Planul cursului

CROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC

CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE

CROMATOGRAFIA CU FLUIDE SUPERCRITICE

1
 CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY (IEC)
Definitie:

 Este o tehnica lichid cromatografica in care faza staţionară ( răşini

schimbătoare de ioni) este constituita dintr-o matrice reticulata inalt
polimerica, pe care sunt grefate grupări acide sau bazice ionizabile capabile
să reţină cationi sau anioni, in anumite conditii experimentale.
 Ionii schimbatorului pot fi inlocuiti de alţi ioni fie din faza mobilă, fie din
probă, de unde denumirea de cromatografie prin schimb ionic.
Clasificare:
 cromatografie de schimb
 cationic:
 schimbătorul reţine ionii încărcaţi
pozitiv, înlocuind ionul H+ al acestuia
 Ex: (-SO3H, -PO3H2)
cromatografie de schimb anionic:
 schimbătorul reţine ionii încărcaţi
negativ, inlocuind ionul X- al acestuia
 Ex: (-RN+H3X-) E- = grupare funcţională (SO3-)
C+ = contraion schimbabil (Na+).
 În schimbul ionic se foloseşte o matrice insolubilă pe care este fixată o grupare
covalentă încărcată negativ sau pozitiv în funcţie de natura schimbătorului.
 (-E-), o grupare fixată pe matrice şi legată ionic de un cation alcătuiesc grupul
ionogenic al schimbătorului.
 Cationul poate fi schimbat reversibil de alţi cationi fără alterarea matricei.
2
 Principii generale

Schimbul de ioni, echilibrul ionic, retinerea ionilor

 Schimbul de ioni reprezintă o reacţie chimică heterogenă între o
fază solidă (răşină schimbătoare de ioni, R-X), o fază lichidă
(eluentul) şi proba ce conţin un cation sau anion. Eluentul poate
conţine un ion schimbabil de aceiasi sarcină cu cel de pe răşină.
Schimbul ionic se reprezintă astfel:
R-X-C+ + M+B- ↔ R-X-M+ + C+ + B-
R-X+A- + M+B- ↔ R-X+B- + M+ + A-

 Pentru 2 cationi monovalenţi (A+ şi B+) reacţia este:

R-A+ + B+  R-B+ + A+

Constanta de schimb ionic:

unde:
[A+]R, [B+]R = concentraţiile la echilibru ale ionilor A+ şi B+ în
schimbător (sau în faza solidă)

[A+]m, [B+]m = concentraţiile la echilibru ale ionilor A+ şi B+ în faza

mobilă (sau eluant). 3
 Dacǎ > 1  B+ din soluţie are o afinitate mai mare decât A+
pentru schimbul ionic, cu deplasarea reacţiei spre dreapta.
 Dacǎ < 1  A+ are afinitate mai mare decât B+, procesul
fiind deplasat spre stânga.
 Dacǎ = 1  afinitatea lui A+ şi B+ pentru schimbul ionic e
asemănătoare.

 Ionii polivalenti prezintă un plus de afinitate faţă de cei

monovalenţi.

 Pentru caracterizarea schimbului se defineşte coeficientul de

distribuţie, D.
 De ex. pentru ionul |B+| :

4
 Pentru caracterizarea cineticii schimbului ionic se utilizează
izoterma de distribuţie, respectiv izoterma de schimb ionic.
Această izotermă defineşte, la echilibru, relaţia dintre
concentraţiile aceloraşi ioni din răşină şi din soluţie.

 Pentru ionul B+:

- Dacă izoterma e convexă (1) 
[B]m < [B]R; ionul B+ are un plus de
afinitate pentru schimbul ionic faţă de
ionul fixat iniţial (A+);

- Dacă izoterma este liniară (2): 

[B]m = [B]R, afinitatea ionilor este
aceiaşi;

- Dacă izoterma e concavă (3) 

[B]m > [B]R, ionul B+ are o afinitate mai
Izoterme de schimb ionic mică decât ionul A+ fixat iniţial.
1=convexa, 2= linearǎ, 3=concavǎ

5
 Mǎrimile ce caracterizează schimbul ionic sunt:
o volumul de retentie VR
o timpul de retentie tR.

 Volumul de retentie VR al unei analize cromatografice

unde:
V0 = volumul gol (mort) al sistemului
D = coeficientul de distribuţie
VS = volumul de schimb ionic.
 Rezoluţia, Rs, procesului cromatografic: este proporţională cu
produsul dintre selectivitate, eficienţă şi capacitatea sistemului.

 Factor de capacitate, k, factor de retenţie: este o măsură a retenţiei

unui component.

 Selectivitate, α, reprezintă
capacitatea sistemului de a
separa două picuri

6
 Grupele funcţionale de la suprafaţa fazei staţionare realizează
specii încărcate pozitiv/negativ.

 La echilibru, grupele funcţionale încărcate pozitiv/negativ sunt

inlocuite de ionii din proba de analizat.

 În a doua şi a treia etapă, componenţii probei străbat coloana şi

sunt distribuiţi între faza staţionară şi cea mobilă.

 In timpul inlocuirii acestia se adsorb si desorb.

 Echilibrul de distribuţie este determinat prin competiţia dintre

componenţii probei şi cei ai schimbatorului. 

 Ionul retinut pe coloana se desprinde de pe aceasta cu o faza

mobila ce contine un ion de aceiasi sarcina mai puternic retinut de
schimbator.

7
APARATURA

8
FAZE MOBILE

 sunt soluţii apoase cu capacitate ionizantã mare - soluţii diluate de acizi sau baze
şi doar când este necesar, se mai adaugă o cantitate mica de metanol sau etanol
pentru a se facilita dizolvarea moleculelor puţin ionizate în apă
 În acest mediu, analitii şi grupele funcţionale ale fazei staţionare sunt ionizate.
 pH-ul mediului
onu influenteaza ionizarea schimbatorilor cationici si anionici puternic acizi/bazici
oinfluenteaza ionizarea schimbatorilor cationici slab acizi si acelor anionici slab
bazici
 au rolul de a elua compusii retinuti pe faza stationara, deplasand echilibrele de
repartitie a ionilor, antrenand ionii separati prin:
ointroducerea in faza mobila a unui ion cu afinitate mai mare fata de rasina
ocresterea concentratiilor ionilor H+ sau HO- din faza mobila
omodificarea pH-ului fazei mobile

Exemple de faze mobile:

pentru anioni: acizi organici, minerali, carboxilici aromatici şi sărurile lor, acizi
carboxilici alifatici, acizi sulfonici aromatici şi alifatici, săruri anorganice
pentru cationi: baze organice, minerale şi sărurile lor

9
POMPĂ

INJECTOR
10
 COLOANĂ

 Coloana este umplută cu fază staţionară polimeră,

reticulată, pe care sunt grefate grupări acide sau
bazice ionizabile, capabile să fixeze cationi sau anioni
în anumite condiţii experimentale.

11
Schimbǎtori de ioni
 Schimbătorii de ioni sunt caracterizaţi prin:
- natura grupelor funcţionale ionice de la suprafaţa matricei
- natura matricei utilizată ca suport

Clasificare:
a) în funcţie de natura ionului fixat distingem:
o Schimbǎtori de cationi - au grupe funcţionale anionice
o Schimbǎtori de anioni - au grupe funcţionale cationice
o Schimbǎtori mixti sau amfoteri ce conţin 2 tipuri de grupe.

Schimbator Tipul Grupele funcţionale

Schimbǎtori de Grupari puternic acide -SO3H

cationi Grupari slab acide
Schimbǎtori de Grupari puternic bazice
anioni Grupari cu bazicitate medie
Grupari slab bazice
-COOH, -PO(OH)2
-OH fenolic
- Baze de amoniu cuaternar
- Amine secundare/tertiare
- NH2

12
Puterea de eluţie a anionilor:
F-, OH- > OAc- > H2PO4- > HCO3- > Cl- > NO2- > HSO3- > CN- > Br- > NO3- > I-

Puterea de eluţie a cationilor:

Li+ > H+ > Na+ > NH4+ > K+ > Rb+ > Cs+ > Ag+
Be+2 > Mn+2 Mg+2 Zn+2 > Co+2 > M+2 (metale tranziţionale) > Ca+2 > Sr+2
Al3+ > M3+ (metale tranziţionale) > Ce3+

13
 Retentia anionilor/cationilor:
 influenta sarcinii – ionii sunt cu atat mai bine retinuti cu cat sarcina lor este mai
mare
 influenta naturii ionului – afinitatea ionului pentru rasina creste in ordinea
crescatoare a numarului atomic din grupa

Elutia ionilor:
-Elutie selectiva – numai un singur ion din cei retinuti este eluat cu ajutorul unui
eluent judicios ales; apoi pentru cel de-al doilea ion se utilizeaza un al 2 lea eluent etc;
se utilieaza cand coeficientii de repartitie ai ionilor sunt foarte diferiti
-Elutie simultana – se pot separa analitii cu coeficienti de repartitie apropiati
-Elutie progresiva – se utilizeaza un gradient de concentratie a eluentului ce
determina o variatie a coeficientilor de repartitie; se pot separa analitii foarte
asemanatori 14
b) tipurile de matrice utilizate ca faze staţionare în cromatografia
ionică pot fi:
- produsi naturali
- polimeri organici de sinteză

Produsi naturali (organici sau anorganici)

 1. Zeoliti sau aluminosilicati alcalini sau alcalino-pamantosi
 pot acţiona atât ca acizi cât şi ca baze
 indică posibilitatea utilizării lor ca schimbători de cationi şi anioni.
 utilizare limitata datorita sensibilitatii crescute la schimbarile de pH
 Ex: Na2.Al2O3.4SiO2.2H2O

 2. Sephadex grefat:
 zaharoza prin oxidare → dextran;
 dextran prin polimerizare cu glicerina → Sephadex
 grefare Sephadex

15
 3. Matricele pe bază de silice cuprind 2 grupuri distincte:
• gruparea funcţională este legată direct de particulele de silice
• silicea este acoperită de un strat polimeric (polistiren, silicon,
fluorocarbon) şi acest strat cuprinde gruparea funcţională.
• sunt produse prin legarea chimică a:
- aminelor cuaternare → schimbători puternici de anioni
- alchilsulfonaţilor → schimbători puternici de cationi.
 
Avantaje:
 eficienţă cromatografică bună
 stabilitate şi rezistenţă la presiuni mari.
 
Dezavantaje:
 pH limitat; 2 > pH < 7
 afinitatea grupelor silanol libere de la suprafaţă
şi a silicei expuse la ionii metalici cu densitate mare
(metale tranziţionale), ce sunt ireversibil adsorbiţi la
suprafaţă, interferând analizele.
 

16
 Polimeri organici de sinteza (rasini)
 sfere mici, cu diametrul de 0.5 mm
 se clasifica functie de structura chimica si de marimea particulelor
(mesh)

 1. Copolimeri reticulati polistiren/divinilbenzen

 sunt produse prin derivatizarea chimică a polimerilor organici de
sinteză: se obţine polimerul cu proprietăţi fizice şi chimice potrivite,
după care se introduc grupele funcţionale.
 Avantaje - domeniu larg de pH (0-14)
- sunt expuse la limitări de presiune, deoarece sunt
materiale relativ « soft » şi astfel, atât lungimea coloanei cât şi viteza de
curgere sunt limitate
- răşinile macroporoase sunt relativ mai rigide şi stabile şi
pot fi utilizate la coloane lungi şi viteze de curgere mari.
 Dezavantaje – capacitate mica de schimb ionic

 Ex: - copolimeri ai stirenului cu divinilbenzen,

- copolimeri ai divinilbenzenului cu acid acrilic sau metacrilic.

17
18
 2. Rasini filmogene

 Ex: Latex, depus sub forma unei pelicule continue pe un suport

impermeabil format din microsfere de silice, sticla sau polistiren.
 gruparile functionale sunt fixate pe particulele de latex
 configuratia filmogena - concentrarea pe o suprafata minima a
schimbatorului de ioni → scaderea fenomenului de difuzie → se
accelereaza schimbarea → cresterea eficacitatii cromatografice
 Stabile pentru un domeniu larg de pH

19
 Caracteristicile schimbătorilor de ioni
1. Stabilitatea chimica
 rezistenta fata de solutii apoase acide/bazice si chiar reactivi organici
 nu sunt solubili in apa, dar in contact cu apa se umfla, marindu-si volumul,
prin fixarea unor cantitati importante de apa, cu degajare de caldura.
 capacitatea de umflare depinde de:
- numarul si natura gruparilor functionale
- gradul de reticulare (> → capacitate de umfla mica)
- natura cationului (in cazul rasinilor cu grupari acide sub forma de
saruri)
 Gruparile putin ionizate retin mai multe molecule de apa decat cele puternic
ionizate sau neionizate
 cu cât capacitatea ionică este mai mare, legăturile polimerice sunt mai puţine,
cu atât sensibilitatea polimerului la adsorbţie este mai mare.

2. Capacitatea ionică
 este determinată de numărul grupelor funcţionale/unitate masă a fazei
staţionare
 un rol important în determinarea concentraţiei ionilor concurenţi utilizaţi de
faza mobilă pentru eluţie
 capacitatea mare a fazelor staţionare necesită utilizarea unei faze mobile mai
concentrate, ceea ce este o problemă în cromatografia ionică, datorită
detectorilor conductometrici ce nu pot funcţiona bine la concentraţii mari în
20
săruri.
3. Selectivitatea
Afinităţile dintre schimbatori, analit si contraion depind de:
 sarcina ionului analitului
 mărimea ionului solvatat
 gradul de polimerizare al schimbătorului de ioni
 polarizarea ionului analitului
 capacitatea ionicǎ a schimbătorului fazei staţionare
 tipul grupării funcţionale a fazei staţionare.

4. Stabilitatea termica
 ȋn general, procesele de schimb ionic au loc la temperatura obişnuită,
dar uneori trebuie să se lucreze la o temperatură mai mare
 rasinile sulfonice – max 80 0C
 rasinile cu grupari de amoniu cuaternar – max 50 0C

21
 DETECŢIA
DETECŢIE ELECTROCHIMICĂ

– are la bază un sistem de electrozi, când ȋn urma aplicării unui potential are loc un
proces de oxidare/reducere cu transfer de electroni şi se măsoară curentul
corespunzător.

Detectori conductometrici
 Măsoară conductivitatea fazei mobile, bogată în specii ionice.
 Avantaje:
 toţii ionii sunt conducători electrici, astfel că, detectorul ar trebui să aibă
un răspuns universal
 detectorii sunt relativ simpli din punct de vedere al funcţionării
 Este determinată de:
- puterea ionică
- tipul de specii din soluţie
- temperatură

Detectori potenţiometrici
 detecţia se bazează pe măsurarea potenţialului soluţiei ce traversează celula de detecţie,
potenţial ce este dependent de concentraţia ionică a soluţiei.

Detectori amperometrici
– măsoară curentul, la potenţial constant 22
DETECŢIE OPTICĂ

Detecţie prin spectroscopie UV-Vis: măsoara absorbanţa, care este

direct proporţională cu concentraţia de analit

Detecţie directă – se utilizează avantajul de a avea grupări cromofore

diferite şi astfel diferite sensibilităti pentru ioni. Exemplu: nitrit, nitrat,
iodura, tiosulfat, cetonă, amino, carboxyl etc
Detecţie indirectă – se utilizează un eluent cu o putere de absorbţie
mare, astfel ȋncât analitul să reducă semnalul ȋn detector (concentraţia
eluentului este redusă ȋn regiunea picului ȋn funcţie de concentraţia
analitului). Exemplu: ftalat, benzoat, salicilat, sulfat, clorură etc
Detectie după derivatizare – doar dacă nu există alte metode de
detecţie. Exemplu: metalele tranziţionale, bromat, cromat

Detecţie prin fluorescenţă: doar dacă analitul prezintă fluorescenţă

sau dacă se utilizează eluenţi pentru detecţia indirectă prin fluorescenţă.
Exemplu: salicilat

23
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI IONICE

Cromatografia ionica se dezvoltă în zilele noastre cu aplicaţii în:

• analiza medicamentelor
• chimia anorganică
• chimia organică

Metoda se aplicǎ determinǎrilor de:

IONI ANORGANICI
 Ordinea de eluţie în cromatografia ionică este determinată de
densitatea sarcinii (sarcină/domeniu) ionului vizat.

24
1. Anioni
 Cercetarea anionilor anorganici se face înaintea tuturor, în apa de diferite
provenienţe, ce poate fi: apǎ potabilǎ, apǎ de ploaie, ap ǎ de diluţie, ap ǎ din hemodializ ǎ
şi din farmacii.
 Se pot separa următorii anioni anorganici: Cl -, HPO42-, SO42-, PO43- , SO32-, I-, Br-,
SCN-, CN-, NO2-

2. Cationi
 Se pot separa următorii cationi anorganici: Li, Na, Pb, Cs, Ca, Sr, Ba, Ra, metale
tranziţionale, pǎmânturi rare, NH 4+

25
IONI ORGANICI
Pentru acizii şi bazele organice, ordinea de eluţie este determinată de pKa
sau pKb (puterea/tăria acidului sau bazei).
1. Anioni
Anionii organici, ce sunt dozaţi în cromatografia ionică, corespund cel mai
adesea formei ionizate a acizilor organici.

1 = tartrat, 2 = formiat, 3 = acetat, 4 = propionat, 5 = izobutirat, 6 = butirat,

7 = izovalerat, 8 = valerat
2. Cationi
Compuşii cu azot cuaternar pot fi cromatografiaţi în coloane de răşini
schimbătoare cationice.

26
 Exemplificăm modul de efectuare a schimbului anionic şi cationic pe
două coloane separate care pot fi cuplate şi alcătui un tip de
cromatografie prin schimb ionic cu dublă coloană.

Schimb cationic

Schimb anionic

27
 Determinarea unor ioni din produse farmaceutice: Soluţie Ringer &
hemodializă
- Anioni:
• fază mobilă: 1.3 mM Na2CO3 + 2.0 mM NaHCO3, 0.8 mL/min
- Cationi:
• fază mobilă: 4.0 mM acid tartric + 0.75 mM acid dipicolinic, 1 mL/min

Determinarea ionilor lactat şi clorură

- Lactat 2235 mg/L Determinarea ionilor sodiu, potasiu,
- Clorura 4314 mg/L calciu
- Sodiu 130.8 mg/L
- Potasiu 5.3 mg/L
28
- Calciu 1.8 mg/L
Determinarea salbutamol, fenoterol, clorprenalina, clenbuterol

• fază mobilă: 1.8 mM HNO3 + 2 % acetonitril , 1 mL/min

29
Studii de dizolvare a unor comprimate

- Exemplu: Analiza mediului de dizolvare ȋn timpul testului de dizolvare a

unor comprimate de citrat de calciu ȋn fluid intestinal

Analiza mediului de dizolvare al comprimatelor de citrat de calciu,

fază mobilă: acid metansulfonic 20 mM
30
Determinarea unor impurităţi ȋn produse farmaceutice
- Exemplu: N-metilpirolidina ȋn Cefepime (antibiotic)

Determinarea N-metil pirolidinei ca impuritate ȋn Cefepime,

fază mobilă: 6 mM HNO3 + 10 % acetonitril

31
 CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE

Definiţie: Cromatografia de excludere sterică este o metodă prin care

moleculele se separă pe baza mărimii lor sau în termeni tehnici, pe baza
volumului hidrodinamic. În mod curent, se aplică moleculelor mari sau
complecşilor macromoleculari, cum ar fi proteinele şi polimerii industriali.
 
Clasificare:
 cromatografie de filtrare prin gel (Gel Filtration Chromatography, GFC)
- faza mobilă este o soluţie apoasă.
 cromatografie de permeaţie prin gel (Gel Permeation Chromatography,
GPC) - faza mobilă este de natură organică.
 cromatografia de excludere de mărime (moleculară) (Size Exclusion
Chromatography, SEC) – separarea se bazează pe mărimea moleculară a
componentelor – in loc de geluri, ca faza stationara se utilizeaza silice
legata cu lanturi de poli 2-hidroxietil aspartamida (doar pentru analiza
compusilor hidrofili)

32
PRINCIPII GENERALE

 Mecanismul separării
Separarea se bazeaza
pe faptul ca
particulele de marimi
diferite vor elua sau
penetra prin faza
stationara cu viteze
diferite.
Acest lucru se
datoreaza porilor fazei
stationare care permit
intrarea in ei numai a
moleculelor de o
marime mai mica
decat largimea lor, iar
moleculele mari vor
parasi primele
coloana
cromatografica.

33
  Parametrii separării

 Volumul total al coloanei

cromatografice
VT = VP + VM + VG
unde:
• VT = volumul total
• VP = volumul porilor
• VG = volumul ocupat de granulele de
gel
• VM = volumul fazei mobile

 Volum de eluţie
VE = VM + KdVP
unde:
• VE = volumul de eluţie
• Kd = coeficientul de difuzie  Procesul cromatografic
Kd = 0 → VE =VM pentru analiza
Kd = 1 → VE =VM + VP unor proteine de marimi
0<Kd<1 → VE <VM + VP diferite

34
 VE  VM
Kd 
VP

VE  VM
Kav 
VP  VG
unde:
• Kav = coeficient de distribuţie/difuzie accesibil
• dar VP + VG = VT - VM

VE  VM
Kav 
VT  VM

35
  Factorul de selectivitate, αS = diferenţa de comportare dintre moleculele implicate
în procesul de separare cromatografică.
Depinde de:
o mărimea moleculelor
o porozitatea gelului
o uniformitatea gelului
Kd .VP
 Factorul de capacitate/retenţie, kB kB 
VM
 Numărul platourilor teoretice – se poate modifica prin modificarea lungimii
coloanei cromatografice sau a debitului fazei mobile
 Rezolutia separarii depinde de:
 alegerea condiţiilor care să
furnizeze spaţiu suficient între
zonele de probă relevante, adică
realizarea unei selectivităţi
suficiente.
 contracararea efectelor de
extindere ale zonei, adică
obţinerea unui randament
suficient în procesele
cromatografice.

36
APARATURA

37
Faza mobilă:

- trebuie să fie un solvent bun pentru polimer, în scopul de a evita

efectele de non-excluziune
- trebuie să dizolve proba la o temperatură corespunzătoare şi într-o
perioadă suficient de lungă înainte de injectare, pentru a permite
granulelor să se umfle în solvent sau de a sparge agregatele
- ȋn unele cazuri, poate fi necesar adaosul de electroliţi pentru a obţine
dezagregare.
- ca eluenţi în separările pe geluri de agaroză se pot utiliza soluţii ale
sărurilor obişnuite, dar nu şi borat care poate forma complecşi cu
grupele hidroxil ale sefarozei.
- exemple: tetrahidrofuranul este un bun solvent pentru mulţi polimeri şi
este adesea utilizat ca fază mobilă; cloroformul şi toluenul sunt utilizaţi
pentru dizolvarea polimerilor atunci când aceştia nu sunt solubili în
solvenţii comuni

38
Pompa
 Introduce, prin intermediul fazei mobile, proba de analizat în sistem.
 In funcţie de compoziţia probei se vor obţine soluţii de diferite vâscozităţi.
 Trebuie să furnizeze aceiaşi vitezǎ de curgere, independent de diferenţa de
vâscozitate.
 Modificările solventului trebuie făcute rapid şi uşor.
 Deoarece modificările solventului implică apariţia în sistem a unui nou
solvent, pompa trebuie să aibă un volum intern mic.
 Rezervorul cu solvent trebuie să fie destul de mare pentru a permite
utilizarea continuă a analitului şi trebuie să fie uşor înlocuibil.

Tipuri de pompe:
 Pompe tip seringă.
 Pompe cu piston.

Injectorul
Introduce soluţia de analizat în faza mobilă.
Trebuie să permită introducerea de:
o volume mici (pentru determinarea masei moleculare)
o volume mari (dacă este dorită fracţiunea colectată).
Nu trebuie să influenţeze curgerea continuă a fazei mobile.
Trebuie să poată fi injectate automat multiprobe, când volumul probei este
mare. 39
Coloana
 Separă eficient componenţii probei unii de alţii.
 Coloanele cu eficienţă mare, determină separări bune şi rapide ale analiţilor.
 Fiecare coloană trebuie să furnizeze informaţii reproductibile pentru o
perioadă lungă de timp atât în scop analitic cât şi de colectare a fracţiunilor.
 Eficientizarea este optimă când se folosesc solvenţi cu vâscozitate mic ǎ şi
când analitul este adus la temperaturi mari.

 Alegerea fazei staţionare trebuie făcută

prin examinarea curbei de calibrare pe
diverse coloane.
 Coloana aleasă trebuie să dea un răspuns
linear despre masa moleculară a analitului.
 Curba de calibrare se determină utilizând
macromolecule cu masă cunoscută şi
reprezentând pe abscisă timpul de retentie
(sau volumul) şi pe ordonată logaritmul
masei moleculare. Utilizând timpul sau
volumul de retentie se poate determina masa
moleculară. Masa şi volumul moleculei sunt
în relaţie directă.
40
FAZE STAŢIONARE
 Fazele staţionare includ:
 faze hidrofilice, atunci când se utilizează faze mobile apoase (apă sau soluţii)
 faze lipofilice, când se utilizează faze mobile organice (THF, cloroform).
 Se numesc geluri, pot fi utilizate sub presiune şi temperaturi de ordinul sutelor
de grade.

Proprietăţi:
 diametrul porilor → depinde de modul de preparare al gelului, care impune
gradul de reticulare/numărul porilor
Porozitatea se caracterizează prin capacitatea de umflare = cantitatea de solvent
care este absorbită de 1 gr. de gel uscat; capacitatea de umflare este cu atat mai
mare cu cat diametrul porilor este mai mare
 forma şi mărimea particulelor (granulelor) – trebuie să asigure stabilirea rapidă
a echilibrelor de difuzie; se prepara granule mici, de forma sferica, cu
granulometrie diferita functie de scopul urmarit

41
 consistenţa – rigiditatea gelurilor, depinde de natura gelurilor şi gradul de
reticulare
 spumoase
- cele mai poroase
- capacitatea cea mai mare de umflare
- rezistenţă mecanică redusă
- se deformează în coloană sub influenta propriei greutati si a vitezei de
curgere a eluentilor

 semirigide (xerogeluri)
- cele mai utilizate

 rigide (aerogeluri)
- rezistenţă mecanică mai mare
- se utilizeaza la separari cu debite mari, sub presiune ridicata

 să nu reacţioneze cu solvenţii – se utilizeaza la pH slab acid sau slab bazic

 să aibă afinitate redusă – evitarea fenomenelor de adsorbţie

42
Gel de dextran
Sephadex (Separation Pharmacia dextran)
- se obtin din dextran prin reactie de reticulare cu
epiclorhidrina glicerinei, in mediu bazic
- contine molecule de glucoza legate prin legaturi α-1,6
glicozidice si α-1,3 glicozidice
- tipuri : G10, 15, 25, 50 etc
- Gradul de reticulare depinde de cantitatea de agent
de reticulare
- Insolubil in apa
- fragil chimic si fizic
- Se separa molecule cu M = 700- 800.000 u.a.m.

Gel de agaroza
Sepharose
(Separation-
Pharmacia-
Agarose)

- se obtin din agar-agar

- este un polizaharid linear de D-galactoza si 3-6-anhidro_-L-galactoza
- sensibil fata de solventi oragnici, uree si de cresterea temperaturii peste 30 ºC
- sunt mai poroase decat sefadexurile
- se separa molecule cu M = 10.000 – 150.000.000 u.a.m.
43
Biogel (gel de poliacrilamidă)

- se obtin prin polimerizarea acrilamidei cu un agent de

reticulare, N-N’-metilen-bis-acrilamida
- insolubil in apa
- porozitate variabila
- Putin rezistente la medii foarte acide/bazice
- se separa molecule cu M = 200 – 400.000 u.a.m.

Aerogel

- este format din perle de sticla poroasa sau de

silice poroasa
- rigiditate mecanica buna
- se separa molecule cu M = 30.000 – 200.000
u.a.m.

44
 Alte faze staţionare:

o Gelurile polistiren, stirogel (stiren-divinilbenzen, Styragel)

- se obtin prin copolimerizarea derivatilor de stiren (vinilbenzen) cu
divinilbenzen (agent de reticulare)
-au porozitate mare
-au rigiditate mare
-sunt utilizate pentru separarea compuşilor putin polari (ex. Lipide)

o Fazele staţionare constituite din alcooli polivinilici ( Fractogel) sau

copolimeri cu poliglicerometacrilat sau vinilpoliacetat sunt utilizate pentru
separările de polimeri biologici ce se găsesc într-o fază apoasă
(polizaharide, proteine)

o Pentru separări hidrofilice sunt utilizate gelurile poroase constituite din

silicaţi ce conţin grupări gliceropropilice (Si-(CH2)3-O-CH2-
CH2(OH).CH2OH).

45
 Detectori
 recunoaşte substanţa ajunsă la nivelul lor
 schimbarea în compoziţia fazei mobile este transformată în semnal electric
ce este transmis la sistemul de prelucrare a datelor.

Un detector ideal trebuie:

 sa fie nedistructivi pentru componentii separati, daca sunt colectati
pentru analiza completa
 să aibă aceiaşi sensibilitate pentru toate componentele
 să aibă un interval de sensibilitate mare (să detecteze cantităţi foarte mici,
dar şi mari de probă)
 să nu fie influenţat de variaţia temperaturii
 să aibă un răspuns rapid
 să fie uşor de manipulat

Tipuri de detectori folosiţi:

 detectori de indice de refracţie (polimeri - variaţia indicelui de refracţie este
dependentă de masa moleculară)
 detectori de absorbţie în UV-Vis şi IR. Detectorii UV sunt excelenţi pentru
polimerii stirenici (polistiren, stiren/isopren, stiren/butadienă, epoxizi,
fenoli, policarbonaţi, poliuretani şi poliesteri aromatici).

46
Avantaje:
 absenţa oricăror interacţiuni cu faza staţionară
 eluţie rapidă
 are un timp bine definit de separare, datorită faptului că există un
volum de eluare finală pentru toţi analiţii nereţinuţi
 potenţialul de determinare al analitului este mare
 control şi măsură în timp real
 sensibilitate bună
 poate oferi benzi înguste
 deoarece analiţii nu interacţionează chimic sau fizic cu coloana, există o
şansă mai mică să apară pierderea analitului.
 estimarea rapidă şi relativ uşoară a greutăţii moleculară şi a distribuţie
de masă pentru probele de polimer

47
Dezavantaje:

 nu este aplicabilă pentru probe cu dimensiuni asemănătoare,

cum sunt izomerii (este necesară o diferenţă de cel puţin 10 %
între masele moleculare)

 filtrarea trebuie să fie efectuată înainte de a utiliza instrumentul

pentru a preveni ca praful şi alte particule să interfereze cu
detectoarele. Deşi utilă pentru protejarea instrumentului, pre-
filtrarea probei are posibilitatea de a elimina o substanţă cu masă
moleculară mai mare, înainte de a putea fi încărcată pe coloană. 

48
 APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUDERE
1. SEPARAREA MOLECULELOR

 Separarea moleculelor cu mărime diferită

 pe un gel foarte reticulat care retine numai moleculele foarte mici
 gelurile care exclud substanţele cu mase moleculare mai mari de 5.000 u.a.m. realizează o
veritabilă desalefiere, deoarece ionii minerali care difuzează liber pot fi eliminaţi în acest
mod
 separarea iodului nefixat în cursul purificării unui trasor, după marcarea unei proteine cu
131
I.

 Separarea moleculelor cu mărimi apropiate

 se bazeaza pe diferentele mici ale constantelor de difuziune
 se recomanda coloane mai lungi

 Analiza unui amestec de macromolecule

 purificarea fracţiunilor plasmatice pentru prepararea de medicamente sau reactivi de
diagnostic
 analiza stabilităţii materialelor plastice (ambalaje)

 Separarea celulelor
 limfocitele izolate de monocite

 Fracţionarea moleculelor mici

 analiza polipeptidelor si proteinelor
 analiza coloranţilor

49
2. DETERMINAREA MASEI MOLECULARE
 etalonarea directă a coloanei cromatografice cu etaloane de masă
molară cunoscută
 etalonarea indirectă, plecând de la determinarea volumului
hidrodinamic
 determinarea masei molare a imunoglobulinelor IgG din forme
farmceutice, presupunând că 90 % sunt sub formă de monomeri şi
10 % sub formă de dimeri.

3. DETERMINAREA DISTRIBUŢIEI MASELOR MOLECULARE

 se bazeaza pe relatia liniara dintre volumul de elutie si logaritmul
masei moleculare.

4. DETERMINAREA PURITĂŢII UNOR SUBSTANŢE FARMACEUTICE

Ex: determinarea unor proteine cu mase moleculare mari (ca
impuritati) in insulina.

50
 CROMATOGRAFIA CU FLUIDE SUPERCRITICE
SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY (SFC)

 Cromatografia cu fluide supercritice (SFC) este o metoda

complementara cromatografiei in faza lichida si a cromatografiei in
faza gazoasa, fiind o metodă de separare puternică şi universală, atât
la scară analitică, cât şi la scară preparativă.
 Relaţia celor trei tipuri de cromatografie este redatã ma jos:

51
 avantaje privind
sănătatea şi
siguranţa
utilizării

avantaje privind
avantaje privind condiţiile de
mediul desfăşurare a
înconjurător proceselor

Fluid
supercritic

avantaje legate
proces de
nepoluant caracteristicile
fizico-chimice

- densitate apropiata de a lichidelor

control uşor al - difuziune intermediara lichide-gaze
procesului - vascozitate mica apropiata gazelor
- solventi foarte buni
- solventi cu eficacitate mare

52
 CO2 lichid rece este pompat (12). Înainte de a intra în
coloană este încălzit, devine supercritic (23). Datorită
vâscozităţii scăzute, presiunea la ieşirea din coloană este
aproape identică cu cea din coloană (34). La ieşirea din
coloană, faza mobilă este decompresată, transformându-se în
fază gazoasă (45). Produşii sunt recuperaţi în cicloni, CO2
gazos este apoi curăţat, răcit şi returnat în rezervor.

53
 APARATURA
FAZE MOBILE

- dioxidul de carbon supercritic

- apa supercriticã , protoxid de azot, amoniac

POMPĂ
– tipul de pompă utilizată este determinat de tipul de coloană utilizată:
•ȋn cazul coloanelor cromatografice capilare - pentru a controla fluxul
principal de fază mobilă, se utilizează pompe de tip seringă care oferă o
presiune constantă
•ȋn cazul coloanelor ȋmpachetate (faze chimic legate/grefate), pentru o
amestecare mai uşoară a fazei mobile sau introducerea de fluide
modificatoare, se utilizează pompe de tip piston.

INJECTOR
– tipul de injector utilizat este determinat de tipul de coloană utilizată:
•ȋn coloanele capilare - proba trebuie introdusă rapid şi atunci se uilizează
supape acţionate pneumatic, cu divizor
•pentru coloanele ȋmpachetate - se utilizează valve injectoare tipice.

54
 COLOANE
 Coloane capilare (din gaz-cromatografie) - pentru separările unor probe
complexe - eficienţa mare – faze stationare identice GC
 Coloane cu faze legate (din cromatografia de lichide) – pentru separările
ce au loc cu viteză crescută ce necesită coloane cu eficienţă moderată şi
pentru probe ce au puţini componenţi - faze stationare identice HPLC

DETECŢIA
Detectori – tipul de detector utilizat este determinat de tipul de coloană
utilizat:
 pentru coloanele capilare şi CO2 ca fluid supercritic se pot utiliza toţi
detectorii din gaz-cromatografie şi mulţi dintre cei din HPLC.
 pentru coloanele ȋmpachetate, numărul detectorilor disponibili este
limitat.
o Spectrofotometric în UV sau FTIR
o Ionizare în flacãrã (FID - Flame Ionization Detector)
o Capturã de electroni (ECD - Electron Capture Detector)
o Spectrometrie de masã (MS - Mass Spectrometer)
55
 APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI CU FLUIDE SUPERCRITICE

Determinarea unor sulfonamide

Condiţii:
o Aparatura: Sistem Gilson SF3 pSFC
o Coloana: 250 x 4,6 mm cu fazã staţionarã cianopropil (mãrimea particulelor 5
mm)
o Temperatura: 50o C
o Sistem injecţie: Model 7125, 10 ml
o Faza mobilã: CO2 modificat cu metanol (10% primele 5 minute, creştere liniarã
la 15% timp de 10 minute)
o Viteza de curgere: 2 ml, 21 minute
o Presiunea: 180 bari
o Detecţie: UV 230 nm

TIC

56
Separãri chiralice/achiralice/de izomeri
Ibuprofen

Flurbiprofen

Fază mobilă: CO2 modificat cu un amestec de 5 % izopropanol și 5 % etanol (v/ v 10 %)

Coloana: Whelk-O1
O O
N O N O
H3 C CH2 CH 2 S H3 C CH2 CH2 S
NH C CH 3 NH C CH3
N N
H H

(+) Albendazol sulfoxide, (-)Albendazol sulfoxide

Lansoprazol Omeprazol Pantoprazol

57
Fitolul

Condiţii:
o Coloana: AMICON cu Silice 15 µm, 100 Å, (250 x 0,4 mm)
o Temperatura: 50o C
o Presiunea: 25 Mpa
o Solvent: CO2
o Viteza de curgere: 13,5 g/min
o Modificări ale dioxidului de carbon
cu MeOH, EtOH sau alcool izopropilic

58
Alte aplicatii
o Separări de vitamine liposolubile
o Separări de acizi graşi
o Separarea benzodiazepinelor din ser
o Purificǎri de substanţe farmaceutice
o Analiza oligomeri/polimeri

Cromatografia cu fluide supercritice a fost conceputa mai ales

pentru separarea:
o substantelor termolabile
o compusilor nevolatili
o unor macromolecule

59