ANALIZA

MEDICAMENTULUI
Note de curs (2) Conf. Cristina Adela Iuga
09-10.10.2017 Şef lucrări Simona Codruţa Hegheş
 Obiective
2

 Principii generale ale

cromatografiei în fază
gazoasă

 Gaz-cromatograful

 Aplicaţii ale GC în analiza

medicamentului
 Istoric
3

 A.J.P Martin, R.L.M Synge

 1941 - Cromatografia de repartiţie lichid-lichid (CLL)

 1951 - Cromatografia de repartiţie gaz-lichid (CGL)

 Separarea si dozarea unui amestec de acizi graşi C1-C12
 Ce este cromatografia de gaze (GC)?
4

 Metodă oficinală în FE, USP-NF, BP

 Este o metodă fizico-chimică de separare cromatografică în
care faza mobilă este un gaz, iar faza staţionară este:
 un solid

 un lichid impregnat pe suport solid inert

 un lichid repartizat uniform pe pereţii unei coloane capilare

 Separarea se produce datorită distribuţiei diferite a

componenţilor între faza mobilă şi faza staţionară
 Metoda gaz-cromatografică (GC)
5

Avantaje Dezavantaje

 Rapidă  Este limitată la substanţele

 Eficientă
 Sensibilă
 Necesită cantităţi mici de probă
 Metoda mai simplă si mai puţin
costisitoare decât alte metode
instrumentale
volatile
 Este aplicabilă doar în cazul
substanţelor termostabile
 Nu se pretează la separări
preparative
 Identificarea compuşilor necesită
cuplajul cu spectrometria de
masă
 Metoda gaz-cromatografică (GC)
6

Parametrii de retenţie Parametrii de separare

 Timpi de retenţie
 Timp mort t0
 Timp de retenţie tR
 Timp de retenţie corectat t′R
 Timp de retenţie relativ tRr
 Indicii Kovats
 Volume de retenţie
 Coeficientul de distribuţie KC
 Factorul de capacitate k’
 Eficacitatea coloanei N
 Factorul de separabilitate α
 Rezoluţia Rs
 Parametrii de retenţie
7

 Timp mort - t0
 Timpul petrecut pe coloană
de un compus nereţinut
 Metan (butan)
 Hexan
 Parametrii de retenţie
8

 Timpul de retentie - tR

 Timpul petrecut de o substantă în

sistemul GC de la injectare până
la detecţie

 Depinde de coloană, temperatură

şi de viteza liniară a gazului

 O variatie mai mare de 0.05min

indică probleme ale sistemului
cromatografic
 Parametrii de retenţie
9

 Timp de retentie corectat - tr′

 Pentru o temperatură şi o viteză a fazei
mobile fiecare substanţă petrece o
perioadă limitata de timp în coloană

 Dependent de:
 Volumul injectorului

 Lungimea firelor din interiorul sistemului

cromatografic

tr′ = tR − t0
 tR = timp de retenţie
 t0 = timp mort
 Parametrii de retenţie
10

 Timp de retenţie relativ tRr

 Reprezintă timpul de retenţie al unui component (1) în raport cu al unui
etalon (2) cromatografiat în aceleaşi condiţii

t Rr  t R1 t R 2
 Este o metodă reproductibilă pentru fiecare echipament GC, in condiţii
de lucru standardizate
 Pe baza acestei relaţii s-a elaborat sistemul de indici de retenţie Kovats
 Parametrii de retenţie
11

 Indicii de retenţie – Kovats

 Retenţia relativă a unui compus faţă de
n-alcani, la o anumită temperatură şi o
anumită fază staţionară
 Normalizează variabilele ce ţin de
instrument/coloană
 Se calculează în condiţii izoterme (1)
sau neizoterme (2)

100logt x   logt n 
(1) I x  100n  log t  
n1
 logt n 

100t x  t n 
(2) I x  100n  t t
n1 n


unde: tn şi tn+1 sunt timpii de retenţie a n-alcanilor de referenţa care

eluează inaintea şi după compusul de interes X; tx este timpul de
retenţie al compusului X ; n numarul de atomi de carbon al
compusului care eluează inaintea compusului de interes

(A) Ulei de mentă separat pe o coloană BPX-5 (12mx0.5mmidx0.25um film. (B) n-alcani C8-C16. Watson, 2012; Fig 11.9
Parametrii de separare
 Coeficientul de partiţie K

 Factorul de capacitate k’

 Eficacitatea coloanei N

 Factorul de separabilitate α

 Rezoluţia Rs
 Parametri de separare
13

 Coeficientul de partiţie K  Factorul de capacitate k’

K  Cs k’ = (tR-t0)/t0
Cm

 Depinde de:  Mărime adimensională

 Faza stationară
 Structura compusului separat  Creste odată cu creşterea
 Temperatura coloanei retenţiei unui compus pe faza
staţionară (Fs)
 Influenţează tR a unui compus pe
coloană  Descrie viteza de deplasare a
compuşilor în coloană
 Este o constantă specifică unui
anumit compus în condiţii
cromatografice standardizate
 Parametrii de separare
14

 Eficacitatea coloanei N
 Atributul principal al coloanelor utilizate în GC
 Este o măsură a dispersiei unei unui analit în sistemul cromatografic →
cu obţinerea unui pic simetric (formă Gaussiană)/asimetric
 Este definită prin numărul de talere teoretice
 Parametrii de separare
15

 Eficacitatea coloanei (N)

 Un taler teoretic al coloanei reprezintă distanţa parcursă de

componentele unei probe până se atinge echilibrul lor de partiţie între
faza mobilă şi faza staţionară

 Cu cât numărul de talere teoretice este mai mare cu atât separarea

este mai bună

 Cu cât înălţimea talerelor este mai mică cu atât picurile sunt mai înguste

 Înălţimea echivalentă a unui taler teoretic (mm)

H L N
 Parametrii de separare
16

 Factorul de separabilitate α

 Reprezintă raportul dintre factorii de capacitate k’ a două picuri

adiacente

  k' /k'
2 1
 Prin definiţie, valoarea lui  trebuie să fie întotdeauna supraunitară

 Dacă valoarea lui  este egală cu 1 apare fenomenul de co-eluţie

 Parametrii de separare
17

 Rezoluţia Rs
 Măsoară gradul de separare a două picuri vecine
 Parametrii de separare
18

 Rezoluţia Rs
 Parametrii de separare
19

 Rezoluţia Rs
 Rezoluţie optimă în timp minim

 O valoare >1.5 asigură o separare corespunzătoare

 Măsurarea corectă a ariei/înălţimii

 O creştere a rezoluţiei presupune o creştere a timpului de analiză

 Parametrii de separare
20

 Rezoluţia Rs
 Selectivitatea α

 Eficienţa coloanei N
 Retenţia k’ http://www.chromacademy.com/essential-guide/Feb-2014/figure-8.jpg
 Compuşii analizaţi prin GG
21

 Compuşii organici se clasifică pe baza presiunii lor de vapori (PV)

exprimată în mmHg:
 Volatili: PV peste1mmHg
 Semi-volatili: PV de la 1mmHg până la10-7mmHg
 Nevolatili: PV sub10-7 mmHg
 Compuşii nevolatili care prin derivatizare pot fi transformaţi în compuşi
volatili
 Compuşii volatili care sunt stabili la temperatura de volatilizare, au mase
moleculare mai mici de 500Da şi polaritate redusă
 Compuşii volatili
22

 Dizolvare – diluare
 Aducerea în soluţie a componenţilor de analizat sau dizolvarea selectivă
a unui compus
 Distilare
 Extracţie
 Cu solvenţi
 Cu fluide supercritice (CO2, pentan, metanol, etc)
 Pe fază solidă (concentrare) - SFE
 Cromatografie în fază lichidă preparativă
 Izolarea şi colectarea de fracţiuni
 Compuşii nevolatili
23

 Se derivatizează înaintea analizei GC

 Prin derivatizare scade polaritatea si creste volatilitatea
 Se aplică compuşilor organici care conţin grupări polare: -COOH, -OH,
-NH2, -SO3H
 Principalele reacţii de derivatizare:
 Metilare
 Sililare
 Trifluoroacetilare
 Piroliză
 Gaz-cromatograful
24

 Butelii cu fază mobilă (Fm) (gaz

vector )

 Injector

 Coloană (Fs)

 Detector

 Înregistrator

 Sistem computerizat de achzitie https://www.medicinescomplete.com/mc/rem/2012/c19-fig-19-5.png

si prelucrare a datelor
 Mecanisme de separare în GC
25

 Fs solidă = separare prin

ADSORBŢIE
 Cromatografie gaz-solid
(CGS)

 Fs lichidă = Separare prin

REPARTIŢIE
 Cromatografie gaz-lichid
CGL
 Faza mobilă în GC
26

 Gazul vector sau faza mobilă  Proprietăţile gazului vector

 partea dinamică a  Masă moleculară mică
cromatografiei de gaze
 Punct de lichefiere scăzut
 Puritate avansată
 Cel mai frecvent se utilizează:
 Hidrogen
 Selecţia gazului vector:
 Heliu
 Azot
 Tipul de detector
 Eficienţa separării
 Costuri implicate
 Faza mobilă în GC
27

 Azotul (N2) de puritate avansată

(6.0) este cel mai utilizat
 Viteza liniară medie care asigură
acelaşi număr de talere teoretice
este de 3 ori mai mare pentru H2
decât pentru N2
 Analizele în care se utilizează H2 ca
şi gaz vector pot fi de 3 ori mai
rapide decât cele cu N2 (eficienţă
constantă)

 Utilizarea H2 este limitată la cazurile

argumentate (caracter exploziv!)
http://www.chromacademy.com/Developing_Fast_Capillary_GC_S
eparations.html  He este o opţiune de compromis
 Faza staţionară în GC
28

 Faza staţionară (Fs) este

depusă în interiorul coloanei
cromatografice si poate fi:

 un solid

 un lichid impregnat pe
suport solid inert

 un lichid repartizat uniform

pe pereţii unei coloane
capilare
http://people.whitman.edu/~dunnivfm/C_MS_Ebook/CH2/Figures/Fig_2_11_Columns.jpg
 Coloane cromatografice umplute
29

 Caracteristici

 Diametrul interior: 2-4mm

 Lungime: 1-4 m

 Coloana: de regulă din oţel

inoxidabil sau sticlă

 Factori care influenţează separarea

 Tipul de Fs solidă

 Lungimea coloanei

 Diametrul coloanei
http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/gc/graphics/packed.jpg
 Faza staţionară solidă
30

 Adsorbanţi anorganici
 Adsorbanţi pe bază de carbon
 Cărbune activ, cărbune grafitat, site moleculare de carbon
 Silicagel
 Silicagel, silicagel grefat cu grupări nepolare, sticle poroase
 Alumine
 Zeoliţi (site moleculare)
 Polimeri organici poroşi
 Aplicaţii ale coloanelor cu Fs solidă:
 Separarea hidrocarburilor cu masă moleculară mică
 Separarea compuşilor foarte polari
 Coloane cromatografice capilare
31

 Caracteristici
 Diametru interior < 2mm
(0.35mm)
 Lungime > 100m
 Coloana: silice fuzibilă

 Avantaje:
 Separare superioară (viteza
gazului vector este aproape
http://www.chromedia.org/dchro/gfx/ZkpovopHC.jpeg
aceeaşi pe toată lungimea
coloanei)
 Timp scăzut de analiză şi
condiţionare
 Faza staţionară lichidă
32

 Suport inert:
 Sorturi de pământ diatomitic sau kieselgur
 Polimeri fluorcarbon

 FS lichidă
 Legată chimic de suport
 Depusă sub formă de peliculă; ex. polisiloxani, polisiloxani ariliden modificaţi,
squalan, polietilenglicoli

 Aplicaţii ale coloanelor cu Fs lichidă :

 Compuşi volatili
 Faze staţionare lichide
33

 Nepolare
 Polisiloxani
 Rezistente la 325-350oC
 Durată de viată lungă
 Principalele grupări grefate
 DB5 (5%-Phenyl)-
methylpolysiloxane)

 Polare
 Polietilenglicoli (PEG)
 Diferă prin greutatea moleculară
a lantului polimeric
 Sensibile la actiunea O2 la
temperaturi crescute http://images.alfresco.advanstar.com/alfresco_images/pharma/2015/02/
09/d82df97a-9e09-4ccf-8121-0a7e04d78555/i1.jpg
 Durată de viată mai redusă
 Faza staţionară în GC
34

 Caracteristici:
 Inerţie chimică
 Vâscozitate
 Polaritate
 Stabilitate la
temperatura de lucru
 Fenomenul de “column
bleeding” = deviere de la
linia de bază

http://www.agilent.com/cs/common/promotions/promotionimages/081914_gccolex_cgram1-4.png
 Cum se alege faza staţionară?
35

 În funcţie de natura compuşilor de separat:

 Molecule nepolare

 FS nepolare (ex. squalan)

 Molecule de polaritate intermediară

 FS = lichide cu grupe polare, sau polarizabile pe un schelet nepolar ( ex.

difenilbenzil)

 Molecule polare

 FS polare (ex. polietilenglicoli)

 Cum se alege faza staţionară?
36

 Caracter chimic similar cu cel al compuşilor de separat

http://www.chromacademy.com/essential-guide/Feb-2014/figure-7.jpg
 Exemplu separare GC
37

 Proba: amestec n-propanol/n-heptan

 Punct de fierbere
 n-propanol pf= 97oC; PV= 40mmHg la 36.4C
 n-heptan pf=98oC; PV= 40mmHg la 22.3C
 Polaritate
 n-propanol Log P = 0.25
 n-heptan Log P = 4.66

 Separare cromatografică
 Coloană Carbowax 20M (PEG, M=20000)
 Coloană CP-Squalane (2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosane)
 Separare pe coloana CarboWax 20M
38

 n-heptan - afinitate redusă faţă de

Fs → eluţie rapidă

 n-propanol - afinitate mare faţă de

Fs – eluţie întârziată

 Compuşii polari sunt reţinuţi pe

coloana si vor elua după compuşii
nepolari
 Separare pe coloană CP-Squalene
39

 n-heptan - afinitate mare faţă de Fs →

eluţie întârziată

 n-propanol - afinitate redusă faţă de Fs

– eluţie rapidă

 Compuşii nepolari - sunt reţinuţi vor elua

de pe coloană după compuşii polari
 Detectori utilizaţi în GC
40

 Să detecteze componentul de analizat în gazul vector

 Să genereze un semnal proporţional cu concentraţia analitului

 Semnalul generat este: preluat, amplificat şi transformat de către

înregistrator în gaz-cromatogramă

 Tipuri de detectori:

 Universali sau semiuniversali – sensibili la un număr mare de componenţi

 Specifici – sensibili numai la anumiţi componenţi

 Detectori utilizaţi în GC
41

 Detectorul de conductibilitate
termică (catarometrul)
 Detector universal nedestructiv
 Măsoară efectul de răcire care
apare la trecerea compusilor
peste filament
 Semnalul este proporţional cu
concentraţia analitului în gazul
vector
 Sensibilitate g
 Determinarea apei din materii
prime farmaceutice, peptide Watson, 2012; Table 11.3
 Detectori utilizaţi în GC
42

 Detector de ionizare în flacără (FID)

 Detector quasi-universal: 90% din
compuşii analizaţi prin CG sunt
organici
 Măsoară conductibilitatea electrică a
unei flăcări de hidrogen în prezenţa
eluentului care conţine un
carbon/hidrogen
 Sensibilitate bună (10ng-100pg)

Watson, 2012; Table 11.3

 Detectori utilizaţi în GC
43

 Detector cu captura de electroni (ECD)

 Detector specific
 Se bazează pe proprietatea
moleculelor cu afinitate mare pentru
electroni de capta electronii liberi
generaţi de o sursă radioactivă
 Compuşii halogenaţi intens pot fi
detectaţi la nivel 50fg -1pg
 In principal utilizat pentru analiza
medicamentelor în fluide biologice

Watson, 2012; Table 11.3

 Detectori utilizaţi în GC
44

 Detectorul cu ionizare termoionică

(TID)
 Detector cu specificitate pentru
compuşii cu P şi N
 Detectează compuşi cu fosfor la
nivel de 10−12 g (pg)
 Detectează compuşi cu azot la
nivel de 10−9g (ng)

 Detector fotometric cu flacără

(FPD)
 Detector cu specificitate pentru
compuşii cu S şi P
 Detectează compuşi cu sulf la nivel
de 10−12 g (pg)
Watson, 2012; Table 11.3
 Detectează compuşi cu fosfor la
nivel de 10−15 g (fg)
 Detectori utilizaţi în GC
45

 Spectrometrul de masă MS sau MS/MS

 Detector universal
 Semnalul înregistrat (abundenţa relativă a m/z) este proporţional cu concentraţia analitului
 Detectează compuşi la nivel de 10−12 g (pg)

http://www.chromacademy.com/essential-guide/nov2010/fig-1.jpg
 Aplicaţii ale gaz-cromatografiei
46

 Analiza calitativă – identificare, puritate

 Pe baza parametrilor de retenţie
 Pe baza rapoartelor m/z – în cazul cuplajului cu MS

 Analiza cantitativă
 Relaţia de proportionalitate între aria (sau înălţimea) picului cromatografic şi
cantitatea de compus
 Pe baza intensităţii semnalului (abundenţei maselor) – în cazul cuplajului cu MS
 Identificarea pe baza parametrilor de
47
retenţie
 Parametri de retenţie
 Proprietăţi relative ale unui solut în raport cu o fază staţionară dată
 Sunt reproductibili în condiţii cromatografice standardizate
 Se compară timpii de retenţie a etaloanelor cu timpii de retenţie a compuşilor analizaţi

 Sistemul de indici de retenţie Kovats

 Pentru identificare se compară indicii obţinuţi experimental pentru substanţele analizate cu
indicii aflaţi în baze de date specializate, ex. baza Adams

Exemplu
 Identificarea pe baza parametrilor de
48
retenţie
 Prin comparare cu parametri de retenţie ai etaloanelor

Gaz-cromatogramă etaloane
Gaz-cromatogramă etaloane
(albastru) şi proba (roşu)
 Identificarea prin spectrometrie de
49
masă
 Se poate analiza un număr mare de
compuşi dintr-un amestec complex
 Spectrul de masă oferă informaţii
 Structurale
 Despre masa moleculară a
compusului analizat
 Acid acetilsalicilic
 M =180
 m/z = 43 CH3CO*

 m/z = 91 C6H5 – CH2*

m/z=120 C6H4-COO*
 Analiza cantitativă
50

 Metoda standardelor externe - A sau h =f(c)

 Metoda standardului intern - A sau h/ASI sau hSI =f(c/cSI)

 standard intern se alege o substanţă care .....

 Metoda normării ariilor

 aria trebuie sa fie înregistrată toti cei “n” componenţi ai probei; detectorul să
aibă sensibilitate egală pentru toţi componenţii probei

A1 unde:
C1%  n  100 C1%=concentraţia compusului de interes, A1= aria compusului C1
 Ai Ai=ariile fiecarui component din cromatogramă
i1
 Aplicaţii ale gaz-cromatografiei
51

 Analiza materiilor prime farmaceutice şi cosmetice

 Analiza formelor farmaceutice industriale şi galenice

 Analiza produselor cosmetice

 Analiza substanţelor active din produse vegetale

 Analiza substanţelor active din matrici biologice – substanţe

active, metaboliţi, etc.
 Analiza materiilor prime farmaceutice
52
şi cosmetice
 Analiza solvenţilor reziduali – metodă oficinală în FE 8.7

 Etanol, metanol, clorură de metilen, n-propanol, 2-propanol etc.

 Determinarea N,N-dimetilanilinei din penicilinele şi cefalosporinele de

semisinteză

 Evaluarea conţinutului în apă

 detectorul de conductibilitate termică (catarometrul)

 Analiza antioxidanţilor – butil-hidroxianisol BHA, buti-hidroxitoluen BHT

 Analiza cerurilor – hidrocarburile, alcoolii, acizii graşi liberi

 Analiza substanţelor active din
53
produsele vegetale
 Metodă dedicată uleiurilor
volatile
 Se utilizează frecvent şi pentru
analiza lipidelor şi acizilor graşi
din produsele vegetale

1. a–Pinen 7. g–Terpinen 13. Geraniol

2. Camfen 8. Terpinolen 14. Neril Acetat
3. b–Pinen 9. Linalol 15. Geranil Acetat
4. Mircen 10. Terpinen–4–ol 16. Cariofilen
5. p–Cimen 11. a–Terpineol 17.trans–a–
Bergamoten
Gaz - cromatograma uleiului volatil de lămâie
6. Limonen 12. Neral 18. b–Bisabolen
 Analiza substanţelor active din matrici
54
biologice
 Necesită o purificare avansată a probelor

 Este necesară utilizarea unui standard intern

 Clase de substante:

 Alcool etilic (alcoolemie)

 Steroizii anabolizanţi, amine simpatomimetice - dopajul sportivilor de

performanţă (gold standard)

 Anticonvulsivante, antihipertensive, fenotiazine, AINS, antidepresive

 Concluzii
55

 Cromatografia în fază gazoasă (GC)

 Metodă cromatografică pe coloană
 Sensibilitate şi rezoluţie deosebite
 Detectori sensibili

 Aplicabilă tuturor substanţelor nepolare volatile sau volatile după derivatizare şi

care sunt termostabile
 Este metodă oficinală în FE 8.7 pentru: analiza solvenţilor reziduali, evaluarea
umidităţii sau apei de cristalizare din materiile prime farmaceutice, analiza
uleiurilor volatile
 GC/MS/MS - metoda oficială de analiză a steroizilor anabolizanţi pentru Agenţia
Mondială Anti-doping (WADA)
 Bibliografie
56

1. Watson D.G. Pharmaceutical Analysis, 3rd Edition, A Textbook for Pharmacy

Students and Pharmaceutical Chemists, Elsevier, 2012.

2. Tranchant J. et al - Manuel pratique de chromatographie en phase gazeuse,

4eme edition, Ed. Masson, Paris, 1995

3. Grob R. L., Barry E.F. – Modern Practice of Gas Chromatography, Ed. Wiley &
Sons, New York, 2004

4. McNair H. M. , Miller J. M. – Basic Gas Chromatography – Techniques in

Analytical Chemistry, Ed. Wiley & Sons, New York, 1997

5. PubChem Compound - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound