PLANUL CURSULUI

Analiza termica a medicamentelor

- Analiza gravimetrica
- Analiza termogravimetrica
- Analiza termica diferentiala
- Calorimetria prin scanare diferentiala

Metode cromatografice
- Clasificarea metodelor cromatografice
- Parametrii cromatografici
- Eficienta separarii
- Izoterme de distributie
- Tehnici de elutie

1
 ANALIZA TERMICĂ A MEDICAMENTELOR
 Analiza termică cuprinde un grup de tehnici în care se monitorizează
diferenţele ce se produc în unele dintre proprietăţile fizice si chimice ale
substanţelor atunci când sunt supuse unui program controlat de
temperatură, prin raportarea la etaloane sau substanţe de referinţă.

 Exemple de metode termoanalitice:

 Analiza gravimetrica
 Analiza termogravimetrica
 Analiza termica diferentiala
 Calorimetria prin scanare diferentiala
 Analiza termomecanica

2
 ANALIZA GRAVIMETRICĂ

 Metodele gravimetrice se bazează pe separarea substanţei de analizat

sub forma unui compus foarte greu solubil, cu o compoziţie bine
definită, cunoscută şi care, după ce a fost adus într-o formă stabilă, se
cântăreşte.

 Condiţiile reacţiilor de precipitare:

 să fie totale
 să rezulte produşi cu o solubilitate cât mai mică, cu o compoziţie
cunoscută şi bine definită
 să se desfăşoare cu o viteză cât mai mare
 precipitarea să nu fie însoţită de fenomene secundare
 compuşii rezultaţi în urma precipitării să poată fi aduşi prin prelucrări
adecvate la compoziţii stabile, cunoscute şi reproductibile.

3
 Operaţiile necesare unei analize gravimetrice:
 pregătirea materialului pentru analiză
 cântărirea probelor
 dizolvarea substanţelor
 precipitarea
 separarea
 purificarea
 uscarea
 calcinarea
 cântărirea precipitatelor
 calculele şi interpretarea rezultatelor.

 Exactitatea rezultatelor obţinute în analiza gravimetrică ţine

de performanţa instrumentelor de măsură. S-au elaborat astfel de
metode:
 semimicrogravimetrice (10-100 mg)
 microgravimetrice (0,01-10 mg)
 ultramicrogravimetrice (sub 0,01 mg).

4
ANALIZA TERMOGRAVIMETRICĂ, THERMOGRAVIMETRY (TG),
THERMOGRAVIMETRIC ANALYSIS (TGA),
THERMAL GRAVIMETRIC ANALYSIS
Principii generale
 Termogravimetria se bazează pe înregistrarea variaţiei masei unei
substanţe date în funcţie de:
 temperatura de încălzire
 timp

 Pot fi analizate: materiale anorganice, metale, polimeri, plastic,

ceramică, sticlă, materiale compuse.
 Intervalul de temperatură: 25-900o C, max 1000o C
 Cantitatea de probă utilizată: 1-150 mg
 Sensibilitatea metodei: 0.01 mg.
 Se poate asocia: cu un spectrometru de masă pentru identificarea şi
măsurarea vaporilor generaţi, cu o sensibilitate mai mare decât dacă
cele 2 metode s-ar folosi separat.
 Probele: pot fi analizate sub formă de pulbere sau fragmente mici, astfel
încât temperatura din interiorul probei să rămână apropiată de
temperatura gazului.

5
 APARATURA
Analizor termogravimetric

Balanta percepe deplasarea parghiei de la pozitia de echilibru cu ajutorul unei lampi si a unei
celule fotoelectrice . Compensarea se face electromagnetic, iar modificarea curentului este
proportionala cu modificarea masei.

Înregistrarea rezultatelor
 Se obţin curbe care permit aducerea unui solid la temperaturi
determinate şi urmărirea:
 variaţiei masei funcţie de timp: m = f(t)
 variaţiei masei funcţie de temperatura de încălzire: m = f(T).
6
 Curbe la temperaturi variabile
 Variind liniar temperatura în funcţie de timp se obţine curba
m = f(T).

 În figura este reprezentat graficul curbei obţinute când este stabilit un

prim echilibru la temperatura T < T1 şi când apare un al doilea echilibru
la T > T1. Linia plină reprezintă curba dacă se aşteaptă la fiecare
temperatură un anumit timp pentru atingerea echilibrului (obţinerea
unui compus cu o compoziţie unitară). Liniile punctate reprezintă
curbele obţinute în mod real, dacă se ridică temperatura cu vitezele
crescânde v1, v2, v3.

7
 Curbe de temperatură constantă
 Aceste curbe se obţin astfel: încălzind o substanţă la temperaturi diferite
(T1, T2, ....), la temperatura T1 se va atinge un prim echilibru după timpul
t1 şi pe curbă se va înscrie un palier orizontal. Incălzind aceeaşi
substanţă la temperatura T2 se atinge un al doilea echilibru (înscris tot
ca palier orizontal) după un timp t2.

 Astfel se determină condiţiile în care un precipitat sau o substanţă

trebuie să fie uscat sau calcinat pentru obţinerea în final a unui compus
cu o compoziţie unitară şi bine cunoscută. 8
Interpretarea curbelor termogravimetrice
(termoliza, TG)

Curbe de termoliza

Curba termogravimetrica (TG) si

curba termogravimetrica derivata (DTG)

9
 APLICAŢIILE ANALIZEI TERMOGRAVIMETRICE

 Măsurarea stabilităţii termice

 Determinarea purităţii compuşilor minerali, anorganici sau organici
 Identificarea materialelor organice prin măsurarea temperaturii de
scindare a legăturilor în atmosferă inertă sau măsurarea temperaturii
de oxidare în aer sau oxigen
 Determinarea temperaturii Curie a tranziţiilor magnetice
 Analize cantitative
- determinarea modificării masei în urma reacţiilor de descompunere
- măsurarea vitezei de evaporare, măsurarea vaporilor emişi de
amestecurile lichide
 determinarea conţinutului în substanţe anorganice sau organice în
diferite materiale

10
 Studierea stabilităţii termice a substanţelor medicamentoase

 Exemplu: teofilina
- pierdere în greutate de 9.3 % în
intervalul 60 - 80 0C, datorat
deshidratării

11
11
 Exemplu: telmisartan

Curbele TG şi DTG pentru telmisartan

12
Descompunerea termică a telmisartanului
 Identificarea unor excipienţi ȋntrebuinţaţi la condiţionarea
unor forme farmaceutice

Curbele termogravimetrice ale

α-lactozei monohidrat, α-
lactozei şi a β-lactozei

13
13
 Determinarea conţinutului unor pulberi
 Descompunerea oxalatului de calciu monohidrat

14
 ANALIZA TERMICǍ DIFERENTIALǍ (ATD)
DIFFERENTIAL THERMAL ANALYSIS (DTA)

Principii generale

 Prin încălzirea unei substanţe, odată cu schimbările fizice şi chimice, se

produce şi o absorbţie sau o degajare de căldură. Se spune că are loc o
variaţie a temperaturii în masa substanţei.

 Măsurarea variaţiei de temperatură in masa substantei se face cu

ajutorul analizei termice diferenţiale.

 ATD reprezintă o tehnică de înregistrare a diferenţei de temperatură

dintre probă şi un martor, atunci când cele 2 substanţe sunt supuse
aceluiasi regim de temperaturǎ controlat.

15
 APARATURA
 Metoda utilizată pe scară largă pentru caracterizarea diverselor
categorii de substanţe constă în: proba de analizat se încălzeşte în
comparaţie cu o masă identică dintr-o substanţă inertă; se înregistrează
diferenţa de temperatură din cursul încălzirii cu ajutorul unui
termocuplu.

16
O celulă ATD conţine:
- Termocuplu pentru probă,
termocuplu pentru martor, un
bloc ceramic sau metalic
- Cuptor
- Programator pentru
temperatură
- Sistem de înregistrare

Înregistrarea rezultatelor
 Diferenţa de temperatură dintre cele două substanţe va fi nulă dacă nu
are loc nici un fenomen fizic sau chimic.
 Orice proces chimic care ar avea loc se produce cu degajare sau
absorbţie de căldură. Ca urmare, apare o diferenţă de temperatură între
cele două probe, ceea ce va determina o deviere faţă de linia de zero,
permiţând astfel să se constate natura procesului termic care se
produce: exoterm (+) sau endoterm (-).

17
Curbe ATD

18
 APLICAŢIILE ANALIZEI TERMODIFERENŢIALE

 Tehnica “fingerprinting” furnizează informaţii referitoare la reacţii

chimice, transformări de fază, modificări structurale ce se pot petrece pe
parcursul încălzirii sau răcirii unei probe, cu scopul identificării acesteia.

 Ex. - teofilina

 Curbele ATD ale calculilor urinari

19
 Identificarea transformărilor de fază şi a modificărilor structurale

Curba ATD a cilazaprilului

Descompunerea termică a cilazaprilului 20

20
 Interacţiunea medicament-excipient
Ex: formarea compusului de incluziune clorhidrat de berberină–HP-β-
ciclodextrina

Curbele ATD pentru clorhidrat de berberină (A),

amestec fizic (B),
HP-β-CD (C) şi
complex de incluziune (D)
21
21
 S-au construit aparate care înregistrează concomitent cele trei curbe,
arătând atât modificările de masă cât şi variaţiile de temperatur ǎ.

Se constatǎ:
 un efect exotermic la 127o şi
161o C,
 o descompunere exotermica la
400o C cu o pierdere de masa de
89,1%.

 Corelând datele furnizate de cele trei curbe (TG, DTG, ATD) se pot trage
următoarele concluzii:
 dacă curbele TG şi DTG nu arată modificări şi numai curba ATD arată
schimbări, substanţa a suferit fie un proces fizic, fie un proces chimic fără
variaţia masei
 dacă toate curbele arată modificări şi în final prezintă paliere orizontale
înseamnă că au loc transformări cu variaţii ale masei, iar în final s-au
obţinut produşi stabili. 22
 CALORIMETRIA PRIN SCANARE DIFERENŢIALĂ
DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY (DSC)

Principii generale
 Calorimetria prin scanare diferenţialǎ (DSC) măsoară cantitatea de căldură
care trebuie introdusă sau îndepărtată din proba de analizat, pentru a o
menţine la aceiaşi temperatură cu o substanţă de referinţǎ inertă, în timp
ce temperatura incintei în care se găseşte proba şi martorul creşte
progresiv.

 Principiul de bază al acestei tehnici este acela că, atunci când proba
suferă o transformare fizică, căldura va trebui să treacă prin probă, apoi
să fie menţinută la aceiaşi temperatură ca martorul. În funcţie de
proces, endoterm sau exoterm, prin probă va trece o cantitate de
căldură mai mare sau mai mică:
 Dacă o probă solidă se topeşte, va necesita o cantitate mai mare de
căldură pentru a creşte temperatura la acelaşi nivel cu cea a
martorului. Aceasta se datorează absorbţiei căldurii de către probă, ceea
se petrece în tranziţia de fază endotermă din solid în lichid.
 Când proba suferă un proces exoterm (cristalizare) este necesară o
cantitate de căldură mai mica pentru a creşte temperatura probei.

23
 PROCEDEE

 DSC prin flux de căldură, flux termic (Heat Flux DSC)

 DSC prin compensarea energiei (Power Compensated DSC)

Heat Flux DSC Power Compensated DSC

24
 DSC prin flux termic
 Proba şi martorul se află in aceiaşi
incintă, aşezate pe platforme situate pe
suprafaţa unui disc de constantan. Sub
fiecare platformă există un disc de
chromel. Legătura dintre aceste două
aliaje formează un termocuplu
chromel-constantan.
 Temperatura este monitorizată
printr-un monocuplu chromel-
aluminiu.
 Se masoara diferenta de temperatura
intre cele 2 creuzete, iar prin calibrare
aceasta diferenta de temperatura se
converteste in raportul dq/dt.
DSC prin compensarea energiei
 Se utilizeaza 2 incalzitoare pentru
monitorizarea vitezelor de incalzire
individuale in cele 2 cuptoare Atât proba
cât şi martorul sunt menţinute la aceiaşi
temperatură, monitorizând consumul de
electricitate de la încǎlzirea lor.
Proba şi martorul sunt plasate deasupra
unui încălzitor şi temperaturile sunt
monotorizate utilizând senzori electronici de
temperatură plasaţi imediat sub probe. În
general, se utilizează termometre cu
rezistenţă de platinorită.
Se masoara energia de compensare
necesara pentru asigurarea temperaturilor
egale intre cele 2 creuzete.
25
  Se reprezintă grafic fluxul de
caldura in funcţie de temperatura sau
timp.
 Dacă proba de analizat nu suferă o
transformare fizico-chimică sau o
tranziţie termica, semnalul DSC este
liniar.

 Rezultatele sunt exprimate prin curba

de încălzire/rǎcire, care poate fi folosită
pentru calcularea entalpiei tranziţiilor.
Entalpia se calculează după formula:

unde:
H = entalpia tranziţiei
K = constanta calorimetrică
A = aria de sub curbă.

26
 APLICAŢIILE CALORIMETRIEI PRIN
SCANARE DIFERENŢIALǍ

 Studierea transformările fizico chimice

Tranziţiile “Glass”
 În sens comun, termenul “glass” se refera la solidele amorfe transparente,
tari şi fragile.
 In sens ştiinţific, sensul de “glass” este frecvent extins la toate corpurile
solide amorfe (şi topituri care cu uşurinţă formează solizi amorfi).

 Definiţia standard de “glass” (solid

sticlos) - faza solidă se formeaza prin
răcirea rapidă a substantei topite.

 Temperatura de tranziţie “Glass”, Tg ,

este temperatura la care solidul amorf
devine fragil la răcire sau moale la
încălzire.
27
Topirea şi cristalizarea

28
Transformările fizico chimice ce pot fi evaluate prin tehnica DSC

29
 Determinarea punctului de topire, polimorfismului

Substanţe medicamentoase ce se pot detecta prin valoarea punctului de topire,

determinat prin DSC

Substanţă pt Viteza de Interval de pt 0C Farmacopeea Observaţii:

determinat ȋncălzire temperatură Farmacopee care citează - puritate
DSC 0C 0
C/minn necesar 0C - polimorfism
- descompunere
Acetaminofen 168.6 10 168-172 - USP -
Acid ascorbic 192 20 190-192 - USP -
Aspartam 246-247 236 USP polimorfism
Cafeină 236 2.5 235-237.5 USP 99.90 %
236.4 5
236.2 10
236.9 2
Cloramfenicol 150.6 10 149-153 148.9 USP 99.79 %
150.6 2
Haloperidol 150.9 2 147-152 150.8 USP 99.30 %
147-151 BP
Nifedipin 171.4 2.5 171-175 172.3 USP 99.70 %
Paracetamol 168.9 2 168-172 - USP 99.50 %
Progesteronă 130 5 126-131 - USP 99.80 %
polimorfism
30
30
 Determinarea formelor polimorfe ale
carbamazepinei

 Analize calitative: amprenta digitală a mineralelor, polimerilor şi

argilelor.

31
  Determinarea structurilor

 descompunerea
termică a unor
substanţe
chimioterapeutice

Curbele TG/DTG şi DSC ale unor substanţe chimioterapeutice: (a) trimetoprim, (b)
sulfametoxazol, (c) ampicilină, (d) clorhidrat de tetraciclină, (e) rifampicină, (f)
trimetoprim-sulfametoxazol
32
32
 Interacţiunea medicament-excipient

Ex: formarea compusului de incluziune aciclovir-β-ciclodextrina

Termogramele DSC şi TG
ale:
aciclovirului (1),
amestecului fizic (2),
β-ciclodextrinei (3),
compusului de incluziune (4)

DSC TG

33
33
Ex: formarea compusului de incluziune trimetoprim-β-
trimetoprim
ciclodextrina

 pic corespunzător topirii

trimetoprimului la 200 0C
 picul corespunzător topirii
β-ciclodextrinei la 85 0C.

 Evaluarea amestecului fizic

demonstrează prezenţa
celor două picuri, spre
deosebire de compuşii de
incluziune la care picul de
topire al trimetoprimului
dispare, datorită Termograma DSC pentru
încapsulării I) trimetoprim,
medicamentului în
cavitatea internă a II) β-ciclodextrină,
ciclodextrinei. III) amestec fizic,
IV) complex

34
 METODE CROMATOGRAFICE
Istoric
 Friedlieb Ferdinand Runge (1795 - 1867)
farmacist şi chimist - separări pe hârtie de filtru
"Der Bildungstrieb der Stoffe" (1855)

 Mihail Semenovici Tswett (1872 - 1919) botanist rus

1903: separarea componentelor pe coloana
FS: Al2O3 (umplutură polară)
FM: eter de petrol (eluent nepolar)
propune termenul de "Cromatografie"

 Reichstein & van Euw (1938): elutie cromatografica

 Martin & Synge (1941): cromatografie de repartitie pe coloana – premiul
Nobel pentru chimie
 Egon Stahl (1956): bazele cromatografiei în strat subţire
 Cremer & Prior: cromatografie de gaz-solid
 Martin & James (1952): cromatografie de gaz-lichid
 Golay (1959): cromatografia de gaze pe coloane capilare
 Giddings & Kirkland (1968): cromatografia de lichide de inalta performanta

35
 Proba

Faza stationara Faza mobila

 Cromatografia cuprinde o serie de metode de analiză bazate pe separarea
componenţilor unei probe, prin migrarea lor diferenţiată între două faze
dintre care una este staţionară, iar cealaltă mobilă.

 Migrarea diferenţiată este o consecinţă a vitezelor diferite cu care

componenţii amestecului antrenaţi de faza mobilă se deplasează de-alungul
fazei staţionare în coloana cromatografică sau un echivalent al acesteia:
hârtia cromatografică sau stratul subţire.
 
 Mişcarea moleculelor este determinată de raportul dintre 2 forţe:
o forţa ce împinge faza mobilă şi odată cu ea moleculele pentru care are
afinitate, favorizată de solubilitate, volatilitate, etc.;
o forţa de reţinere a fazei staţionare pentru moleculele cu care
interacţionează.
 Raportul dintre cele 2 forţe este diferit, funcţie de moleculele ce trebuie
separate, ceea ce determină mobilităţi diferite şi separarea componentelor.

36
 CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE
Criterii:
 starea fizica a celor doua faze
 lichid, solid, gaz, fluid supercritic
 migrarea fazei mobile
 prin developare
 de elutie
 modul de curgere al developantului sau eluentului
 ascendent, descendent, radial, bidimensional, etc
 după tehnica de lucru adoptată
 eluţie izocratica, in gradient, frontală, prin deplasare
 după forma izotermei de sorbţie
 lineară , concava, convexa, etc.
 polaritatea fazelor
 Cromatografie cu faza normală (FS polară, FM nepolară)
 Cromatografie cu faza inversă (FS nepolară, FM polară)
- FS polare: silicagel, oxid de aluminiu
- FS nepolare: diferite tipuri de silicagel silanizat
- FM polara: metanol, acetonitrile, etanol, apa, tetrahidrofuran
- FM nepolare: diclormetan, cloroform, hexan, toluen

37
 Developare: repartizarea componenţilor pe coloana
cromatografică. Rezultă o separare completă dacă zonele
componenţilor sunt distincte, despărţite prin spaţii de sorbent
libere de substanţă.

 Eluţie: procesul prin care proba părăseşte coloana, apoi fiecare

component este identificat şi dozat.

 Faza mobila/eluent/eluant/ agent de eluare:

solventul/amestecul de solventi care antrenează componentii
amestecului supus analizei, la traversarea unei faze stationare.

 Faza stationara: un solid sau un lichid imobilizat, cu ajutorul

caruia se realizeaza separarea unor analiti

38
 mecanismul care stă la baza procesului elementar de separare:

Cromatografia de adsorbţie - constă în distribuirea componenţilor unui

amestec dat, în funcţie de afinităţile lor pentru faza staţionară (un solid
dotat cu proprietăţi adsorbante).
cromatografie lichid-solid
cromatografie gaz-solid.

Cromatografia de repartiţie - se bazează pe solubilitatea selectivă a

componenţilor amestecului de analizat între două faze nemiscibile. Faza
staţionară este lichidă, înfăşurând sub forma unui film aderent o
suprafaţă inertă, iar faza mobilă poate fi un lichid sau un gaz.
cromatografia lichid-lichid
cromatografia gaz-lichid.

39
Cromatografia prin schimb ionic -
constă în schimbul reversibil de ioni şi
anume între ionii din soluţie şi ionii de
acelaşi semn ai grupărilor ionizabile
ale schimbătorului de ioni.

Cromatografia de excludere - difuzie (excludere moleculară, filtrare

prin gel). Moleculele de solut părăsesc coloana cromatografică în
ordinea descrescătoare a masei lor moleculare. Componenţii cu masă
moleculară mare nu pot pătrunde în faza staţionară conţinută în
cavităţile granulelor de gel si vor părăsi primii coloana - excludere; cei
cu masă moleculară mică vor difuza liber între faza intragranulară (faza
staţionară) şi faza intergranulară (faza mobilă) şi vor ieşi ultimii. Faza
mobilă poate fi gaz sau lichid. Suportul este un material cu porozitate
controlată, de obicei geluri.

40
Cromatografia de afinitate – se bazeaza pe
proprietatea unor adsorbanti
macromoleculari de a manifesta o afinitate
specifica pentru anumiti analiti. Analizeaza
interactiunile specifice dintre moleculele de
analit si un ligand fixat pe un suport inert
insolubil; liganzii sunt inclusi in suportul
solid, caruia ii confera specificitate pentru
anumite molecule de analit, fata de care
manifesta o afinitate, legandu-le prin
covalenta.

Cromatografia cu fluide supercritice – exploateaza solubilitatea

analitilor intr-un fluid supercritic, care asigura extragerea analitilor
din matrice si apoi separarea lor cromatografic

Electrocromatografia capilara micelara – combina cromatografia cu

electroforeza

41
 -
gaz

Mecanisme de separare 42
Parametrii cromatografici (Cromatografia planara)

 Factor de repartitie, Rf (raport frontal, factor de retentie,

“retardation factor”) = raportul dintre distanta parcursa
de solut si distanta parcursa de frontul solventului.

43
 Parametrii cromatografici (Cromatografia pe coloana inchisa)
 Metoda constă în introducerea unei cantităţi mici de probă în coloana
cromatografică şi apoi a unui volum mare de fază mobilă . Componenţii
separaţi sunt colectaţi la baza coloanei în fracţiuni şi analizaţi prin diverse
metode .

Separare cromatografică pe coloană

44
Cromatogramă/Curbă de eluţie: rezultatul distribuţiei zonelor de-alungul coloanei,
reprezentarea grafică a concentraţiei unui analit în funcţie de timp sau de volumul
de eluent.
45
• Linie de bază = orice parte a cromatogramei unde doar faza mobilă iese din coloană.
• Punct de injectare = punctul în care proba este plasată în coloană.
•Maximul picului = cel mai înalt punct al picului.
• Înălţime pic = distanţa între maximul picului şi linia de bază
• Lăţime pic la 0.5 h = latimea la jumătatea înălţimii picului.
• Lăţimea picului pe linia de bază = distanţa între intersecţiile tangentelor desenate
la cele 2 părţi ale picului şi baza picului.
• Punct mort = pozitia picului unui solut neretinut
• Timp mort = timpul între punctul de injectare şi punctul mort
•Volum mort = volumul fazei mobile ce trece prin coloană intre punctul de injectare si
punctul mort.

 Timp de retentie (tr) = timpul între punctul de injectare şi picul maxim

 Volum de retentie (Vr) = volumul fazei mobile ce trece prin coloană între punctul de
injectare şi picul maxim
Timp de retentie corectat (t’ r) = timpul între punctul mort şi picul maxim sau
diferenta dintre timpul de retentie si timpul mort.
 Volum de retentie corectat (V’r) = volumul fazei mobile ce trece prin coloană între
punctul mort şi picul maxim sau diferenţa între volumul de reţinere şi volumul mort.
Raport de retentie (Rr) = raportul dintre viteza medie de deplasare a analitului si a
fazei mobile.
46
 Coeficient de distribuţie/repartitie (K)= raportul concentraţiei unui
component în faza staţionară şi în faza mobilă:
[i ]s
K
[i ]m

Depinde de:
-natura componentului repartizat intre FS si FM
-natura fazelor FS si FM
-temperatura de lucru
-mecanismul de interactiune cu FS si FM

 Factor de retentie/capacitate (k) = raportul dintre cantitatea de analit

adsorbita de catre faza stationara si cantitatea de analit prezenta in faza
mobila.

47
 Eficienta separarii
 Factor de separare/selectivitate – este o masura a capacitatii
sistemului cromatografic de a separa doi componenti.

K B kB
 
K A kA

48
 Rezoluţia, (Rs) – aptitudinea unui sistem cromatografic de a separa
componentii dintr-un amestec - măsoară capacitatea efectiva/gradul total
de separare a 2 picuri vecine

unde:
- z = este distanţa între maximul de concentraţie al picurilor de eluţie
aparţinând celor doi soluţi vecini A şi B;
- l = lăţimea fiecărui pic.

Distanţa dintre punctele

de inflexiune este de 2,
l = 4.

Rezoluţia a două picuri vecine 49

 Considerând cele două picuri egale şi foarte apropiate astfel ca
tangentele lor să se întâlnească pe linia de bază, se constată că lăţimea
ambelor picuri este egală cu 8. In mod similar şi distanţa z se poate
exprima în unităţi de abatere standard. Valoarea sa este de 4  (2 pentru
fiecare pic). Prin urmare, rezoluţia pentru două picuri a căror tangente se
ating este:

 Cu cat rezoluţia are o valoare mai mare, cu atat separarea este mai buna

50
a) Rs = 1, dB-dA = 4,
curbe suprapuse 2 % → separare rapida

b) Rs ≥ 1.5, dB-dA = 6,

curbe suprapuse 0.3 % → separare mai
buna

c) Rs < 1, dB-dA = 3.2,

curbe suprapuse →
separare complet nesatisfacatoare

51
 Teoria talerelor teoretice (Teoria platourilor teoretice)

 Exemplu: fiecare taler conţine

- o masă m de fază staţionară,
- faza mobilă este adusă în fracţiuni de volume vi.

 După stabilirea echilibrului, fiecare porţiune de

fază mobilă este transferată pe talerul imediat
inferior. Astfel, faza mobilă a talerului r, în
echilibru cu faza stationara a aceluiaşi taler, se
deplasează în talerul următor r + 1 unde vine în
contact cu o nouă fracţiune de fază staţionară cu
care se va pune în echilibru. In acelaşi timp faza
staţionară care a rămas pe talerul r se va pune în
echilibru cu faza mobilă provenită din talerul r - 1.

 In coloana cu talere, funcţionarea este

discontinuă; are loc o suită de operaţii de punere
în echilibru şi de transferări alternative, faza
mobilă deplasându-se cu un volum corespunzător
unui taler ( vi) la fiecare transfer.

52
Pentru a compara 2 coloane ce au lungimi diferite sau aceeaşi coloană în
condiţii diferite, se foloseşte HETP (Height Equivalent to a Theoretical
Plate) - H:

în care :
-L = lungimea coloanei (cm),
-N = numărul de talere teoretice

2
 tR 
N  a 
W
 
în care :
- tR = timp de retentie
- w = latimea picului
- a = constantă ce depinde de înălţimea picului măsurat

 Un număr mare de talere teoretice (N) sau o valoare HETP (H) mică
determină o eficienţă bună a coloanei.
53
 Ecuaţia Van Deemter
H = A + B/v + Cv
 A, B, C sunt constante pentru o
coloana, un analit si conditii
experimentale date:
- A = difuziune turbulentă, determinata
de curgerea neuniforma a fazei mobile
prin coloana/faza stationara (structura
neuniformă a umpluturii)
- B = difuziunea longitudinală a
moleculelor fazei mobile
- C = coeficientul de rezistenţa la
transferul de masă în faza staţionară
- v = viteza de deplasare a fazei mobile
(cm.s-1).

54
Difuzia turbulenta:

- este data de particule solide mici, acoperite sau nu cu un film

subtire, cu forma si traiecte diferite de deplasare
- inaintarea neuniforma a analitilor ce trebuie separati
cromatografic produce turbulente care determina largirea zonei
in care se afla fiecare analit
- depinde de:
■ debitul fazei mobile
■ caracteristicile particulelor
■ calitatea materialului de umplutura
55
Difuzia longitudinala

- exprima influenta difuziunii moleculelor in directia de curgere

a fazei mobile
- depinde de:
■ capacitatea de curgere a fazei mobile
■ coeficientul de difuzie al analitului in faza mobila
■ vascozitatea fazei mobile
■ temperatura
■ masa moleculara a analitului.

56
Coeficientul de rezistenta

- corespunde rezistentei la transferul de masa

a) nu toate moleculele din faza mobila sunt antrenate cu
aceiasi viteza, conditiile de repartitie sunt diferite
b) contactul dintre faza mobila si stationara nu este identic
peste tot
c) elutia nu se face cu aceiasi viteza pentru toate moleculele

57
 IZOTERME DE DISTRIBUŢIE

 Caracterul liniar şi neliniar al izotermelor de distribuţie se reflectă

în aspectul zonelor de concentraţie ale componenţilor separaţi pe
coloană sub forma curbelor de eluţie.

 Se consideră două concentraţii C1 şi C2 în faza mobilă. Valorile

corespunzătoare din faza staţionară adsorbantă sunt q1 şi q2

Izoterme de distribuţie
q - cantitate adsorbită pe unitate
de masă de adsorbant ;
c - concentraţie în faza mobilă

58
 Izoterma de sorbţie liniarǎ (izoterma I):
- pentru C =2C cantităţile adsorbite vor
2 1
fi q2=2q1
- proporţionalitate între cantitatea de
substanţă sorbită şi concentraţia sa în
soluţie
- străbaterea coloanei cromatografice se
face cu o viteză independentă de
concentraţie.

59
 Izoterma de sorbţie convexă (izoterma II): - pentru C2=2C1 cantităţile
adsorbite vor fi q2 < 2q1
- la concentraţii mai mari (C2), în soluţie rămâne o proporţie mai mare de
substanţă, comparativ cu cantitatea corespunzătoare concentraţiei mai
mici (C1)
- substanţa va parcurge coloana cu viteză mai mare la concentraţie mare şi
cu viteză mai mică la concentraţie mică.

 Pentru izoterma concavă (izoterma III):

- pentru C2=2C1 cantităţile adsorbite vor fi q2 > 2q1
- viteza mare va corespunde concentraţiei mici, deoarece la această
concentraţie există o proporţie mai mare de substanţă în soluţie.

60
 Dacă izoterma de distribuţie este:

● liniară, aspectul zonei de concentraţie se menţine neschimbat în

timpul deplasării de-alungul coloanei cromatografice.
● curba, zona de concentraţie îşi
schimbă aspectul în timpul deplasării
devenind nesimetrică, porţiunea
maximului de concentraţie a zonelor
deplasându-se mai :
- repede (izotermă convexă)
- încet (izotermă concavă)

Izotermele de distribuţie liniare se

întâlnesc mai ales în cromatografia de
repartiţie şi în domeniul concentraţiilor
mici în cromatografia de adsorbţie. Cel
mai frecvent tip de izotermă este cel
convex, iar cel mai rar cel concav.
61
 TEHNICI DE ELUŢIE
1.Eluţia izocratică
 Condiţiile cromatografice se menţin constante pe parcursul
experimentului.
 Această tehnică este posibilă numai în cazul unui amestec cu număr
redus de componenţi.
 Fiecare component al probei trece prin coloană cu o viteză constantă
specifică şi determinată de concentraţia solventului organic al eluentului.
 O coloană mai lungă, întotdeauna va determina o rezoluţie mai bună.
 Eluţia izocratică este necorespunzătoare pentru separarea probelor care
conţin mulţi componenţi cu coeficienţi de distribuţie cu valori încadrate pe
un interval larg.
 Pentru realizarea unei separări bune în aceste condiţii trebuie ales un
eluant cu putere de eluţie corespunzătoare pentru toţi componenţii.

Efectul unor
concentraţii
diferite de
solvent
organic

62
 Când se foloseşte un solvent cu
putere de eluţie slabă (E1) se separă bine
componenţii 1 şi 2, cu un volum prea
mare componenţii 3 şi 4 şi nu se
desprind de pe coloană compuşii 5 şi 6.
 Dacă se foloseşte un solvent puternic
(E2) cu putere de eluţie prea mare,
componenţii 1 - 4 nu se separă, dar
compuşii 5 şi 6 sunt bine separaţi.
 Când se foloseşte amestecul
E1 + E2 cu putere de eluţie medie se
obţin separări intermediare bune dar nu
se separă componenţii 1 şi 2 şi se
eluează componenţii 5 şi 6 într-un
volum prea mare.
 Rezolvarea se face prin aşa-numita
“eluţie în etape“ când se adaugă eluenţi
diferiţi în mod discontinuu cu o putere
de eluţie crescătoare (E1 urmat de E1 +
E2 şi apoi E2).
 Se recomandă aplicarea acestei
metode numai în cazul probelor cu
izoterme liniare şi de compoziţie
cunoscută pentru a decide uşor când
trebuie schimbat solventul.
63
2. Eluţia în gradient

Puterea de eluţie a solventului care intră în coloană se schimbă

mereu.

 Se realizează cu doi solvenţi, unul slab şi altul puternic. Aceştia

sunt amestecaţi în proporţii treptate astfel încât primul solvent
care părăseşte dispozitivul să fie cel slab E1, în timpul separării
eluentul devine în mod progresiv mai bogat în E2, iar la sfârşitul
separării solventul care părăseşte dispozitivul să fie numai E2 pur.

 Metoda are următoarele avantaje:

 este posibil să se separe componenţii cu proprietăţi sorbtive
foarte diferite într-o singură operaţie
 se obţin picuri de eluţie strâmte şi înalte datorită linearizării
izotermelor de distribuţie sub efectul gradientului
picurile de eluţie sunt mai apropiate datorită aplatizării
izotermelor de distribuţie
 se evită pierderea vreunui component
 diagrama de eluţie este uşor interpretabilă deoarece un
component apare într-un singur pic.
64
 3.Procedeul frontal
 Acest procedeu constă în trecerea soluţiei de analizat prin coloana
cromatografică, nefiind necesar un solvent de developare. Se determină
concentraţia de solut în eluent, se reprezintă această mărime în funcţie de
volumul de eluent şi se obţine o curbă în trepte.

• Prima treaptă conţine

Diagrama analizei frontale
componentul 1, treapta a doua
conţine componentul 1 şi 2 şi
astfel până la n componenţi.
• Se obţine o separare individuală
doar a componentului cu
afinitatea cea mai slabă pentru
faza staţionară. După acesta,
fiecare treaptă corespunde unui
amestec binar, ternar, până la
soluţia iniţială.
• Metoda nu prezintă un interes
deosebit, informaţiile obţinute
referindu-se mai mult la numărul
componenţilor din probă
65
 4. Procedeul deplasării
 Metoda este eficientă doar când faza
staţionară este solidă şi soluţii sunt adsorbiţi la
suprafaţa ei, în funcţie de afinitate.
 În coloană este introdusă o moleculă numită
deplasant (“displacer”) ce deplasează soluţii de
faza staţionară. În această situaţie, molecula
deplasant determinǎ zone de concentraţii mari
în solut, adiacente frontului deplasant.
 Se numeşte agent de deplasare ideal acea
substanţă care introdusă în orice concentraţie
CD determină o linie de viteză care
intersectează izoterma solutului. În caz
contrar, deplasantul este neideal şi se constată
impurificarea treptei următoare sub forma
unui pic de eluţie.
 În zonele concentrate, soluţii intră în
competiţie pentru locurile de la suprafaţa fazei
staţionare. Componenţii cu afinitate mare
pentru suprafaţa fazei staţionare se ataşează în
locul celor cu afinitate mică. Pe măsură ce
frontul deplasant traversează coloana, împinge
soluţii, iar competiţia între aceştia este
continuă.
 In final componenţii se separă în zone
adiacente şi distincte.

66
CROMATOGRAFIA PLANARĂ (pe coloana deschisa):
- Cromatografia pe hârtie
- Cromatografia pe strat subţire
- Cromatografia pe strat suprapresurizat
- Cromatografia planarǎ multidimensionalǎ

CROMATOGRAFIA PE COLOANA (pe coloana inchisa):

- Cromatografia de lichide de inalta performanta
- Gaz-cromatografia
- Cromatografia prin schimb ionic
- Cromatografia de excludere
- Cromatografia cu fluide supercritice

67