Planul cursului

CROMATOGRAFIA PLANARĂ (pe coloana deschisa, de suprafata):

- Cromatografia pe hârtie
- Cromatografia pe strat subţire

- Cromatografia pe strat suprapresurizat

- Cromatografia planarǎ multidimensionalǎ

Avantaje:
-simple
-rapide
-economicoase
-acesibile oricarui laborator de analiza si control
-utilizeaza cantitati foarte mici de probe
-putere mare de rezolutie

1
 CROMATOGRAFIA PE HÂRTIE
PAPER CHROMATOGRAPHY (PC)
 
 Cromatografia pe hârtie este o metodă fizico-chimică de separare şi identificare a
unor amestecuri de substanţe, bazată pe repartiţia lor diferită între:
 faza staţionară - hârtia cromatograficǎ şi lichidul fixat pe ea
 fază mobilă - un solvent sau amestec de solvenţi organici şi anorganici.
 O separare cromatografică depinde în mare măsură de modul cum s-au ales cele
două faze.
 Hârtia cromatograficǎ [C6H7(OH)3]n

unitati de β–glucoza
lanturi de celuloza, M > 100000 u.a.m, intre care există un număr mare de legături de hidrogen
structura uniforma
structura fibroasa - celuloza care formează faza staţionară prezintă suprafeţe de ordinul 600 m 2/g.
structura poroasa - determina ascensiunea capilară a solventului şi separarea componenţilor.
(poate avea porozitati diferite; pentru un anumit sort de hartie cromatografica, grosimea si
porozitatea sunt uniforme)
Faza staţionară este alcătuită din faza apoasă care există întotdeauna în celuloză datorită
caracterului hidrofil şi structurii poroase a celulozei.
2
 Hârtia cromatografică obişnuită nu se poate folosi la separările de
substanţe grase, alcaloizi, proteine, etc. Pentru aceste scopuri se foloseşte
hârtia cromatograficǎ hidrofobizată sau celuloza modificată chimic .
-acilarea grupelor OH - triacetat de celuloza [C 6H7O2(OCOCH3)3]n - faza inversa
-hartie cromatografica siliconata – faza inversa

3
 Caracteristicile unor sorturi comerciale de celuloză schimbătoare de ioni

 Prin grefarea pe lanţul macromolecular al celulozei de grupări ionizabile s-a obţinut celuloza
schimbătoare de ioni, caracterizată printr-o mare capacitate de schimb. Grupările ionizabile se
găsesc pe suprafaţa reţelei macromoleculare şi din acest motiv asigură o adsorbţie mărită faţă de
proteine, acizi nucleici etc.

 Pentru separarea în bune condiţii a unor clase de substanţe se utilizeaza impregnarea fazei
stationare cu:
soluţii tampon
solventi polari, hidrofili: metanol, formamida, glicoli, glicerina, celosolv (CH 2OH-CH2-O-C2H5)
solventi nepolari, hidrofobi: arene, alcani lichizi, kerosen
o altă fază staţionară
agenţi de complexare, săruri ale metalelor grele (Ag+, Cu2+, Pb2), agenţi de precipitare, acid silicic
(pentru separările lipidelor polare, hidraţilor de carbon şi a fosfolipidelor) 4
 In separările cromatografice, ca faze mobile se folosesc: amestecuri de 2 sau mai
multi solventi sau amestecuri de solventi cu solutii de saruri sau cu solutii tampon:
Exemple de solvenţi utilizati în cromatografia pe hârtie:
 alcooli: amilic (n- şi izo-), butilic (n-, izo-, terţ-), etilic, metilic, propilic (n-, izo-)
 cetone: acetona, acetilacetona, etilizopropilcetona, metiletilcetona
 esteri: acetat de etil, formiat de etil
 eteri: eter etilic, dioxan
 acizi organici: acid butiric, acid formic, acid propionic, acid acetic
 baze organice: dietilamină, nicotină, piridină
 alţi solvenţi: tetrahidrofuran, benzen, toluen, xilen (o, m, p), ciclohexan.
 
Sisteme de faze mobile:
izopropanol-amoniac-apa eluare analiti hidrofili
n-butanol-acid acetic-apa
apa-fenol

formamida-cloroform
formamida-cloroform-benzen eluare analiti mediu-hidrofobi
formamida-benzen
formamida-benzen – ciclohexan

dimetilformamida-ciclohexan
kerosen-izopropanol 70 % eluare analiti hidrofobi
ulei de parafina-DMF-metanol-apa
5
 CLASIFICARE
 După sensul de migrare al fazei mobile:
 radială, circulară sau pe discuri
 orizontală
 ascendentă
 descendentă

 După direcţia de migrare a sistemelor:

 unidimensională
 bidimensională

6
Detectia
 Detectia dupa migrare poate fi:

 Detectia vizuala:  Detectia instrumentala:

o Detectie chimica: o Detectie densitometrica

- directa pentru compusii colorati
- dupa pulverizarea unui reactiv o Metodă adecvată - banda de
capabil sa reactioneze cu hârtie se decupează, se extrage
moleculele separate pentru a da cu un solvent adecvat şi se
substante colorate (Exemple de
reactivi: iodură de platină, verde de analizeaza: refractometric,
bromcrezol, brom - amidon - iodură spectrofotometric etc.
de potasiu, diazotare şi cuplare cu
-naftol, p-nitroanilină diazotată (în
mediu bazic), p-dimetil-
aminobenzaldehida, reactivul
Dragendorff, vapori de iod,
reactivul Marquis, reactivul Millon,
ninhidrină, permanganat de
potasiu, etc)
o Detectie fizica:
- examinare in lumina UV
7
 APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI PE HARTIE
 Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase. Ex:
 Separarea si identificarea fenobarbitalului si difenilhidantoinei din
tablete (FS: Whatman 1, FM: amoniac 10 %: apa:butanol – 70:30:100,
Detectie: sulfat de mercur (II))

 Identificarea si determinarea puritatii substanţelor

medicamentoase. Ex:
 Identificarea si determinarea puritatii ergometrinei maleat (FS: hartie
Schleicher-Schull 2043/b impreganata cu dimetil-ftalat:cloroform - 1:9,
FM: formamida: hidroxid de potasiu 0.1 N impregnat cu demetilftalat (2:8),
Detectie: imersare in paradimetilaminobenzaldehida 0.5 % in
cloroform:ciclohexan – 1:19)

 Alte exemple:
Analiza cationi anorganici
Analiza medicamente radiofarmaceutice
Identificarea gentamicinei sulfat
Identificarea vancomicinei clorhidrat
 
8
 CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBŢIRE (CSS)
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC)

 Principiul CSS - probele sunt separate prin migrarea fazei

mobile (eluantului) prin faza stationara.

 Migrarea prin capilaritate a eluantului cu traversarea

adsorbantului antrenează selectiv soluţii. În funcţie de natura
chimică:
 solutii care au energie de adsorbţie mare sunt puternic fixaţi si
sunt puţin antrenaţi de către eluant → migrează puţin.
 soluţii care au energie de adsorbţie mică - fenomenul invers.

9
 MĂRIMI FUNDAMENTALE

 Fenomenul de adsorbţie în strat subţire poate fi considerat ca o tehnică

de separare a compuşilor dintr-un amestec.
 Fiecare cromatogramă obţinută cu acelaşi adsorbant, acelaşi eluant şi în
condiţii experimentale identice prezintă acelaşi aspect : fiecare compus
migrează în acelaşi mod.
 Astfel, este posibil pentru un sistem cromatografic dat, să se
caracterizeze un solut (substanţa dizolvată) prin distanţa pe care o parcurge
în raport cu frontul de solvent.

 Distanta se poate inlocui cu timpii necesari pentru eluarea

analitului/fazei mobile.
Factorul de retentie: ≤ 1
 Pentru caracterizarea separarii se pot calcula si:

RM = log (1/Rf – 1) Rk = RM proba – RM standard

10
Etape în cromatografia pe strat subţire

11
 Pregătirea plăcilor cromatografice
 TLC
 plăcile sunt constituite dintr-un suport inert rigid (placă de sticlă) sau
flexibil, suplu (folie de aluminiu, material plastic, etc.), pe care faza
staţionară este depusă sub forma unui strat subţire cu o anumita marime
a particulelor.
 Dimensiunile placilor:
- 5 x 5 cm; - 5 x 20 cm, - 10 x 20 cm; - 20 x 20 cm.
 Grosime strat subtire:
- 1-2 mm pentru cromatografia preparativa
- 0.1-0.25 mm pentru cromatografia analitica
 Reactivare – 110 ºC, 30 minute
 distanţa de migrare: 10-15 cm

 HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography):

 dimensiuni: 10 x 10 cm sau de 10 x 5 cm
 grosimea stratului adsorbant: 100 m
 diametrul particulelor: este mult mai mic
 distanţa de migrare: 3-5 cm
 spotarea: automat; scanarea: UV-VIS sau prin fluorescenţă cu ajutorul
densitometrelor.
12
Exemple de faze staţionare:

 silicagel – mecanism de adsorbtie si de repartitie, neputandu-se determina

care este predominant
 alumina – mecanism de adsorbtie si de repartitie, neputandu-se determina
care este predominant
 pulbere de celuloza – mecanism de repartitie
 kieselgur
 poliamida
 schimbători de ioni
 geluri
 oxidul de magneziu, oxidul de bismut,
 silicaţii de calciu şi aluminiu,
 carbonaţii de calciu, magneziu, zinc,
 fosfaţii de calciu şi magneziu,
 sulfatul de calciu,
 cărbunele activ,
 polietena,
 polivinilpirolidona,
 amidonul,
13
Faze polare negrefate

Faze polare grefate

14
Faze nepolare grefate (slab polare)

 Datorită progresului fazelor de silice grefate folosite pentru HPLC, a

apãrut o gamă de plăci cu silice, având grefate structuri chimice de tip C 18,
C12, C8, C2, difenil, agenţi de complexare chiralici, destinate separării
formelor enantiomere de aminoacizi etc.
 Gama fazelor grefate este totdeauna relativ limitată, în comparaţie cu cele
disponibile pentru HPLC, dar este într-un progres continuu. Introducerea
acestor faze de silice grefate a condus la un nou interes pentru CP cu fază
inversă (Reverses Phase Chromatography –RPC).

15
 Silicagel/gel de silice/silice
(acid ortosilicic polimerizat)

16
Tip silicagel Marimea Suprafata Volumul Marimea pH
porilor nm (Ǻ) specifica (m2/g) porilor particulelor
(ml/g)
Silicagel 40 4 (40) ~ 600 0.6 63-200 6.5
Silicagel 60 6 (60) ~ 500 0.8 40-63 7.0
Silicagel 100 10 (100) ~ 360 0.8 63-200 7.0

17
Modificări chimice ale silicei
 Se introduc radicali alifatici C2-C18, grupǎri diolice, CN etc.

18
Alte modificǎri:
Legǎturi Si-C
Legǎturi Si-N

Siloxani

19
Alumina (oxid de aluminiu, Al2O3)
Proprietăţile adsorbtive au fost atribuite grupelor hidroxil
superficiale.
 Toate substanţele organice (excepţie fac hidrocarburile alifatice)
sunt adsorbite de alumină:
 compuşii neionici care au grupe donoare de protoni sunt adsorbiţi
prin legături de hidrogen
 hidrocarburile aromatice sunt adsorbite pe atomii de aluminiu prin
legăturile .
Alumina acidă şi bazică funcţionează ca schimbători de ioni.

In vederea obţinerii unor rezultate reproductibile a fost necesară o standardizare

a gradului de activare. Brockmann şi Schoder au definit 5 grade de activare în
funcţie de conţinutul de apă adsorbită. S-au ales 5 coloranţi standard (azobenzen,
p-metoxidiazobenzen, galben Sudan, roşu Sudan şi p-aminoazobenzen) şi în funcţie
de ei s-au definit gradele de activare: I, II, III, IV, V corespunzătoare la 0, 3, 6, 10 şi
15% conţinut în apă.
20
 Kieselgur

 reprezintă pământul de infuzorii ce se găseşte în natură sub formă de

zăcăminte provenind din scoici microscopice de diatomee.
 este constituit din dioxid de siliciu cristalizat (kieselsa ϋre)
 structura poroasă îi oferă posibilităţi adsorbante
 este folosit în separările cromatografice de repartiţie când este impregnat
cu substanţe hidrofile sau lipofile
 este un adsorbant inactiv deoarece are o suprafaţă specifică foarte mică
(aproximativ 1 m2/g) şi pH neutru.
 Kieselgurul folosit în cromatografia pe strat subţire este de o calitate
specială, de o puritate avansată şi cu mărimea particulelor de 10 m.
 Tipuri de kieselgur folosit în cromatografia pe strat subţire: Kieselgur G-
Merck, Celite 545-John Moville (SUA), Kieselgur G-B.D.H.

21
 Hidroxidul de magneziu

 se aseamănă în proprietăţi cu oxidul de aluminiu, faţă de care prezintă unele

avantaje şi dezavantaje:

 Avantaje:
 capacitate de adsorbţie mai mare
 mai puţin sensibil la activare
 straturile au o bună rezistenţă mecanică chiar fără liant.

 Dezavantaje:
 reacţionează cu iodul împiedicând astfel identificarea unor substanţe
 este mai uşor deshidratat de către solvenţii anhidri
 este solubil în alcool etilic.

 Preparate de hidroxid de magneziu mai des utilizate: Sea Sorb-43- Fischer;

Magnesia-West Vaco; hidroxid de magneziu Fischer.

Silicatul de magneziu

 principalele preparate din silicat de magneziu: silicat de magneziu - Woelm;

adsorbosil-M-1-A.S.L.(A.D.M.-1), adsorbosil M-2-A.S.L. (A.D.M.-2), silicat de magneziu-
M-1-Bio-Rad. Lab. (SUA).
 se utilizează într-o formă alcalină cu pH = 9,8 şi o formă neutră cu pH = 7,5.
  22
 Pulberea de celuloză
 Celuloza se caracterizează prin:
 un numar foarte redus de grupe OH libere, acestea fiind antrenate în
legături de hidrogen care unesc diferite agregate structurale între ele.
 un numar mare de canale şi goluri în care se pot adsorbi uşor solvenţi
polari capabili de a diminua legăturile de hidrogen sau de a forma la rândul
lor legături de hidrogen cu grupele OH. Are loc o lărgire a canalelor ceea ce
duce la creşterea capacităţii de pătrundere a solvenţilor şi a formării fazelor
staţionare lichide în acest suport.
 calităţi excelente de suport pentru cromatografia de repartiţie lichid -
lichid datorita capacitatii mari de a reţine apa şi solvenţii polari.

 Preparate din celuloză: pulbere de celuloză-D.O.-Camag, pulbere de

celuloză-D.F.O.-Camag, pulbere de celuloză 65-Schleicher-Schull, Celex
D(DEAE)-Bio Rad. Lab. (SUA), Celuloza ECTEOLA 67-Schleicher-Schull,
Selectacel CM 68-Schleicher-Schull, Celuloză-CM-Serva, Celuloza M.N.-
300,300 G, Celuloza M.N.-300-PEI (schimbător anionic), Celuloza M.N-300-
Poly-P (schimbător anionic).

23
 Poliamida (-CO-NH-)
 Este un polimer sintetic obţinut prin polimerizarea lactamelor sau
policondensarea acizilor graşi cu amine alifatice.
 Grupele C=O şi NH ale poliamidei din interiorul polimerului formează
legături de hidrogen prin intermediul cărora lanţurile sunt legate între ele.
Aceleaşi grupe de la suprafaţa polimerului rămân libere şi joacă un rol
important în adsorbţia produşilor care trebuie separaţi.
 O poliamidă folosită în cromatografia planară este Poliamida 6 (6(poli-[ -
aminocaprolactama]) cu o granulaţie de 5-20 m.
 Poliamida este folosită cu succes în separarea compuşilor cu structură
fenolică. Aceştia sunt relativ puternic adsorbiţi datorită legăturilor de
hidrogen care se pot forma între fenoli, ca donori de protoni şi grupa C=O
amidică ca grupă acceptoare de protoni. Substanţele care au grupe
acceptoare de protoni pot fi mai slab adsorbite prin formarea de legături de
hidrogen cu grupa NH amidică ce funcţionează ca grupă donoare de protoni.
 Preparate de poliamidă: poliamidă M.N.; poliamidă Merck.

24
 Sefadexul

 Este dextran de origine bacteriană caracterizat prin punţile

transversale de 1, 3 - gliceril - ester.
 Se folosesc diferite tipuri de sefadex (mai ales site moleculare), notate
G10, G25, G75, G100, G200, care diferă între ele prin gradul de polimerizare şi
prin numărul punţilor transversale. Numărul mare de legături
transversale duce la obţinerea unor ochiuri cu diametrul mic, ceea ce
conferă proprietăţi selective în separarea substanţelor cu moleculă mare
sau mică. Sefadexul se foloseşte în cromatografia pe strat subţire pentru
încercări preliminare şi orientative pentru transpunerea separărilor pe
coloană.
 Tipuri de sefadex utilizate mai des: Sephadex G-25; Sephadex G-50;
Sephadex G-75; Sephadex G-100; Sephadex G-200.
Se cunosc sefadexuri modificate chimic ce funcţionează pe principiul
schimbătorilor de ioni cu mărimea particulelor cuprinsă între 20-300 .

25
FAZE MOBILE

 Solvenţii utilizaţi în cromatografia planară, clasaţi funcţie de forţa

eluotropă faţă de n-hexan.

 pentru optimizare se pot

adauga acizi sau baze

26
Depunerea eşantionului (spotarea)

clasică – proba (10 -50 μl, 1 %) este depusă cu ajutorul unor capilare,
micropipete, microseringi, la o distanţă, în general de 2 cm de extremitatea
plăcii, în punct sau în bandă. Pentru a obține spoturi optime, eșantionul
poate fi aplicat în etape, după fiecare aplicare lăsând un timp de uscare.
de înaltă performanţă - se utilizează aparatele semi- sau automate de
spotare a probei.

 Probele de analiti se dizolva in solventi cat mai putin polari si cat mai
volatili.

27
Developarea plăcilor

Placa este plasată într-o cuvă (bac) de developare, conţinând solventul (sau
amestecul de solvenţi) ce constituie faza mobilă.
- migrare front de solvent – 10-15 cm

 Se constată experimental că, relaţia între distanţa parcursă de către

frontul de solvent şi timp este direct proportionala.
 Migrarea analitilor se face sub actiunea fazei mobile, prin capilaritate.
28
 Influenţa fazei gazoase asupra vitezei ascensiunii în capilare

 Legea de mai sus nu este respectată, când cuva de developare are

dimensiuni mult mai mari decât cele ale plăcii. Aceasta se datorează
faptului că, o parte a fazei este în contact cu atmosfera cuvei.

 Influenţa fazei gazoase se manifestă in mai multe moduri:

 evaporarea solventului
 adsorbţia vaporilor solventului de către stratul uscat

 Aceste 2 fenomene au loc concomitent. Atenuarea unuia din aceste

efecte nu se poate controla mai ales când e vorba de amestecuri de solvenţi.

 O placă de silicagel uscată absoarbe 10 % apã din greutatea sa (când

este situată în atmosfera ambiantă).

 Singura soluţie constă în a reproduce exact toate operaţiunile efectuate

în timpul unei cromatografieri.
 Pentru evitarea influenţei vaporilor solvenţilor, se utilizeazã cuve
„sandwich”: O placă de suport inert (sticlă etc.) este aşezată paralel la o
distanţă de câţiva mm faţă de placa cu solutul de analizat; ca urmare a
căldurii de adsorbţie se evită transformarea solvenţilor volatili în picături.
29
 METODE DE DEVELOPARE ÎN CROMATOGRAFIA PLANARA
 Developarea liniară
 ascendenta/descendenta
 orizontala
or - solventul ajunge din 2 părţi opuse ale plăcii printr-o fantă capilară.
Procesul de developare se opreşte când cele 2 fronturi se întâlnesc. Avantajul acestui
sistem este că, permite ocuparea totală a stratului de adsorbant şi dublarea numărului
de eşantioane pe care le putem analiza.
Developarea circular/radiala
faza staţionară este dispusă orizontal, faza mobilă ajunge până la centrul plăcii şi se
distribuie uniform prin capilaritate, ceea ce produce un spot circular care creşte dacă
se continuă alimentarea solventului.
Developarea anticirculară
faza mobila migreazǎ de la periferie spre centrul plăcii. Practic, un canal foarte strâmt
înconjurǎ placa, este umplut de faza mobilǎ şi transferul pe strat este realizat prin
capilaritate.

Sisteme cu flux forţat (la presiune)

Sistemul caută să împrospăteze capilaritatea şi în acest fel sã domine faza mobilă.
Scopul imediat este câştigarea de timp şi de a ajunge la un sistem de cvasicoloană.

Utilizarea forţei centrifuge

 Migrarea solventului este în funcţie de viteza de alimentare a fazei staţionare.
 Viteza maximă permisã este definită de cantitatea de lichid ce poate alimenta stratul
fără a inunda suprafaţa.
30
 DETECŢIA
ANALIZA CALITATIVA – separare, identificare, determinarea puritatii

-Identificare - utilizare de solutii etalon

-Puritate – trebuie sa se obtina un singur spot cu o anumita faza mobile, aceiasi intotdeauna,
pentru care sa se obtina o valoare Rf constanta pentru experiente efectuate in conditii standardizate

1. Examinarea placii cromatografice in UV (254, 366 nm)

 Lumina UV permite vizualizarea substanţelor fluorescente atunci când ele sunt iluminate la
aceste lungimi de undă.
 derivatizare analit inaintea cromatografierii

 Pentru facilitarea detectării substantelor nefluorescente in UV se pot amesteca cu stratul de

adsorbant:
un indicator fluorescent - poate fi o sare anorganică ce dă plăcii o culoare galbenă (acetat de
uranil) sau galben verzuie (silicat de zinc), rodamina B, dicloro-2,7-fluoresceina . Cea mai utilizată
este o sulfură mixtă de zinc şi cadmiu fluorescent la 254 nm de unde şi denumirea de F 254. Alte
săruri sunt în general fluorescente la 366 nm (sarea de sodiu a 5,8,10-trisulfonat-hidroxi-3-piren).
Compuşii apar sub formă de pete pe fondul luminos prin diminuarea fluorescenţei statului

2. Examinarea placii cromatografice in Vis

substante colorate
derivatizare analit inaintea cromatografierii
utilizarea unei soluţii de eluant în care este dizolvat reactivul. Ex: ninhidrina pentru detectarea
acizilor aminaţi, fluorescamina pentru amine biogenice şi proteine.

31
 Amestecarea stratulului de adsorbant cu:
 diversi reactivi:
- utilizarea unei sǎri de zirconiu permite detectarea unor estrogeni
- agenti complexanti chelatanti: EDTA, citrati – tetraciclina
- acid boric – separare izomeri
- azotat de argint – hidrocarburi etilenice

 Derivatizare analit după cromatografiere:

 expunerea placii la vapori de iod – pete brun roscate (procesul de
adsorbtie a vaporilor de iod pe compusii organici este un proces
reversibil)
 pulverizarea de solutii caustice, urmata de incalzirea la 110 0C sau de
reactivi diversi, formand compusi colorati; Exemple:
- acid sulfuric (R), acid fosforic, bicromat/permanganat de potasiu in
solutie sulfurica – pentru alcaloizi, steroizi, zaharuri, aminoacizi
- tetraiodomercuriatul de potasiu, solutie de iod in iodura de potasiu,
sulfat de ceriu, acid picric, acid picrolonic – pentru benzodiazepine
- fluoresceina, eozina, ninhidrina - antibiotice

32
ANALIZA CANTITATIVA
1. dupa razuirea spotului de pe cromatoplaca, dizolvarea componentei intr-un
solvent convenabil si masurarea absorbantei spectrofotometric.
2. masurare densitometrica - cu ajutorul detectorilor densitometrici
(fotodensitometre): scannere care măsoară intensitatea luminii absorbite sau
reflectate de spoturile cromatografice. Intensitatea acestora se înregistrează sub
formă de curbă care se manifestă sub formă de picuri a căror arie se foloseşte
pentru calcularea concentraţiei.

1. lampi, 2. lentile de intrare, 3. fanta intrare monocromator, 4. retea, 5. si 8. oglinda, 6. disc cu

fante, 7. sistem de lentile de focalizare, 9. separator de radiatie, 10. fotomultiplicator de
referinta, 11. placa cromatografica, 12. fotomultiplicator de masurare, 13. fotodioda 33
Masurare densitometrica prin:
 reflexie (reflectanta)
•se bazează pe dispersia luminii incidente de către analitul din spot
•dispersia luminii este independenta de grosimea stratului subtire
•este importanta daca spotul este net diferentiat de suport, dpdv spectral
•exactitatea şi precizia depind de: forma şi dimensiunile spotului, de uniformitatea
developării
 transmisie (transmitanta)
•dă cel mai nefavorabil răspuns semnal/zgomot (datorat neregularitatilor stratului:
variatia grosimii si dimensiunea particulelor diferita)
•nu se foloseşte < 320 nm
 emisie fluorescenta
•cele mai selective şi sensibile măsurători
•curbă de calibrare liniară
•semnalul integrat este independent de forma spotului
•de preferat, daca este posibil
 stingerea (extinctia) fluorescentei
•se aplică pentru analiţii care absorb ȋn UV, dar nu au fluorescenţă proprie
•stratul subtire este fluorescent
•se masoara scaderea intensitatii fluorescentei pana la extinctia ei
•semnalul integrat depinde de forma spotului

34
 APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI PE STRAT SUBTIRE

 Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase

 Separarea si identificarea acidului acetilsalicilic, paracetamolului si
cafeinei din comprimate
-Faza stationara: Silica gel 60 F254
-Faza mobila: acetat de etil
-Detectie: 254 nm
-Rf aspirina = 0.76, Rf paracetamol = 0.53, Rf cafeina = 0.25, Rf proba 4 =
0.23; 0.52; 0.90

1 – acid acetilsalicilic
  2 – paracetamol
3 – cafeina
4 – amestec

35
 Separarea si identificarea ibuprofenului si a cafeinei din comprimate
- Faza stationara: Silica gel 60 F254
- Faza mobila: acetat de etil:etanol:acid acetic (25:1:1)
- Detectie: 254 nm
- Rf ibuprofen = 0.91, Rf cafeina = 0.23, Rfproba = 0.24; 0.93
 

1 – ibuprofen
2 – cafeina
3 - amestec

 Alte exemple de separare, identificare si determinare cantitativa a

principiilor active din forme farmaceutice:
 Acid acetilsalicilic, fenacetina si cafeinei din comprimate
 Dansil-aminoacizi (FS: silicagel, FM: cloroform-metanol-acetat de etil si FS:
RPC18F254, FM: metanol-apa, Detectie: fluorescenta la 366 nm)
 Fenotizine (FS: kieselgur, FM: eter de petrol+dietilamina amestec saturat in
fenoxietanol, Detectie: UV la 365 nm)
 Piroxicam (FS: silicagel, FM: acid acetic/toluen, Detectie: UV la 254 nm)
36
 Alte aplicatii:

 stabilirea conditiilor optime pentru separarea prin HPLC

 determinarea rapida a puritatii produselor farmaceutice (in laboratoarele de

analiza si control din industria farmaceutica)

 determinarea unor compusi biochimici si biologici (in laboratoare medicale/clinice)

 separare de ioni anorganici, complecsi organo-metalici, compusi organici (microg →

g)
 Separare amestec analgezice: acid ascorbic, cafeina, acetaminofen, FS: silicagel
60F254, FM: diclormetan-acetat de etil-etanol si FS: RP 18F254, FM: metanol-
apa-acid formic)
 Separare compusi anabolici: metiltestosteron, estradiol, estradiol benzoat,
progesteron, estradiol valerat, testosteron propionat – FS: silicagel, FM: n-hexan-
eter etilic-diclormetan si FS: RP 18F254, FM etanol-metanol-apa)

 Aplicatii HPTLC:
 determinarea hidrocortizonului si cincocainei din unguent
 determinarea trimetoprimului si sulfametoxazolului din comprimate de
cotrimoxazol

37
 CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE SUPRAPRESURIZAT
OVERPRESSURED LAYER CHROMATOGRAPHY( OPTLC)

 Metoda constă în introducerea unei plăci cromatografice într-o incintă

închisă sub presiune. Placa este acoperită de o membrană flexibilă. Odată
închis capacul aparatului, se aplicǎ o presiune asupra membranei de 1,2
Mpa-2,5 MPa.

 Faza mobilă este forţată să traverseze stratul subţire. Omogenitatea şi

liniaritatea scurgerii solventului sunt asigurate pe toată lărgimea plăcii.
Frontul solventului avansează cu o viteză dependentǎ de debitul pompei
aleasǎ de operator.
 Se mareste viteza de migrare
 Presiunea necesară pentru a păstra constant debitul unei faze mobile
creşte cu distanţa migrării.
Aplicaţii:
determinarea trans-veratrolului
 determinarea aflatoxinelor
 analiza carotenoidelor din piperul roşu
 analiza glicozidelor digitalice.
38
CROMATOGRAFIA PLANARǍ MULTIDIMENSIONALĂ

 2D CP ţintă sau selectivă

 2D CP modulată

39
 CP cuplare-straturi  Combinare MD-PC

40