ANALIZA

MEDICAMENTULUI
NOTE DE CURS (4) Conf.dr. Cristina Adela Iuga
23-24.10.2017 Sef.lp.dr Simona Codruţa Hegheş
Sef lp. dr. Lucia Maria Rus
 Obiective
2

 Cromatografia pe strat subţire (CSS/TLC)

 Principii ale cromatografiei planare
 Aplicaţii în analiza medicamentului

 Cromatografia planară modernă

 HPTLC
 UTLC
 Cromatografia pe strat subtire (CSS)
3

 Thin layer chromatography (TLC)

 European Pharmacopoeia 8.8 capitolul 2.2.27

 Metodă care permite separarea componentelor unui amestec

pe baza diferenţei lor de deplasare de-a lungul unui strat
adsorbant sub acţiunea unui sistem de solvenţi

 Mecanismele prin care se poate realiza separarea:

 Adsorbţie
 Repartiţie
 Schimb ionic
 Faza staţionară
4

 Silicagel

Structura silicagelului

 Oxid de aluminiu
 Celuloză
 Silicagel modificat – C18, C8
 Pulbere de poliamidă
 Hidroxid, silicat de magneziu/ calciu
 Răşini schimbătoare de ioni
 Faza staţionară
5

 Se poate aplica:
 Sub formă de suspensie depusă:
 Pe o placă de sticlă
 Pe folie de aluminiu/polimer

 Se adaugă:
 Lianţi: polimetacrilat 1-2% , CaSO4 (silicagel G)
 Agenţi fluorescenţi ex. silicagel GF254/366 ToC

 Pretratamentul plăcilor:
 Spălare, impregnare
 Activare 120°C timp 20min
 Separare prin adsorbţie
6

 Faza stationară polară:

 Solidă, insolubilă în faza mobilă
 Să nu interacţioneze chimic cu faza
mobilă şi cu substanţele de separat
 Polaritate, capacitatea de adsorbţie:
 Slabă
 CaCO3
 Puternică
 Gel de silice (SiO2), alumină (Al2O3)
 Separare prin adsorbţie
7

 Faza stationară nepolară:

 Fixată prin legături
covalente la suprafaţa
stratului adsorbant
 Grupări grefate:
 Intermediar-polare =
cromatografie in faza
normala (NP): diol,
cianopropil, aminopropil
 Nepolare =
cromatografie in faza
inversa (RP): alchil (C8,
C18), fenil
 Separare prin schimb ionic
8

 Faza stationară:
 Suport insolubil în apă grefat cu grupări funcţionale ionizabile

Schema separarii cromatografice prin schimb ionic

 Faze mobile
9

 Solvenţi organicianorganici de puritate avansată, cu capacitate de eluţie

diferită faţă de acelaşi adsorbant

 Capacitatea de eluţie a fazei mobile depinde de:

 Polaritate
 Constanta dielectrică
 Capacitatea de a forma legături de hidrogen
 pH-ului mediului

 Faza mobilă se alege dependent de structura şi proprietăţile substanţelor

de separat

 In faza mobilă se utilizează amestecuri de doi sau mai mulţi solvenţi

 Faza mobilă trebuie să aibă polaritate opusă fazei staţionare

 Serie eluotropă - fază staţionară polară
10

Watson, 2012; Table 13.2

 Optimizarea separării
11

 Fază staţionară polară

 Substanţele polare rămân pe linia de start
 Substanţele nepolare migrează în frontul solventului
 se creşte polaritatea fazei mobile (prin adăugare de apă, alcooli,
acizi, baze)

 Fază staţionară nepolară

 Substanţele nepolare rămân pe linia de start
 Substanţele polare migrează în frontul solventului
 se scade polaritatea fazei mobile (prin adăugare de hexan, toluen,
eter etilic etc.)
 Exemplu
12

Triamcinolon logP=1.16
Hidrocortizon logP=1.61
Hidrocortizon acetat logP=2.19
Testosterone logP=3.32
Testosterone propionate logP=4.77

Watson, 2012; self-test 13.2

 Echipament
13

 Plăci cromatografice din

sticlă sau din alte materiale
(10x10cm, 10x20cm,
20x20cm)

 Vase de sticlă- cu închidere

etanşă (bacuri
cromatografice)

 Microcapilare gradate
 Etapele unei analize CSS
14

 Aplicarea probelor

 Developarea

 Uscarea

 Revelarea

 Interpretarea

 Conservarea
 Tehnici cromatografice de developare
15

 Dependent de sensul de
migrare al solventului pe
placa cromatografică:
 Tehnica ascendentă (a)
 migrarea fazei mobile se
realizează datorită forţei de
capilaritate

 Tehnica descendentă (b)

 migrarea fazei mobile se
realizează în sensul forţei de
gravitaţie
 Tehnica ascendentă unidimensională
16

 O singură eluţie în sens ascendent

 Tehnica ascendentă bidimensională
17

http://static.trunity.net/images/302097/400x413/scale/icb-01.19.jpg
 Tehnica ascendentă bidimensională
18

 Amestec de aminoacizi obtinuti din hidrolizate proteice

 A = Proba
 Solvent-1: Toluen : 2-Cloroetanol : Piridina;
 Solvent - 2: Cloroform : Alcool benzilic : Acid acetic
 Revelare: ninhidrina (spoturi de la roz la violet)
 Cromatograma
19

 Evaluare calitativă -
(identitate şi puritate)
 Parametrul de identificare
este Rf-ul care este constant
în condiţii cromatografice
standardizate

 Evaluare cantitativă
 Metode de identificare
20

 Tehnica standardelor externe

 Tehnica standardelor interne

 Tehnica eluţiei
 Identificare
21

 Tehnica standardelor externe

1. Proba (P) =A+B+C

2. Etalon (A)
3. Etalon (B)
4. Etalon (C)
 Exemplu
22

 Condiţii cromatografice:

H
N

O
 Adsorbant: silicagel GF254

O
 Developant: acetat de etil -
acid acetic glacial (99:1)

O
Soluţii de aplicat:

H

 Sol. etalon 1% m/V în metanol Acid acetil salicilic Paracetamol
de acid acetil salicilic,

O
paracetamol, codeină, cafeină

O
 Sol. probă

N
Distanţa de migrare a

N


N
developantului: 10 cm

N
N
O
O
 Revelarea cromatogramei: H
expunere la lumina UV Cafeină
Codeină
 Exemplu
23

 Identificarea componentelor din comprimate analgezice-

antipiretice

1- probă analizat
2- acid acetilsalicilic (e.n)
3- paracetamol (e.n)
4- codeină fosfat e.n)
5- cafeină (e.n)

1 2 3 4 5
 Identificare
24

 Tehnica standardelor interne

C
1. Proba (P) =A+B+C
B
2. Etalon (A) = P+A
3. Etalon (B) = P+B
A
4. Etalon (C) = P+C

1 2 3 4
 Identificare
25

 Tehnica eluţiei
 Se răzuieşte adsorbantul care conţine zona
corespunzătoare compusului de interes,
 Se suspendă stratul adsorbant ce conţine spotul de interes
în solvenţi adecvaţi de extracţie
 Substanţa extrasă se va identifica prin alte metode analitice
 Evaluarea purităţii
26

 Prezența impurităţilor determină apariţia de spoturi

suplimentare
 În cazul în care substanţa de analizat şi impurităţile prezintă
aceaşi modalitate de revelare, în farmacopee există
următoarele situaţii:
 Nu se permite prezenţa impurităţilor
 Se admite prezenţa impurităţilor în anumite limite
 Sunt disponibile etaloane de impurităţi

 Nu sunt disponibile etaloane de impurităţi

 Evaluarea purităţii
27

 CHLORDIAZEPOXIDUM
 Adsorbant: silicagel G
 Developant: toluen-cloroform-metanol
(40:100:10)
 Soluţia de aplicat: 10 µl (50µg
clordiazepoxid)
 Distanţa de migrare a developantului:
15 cm A
 Revelarea cromatogramei:
tetraiodobismutat (III) de potasiu
 Examinare: la lumina zilei

 Substanţa analizată în condiţiile

descrise este considerată pură numai
dacă pe cromatogramă apare un singur
spot
 Evaluarea purităţii
28

 CHLORAMPHENICOLI NATRII a b
SUCCINAS
 Soluţii de aplicat:
a) 2 µl (200µg succinat de
cloramfenicol şi de sodiu)
b) 2 µl (4µg cloramfenicol e.n.)

 Dacă pe cromatogramă, în dreptul

punctului a, pe lângă pata principală
corespunzătoare succinatului de
cloramfenicol şi de sodiu, cu
fluorescenţă violetă, de pe linia de
start, mai apare o altă pată, mărimea
şi intensitatea acesteia nu trebuie să
depăşească mărimea şi intensitatea
petei din dreptul punctului b
Cloramfenicol neesterificat.
Cel mult 2,0%
 Evaluarea purităţii
29

 Tehnica concentrat- diluat

 Se aplică când nu se dispune de etaloane de impurităţi
 Constă în cromatografierea a două soluţii ale aceleaşi
substanţe : una concentrată şi una diluată (la limita maximă
la care impuritatea este admisă)
 Se compară zona impurităţii detectată în soluţia concentrată
ca mărime şi intensitate cu zona corespunzătoare probei din
soluţia diluată
 Evaluarea purităţii
30

DICLOFENACUM NATRICUM a b

 Soluţiile de aplicat:

a: 10µl (100µg diclofenac sodic)

b: 2,5µl (0.5µg diclofenac sodic)

 Pe cromatogramă, în dreptul
punctului a, pe lângă pata
principală corespunzătoare
diclofenacului sodic, mai poate să
apară o singură pată a cărei
mărime şi intensitate nu trebuie să
depăşească mărimea şi intensitatea Impurităţi înrudite chimic
petei din dreptul punctului b Cel mult 0,5%
 Evaluarea purităţii
31

ACENOCUMAROLUM a b

 Soluţiile de aplicat:
a: 20µl (400µg acenocumarol)
b: 20µl (0.4µg acenocumarol)

 Pe cromatogramă, în dreptul
punctului a, pe lângă pata
principală corespunzătoare
acenocumarolului, mai apar si alte
pete, suma acestora nu trebuie să
depăşească mărimea şi intensitatea
petei din dreptul punctului b Impurităţi înrudite chimic.
Cel mult 0,1%
 Evaluarea cantitativă
32

 Metode indirecte
 Eluția spoturilor, extracția substanțelor de interes și
evaluarea cantitativa prin alte metode analitice

 Metode directe
 Pe baza relatiei de proportionalitate dintre concentratie și
aria/absorbanța/fluorescența spotului
 Densitometrie
 Evaluare cantitativă indirectă
33

 Răzuirea de pe placă a:
 spotului corespunzător
substanţei de analizat
 spotului corespunzător
substanţei etalon
 unei zone fără substanţă de
la acelaşi Rf (blanc)

 Se solubilizează în solvenţi
potriviţi pentru extracţia
substanţei de interes

 Se citeşte absorbanţa probei

(Ap) şi a etalonului (Ae) faţă de
blanc
 Evaluarea cantitativă directă
34

 Metode optice
 Măsurarea densităţii optice/fluorescenţei
 Spectrofotometrie "in situ“ → curbe de etalonare absorbanţă-
concentraţie
 Densitometrul trasează în funcție de aria picurilor o pseudo-
cromatograma
 Permite masurarea ariei picurilor
 Sunt suficiente cateva ng pentru a avea un pic
cromatografic
 Densitometru
35

 Standardizarea tehnicilor
de:

 Aplicare a probei

 Developare a placilor
cromatografice

 Revelare

 Vizualizare şi procesare
a datelor
http://www.camag.com/en/tlc_hptlc/complete_systems/basic_kits/tlc_basic_kit_20x20.cfm
 Densitograma acizilor grași din extracte de
plante
36
 Cromatografia planară modernă
37

 UTLC
 (Ultracromatografie pe
strat subtire)
 Cresc performanţele de
 HPTLC separare
 (Cromatografie pe
start subţire de înaltă
performanţă )
 Scad timpii de analiză
 CSS
 Cromatografia pe strat subţire de înaltă
38
performanţă
 High Performance Thin Layer Chromatography- HPTLC
Principii

 Aplicaţii în analiza medicamentelor

 Cromatografia pe strat subţire de înaltă
performanţă (HPTLC)
39

 Echipamente cu performanțe
îmbunătăţite
 Faze staționare cu particule de
dimensiuni mult mai mici –număr
de talere teoretice (N) mult mai
mare
 Automatizarea tehnicilor de:
 Aplicare a probei

 Developare orizontală a
plăcilor cromatografice
 Revelare

 Inregistrare densitogramă şi FS HPTLC: silicagel cu

FS HPTLC: silicagel cu
procesare date particule sferice
particule neregulate
 CSS versus HPTLC
40

Proprietate CSS HPTLC

Marimea particulelor (m) 2-40 2-10

Marimea medie a particulelor (m) 10-15 5

Grosimea statului de FS (m) 250 100-200

Distanta de separare (mm) 100-150 30-70

Distanta optima de separare (mm) 120 60

Timpul de analiza pentru o separare optimă (min) 30-60 8-20

Consumul de solventi (mL) 25-50 10-20

(20x20cm) (20x10cm)
5-10
(10x10cm)
Limita de detectie, absorbanta (ng) 100-1000 10-100

Limita de detectie, fluorescenta (ng) 1-100 0.1-10

 CSS versus HPTLC
41

Proprietate CSS HPTLC

Separare Buna Foarte bună
Vizualizare Buna Foarte bună
Rapiditate Mare Mare
Simplitate Foarte mare Mare
Robustete Redusa Bună
Reproductibilitate Redusa Foarte bună
Cuantificare Redusa Bună
Validare Foarte redusa Bună
 CSS versus HPTLC
42

 Separare a a flavonoidelor din

sunatoare
(a) TLC (CSS)
(b) HPTLC
 FS: Silicagel 60
 FM: acetat de etil-clorura de
metilen-acid formic-acid acetic-
apa: 100:25:10:10:11 (v/v)
 UV 366 nm

Nota: placa HPTLC este marita de 2 ori pentru

comparare
 Caracteristici ale HPTLC
43

 Capacitate de separare superioară

 Separarea unor amestecuri mult mai complexe
 Identificarea unui număr mai mare de compuşi

 Sensibilitate superioară
 Limite de detecţie/cuantificare mai mici
 Exemplu
44

 Analiza cantitativă a captoprilului din forme farmaceutice

 Captoprilul - nu prezintă cromofor → derivatizare în vederea
detecţiei (reacţie cu fluorobenzoxidiazol) → compus fluorescent
 HPTLC cu densitometrie de fluorescenţă
 FS: silicagel
 FM: eter izopropilic: metanol:apă:acid acetic: 9:8:2:1
 Limita de detecţie - ng
F

S
R
N

N
O
+
R
S
H

O
N

N
S
O
-

S
O
-
3

Densitograma captoprilului
 Exemplu
45

 Analiza tuberculostaticelor (rifampicina, izoniazida si pirazinamida) din

forme farmaceutice
 Rifampicina – impuritati (desacetil-rifampicina, rifampicin-chinona)

 Evaluare fotodensitometrica in domeniul UV la 2 lungimi de unda

 Precizia metodei – comparabila cu cea a metodei HPLC

CONHNH2 OH
CH3 CH3

CH3 CH3
N OH O
OH OH
Izoniazida (I) NH
CH3COO H 3C NCH3
N
CH3O CH3 N
N CONH2
OH
O Densitograma HPTLC a amestecului rifampicina
N O CH3
(R) si impuritati, izoniazida (I) si pirazinamida
Pirazinamida (P)
Rifampicina (R) (P)
 Ultracromatografie pe strat subțire (UTLC)
46

Grosimea stratului
de separare 10m
 Exemplu de separarea a
trei coloranţi prin UTLC: Suport inert

 Volum aplicat: 10 nL
 Distanta de separare (migrare)
1,5 cm
 Durata analizei 165 secunde
 Ultracromatografie pe strat subțire (UTLC)
47

 (A) densitograma TLC a A

compuşilor de interes
 Volum aplicat 1L

 (B) densitograma UTLC a

compuşilor de interes
 Volum aplicat 0,02L
B
 Detecţia s-a realizat la
220nm

Mennickent et al., Chromatographia (2013) 76: 1233-1238

 Concluzii
48

 Metodele cromatografice – metode separative aplicabile

amestecurilor complexe

 Cromatografia planară
 Metoda ieftină şi robustă de identificare şi control al purităţii
 Identificare, evaluarea purităţii şi determinări cantitative
 Densitometria creşte semnificativ exactitatea, precizia şi robusteţea
determinărilor cantitative

 Cromatografia planară modernă - sensibilitate superioară şi

timpi de analiză reduşi
 Bibliografie
49

1. Encyclopedia of analytical science, Second Edition, Elsevier Academic Press, 2005;

2. Watson D.G. Pharmaceutical Analysis, 3rd Edition, A Textbook for Pharmacy
Students and Pharmaceutical Chemists, Elsevier, 2012.
3. Karin Bauer, Leo Gros, Werner Sauer. Thin Layer Chromatography – An introduction,
Heidelberg, Germany, 1991;
4. ***Farmacopeea Europeană ediția 8.8 online
5. Eike Reich, Anne Schibli. Stationary Phases for Planar Separations — Plates for
Modern TLC, LCGC North America 2005,
http://pharmtech.findpharma.com/pharmtech/article/articleDetail.jsp?id=160405
&sk=&date=&pageID=3
6. Francis Rouessac, Annick Rouessac. Analyse chimique. Méthodes et techniques
instrumentales modernes, 6e édition, Ed. Dunod, Paris, 2004