baza echilibrelor de partiție succesive,
aminoacizii se vor distribui diferit în cele două faze.

Ca și în cazul separării lipidelor prin cromatografie în strat subțire, și în cazul acestui

experiment, faza staționară este silicagelul, iar faza mobilă este un amestec de solvenți. De
asemenea, faza mobilă se deplasează ascendent. Prin urmare, aminoacizii cu afinitate mare
pentru faza mobilă migrează mai mult, iar cei cu afinitate mare pentru faza staționară
migrează puțin. La finalul experimentului, aceștia din urmă se vor găsi mai aproape de linia
de start.

Pentru a obține cromatograma la finalul experimentului este necesară evidențierea

aminoacizilor prin reacția cu ninhidrină.

La finalul experimentului, pe cromatogramă se vor observa spoturi colorate și

localizate la o anumită distanță fată de linia de start. Pentru fiecare sport se calculează factorul
de retenție:

distanța parcursă de analit

Rf=
distanța parcursă de faza mobilă

Pe baza valorilor Rf ale soluțiilor standar de aminoacizi se va putea stabili compoziția

calitativă a probei primită spre analiză.

Schimbarea compoziției calitative și cantitative a fazei mobile determină însă și

modificare valorilor Rf. Se schimbă polaritatea fazei mobile,ceea ce duce la modificarea
afinității aminoacizilor pentru cele 2 faze.

Reactivi, materiale și aparatură necesare

 Tampon fosfat de potasiu, 0,02M, pH=6,5
 Soluții 0,05 M de aminoacizi în tamponul fosfat
 Probă de analizat
 N-propanol
 Amoniac
 Etanol
 Soluție de acid acetic 1M
 Faza mobilă A: se prepară un ametec de n-propanol:amoniac în raport de 7:3
 Sticlărie: tacuri cromatografice, capilare
 Plăci de silicagel
 Aparatură : etuvă

3
Mod de lucru
În fiecare tanc cromatografic se introduce un anumit volum de fază mobilă și se
închide etanș pentru a permite saturarea atmosferei din interior cu vaporii amestecului de
solvenți.

Separat se pregătește plăca cromatografică cu dimensiunile 10x7 (cm). Este de

preferat sa nu se atingă cu degetele suprafața silicagelului depus pe plăcile cromatografice.

La una dintre extremități se trasează cu creionul o linie subțire fără să fie zgâriat
silicagelul. Aceasta ve fi linia de start unde vor fi aplicate probele. Linia de start trebuie să fie
plasată la o distanță de aproximativ 1 cm față de marginea plăcii.

Cu ajutorul unor capilare se plică la nivelul liniei de start proba de analizat și soluțiile
standard sub forma unor spoturi cu un diametru cât mai mic. Între spoturile învecinate trebuie
să fie o distanță de aproximativ 1,5-2 cm. Fiecare spot se încarcă de maxim trei ori.

După aplicarea soluției pe placa cromatografică aceasta se lasă câteva minute pentru
evaporarea solventului și se introduce în tancurile cromatografice.

Este obligatoriu ca nivelul fazei mobile din fiecare tac cromatografic să fie sub linia de
start de pe placa cromatografică. În caz contrar probele sunt spălate cu faza mobilă.

Plăca cromatografică se lasă în tancurile cromatografice până când faza mobilă ajunge
la o distanță de aproximativ 1 cm față de marginea superioară a plăcii. În acel moment se
scoate plăca, se marchează cu un creion nivelul până la care a migrat faza mobilă și apoi se
introduc în etuvă la 110 ºC pentru a facilita evaporarea excesului de fază mobilă.

După uscarea plăcii, pe suprafața acesteia se pulverizează ninhidrină. Apoi, plăca este
introdusă din nou în etuvă pentru favorizarea reacției de culoare.

În final se constată apariția spoturilor.

Prelucrarea datelor
o Se notează valorile Rf pentru fiecare spot.
o Se trec într-un tabel valorile Rf obținute pentru fiecare aminoacid. Se comentează
diferențele obținute

Valină Alanină Aspargină

D, cm 2,25 2,1 0,8
Lfază mobilă,cm 5
Rf 0,45 0,42 0,16

o Se fotografiază placa cromatografică și se analizează pozele

4
Concluzii
 Aminoacizii cu afinitate mare pentru faza mobilă migrează mai mult (alanina și
valina), iar cei cu afinitate mare pentru faza staționară migrează puțin (aspargina);
 În proba de analizat se constată ca a fost un amestec de valină și alanină;
 Factorul de retenție este mai mare cu cat distanța de migrare este mai mare.