ANALIZA

MEDICAMENTULUI
NOTE DE CURS (5)
30-31.10.2017 Conf.dr. Cristina Adela Iuga
 Obiective
2

 Electroforeza capilară (EC) în analiza

medicamentelor
 Principii generale
 Tehnici electroforetice

 Aplicatii in analiza medicamentului

 Spectrofotometria de absorbţie UV-VIS

 Principii generale
 Aplicaţii in analiza medicamentului
 Electroforeza capilară (EC) în analiza
3
medicamentelor
Principii generale
Tehnici electroforetice
 Electroforeza capilară (EC)
4

 Farmacopeea Europeană Ediţia 8.8 - Capillary Electrophoresis

 EC este tehnica de analiză cu cea mai rapidă ascensiune în
analiza farmaceutică, fiind considerată rivala HPLC ca
aplicabilitate
 Echipamentul este destul de simplu, voltajul aplicat fiind insă
unul ridicat
 EC este preferată atunci când sunt necesare separări foarte
selective
 Electroforeza capilară (EC)
5

 Avantaje
 Eficienţa potenţială este mult mai mare
 Timp de analiza mult mai scurţi

 Coloane mai ieftine

 Consum de solvenţi mai redus

 Dezavantaje
 Robusteţe inferioară
 Sensibilitate inferioară

 Optimizarea mai dificilă

 Electroforeza capilară (EC)
6

 Separarea analiţilor din proba aflată în soluţie, se realizează prin

aplicarea unui potenţial ridicat (10-30kV) la capetele unei coloane
capilare (25-75m) de silice fuzibilă ce conţine faza mobilă.

 Faza mobilă are în general o componentă apoasă şi obligatoriu un

electrolit.

 În curent electric ionii încep să migreze către electrodul de sarcină opusă în

funcţie de sarcină şi raza ionului

 Analiţii neutri migrează prin coloana capilară datorită fluxului

electrosmotic, care în general este spre catod.

 Sistemul de detectie măsoară semnalele generate de ioni pe măsura

trecerii lor prin soluţie
 Electroforeza capilară (EC)
7

 Separarea electroforetică a analiţilor se datorează diferenţelor de viteză

de migrare în câmp electric
v = E x μe (ecuaţia 1)
 v – viteza de migrare
 E- câmpul electric aplicat (Volti/cm) – depinde de lungimea capilarului si potentialul
aplicat
 μe = mobilitatea electroforetică

 Câmpul electric se exprimă în V/cm şi depinde de lungimea capilarului şi

de intensitatea potenţialului aplicat
μe = (FE) forţa electrică / (FF) forţa de fricţiune
FE = qE
 q = sarcina ionului (cu cât este mai mare, ionul migrează mai rapid)
 E = câmpul electric aplicat
 Mobilitatea electroforetică (μe)
8

 Pentru un ion sferic:

FF= -6πηrv
 η = vâscozitatea mediului
 r = raza ionului
 V = viteaza ionului

 În situaţia în care, pentru un ion, forţa electrică FE este egală cu

forţa de fricţiune FF se obţine ecuaţia 2
qE=-6πηrv

 Prin substituire se obţine pentru mobilitatea electroforetică

ecuaţia:
μe = q/6πηr
 Electroforeza capilară (EC)
9

Watson, 2012; Fig.14.1

 Fluxul electroosmotic (FEO)
10

 Peretele capilarele de sticlă se comportă

similar cu suprafaţa silicagelului şi sunt
încărcate negativ; pKa-ul grupelor silanol
variază între 4 şi 9
 Cationii din soluţia tampon de migrare sunt
atraşi la nivelul stratului anionic fix de la
suprafaţa peretelui capilar determinând
pozitivarea acestuia
 Ca urmare moleculele de apă sunt atrase
către pereţii capilarului
 Când se aplică un potenţial electric, cationii
din soluţie migrează către catod, trăgând
după ei moleculele de apă – fluxul
Watson, 2012; Fig.14.2
electroosmotic
 Reglează viteza de deplasare în electrolit a
speciilor neutre şi încărcate pozitiv.
 Fluxul electroosmotic FEO
11

 Existenta FEO face ca virtual toti compusii de

interes din solutie indiferent de sarcina lor
(cationi, anioni, neutri) sa se deplasese spre
catod
 Viteza FEO spre catod excede aproximativ de
10X mobilitatea electroforetica a anionilor
spre anod
 Cationii se deplaseaza cu o viteza egala cu
FEO+mobilitatea lor electroforetica; primii vor
ajunge cationii cei mai mici
 Moleculele neutre se deplaseaza cu o viteza
egla cu a FEO
 Anionii se deplaseaza cu o viteza egala cu
FEO – mobilitatea lor electroforetica; ultimii
vor ajunge la catod anionii cei mai mici

Watson, 2012; Fig.14.4

 Factorii care afecteaza FEO
12

Variabila Efectul asupra FEO Comentarii

pH-ul tamponului FEO creste cu pH-ul Cea mai convenabila modalitate de control al FEO;
trebuie sa se tina cont de efectul asupra analitilor
Forta ionica a FEO scade cu cresterea Cresterea fortei ionice determina cresterea intensitatii
tamponului fortei ionice curentului electric prin capilar si incalzirea acestuia
Forta ionica mica – proba se absoarbe mai mult pe
peretii capilarului

Campul electric Cresterea campului Scaderea campului electric determina separari

electric, creste FEO insuficiente, cresterea lui determina incalzirea
capilarului
Temperatura Cresterea temperaturii Usor de controlat
scade vascozitatea si
creste FEO
Modificator Uzual scade FEO Efect complex care trebuie evaluat experimental
organic

Watson, 2012; Table.14.1

 Factorii care afecteaza FEO
13

Variabila Efectul asupra FEO Comentarii

Surfactantul Se absoarbe la suprafata •Surfactantii cationici au o afinitate mare fata de
capilarului gruparile silanol si blocheaza accesul cationilor mici in
solutie reducand FEO; la concentratii mari formeaza un
strat dublu care determina incarcarea pozitiva a
capilarului si inversarea FEO (catre anod)
•Surfactantii anionici scad accesul ionilor mici in
tamponul de migrare si cresc FEO
Acoperirea Pot creste sau scadea FEO •Stratul de acoperire neutru reduce incarcarea
covalenta a dependent de tipul negativa a capilarului si scade FEO
peretilor stratului de acoperire •Straturile de acoperire ionice vor avea efect
capilarului pronuntat asupra FEO

Watson, 2012; Table.14.1

 Echipament EC
14

 Injectarea probei este automata si se

realizeaza de regula prin presurizarea cu
aer (50bari) a fiolei de injectare
 Dupa incarcarea probei, capilarul este trecut
intr-un recipient ce contine tamponul de
migrare; debitul tamponului de migrare prin
capilar fiind de ordinul nl/min
 Coloanele capilare sunt termostatate:
deschise la ambele capete, i.d. 0.025-
0.05mm, L= 50-100cm
 La capatul catodic capilarele au o fereastra
transparenta care permite detectia analitului
 Detectorii uzuali sunt: UV-VIS, PDA
 Alti detectori: fluorescenta, conductometric,
MS

Watson, 2012; Fig.14.5

 Aplicaţii ale EC în analiza medicamentului
15

 Calitative

 Separarea si identificarea componentelor din amestecuri complexe pe

baza timpului de migrare (tm)

 Puritate – disparitia unor picuri sau aparitia de picuri suplimentare

 Cantitative

 Cuantificarea substanţelor medicamentoase pe baza relatiei de

proportionalitate intre aria picului si concentratia in analit
 Tehnici electroforetice
16

 Electroforeza capilară zonala

 Cromatografie electrocinetica micelara (MEKC)

 Electroforeza capilara de afinitate

 Electro-cromatografie capilara
 Electroforeza capilară zonală
17

 Oficinala in FE – aplicata in cazul separarilor dificil de realizat prin HPLC

 Este cea mai utilizată tehnică de electroforeză

 Faza mobila poate fi o solutie tampon acida (fosfat/ citrat), bazica (borat)
sau un amfolit (acid+ bazic) in care se adauga diferiti aditivi
(ciclodextrine)

 FEO creşte odată cu cresterea pH-ul fazei mobile

 Ordinea de separarie: cationi, moleculele neutre, anioni

 Cromatografie electrocinetică micelară
18
MEKC
 Se aplică cu precadere pentru separarea moleculelor neutre, ce au
tendinţa de a migra spre catod fără a se separa, dar si a speciilor ionice

 În faza mobilă se adauga un surfactant cationic, anionic (laurilsulfat de

sodiu) sau neutru peste concentratia micelara critica cand se formeaza
micele încărcate electric

 Micelele incorporeaza compuşii neutri - afinitate de tip hidrofil/ hidrofob

 Micelele cationice migreaza spre catod, cele neutre cu FEO si cele anionice
in sens contrar FEO
 Electrocromatografia capilară (CEC)
19

 Asociază electromigrarea ionilor (electroforeză) cu procesele de repartiţie

între faze (cromatografie)

 Capilarul contine faza stationara solida, cea mai uzuala fiind cea de tip
monolitic

 Faze stationare de tip monolit se caracterizeaza prin porozitate mare

asociata cu presiunea mica de operare

 Separarea se datoreaza atat electromigrarii cat si adsorbtiei pe faza

stationara

 Se aplică in cazul separarilor dificil de realizat prin alte metode

 Exemplu
20

 EC zonala
 Separarea atenololului si
impuritatilor sale
 Capilar: 0.05mmx50cm la 15kV
 Faza mobila: tampon borat/fosfat
pH=9.7
 Separarea se realizeaza
predominant pe baza sarcinii
 AT – atenolol
 TA – atenolol dimer
 D – atenolol diol
 BA – forma acida
 PPA – forma fenolica

Watson, 2012; Fig.14.6

 Exemplu
21

 AINS conţin o grupare acida care are ionizeaza la pH=9.1 cu formare de

anioni monovalenti

C
l
O
F

O
H

O
C
O
O
H

N
N
H
C
H3

N
S
C
H

C
H3
H

O
H
C
O
O

C
O
O
H
S C
H3

Sulindac, M=356.4, pKa=4.09 Indometacin, M =357.7, pKa=4.5 Piroxicam, M=331.346, pKa=4.7

C
l
O

C
H3

O
S

O
C
O
O
H

O
H
Acid tiaprofenic, M=260.3, pKa=4.03 Alclofenac, M=226.66, pKa = 4.6
 Exemplu
22

 EC zonala
 Faza mobila: tampon glicină 0.075
M pH 9.1 cu trietanolamina
 Separare pe baza razei ionice;
migrarea a anionilor contrara FEO

 Ordinea separării:
 Sulindac (S)
 Indometacin (I)
 Piroxicam (P)
 Acid tiaprofenic (T)
 Alclofenac (A)
 Exemplu
23

 EC zonala
 Separarea enantiomerilor
anestezicelor locale
 Faza mobila: tampon fosfat pH 3.0
cu adaos de surfactant cationic
(trietanolamina) si 10mM 2-metil-
betaciclodextrina ca selector chiral
 FEO spre anod
 2-beta-ciclodextrina migreaza
spre anod cu FEO
 Compusii migreaza spre catod
mult mai lent
 Concluzii
24

 Separarea analiţilor - datorită diferenţei între viteza de migrare a speciilor

neutre sau purtătoare de sarcini electrice din proba aflată în soluţie într-un
câmp electric
 Analiţii migrează în câmpul electric aplicat dependent de sarcina şi mărimea
lor
 Analiţii neutri migrează prin coloană datorită fluxului electroosmotic FEO
 In fazele mobile pot fi adaugati diferiti aditivi (surfactanti, ciclodextrine, etc)
care cresc slectivitatea metodei
 Metoda foarte eficientă de separare a amestecurilor complexe dar si a
enantiomerilor
25 Spectrofotometria de absorbtie

 Spectrofotometria UV-VIS
 Principii generale
 Aplicatii in analiza farmaceutica
 Obiective
26

 Clasificare si definitii
 Spectrofotometria de absorbtie

 Spectrofotometria de emisie

 Echipamente utilizate in spectrofotometria UV-VIS

 Aplicatii in analiza farmaceutica

 Metode spectrofotometrice
27

Clasificare Definitii
 Metode spectrofotometrice  Totalitatea tranziţiilor electronice sau
moleculare de pe nivele energetice
aplicate în analiza inferioare pe nivele superioare consitutie
medicamentului: un spectru de absorbție (UV, VIS, IR)

 ultraviolet (UV)

 vizibil (VIS)

 în infrarosu (IR)

 de fluorescentă (FLD)  Totalitatea tranziţiilor electronice sau

moleculare de pe nivele energetice
superioare pe nivele inferioare consitutie
un spectru de emisie (FLD)
 Spectrul electromagnetic al luminii
28
 Domeniul spectral vizibil
29

 Spectrul vizibil reprezintă porţiunea din spectrul electromagnetic care este

vizibilă pentru ochiul uman
 Undele luminoase cu lungimi de undă scăzute au frecvenţe şi energii crescute
 Undele luminoase cu lungimi de undă mari au frecvenţe şi energii scăzute
 Spectrofotometria de absorbție
30

 Studiul spectrelor de absorbţie obţinute în lumină monocromatică

 Spectrele de absorbţie în domeniul UV (200 – 400nm) şi VIS (400–

750nm) sunt spectre electronice-viratorii-rotatorii

 Spectrele de absorbţie în domeniul IR apropiat (2.5–0.8) m şi IR

mijlociu (30–2.5 m) sunt spectre vibratorii-rotatorii, respectiv in IR
indepărtat (1000–30 m) sunt spectre de rotație pură

 Spectrele de absorbţie au o semnificaţie calitativă şi cantitativă pentru

caracterizarea şi determinarea substanţelor medicamentoase ca atare
sau din amestecuri
 Spectrofotometria de absorbție
31

Tabel I - Grupări funcţionale şi legături cromofore în domeniul spectral UV si IR

Spectrofotometria UV-VIS
 Legea Lambert–Beer
I=I0x10-εcl
 în care:
 I = intensitatea luminii transmise
 I0 = intensitatea luminii incidente
 ε= absorbtivitatea molară
 c = concentraţia (% m/V)
 l = lungimea stratului absorbant
(cm)
 Limita de detecție a metodei este de
10-4M - 10-5M;
 Absorbanţa (A) – (densitatea optică, extincţia) unei
soluţii este proporţională cu concentraţia în substanţa
de analizat a soluţiei ş cu grosimea stratului
absorbant (l).
 Transmitanţa (T) – (transmisia) este raportul dintre
intensitatea luminii transmise (I) şi intensitatea luminii
incidente (I0).
 Absorbtivitatea (a) - este raportul dintre absorbanţa
soluţiei de analizat (A) şi produsul dintre concentraţia
soluţiei (c) exprimată în g/l şi grosimea stratului
absorbant (l) exprimat în cm.
 Absorbtivitatea molară () - este o măsură a
absorbţiei luminii la o anumită lungime de undă, într-
un strat cu grosimea de 1cm al soluţie de analizat cu
o concentraţie de 1mol/L.
 Absorbanţa specifică A1cm 1% - (extincţia specifică)
absorbanţa unei soluţii cu concentraţia de 1g%
(m/V), citită în cuvă de 1cm, la o anumită lungime de
undă şi într-un anumit solvent.
 Spectrofotometru UV-VIS
33

 Sursa de radiaţii - filament de wolfram pentru domeniul vizibil şi lampă de

deuteriu sau hidrogen pentru domeniul ultraviolet
 Monocromatorul
 Suportul pentru cuve si cuvele
 Confecţionate din sticlă/plastic (VIS)
 Cuarţ/raşină specială (UV)
 Amplificatorul
 Detectorul
 Înregistratorul
 Spectrofotometru UV-VIS cu şir de
diode
34

Fanta
Oglinda

Sir de diode

Fanta

Cuva
Lampa deuteriu (UV)
Lampa tungsten (VIS)

Monocromator
 Spectrul UV-VIS
35

 Reprezentarea grafică a absorbantelor în funcţie de valorile lungimii de undă

 Fiecare spectru are o semnificaţie calitativă şi cantitativă

Fig.1 Reprezentarea grafică a unui spectru UV

 Aplicaţii in analiza medicamentului
36

 Identificarea unei substanţe se poate face prin:

 compararea spectrului obţinut cu spectrul substanţei etalon realizat în
aceleaşi condiţii
 compararea cu date din literatură

 Abaterea admisă faţă de lungimea de undă acceptată de farmacopei

pentru identificarea unei substanțe este de ±2nm

 Controlul puritătii unei substanţe se realizează prin:

 Calcularea raportului absorbanţelor la anumite lungimi de undă

 Calcularea diferenţei absorbanţelor la anumite lungimi de undă

 Substanţa se consideră pură dacă valorile astfel calculate se
încadrează în intervalele prevazute de farmacopei
 Aplicaţii in analiza medicamentului
37

 Determinarea cantitativă în UV-VIS a unei substanţe se

realizează, în general, la lungimea de undă la care aceasta
prezintă un maximum de absorbţie

 Este necesar să fie respectat domeniul de liniaritate a legii

Lambert-Beer (absorbanţa cuprinsă între 0.2-0.8)

 Evaluarea cantitativă se poate face astfel:

 Cu ajutorul unui etalon cu o concentraţie cunoscută Ce
 Prin intermediul unei curbe de calibrare construită din minimum 5
puncte
 Cu ajutorul absorbanţei specifice A1cm 1%
 Spectrofotometria UV-VIS derivată
38

 Spectrul derivat este reprezentarea grafică

a derivatei 1-a, a2-a sau superioare ale
absorbanţei în funcție de lungimea de undă

 Avantaj: permite evidenţierea unor detalii

imposibil de obţinut prin reprezentarea
clasică a spectrului

 Dezavantaj: raportul semnal/zgomot este

mai mic decât la spectrele clasice
 Dozarea omeprazolului
39

 Omeprazolul prezintă în soluţie

metanolică un maxim de
absorbtie la 302nm

 Produşii săi de degradare

absorb pe tot domeniul
spectral 200-400nm

 Spectrele suprapuse ale

omeprazolului:
1. OPZ
2. OPZ degradat 10%
3. OPZ degradat 100%

Fig. 2 Spectrele OPZ si OPZ degradat

 Dozarea omeprazolului
40

 Spectrele derivate de ordinul 1

ale omeprazolului:
1. OPZ
2. OPZ degradat 10%
3. OPZ degradat 100%

 Lungimea de undă optimă pentru

determinarea cantitativă este
cuprinsă între 312-314nm

 In acest domeniu poate fi

evidenţiată prezenţa produşilor de
degradare

Fig. 2 Spectrele derivate (1) ale OPZ si OPZ degradat

 Dozarea omeprazolului
41

 Spectrele derivate de ordinul 2

ale omeprazolului:
1. OPZ
2. OPZ degradat 10%
3. OPZ degradat 100%

 Diferenţa între spectrele OPZ,

OPZ degradat 10%, respectiv
OPZ degradat 100% nu este atât
de netă

 Cea mai bună alegere din punct

de vedere analitic o reprezintă
derivata de ordinul unu

Fig. 3 Spectrele derivate (2) ale OPZ si OPZ degradat

 Identificare
42

 Imipraminum hydrochloricum
 Spectrul in ultraviolet si vizibil al solutiei 0.001%m/V prezinta 3
maxime: la 215nm, la 410nm si la 620nm
 Controlul puritatii
43

 Imipraminum hydrochloricum
 Substante straine
 Spectrul in ultraviolet si vizibil al solutiei 0.001%m/V prezinta 3
maxime: la 215nm, la 410nm si la 620nm
 Diferenta absorbantelor solutiei determinate la 410nm si la
215nm, trebuie sa fie cuprins intre 0.2 si 0.4, iar diferenta
absorbantelor aceleiasi solutii, determinate la 410nm si 620nm
trebuie sa fie cuprins intre 0.2 si 0.5
 Determinare cantitativa - etalon
44

 Diclofenac 100mg/supozitor
 Mod de lucru
 Soluţia etalon: din soluţia etalon gata preparată se măsoară exact 1mL (cu pipeta cu
cotă) într-un balon cotat de 50mL şi se aduce la cotă cu NaOH 0,1N (Ce=1mg/ml).
Soluţia se omogenizează şi se citeşte absorbanţa la 277nm faţă de NaOH 0,1N (Ae)

 Soluţia probă: într-un pahar Berzelius de 50mL, se cântăreşte cu exactitate pe balanţa

analitică o masă de supozitoare corespunzătoare la 50mg diclofenac sodic. Se adaugă
25mL apă distilată, 2g de parafină solidă şi se menţine pe baie până la topirea bazei
de supozitor. Se agită cu o baghetă de sticlă amestecul topit menţinut pe baia de apă
timp de 5 minute. Se răceşte sub jet de apă, fără agitarea paharului. După solidificarea
bazei de supozitor, lichidul se filtrează într-un balon cotat de sticlă de 50mL. Se repetă
operaţia de extracţie de încă 2 ori cu câte 10mL apă distilată şi se colectează filtratele în
acelaşi balon cotat. Se aduce la cotă cu apă distilată şi se omogenizează. 1mL din
această soluţie se aduce într-un alt balon cotat de sticlă de 50mL. Balonul se completează
la cotă cu NaOH 0,1N, se omogenizează şi se citeşte absorbanţa la 277nm faţă de
solvent (Ap)
 Exemplu
45

 Mod de calcul
 Determinare cantitativa – A1cm1%
46

 Furazolidonă suspensie 0.5%

 Mod de lucru
 Într-un balon cotat de 50mL se cântăresc, cu ajutorul unei pipete, exact (ag) 0.8000g
suspensie în prealabil bine omogenizată, se adaugă 10mL acid acetic glacial şi 5mL
NH4OH 25%, se completează cu apă la cotă. 10mL din această soluţie masurată exact cu
pipetă cu cotă se diluează apă la 100mL într-un balon cotat şi se citeşte absorbanţa
soluţiei (A) la spectrofotometru, la 367nm, în cuve de cuarţ de 1cm, faţă de apă.
Absorbanța specifică la 367nm = 746.
 Exemplu
47

 Mod de calcul
 Exemplu
48

 Miofilin 100mg/cp
 Mod de lucru (Dozarea teofilinei)
 Se cântăreşte cu exactitate o cantitate de pulbere corespunzătoare la 100mg teofilina se
agită cu 50 mL de NaOH 0,1 mol/L într-un balon cotat de 100 mL, (timp de 15 minute)
după care se aduce la semn cu acelaşi solvent. Soluţia se filtrează, îndepărtându-se primii
20 mL de filtrat. 0,5 mL soluţie filtrată măsurată exact cu pipetă cu cotă se diluează la
50 mL în balon cotat cu o soluţie de NaOH 0,1mol/L. Se citeşte absorbanţa soluţiei la
lungimea de undă de 278nm folosind ca lichid de compensare soluţia de NaOH 0,1
mol/L. Absorbanța specifică la 278nm = 428.
 Exemplu
49

 Mod de calcul
 M aminofilina = 420,427

 M teofilina = 180,164

 M etilendiamina = 60,1
 Concluzii
50

 Metoda spectrofotometrică UV-VIS poate fi aplicată la

analiza tuturor substanţelor ce posedă în moleculă grupări
cromofore

 Limita de detecţie a metodei este de 10-4M - 10-5M

 Spectrofotometria UV-VIS este o metodă analitică cu aplicatii:

 Calitative (identificare, controlul calității)
 Cantitative– dozarea substanțelor active ca atare sau din forme
farmaceutice după o prealabilă extracţie

 Spectrofotometria derivată oferă posibilitatea determinării

cantitative a:
 Substanţelor active în prezența produşilor lor de degradare
 Amestecurilor de substanţe medicamentoase
 Bibliografie
51

 Watson DG. Pharmaceutical analysis. Second edition. A

textbook of pharmacy student and pharmaceutical chemists,
Elsevier; 2005.

 Rouessac F, Rouessac A. Analyse Chimique. Méthodes et

techniques instrumentales modernes 6e édition, Dunod; 2004.

 Farmacopeea Europeana 8.8 online