Electroforeza

Noțiuni generale
Electroforeza este o metodă de separare a particulelor încărcate electric prin migrare
diferențiată sub acțiunea unui câmp electric. Termenul ionoforeză este folosit în cazul ionilor
de dimensiuni mici.
Principiile migrării electroforetice: migrarea particulelor depinde de mai mulți factori,
enumerați mai jos.
1. Mobilitatea electroforetică (μ), variază în funcție de sarcina și geometria particulei.
O particulă coloidală cu sarcina electrică Q, plasată într-un câmp electric E, este supusă
unei forțe F de deplasare care o conduce către electrodul de semn opus, proporțională cu sarcina
sa electrică (Q) și intensitatea câmpului electric (E):
F=Q•E
Forțele de frecare (f), datorate vâscozității mediului (η), se opun migrării particulei, mai
ales dacă particula este voluminoasă și viteza sa de migrare (v) este mare. Forța de frecare este
proporțională cu vâscozitatea mediului, raza (r), și viteza de deplasare ale particulei:
f = 6π • η • r • v
(N.B. Coeficientul de vâscozitate η depinde de temperatură)

La un moment dat, cele două forțe echilibrează particula, iar aceasta se va deplasa cu o
viteză constantă.
Q•E=6π•η•r•v
Din relația de egalitate a celor două mărimi se poate deduce expresia vitezei de deplasare
în câmp electric a particulei proteice:
v=Q•E/6•π•η•r
Din relația de mai sus se poate observa că viteza de migrare este proporțională cu
valoarea câmpului electric aplicat (E) și încărcarea electrică a particulei (Q) și invers
proporțională cu raza ei (r) și vâscozitatea mediului (η). Raportul dintre sarcina particulei și
produsul dintre dimensiunea particulei și vâscozitatea mediului se numește mobilitate
electroforetică (μ).
μ=Q/6π•η•r

Din ultimele două relații rezultă că mobilitatea electroforetică este raportul dintre viteza
particulei și intensitatea câmpului electric:

μ = v/E
 Mobilitatea electroforetică este o caracteristică a fiecărei particule și reprezintă viteza
de migrare într-un câmp electric de 1 Volt/cm și se exprimă în cm2 V-1s-1.
2. Curenții lichidieni:
o Curentul de electro-endosmoză
suport

stratul fix de sarcini negative

----------------
+++++++++++++ stratul fix de sarcini pozitive
+ -
+ ++++++++++++
----------------

suport

Suporturile electroforetice la pH alcalin se încarcă electronegativ producând un

potențial de suprafață și antrenarea unui strat electropozitiv format din cationi ai solventului.
Sub acțiunea câmpului electric, aceste sarcini pozitive se deplasează în direcția opusă
particulelor coloidale, împiedicând deplasarea particulelor cu mobilitate scăzută.
o Curenții de evaporare (efectul Joule)
Curentul electric determină creșterea temperaturii și pierderea de lichid prin evaporare,
ceea ce conduce la apariția curentului lichidian care perturbă migrarea particulei. Pentru a limita
acest fenomen, rezervorul este închis cu capac și în unele cazuri prevăzut cu un sistem de răcire.

Tehnici electroforetice
Electroforeză liberă, în coloană lichidă, după Tisélius (1937), acest tip de electroforeză
este realizată într-un tub în formă de U cu secțiune pătrată (pentru a efectua măsurători optice
prin tub, ca o cuvă de spectrofotometru): separarea nu este totală, dar zonele de separare sunt
puse în evidență prin metode optice (absorbție UV, indice de refracție, fluorescență). Această
metodă este utilizată în cercetare pentru determinarea mobilității electroforetice și pentru
determinarea purității proteinelor.

+ - + -

A B
A A A B
B B A B
A
A B A B
BA B A B A A A B A B
Electroforeza pe suport sau electroforeza zonală stabilizează faza lichidă prin
utilizarea unui suport poros impregnat cu un solvent tamponat. Suportul trebuie să fie omogen,
poros și inert. Cele mai utilizate suporturi sunt: hârtia, acetatul de celuloză, gelul de
poliacrilamidă, gelul de agaroză și gelul de amidon. Electroforeza se poate efectua pe bandă
(hârtie, acetat de celuloză), pe lamă sau în tub (pentru geluri).
 direcția migrare

gel direcția
migrare
tampon

tampon
gel

electroforeză orizontală electroforeză verticală

Revelarea
După separare, moleculele trebuie să fie identificate. La sfârșitul electroforezei, difuzia
își reia drepturile, determinând o pierdere de rezoluție (particulele grupate într-un loc precis au
tendința de a se dispersa). Pentru a evita difuzia, electroforegrama se supune unei operații de
fixare și apoi unei operații de revelare cu o substanță chimică adecvată.

Electroforeza proteinelor serice

Aceasta este o metodă generală care permite separarea constituenților unui amestec
proteic sub acțiunea unui câmp electric. Această metodă se bazează pe caracterul amfoter al
proteinelor, datorat prezenței concomitente a grupărilor funcționale amino și carboxil în
moleculă.
COOH
pH˂pHi catod (-)
(H+)
NH3+
COOH COOˉ
(+)

NH2 NH3+ pHpHi

(HOˉ)
pHi COOˉ
(0) anod (+)
NH2

(-)
Migrarea se efectuează, în general, la pH 8,2 - 8,6, obținut cu ajutorul sistemului tampon
veronal disodic – veronal. La pH mai mare decât pH-ul izoelectric (în general, pH 8,2 - 8,6),
proteinele sunt încărcate negativ și se comportă ca anioni ca urmare a ionizării grupărilor
carboxil ale aminoacizilor dicarboxilici (acid glutamic și aspartic). Sub acțiunea unui câmp
electric proteinele vor migra spre anod (+).
Principiul metodei
În tampon alcalin (pH = 8,6) proteinele serice sunt separate în 5 fracțiuni și apoi
evidențiate cu Coomassie blue sau amidoschwarz. După îndepărtarea colorantului în exces cu
o soluție acidă, gelul este uscat pentru conservare.
Materiale și reactivi
 - Agaroză;
- Generator de curent continuu;
- Cuvă de electroforeză;
- Pipete automate de 1 - 10 μL și vârfuri adaptate;
- Tampon veronal-veronal sodic pH 8,6;
- albastru de bromofenol (ABF), coomassie blue sau amidoschwarz;
- Acid acetic 5 %;
- Ser sanguin.
Tehnica
1. Prepararea gelului de agaroză
 Se prepară o suspensie de agaroză 1 % în tampon veronal-veronal sodic pH 8,6.
Se încălzește suspensia la 100 °C cu agitare pentru a obține un „gel topit” perfect
omogen.
2. Pregătirea probelor
 Proba constă din ser proaspăt sau păstrat la 4 °C timp de mai puțin de o
săptămână. Nu se utilizează plasmă (apare o bandă suplimentară la nivelul γ-
globulinelor datorată fibrinogenului) sau ser hemolizat (hemoglobina modifică
profilul electroforegramei).
 Se diluează serul în tampon veronal-veronal sodic pH 8,6, glicerol și colorant
ABF.
3. Electroforeza
 Se toarnă gelul de agaroză.
 Se umplu cele două rezervoare ale cuvei electroforetice cu tampon veronal-
veronal sodic pH 8,6.
 Proba (10 μL) este depusă în godeuri. Godeurile sunt poziționate la 1/3 de polul
negativ al gelului. Se așteaptă pătrunderea probelor în gel.
 Se închide cuva electroforetică.
 Se conectează cuva electroforetică la generatorul de curent electric continuu.
 Se efectuează migrarea la aproximativ 10 V/cm. Se utilizează ABF ca marker în
timpul migrării.
4. Colorarea gelului
 Fixarea și colorarea se efectuează prin imersarea gelului într-o baie de coomassie
blue / amidoschwarz 5 g/L (preparat în acid tricloracetic 5 %) sub agitare, 10
minute.
 Decolorarea / spălarea se efectuează prin imersarea gelului într-o baie de acid
acetic 5 % sub agitare.
5. Analiza electroforegramei
 Identificarea fracțiunilor proteice.
Electroferograma cuprinde cinci fracțiuni: albumine, α1-globuline, α2-globuline, β-
globuline și γ-globuline.
Evaluarea colorimetrică a electroforegramelor
 Decupați fracțiunile separate.
 Introduceți fiecare fracție într-o eprubetă.
 Se adaugă 1 mL soluție de eluare (NaOH 0,1 N) și se încălzește pe baie de apă.
 După 20 de minute, citiți absorbanța la 570 nm.
 Completați următorul tabel:

Fracția proteică Absorbanță ∑AGlobuline ∑A % 𝐴𝐴𝑙𝑏𝑢𝑚𝑖𝑛𝑒

(A) (AAlbumine + 𝐴𝑋 ∑A𝐺𝑙𝑜𝑏𝑢𝑙𝑖𝑛𝑒
∑AGlobuline) 𝑥 100
∑A
Albumine
1-globuline
2-globuline
-globuline
-globuline
Valorile fiziologice pentru om sunt:

Fracția proteică %
Albumine 52 - 65
Alfa 1 globuline 2 – 4,5
Alfa 2 globuline 10 - 15
Beta globuline 6 - 13
Gama globuline 10 - 19

Exerciții

1. Explicați și comentați următoarele afirmații.

a. Solubilitatea minimă a unei proteine este atinsă la punctul izoelectric (pHi).
b. Pentru o valoare a pH-ului mai mare decât pH-ul ei izoelectric, o proteină poartă
întotdeauna o sarcină negativă, iar pentru o valoare a pH-ului mai mică decât pH-ul ei
izoelectric, o proteină poartă întotdeauna o sarcină pozitivă.
2. Trei proteine (A, B, C) au fost supuse electroforezei în gel de agaroză la pH 7. După migrare
și revelare, s-a obținut următoarea electroforegramă:
start

-
+
A B C

Având în vedere polaritatea indicată, ce fel de proteine corespund fracțiunilor notate A, B

și C?
3. Electroforeza este o tehnică de separare care exploatează următoarele caracteristici
moleculare:
a. dimensiunea și sarcina electrică;
b. solubilitatea moleculelor;
c. dimensiunea și polaritatea moleculelor;
d. forma moleculelor.
4. Peptidele A (Lys-Gly-Ala-Ala), B (Lys-Gly-Ala-Glu) și C (His-Gly-Ala-Glu) au fost
supuse electroforezei la valorile de pH 2 și 11. În ce direcție vor migra cele trei peptide?