UNIVERSITATEA OVIDIUS DIN CONSTANA

FACULTATEA DE FARMACIE
SPECIALIZAREA FARMACIE
DISCIPLINA CHIMIE FIZIC

METODA CROMATOGRAFIC DE
ANALIZ A SUBSTANELOR
FARMACEUTICE

NUME STUDENT : HIRA ELENA

ANUL II, GRUPA 4
PROFESOR COORDONATOR: Prof.Univ.Dr. SRBU RODICA
Cuprins
CROMATOGRAFIA......................................................................................1
Clasificarea metodelor cromatografice...........................................................3
MARIMI SI ECUATII CARACTERISTICE UNEI COLOANE
CROMATOGRAFICE....................................................................................5
Numrul de talere teoretice al coloanei, n...................................................6
Cromatografia de gaze (GC)...........................................................................7
Detectorii gaz cromatografici....................................................................10
Detectorul bazat pe ionizare n flacr (FID)............................................12
Detectorul cu captur de electroni.............................................................13
Detectorul bazat pe fotoionizare (PID)......................................................14
Coloanele gaz cromatografice...................................................................14
Analiza calitativ i cantitativ n GC...........................................................17
Analiza calitativ.......................................................................................17
Analiza cantitativ.....................................................................................20
Metoda standardului (etalonului) intern....................................................20
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA..........21
Coloanele n LC.........................................................................................22
Faza staionar...........................................................................................22
Faza mobil................................................................................................23
CROMATOGRAFIA IONICA......................................................................24
Detecia......................................................................................................25
CROMATOGRAFIA PLANARA.................................................................26
Bibliografie....................................................................................................29
CROMATOGRAFIA
Separarea diferitelor substante dintr-un amestec constituie una dintre cele mai
importante probleme ale chimiei analitice. Metoda cromatografica se bazeaza pe
repetarea echilibrului de repartitie a componentelor unui amestec intre o faza mobila si
una stationara. Datorita diferentelor in repartitie are loc deplasarea, cu viteza diferita, a
componentelor purtate de faza mobila de-a lungul fazei stationare. In functie de natura
fazelor se disting urmatoarele tipuri de cromatografie:

Faza mobila Faza stationara Denumirea tipului de cromatografie

Lichid Lichid Lichid-lichid (LL)

Lichid Solid Lichid-solid (LS)

Gaz Solid Gaz-solid (GS)

Gaz Lichid Gaz-lichid (GL)

In general, metodele de separare cromatografice se impart in doua categorii: in

prima intra cele care se bazeaza pe interactiunea diferita a componentilor cu faza
stationara (repartitie, adsorbtie, schimb ionic si afinitate), iar in a doua cele care se
bazeaza pe marimea diferita a componentilor (excluziunea sterica). Schema de principiu a
unui cromatograf (LL sau LS) este reprezentata mai jos. El se compune din: sursa de
eluent, dispozitiv de introducere al probei, coloana si un detector la care se adauga
urmatoarele anexe: sursa de eluent, dispozitiv de masurare si reglare a debitului,
dispozitiv de introducere a probei, instrument de inregistrare a semnalului furnizat de
detector. Principiul cromatografiei este urmatorul: eluentul trece prin dispozitivul de
introducere a probei, preia proba de analizat si o introduce in coloana cromatografica.
Coloana cromatografica este sediul procesului de separare. Din cauza interactiunii
moleculelor cu faza stationara, componentele din amestecul de analizat raman in urma
eluentului, in functie de diferentele care exista intre constantele echilibrului de repartitie
intre cele doua faze.

3
 Componentele amestecului separat vor iesi din coloana la timpuri diferite, dupa
care sunt introduse de eluent in detector. Acesta transforma diferenta unei proprietati
fizice intre component si eluent, intr-un semnal electric, proportional cu concentratia
componentului din eluent. Inregistrarea grafica a semnalului detectorului in functie de
timp se numeste cromatograma. Timpul tR la care apare maximul unui pic, masurat din
momentul introducerii probei se numeste timp de retinere sau retentie si este o
caracteristica calitativa a componentului respectiv. Inaltimea picului h sau aria lui, A, sunt
caracteristici cantitative, proportionale cu cantitatea componentului din proba. Se noteaza
cu tM (timp mort) timpul in care eluentul si componentele care nu interactioneaza cu faza
stationara parcurg distanta pana la detector. Astfel putem exprima viteza zonei
componentului (v) si a eluentului (u) prin urmatoarele ecuatii: v = L/t R, u = L/tM, unde L
este lungimea coloanei. Coeficientul de partitie K reprezinta raportul dintre concentratia
molara (cS) a substantei in faza stationara si concentratia substantei in faza mobila (c M): K
= cS/cM. Fractiunea din timpul de retinere in care o molecula se gaseste in faza mobila se
noteaza cu R si reprezinta probabilitatea ca molecula sa se gaseasca in faza mobila,
respectiv fractiunea din totalul moleculelor care se afla in faza mobila. 1 - R reprezinta
restul moleculelor care se gasesc in faza stationara. La echilibru reiese ca:

R c V VM 1 1 u
= m m , R= V + KV = v=
K ,
= R=v /u=t M /t R ,
1R c s V s M s
V
1+ K V 1+ S

M
1+ K VV S

4
unde VM si VS reprezinta volumul fazei mobile, respectiv stationare iar k =
KVS/VM reprezinta raportul dintre cantitatea totala de substanta aflata in faza stationara si
cantitatea totala de substanta aflata in faza mobila si se numeste factor de
capacitate. Pentru o specie oarecare A aflata in amestec, factorul de capacitate kA va fi:

K A V s t Rt M k B K B t R(B )t M
k A= = , = = =
VM tM k A K A t R ( A) t M

Factorul de capacitate k este o functie de parametri de solubilitate, in cazul

cromatografiei de separatie lichid-lichid. Practic, in vederea obtinerii unei rezolutii
maxime pe unitatea de timp, trebuie ca valoarea lui k sa fie cuprinsa intre 2 si 5. Factorul
de separare pentru o anumita coloana de separare este un parametru utilizat pentru
descrierea diferentelor ce apar intre vitezele de migrare a componentilor. Se defineste ca
fiind raportul dintre factorii de capacitate kA si kB, ai componentului B (care trece mai
greu prin coloana) si A (componentul care se elueaza mai repede) aflati in amestec. Una
dintre cele mai importante caracteristici ale unui sistem cromatografic este eficienta sau
numarul de talere teoretice. Cu cat o coloana va avea mai multe talere pe unitatea de
lungime cu atat eficacitatea ei de separare va fi mai buna. Numarul de talere N poate fi
definit din cromatograma unui singur pic astfel:

t
t R /


N=

unde: tR este timpul de retentie, este dispersia aceleiasi benzi in unitati de timp, iar W
este valoarea segmentului pe abscisa rezultat din intersectia celor doua tangente prin
punctele de inflexiune ale picului. N este un numar adimensional. Aceeasi valoare a lui N
poate fi obtinuta din volumul de retentie V R si dispersia exprimata in unitati de volum.
Numarul de talere N este o masura a eficientei intregului suport al coloanei. O alta
masura a eficientei coloanei, folosita curent in cromatografie este data de inaltimea unui
taler H (inaltimea echivalenta a unui taler teoretic):

N=[V R / V ]2=[L / ]2 , H=L/ N= / L ,

2
H=L W 2 /16 t R2 ;

R=2 t R (B) 2t R( A ) /W A +W B

unde L este lungimea coloanei cu umplutura. Pentru caracterizarea separabilitatii a doi

componenti s-a introdus notiunea de rezolutie, notata RS. In expresia rezolutiei s-a cautat
sa se lege marimile care caracterizeaza proprietatile termodinamice ale fazelor si
componentilor precum si marimile care caracterizeaza dinamica proceselor din coloana.
Rezolutia este o notiune mai cuprinzatoare, continand si marimile care caracterizeaza
eficacitatea coloanei precum si selectivitatea ei.

5
Clasificarea metodelor cromatografice
S-au imaginat i realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele
de altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar i a celei staionare. Astfel se distinge
cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobil este un lichid, cromatografia de gaze
(GC) cnd aceasta este un gaz sau cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobil
este un lichid aflat peste temperatura critic. n cadrul cromatografiei de lichide se mai
face distincie ntre cromatografia pe coloan deschis i cea pe coloan nchis Pe de alt
parte, n cadrul fiecreia dintre acestea, distingem mai multe variante.
n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare:
Cromatografia de adsorbie, una dintre primele tehnici utilizate, veche de mai bine un
secol (vet, 1903), utilizat pentru separarea substanelor organice cu molecule de
dimensiuni mici i medii pe adsorbeni, ca silicagel i alumin, folosindu-se, ca faze
mobile, diferite amestecuri de solveni organici.
Cromatografia ionic (de schimb ionic), care se petrece pe o faz staionar solid,
poroas, format din materiale specifice - schimbtorii de ioni - substane cu o reea
solid afnat, de natur organic sau anorganic, pe care se gsesc grefate, prin procesul
de obinere, nite centre de schimb ionic. Cele mai rspndite sunt rinile schimbtoare
de ioni - organice - la care scheletul-suport este unul organic - un polimer poros. Pe
aceste centre are loc o reacie ionic sau o interaciune ntre substana din soluie
(electrolit sau neelectrolit) i funciunea legat chimic de suportul solid, numit reacie de
schimb ionic.
Cromatografia de excluziune steric se desfoar pe faze staionare poroase dar cu
porozitatea selecionat astfel nct s corespund dimensiunilor moleculelor supuse
separrii. O parte dintre molecule intr prin pori, reuind s interacioneze cu suportul
solid, prin fore de adsorbie foarte slabe, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic
nereinute odat cu faza mobil. Se obine astfel un soi de sit la scar molecular
separarea moleculelor fcndu-se n funcie de dimensiune. Tehnica se mai ntlnete i
sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeaie prin geluri n funcie de natura apoas
sau organic a fazei mobile.
Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza staionar este o faz lichid,
nemiscibil cu cea mobil i imobilizat pe un suport solid, ntr-o coloan. Aici suportul

6
solid este, cel puin principial, inert fa de componentele din prob. ntruct simpla
impregnare a unui suport poros cu un lichid permitea splarea acestuia n timp, s-a recurs
la legarea pe cale chimic a acestora de suport, obinndu-se nite faze cu totul specifice -
faze staionare legate chimic. Molecule organice de dimensiuni mici sunt, prin sintez,
legate de suportul poros, fenomenul de pierdere prin splare de ctre faza mobil, fiind
practic anulat. Acest tehnic este cea mai rspndit devenind aproape sinonim cu
cromatografia de lichide.
Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC), se refer la un grup
de tehnici nrudite cu cele din LC, care au toate n comun faptul c faza mobil circul
printr-un material poros dispus ntr-un plan i formnd un strat relativ subire, dar de
compoziie asemntoare cu cele menionate la cromatografia pe coloan. Se disting:
Cromatogafia pe hrtie, tehnic n care faza staionar este o hrtie poroas din celuloz
(iniial o hrtie de filtru) care este irigat de solvent prin fore capilare - o tehnic, azi, de
importn istoric.
Cromatografia pe strat subire (TLC), n care faza staionar pulverulent este fixat de
suportul plan (sticl, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un strat subire (0.1-
0.5mm) de asemenea irigat prin capilaritate.
Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC), n care faza staionar
are granulaie extrem de fin ridicndu-se astfel eficiena separrilor dar i viteza
acestora. Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate, accesibilitate i pre de cost
cobort, dar totodat prin performane ceva mai slabe dect cromatografia de lichide pe
coloan sub presiune ridicat (HPLC) varianta modern a LC.
n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze (sau mai pretenios cromatografiei n
faz gazoas), denumit prescurtat GC se disting urmtoarele tehnici:
Cromatografia gaz-lichid n care faza staionar este un lichid nevolatil imobilizat pe un
suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat ntr-o coloan n aa-
numita cromatografie de gaze convenional sau chiar pe pereii coloanei, confecionat
de dimensiuni capilare, n cromatografia pe coloan capilar.
Cromatografia gaz-solid este analog cu cele discutate la cromatografia de adsorbie i
la cea de excluziune steric cu deosebirea c schimbarea gazului nu modific
selectivitatea. Faza staionar o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv sitele

7
moleculare (nite silicai naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros.
Metoda este extrem de important pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2,
N2, gaze nobile etc.)

MARIMI SI ECUATII CARACTERISTICE UNEI

COLOANE CROMATOGRAFICE
Factorul de retenie, RF reprezint raportul, subunitar, dintre vitezele de deplasare
prin coloan ale unui component i ale eluentului.Cum vitezele amintite se pot calcula din
raportul spaiului parcurs n unitatea de timp, lungimea coloanei fiind notat LCOL, avem
Lcol
t R t M V 0n
conform definiiei: R f = = =
Lcol t R V 0R
tM

Coeficientul de distribuie, K (sau KD) este o mrime identic celei din extracie
(repartiia ntre faze) definit ntotdeauna prin raportul dintre concentraiile componentului
n chestiune din fazele staionar, CS, respectiv mobil, CM. Conform definiiei (dup
Nernst):
K=C S /C M
n cazul cromatografiei de adsorbie acesta a fost denumitcoeficient de adsorbie, n
cazul cromatografiei de schimb ionic(denumit ulterior cromatografie ionic), coeficient
de distribuie ionic, iar n cadrul cromatografiei de excluziune steric coeficient
dedifuziune.
Factorul de capacitate, k (anterior notat k) se definete ca raportul dintre numrul
de moli distribuii ntre fazele: staionar, CS.VSrespectiv cea mobil, CM.VM. Ecuaia
de definiie este: k =C S V S /C M V M
.
unde cu VS respectiv VM s-au notat volumele fazelor - staionarrespectiv mobil - din
coloan, volumul ultimei fiind egal numeric cu volumul mort al coloanei. n ultimul timp
a primit denumirea de factor
de separare. Acest factor este legat de timpul de retenie, respectiv de cel mort, printr-o
ecuaie foarte mult utilizat:
t R=t M (1+k )
Deci, cu ct factorul de capacitate este mai mare coloana reine mai puternic un
component. Pe de alt parte din ecuaia anterioar se poate vedea c dac k = 0 atunci tR
= tM.
Pentru determinarea practic a valorii k se exprim aceast mrime din ecuaia de
mai sus, i innd cont de cele amintite anterior,anume: tR = tR tM se obine relaia de
'
calcul: k =t R /t M
Retenia relativ, , a mai fost denumit i factorul de separare tocmai pentru c,
cu ct valoarea acestuia este mai mare cu att poziia picurilor pe aceiai cromatogram
este mai distanat deci separarea pe coloana respectiv este mai net. S-a constatat c
influena variabilelor experimentale este cu mult mai redus dac se utilizeaz

8
Pentru calcululacesteia trebuie efectuat msurarea, att pentru componentele probei
ct i pentru o substan considerat etalon (sau standard) a timpului ( sau volumului) de
retentive, in conditii absolut identice.

Numrul de talere teoretice al coloanei, n. Conform teoriei

talerelor migrarea unei substane separate prin coloan se poate descompune teoretic
ntr-o succesiune de deplasri prin dreptul a n mici incinte din interiorul coloanei n care
au loc echilibre perfecte ntre fazele staionar, din incinte, i cea mobil. Similar cu
distilarea pe coloane prevzute cu talere, aceste mici incinte ideale au fost denumite
"talere teoretice". Lungimea poriunii dintr-o coloan, ce corespunde unei asemenea
incinte, pe parcursul creia se realizeaz un echilibru termodinamic, se noteaz cu H i
poart numele de nlime echivalent a unui taler teoretic. Aceasta caracterizeaz
performana coloanei i se poate calcula din raportul:
H=LCOl / N

Cromatografia de gaze (GC)

Aceast tehnic cromatografic este printre cele mai rspndite i totodat este
prima dintre metodele de analiz cromatografic aplicat pe scar larg n analizele
chimice.
Compuii amestecului supus separrii nu trebuie s fie neaprat gaze, ci pot s fie
i lichide sau chiar solide volatile. Substanele de analizat se introduc n coloana de
separare, la o temperatur potrivit, prin intermediul unui dispozitiv de introducere a
probei. Singura restricie este temperatura de vaporizare care uneori poate fi mai mare
dect temperatura de descompunere a substanelor de analizat. n aceste cazuri se poate
recurge la alte tehnici cromatografice care au ca eluent un lichid sau fluid supracritic. De
asemenea, se mai pot realiza, nainte de introducerea probei n cromatograf, nite derivai
(compui noi), volatili, utiliznd anumite reacii chimice specifice, procedeu denumit
derivatizare. Uurina cu care se pune la punct o analiz nou, sensibilitatea sa,
posibilitatea de automatizare precum i largile posibiliti de aplicare sunt avantajele
principale ale acestei metode. Printre domeniile n care GC i-a cucerit un loc de prim
rang sunt: petrochimia, industria farmaceutic, protecia mediului, analiza aromelor,
igiena i criminalistica.

Cromatograful de gaze

9
 Instrumentul care realizeaz separrile i totodat analiza n GC poart numele de
cromatograf de gaze. Funcionarea acestuia se poate nelege urmrind schema din fig. 1.

Schia prezint concis doar componentele principale. Astfel gazul purttor

(eluentul), de exemplu hidrogenul sau heliul, prsete cilindrul sub presiune, 1, n care
acesta se gsete iniial i ptrunde n coloan, la o presiune de intrare, cu ceva peste cea
atmosferic (1-3atm), prin intermediul unui reductor 2. Apoi gazul se ramific (opional)
prin dou conducte. O parte intr n coloan, n mod continuu iar cealalt ramur, direct
n detector. Coloana 4, se afl ntr-o etuv - termostat, 3, izolat termic i prevzut n
exterior cu un dispozitiv pentru introducerea probei (care de regul include i o
microsering), notat S, etuv care mai este dotat n interior cu un ventilator V i cu un
dispozitiv electric de nclzire - termostatare, R.
n coloana cromatografic se produce separarea probei. Aceasta se introduce n
coloan doar dup ce instrumentul este n regim de funcionare continu i a fost adus la
temperatura de lucru. Dup ce prsete coloana 4, gazul purttor intr, antrennd pe rnd
componentele separate, n celula de msur din detector de unde iese n atmosfer sau se
colecteaz separat.
Faza mobil n aceast tehnic este un gaz: hidrogenul, heliul, azotul sau argonul.
Aceasta poate fi eliberat, prin intermediul unor ventile i regulatoare de presiune, din
cilindri de gaze presurizate, fie obinute din generatoare (cazul N2 sau H2) - direct n
laborator. Gazul nu trebuie s conin urme de ap, oxigen sau dioxid de carbon care pot
prejudicia fazele staionare. De aceea se mai intercaleaz filtre cu dublu rol: uscare,
respectiv, reducerea oxigenului, dispozitive situate imediat dup sursa de gaz. n cazuri

10
excepionale se pot utiliza i ali elueni cum ar fi CO2, Ne etc. Spre deosebire de
cromatografia cu elueni lichizi, n GC natura gazului are o importan minor asupra
selectivitii separrii deoarece gazul, practic, nu interacioneaz cu componentele probei
sau cu suportul. Desigur c viteza optim nu este aceeai pentru toate gazele i se
stabilete pe baza ecuaiei Van Deemter. Presiunea de la captul coloanei se regleaz cu
ajutorul unui regulator de presiune i ventil ac.
Introducerea probei se realizeaz cu aa-numitele seringi micrometrice (fig. 2), n
cazul probelor care au volumele n domeniul 0.1-10l. Cu acestea, dup umplerea cu
volumul de prob necesar, apsnd pistonul, se injecteaz coninutul prin cauciucul
siliconic sau garnitura inelar a unui septum din dispozitivul de introducere a probei.
Pentru gaze se folosesc fie seringi ceva mai mari, de 0.5ml, fie nite dispozitive speciale
numite ventile pentru introducerea probei.

11
 Dispozitivele pentru injecie au rolul de a permite introducerea seringii i totodat,
de a provoca volatilizarea probei n curentul de gaz purttor ct mai aproape de intrarea
n coloan. Aceste dispozitive sunt diferite n funcie de coloanele utilizate. De exemplu
n coloanele cu umplutur i cele capilare, cu diametre de 530m - wide bore, se folosesc
dispozitive cu volatilizare direct. Aceste dispozitive (fig. 3) au toate o inserie din sticl,
nclzit, introdus ntr-un tub prin care trece gazul purttor, aflat la o temperatur
suficient de ridicat pentru a permite volatilizarea probei simultan cu injectarea acestuia.
Captul de sus al dispozitivului din fig. 3, situat n afara cromatografului, conine un
septum, adic o pastil din cauciuc siliconic care permite ptrunderea acului ascuit al
seringii. Cellalt capt al dispozitivului este legat la coloana cromatografic prin
intermediul unui racord filetat i a unei garnituri. Astfel, imediat dup injectarea probei,
aceasta ptrunde n capul coloanei.
Pentru coloane capilare, care au debitele mult mai mici iar volumele introduse n
coloane deosebit de mici, introducerea cu o sering a probelor, direct, ar compromite
coloana definitiv. De aceea se folosesc nite dispozitive speciale cu ajutorul crora doar o
mic fraciune din prob, cunoscut, intr n coloan iar restul este evacuat n
atmosfer. Dispozitivele se numesc split/splitless iar fraciunea de prob introdus efectiv
n coloan reprezint 1/20 pn la 1/500 din volumul injectat cu seringa. Incinta
termostatat n care se afl coloana, numit etuv-termostat, are temperature reglabil
ntr-un domeniu larg (40-450C) fiind foarte precis stabilizat (0.1C) i totodat
ventilat, pentru o egalizare rapid a temperaturii. La anumite cromatografe, se pot
executa i programe de temperatur, adic nclziri controlate ale coloanei, n timp, pe
parcursul efecturii analizei.
Are loc n acest fel o
volatilizare treptat a
compuilor - la nceput ies
cei volatili care migreaz
rapid i la urm, cei mai
puin volatili care migreaz

12
foarte lent mrind mult durata analizei. Programele se stabilesc prin ncercri
experimentale.

Detectorii gaz cromatografici

Detectorii sunt instrumentele analitice propriu zise din gaz cromatografe, avnd
rolul de a sesiza n mod continuu, rapid i cu o mare sensibilitate, componentele din
proba supus analizei. n corpul detectorului zonele cromatografice care ies separate din
coloan, coninnd de preferin moleculele unei singure substane, se transform n
semnale electrice (picuri). Pentru a se putea compara, ca performane, fiecare detector
este caracterizat de nite mrimi fizice: specificitate, sensibilitate, zgomot de fond, drift,
limit de detecie, constant de timp, reactivitate, efect asupra probei i altele, comune
multor metode analitice. De asemenea, unii detectori distrug proba iar alii o las
nealterat, permind separarea fizic a acesteia. Despre sensibilitate i limita de detecie
am amintit n cursurile introductive cteva lucruri eseniale valabile i aici. n orice gaz
cromatograf trebuie s existe cel puin un detector universal care s permit nregistrarea
sigur a tuturor componenilor. n afar de acesta mai pot exista i ali detectori specifici,
care mresc sigurana analizei componenilor de interes practic, deoarece rspund doar la
anumite tipuri de molecule.
Domeniul dinamic liniar al detectorului reprezint domeniul n care semnalul
variaz liniar cu concentraia (sau alteori cu debitul masei de component) ce trece prin
detector. Acesta se msoar de la limita de detecie pn la nivelul superior de
concentraie la care apar abateri de la liniaritate de peste 5%. Domeniul dinamic liniar se
stabilete experimental prin construirea curbei de etalonare n urma injeciei unor cantiti
cresctoare de component.
Exist mari diferene ntre metodele de detecie (tabelul 1) dar toate au domeniul
liniar mai ridicat dect multe dintre metodele de analiz optice. Cei mai utilizai detectori
sunt n practica curent detectorii cu un domeniu liniar larg, anume: detectorul bazat pe
conductibilitate termic (TCD), detectorul cu ionizare n flacr (FID), detectorul cu

13
fotoionizare (PID) i cel cu captur de electroni (ECD). Se observ de asemenea c cei
patru detectori acoper mpreun un larg domeniu de concentraii motiv pentru care gaz
cromatografele comerciale au n dotare cel puin doi din aceti detectori.

Constanta de timp reprezint viteza de rspuns a instrumentului din momentul

intrrii componentului n detector. Mai riguros, acesta reprezint timpul necesar
rspunsului detectorului pentru a atinge 90% din valoarea limit final. Acest parametru
include i ntrzierea datorat electronicii.
Reactivitatea include i posibilitatea reinerii de componente ale probei sau
provenite din aceasta prin degradare, prin adsorbie sau prin reacii chimice.
Efectul aspra probei poate fi distructiv sau nedistructiv. n ultimul caz proba
separat poate fi izolat. De exemplu, FID este un detector distructiv pe cnd TCD este
nedistructiv.

Detectorul bazat pe ionizare n flacr (FID)

Acesta este unul din cei mai folosii detectori, n special datorit sensibilitii sale
ridicate la compuii cu carbon, practic nelipsii din orice tip de gaz-cromatograf dedicat
analizei substanele organice. Dei distruge proba, a fost detectorul care a consacrat
definitive cromatografia de gaze. Funcionarea sa are la baz modificarea
conductibilitii electrice a gazelor n prezena unor particule ncrcate (de regul
molecule ionizate). Dac la presiunea i temperatura ambiant un gaz aflat ntre doi
conductori este un izolator foarte bun, n momentul cnd ntre cei doi electrozi apar
particule ncrcate electric, n urma deplasrii acestora n cmpul electric creat, apare un

14
curent electric. Ionizarea moleculelor probei este intensificat de prezena unei flcri de
hidrogen, care arde n aer ntr-o incint, flacr ce atinge temperaturi ridicate (2000-
2200C).
Cele mai slabe semnale, care nu pot servi unei analize chimice, le dau substanele
alctuite din moleculele covalente simple: N2, O2, CO, CO2, H2O, CS2, NH3, CCl4,
SiCl4,oxizi de azot, He i alte gaze rare. De aceea gazul purttor n cromatografia de gaze
este N2, He sau Ar, condiii n care detectorul d un semnal de baz minim, foarte stabil.
Schia simplificat este prezentat n fig. 6.

n momentul apariiei in flacr a unor molecule organice, de exemplu

hidrocarburi sau derivai, ionizarea duce la un semnal (curent) specific fiecreia dintre
acestea. Curentul se transform n tensiune pe rezistena cu valoare ridicat R. i aici
debitele gazelor trebuie s fie riguros constante. Sensibilitatea FID la fluctuaiile debitului
i ale temperaturii sunt ceva mai mici dect la detectorul bazat pe conductibilitatea
termic. n gazul purttor provenit din coloan, se dilueaz cu hidrogenul i aerul
necesare i eventual cu un alt gaz inert (N2, Ar). FID (fig. 6) este confecionat adeseori
din oel inoxidabil iar ntre corpul metalic i placa cilindric pozitiv, de deasupra sa, se
aplic un potenial de polarizare de 100-300V, continuu. Rspunsul detectorului, depinde

15
de numrul de molecule ionizate ce apar n flacr. Cele mai stabile rezultate se obin
pentru alcani. Pentru alte substane semnalul n general scade cu creterea numrului de
heteroatomi din molecul. De aceea, aici este nevoie de un factor de corecie specific
pentru fiecare compus analizat. De regul se folosesc factori de corecie relativi, adic
raportul dintre arie i unitatea de mas a unui compus de referin i rspunsul, pentru
unitatea de mas a speciei chimice analizate.

Detectorul cu captur de electroni

Gazul purttor este n acest caz azotul. La ptrunderea n detector, acesta este
ionizat de ctre o surs - radioactiv (sunt suficieni civa mCi furnizai de o surs
coninnd 63Ni). Gazul, trece apoi printre doi electrozi, ntre care se asigur o cdere de
tensiune de o sut de voli de regul ntre un electrod central, pozitiv i corpul
electrodului - negativ. n lipsa oricrei molecule organice n gazul purttor, exist un
curent de baz redus datorat moleculelor de diazot (N2) - ionizate negativ. La apariia n
detector a unei molecule organice M, care conine elemente electronegative (ca Cl sau F)
- cu mare afinitate pentru electroni, aceasta va capta o parte dintre electronii radiaiei -.
Va aprea, n consecin, o diminuare a curentului de recombinare a ionilor de semne
contrare. Au loc aadar transformrile:

N2 N2 + e-, Curent de fond

M + e- M-; M- + N2+ M + N2, Diminuarea curentului de fond.
Se produc deci picuri negative, ceea ce nu deranjeaz cu nimic rezultatul final -
analiza chimic. Fiecare particul - poate genera prin ciocniri ntre 100 i 1000 electroni
termici. Acetia avnd o mobilitate ridicat vor fi colectai de anod nainte de a se putea
recombina cu ionii pozitivi de diazot. De aici rezult sensibilitatea mare a metodei.
Curirea detectorului se face prin scoaterea electrodului +, pe care se depun o mic parte
dintre moleculele organice ionizate. Acest detector este unul selectiv, adecvat pentru
detecia compuilor halogenai (pesticide), avnd o liniaritate a rspunsului aproximativ.

Detectorul bazat pe fotoionizare (PID)

16
 Detectorul bazat pe fotoionizare (PID) este un detector deopotriv sensibil i
specific pentru hidrocarburi aromatice i cu heteroatomi (P i S) n molecul. Dispozitivul
se bazeaz pe capacitatea razelor UV de a ioniza moleculele organice, care prsesc
coloana o dat cu gazul purttor. Analog cu metoda precedent, bazat tot pe ionizare,
ionii produi sunt colectai pe doi electrozi, cel pozitiv fiind cel demontabil (permind
astfel ntreinerea periodic). Deoarece fraciunea moleculelor ionizate este mic, PID se
consider un detector nedistructiv i poate fi nseriat cu ali detectori. Lmpile UV cu
energii cuprinse ntre 5.6 i 11.7eV pot furniza o selectivitate suplimentar, peste 10.6eV
practic toate moleculele organice ioniznd.

Coloanele gaz cromatografice

Coloanele sunt inima oricrui cromatograf de gaze i sediul separrii respectiv al
corectitudinii rezultatului analizei chimice. Iniial au existat dou tipuri de coloane: (A)
cu umplutur i (B) coloane capilare (fig.7 ). Din anii 1990 a mai aprut un tip
coloanele 530m (whide bore) - care dei nu mai sunt coloane capilare, n adevratul sens
al cuvntului, pstreaz geometria i tipurile de umplutur ale coloanelor capilare.
Coloanele cu umplutur -primele coloane cunoscute n GC - sunt confecionate din tuburi
(oel, sticl sau alte materiale), avnd diametre cuprinse ntre 2-8 mm - cel mai frecvent
de 1/8 oli (3.18mm) sau oli (6.35mm) - i conin adsorbeni, site moleculare sau un
support inert pe care se gsete depus sau legat chimic un film subire dintr-o faz
staionar. Raportul diametrelor coloanei i umpluturii trebuie s fie cuprins ntre 25 i
20. n ultimul timp au aprut i coloane cu umplutur de 1/16 oli.
Umplutura coloanei const dintr-o anumit faz staionar - activ care se depune
pe granulele umpluturii inerte i poroase, n afara coloanei (dup dizolvarea acesteia ntr-
un solvent potrivit ales) prin amestecare urmnd apoi evaporarea solventului ntr-o etuv
Doar apoi umplutura se introduce n coloan i coloana se monteaz n cromatograf, prin
intermediul unor racorduri filetate. Debitul gazului purttor la aceste coloane este cel mai
mare, fiind cuprins ntre 10 i 40mLmin-1. Astfel de coloane sunt din ce n ce mai puin
utilizate.

17
Fig. 7. Cele dou tipuri de coloane, cu umputur - A i capilare - B;
coloanele 530 m (wide bore) nu difer ca geometrie de cele capilare

Suportul poros (i totodat inert) este format dintr-un material solid, elaborat
industrial, de form preferat sferic i cu o granulaie ct mai uniform (de exemplu 60-
80 mesh sau 80-100 mesh [109]). n raport cu suportul poros, faza staionar constituie
doar 3- 25%. Cele mai rspndite sunt confecionate din pmnturi diatomitice (de ex.
diversele tipuri de Chromosorb) dar multe sunt fabricate din silice (de ex. Spherosil).
Acestea se modific chimic prin silanizare pentru a deveni inerte.
Coloanele capilare sunt, la rndul lor, de cel puin dou tipuri:
faz staionar depuse chiar pe peretele coloanei capilare (WCOT)
faza staionar depus pe un suport solid, poros, aderent, format n prealabil pe
peretele acesteia (SCOT).

18
Au diametre 0.1-0.35mm i lungimi ntre 5-100m, separarea durnd ceva mai mult dect
la cele cu umplutur. Cu ct coloana este mai lung durata analizei crete. Coloanele
capilare se confecioneaz n ultimul timp mai ales din sticl de cuar. n exterior acestea
sunt mbrcate ntr-un polimer - poliamid - pentru a rezista mai bine la ocuri mecanice
respectiv la coroziune (n acelai scop se mai folosete aluminiul). Coloanele sunt
bobinate pe suporturi metalice avnd o form circular.

Coloanele WCOT conin faza staionar sub form de film subire n interiorul
capilarei, grosimea acestuia variind ntre 0.05-5m. Faza staionar poate fi depus fizic
sau chiar legat chimic de grupele -OH ale silicei hidratate. Si aceste coloane sunt
disponibile deja comercial pentru majoritatea aplicaiilor curente. Eficacitatea unei astfel
de coloane poate atinge 150mii talere teoretice. nlimea echivalent a unui taler teoretic,
H, n cazul acestor tipuri de coloane, are o expresie deosebit de ecuaia lui Van Deemter
i a fost descoperit de Golay, anume:

unde termenul A lipsete iar CG este coeficientul de difuzie al speciei moleculare

separate n faza gazoas, CL, fiind acelai coeficient pentru faza lichid. Coloanele
530m sau wide bore sunt confecionate tot din silice (SiO2) avnd lungimi cuprinse
ntre 5-50m. Le-am putea denumi coloane semicapilare deoarece pstreaz caracteristicile
coloanelor capilare dar dimensiunile nu mai sunt apropiate de dimensiunea
firelor de pr. Debitul prin aceste coloane atinge 15mLmin-1 (adic intr n domeniul
celor cu umplutur), dar au performane superioare acestora.
Fazele staionare sunt i ele de mai multe feluri: polare, de exemplu
polietilenglicoli, nepolare de exemplu cauciucuri siliconice, intermediare i n sfrit cele
cu puni de hidrogen sau cele specifice (de exemplu cele destinate separrii amestecurilor
racemice). Fazele staionare sunt lichide sau solide.
Fazele staionare lichide sunt formate din lichide nevolatile avnd o compoziie
chimic foarte variat (peste 100 de tipuri). Pentru a se putea lega chimic numrul

19
acestora a fost restrns la cele care pot, prin sintez, s duc la un film grefat pe partea
intern a coloanei. La ora actual se pot distinge dou tipuri de compui preferai:
polisiloxanii i polietilenglicolii fiecare ntr-o varietate care s permit modificarea
polaritii acestora.

Analiza calitativ i cantitativ n GC

Analiza calitativ
n GC analiza calitativ se poate realiza fie pe baza utilizrii timpilor de retenie
ajustai, tR' fie pe baza volumelor de retenie ajustate, VR' msurate experimental n
cazul probei necunoscute i comparate cu valorile similare ale unor probe cunoscute.
Deci pentru orice analiz calitativ este nevoie de substana pur, lucru nu ntotdeauna
accesibil. De aceea cuplajul cu spectrometria de mas a depit acest neajuns, devenind
una dintre cele mai bune tehnici de analiz calitativ.
n cazul LC eluentul, un lichid, este necompresibil i n consecin, debitul acestuia nu se
va modifica la nceputul coloanei fa de sfritul acesteia. n cazul CG, ns, presiunile
iniial, pi i cea final, pf, fiind diferite, este necesar introducerea unei corecii a
volumului de retenie msurat, cu ajutorul unui factor, j, numit factorul de corecie
corespunztor cderii de presiune. Acesta se poate calcula din ecuaia dat n cele ce
urmeaz, fr deducie:

n care cu p s-a simbolizat raportul presiunilor, iniial (pi) respectiv final (pf), adic p =
pi/pf.
Cu ajutorul acestei mrimi semnale de retenie din diverse condiii experimentale
se pot face comparabile n analiza calitativ prin CG.
Volumul de retenie corectat, VR definit prin produsul:
VR0 = jVR
20
unde j este factorul de corecie de mai sus iar VR - volumul de retenie.
Volumul de retenie net, VN, este volumul de retenie ajustat dar corectat i pentru
cderea de presiune
VN = jVR'
Aceste volume sunt utilizate cu precdere n analiza calitativ fiind mai sigure dect
volumul de retenie simplu mai ales cnd nu se mai recurge la alte tehnici.
Volumul de retenie specific, Vg. Prin mrirea cantitii de faz lichid staionar,
fie prin utilizarea unei cantiti (grosimi) mai mari fie prin utilizarea unei coloane mai
lungi, crete volumul de retenie. Pentru a se lua n considerare i acest factor se definete
volumul de retenie specific (exprimat de regul n mL/g) cu ecuaia de definiie:

Vg = 273VN/(TcmL)

unde Tc este temperatura absolut a coloanei,

VN - volumul de retenie net al componentului i
mL - masa fazei staionare lichide din coloan.

Dar pentru c toi aceti parametri depind, n mare msur, de o serie de condiii
experimentale ca temperatura, debitul gazului purttor, cantitatea de faz lichid etc,
pentru identificarea substanelor se recurge n ultimul timp la utilizarea indicilor de
retenie Kovts. Aceti indici, notai n continuare cu I, sunt practic independeni de
factorii amintii. Astfel, pentru orice substan de analizat calitativ se caut o pereche de
n-alcani care dau picuri situate ca timp de retenie unul nainte, altul dup substana
amintit. Din cele trei valori tR' msurate se calculeaz valorile I. Indicii de retenie
Kovts exprim retenia relativ a unei substane oarecare, fie cunoscut, fie necunoscut,
raportat la cea a unor alcani normali, luai drept substane de referin (sau etalon).
Formula de calcul, propus de autorul metodei, pentru indicii amintii este:

21
unde tR,X', tR,n' i tR,n+1' sunt timpii de retenie ajustai pentru substana necunoscut X
respectiv alcanii cu n respectiv n+1 atomi de carbon. Valoarea n se alege astfel ca tR,n' <
tR,X' < tR,n+1' adic, n aa fel ca timpul de retenie al substanei necunoscute s fie cuprins
ntre timpii de retenie ai celor doi alcani. De exemplu, benzenul are timpul de retenie
cuprins ntre cel al n-hexanului i al n-heptanului (ca i cum ar avea cam 6,5 atomi de
carbon). Schimbnd condiiile experimentale se schimb tR', respectiv VR', dar niciodat
valoarea indicilor de retenie I. Metoda se bazeaz pe faptul c practic nu exist substan
chimic separat prin GC creia s nu i se poat asocia o pereche de n-alcani care au
timpul de retenie, unul mai mare i altul mai mic dect substana respectiv. Pentru seria
omoloag a alcanilor este respectat ecuaia:
log(tR') = an + b

unde a i b sunt nite constante numerice gsite pe cale experimental, care sunt aceleai
pentru o coloan i condiii fizico-chimice date. Se observ c n formula valorii I,
termenul b se va reduce i factorul a se va simplific. Astfel, indicele Kovts, I, va
depinde doar de numrul aparent de atomi de carbon ai substanei respective - constant.
Experimental se procedeaz astfel: dup cteva ncercri preliminare se injecteaz
mpreun cei doi alcani, cu Cn respectiv Cn+1 mpreun cu substana de analizat, X iar
dup msurarea pe cromatogram a valorilor tR' pentru toate trei picurile componentelor
amestecului, prin nlocuirea acestora n formula precedent sau pe cale grafic, se obine
indicele Kovats, I ( fig. 12).

22
 Analiza cantitativ

n anumite condiii (pe poriuni liniare ale rspunsului detectorului, condiii

experimentale identice etc.), suprafaa dintre linia de baz i curba picului cromatografic -
semnalul analitic - este proporional cu cantitatea de component injectat. Deci, pe
domeniul liniar al detectorului, oricare ar fi acesta, exist relaia:
Masa injectat = K(Aria picului)
unde K este o constant numeric. Aceast proprietate poate servi pentru construirea unei
curbe de etalonare fiind general valabil att n cazul GC ct i n celelalte tehnici
cromatografice. Se poate i aici aplica metoda adausului standard, mai ales la domenii
liniare largi. Pentru valori tR' mici, cnd picurile sunt i ascuite i nguste, se poate
utiliza n locul ariei nlimea sa - cu rezerva unei pierderi din precizia determinrii.
Amintim n cele ce urmeaz cteva practici de baz legate de analiza cantitativ folosind
ariile picurilor.

Metoda standardului (etalonului) intern

De multe ori apar fluctuaii neateptate n condiiile experimentale de la o prob la

alta. Pentru evitarea surprizelor de acest gen (i a erorilor aferente analizelor) se
utilizeaz, analog cu alte metode instrumentale, un standard intern, diferit de substana de
analizat.
Acesta este o substan pur cunoscut, introdus intenionat n amestecul care
constituie proba, i totodat aflat pe cromatogram n vecintatea componentelor de
analizat, de fiecare dat n aceeai cantitate. Motivul introducerii este tocmai acela c
raportul dintre ariile unui pic oarecare i standardul intern este constant, indiferent de
debitul gazului sau al altor perturbaii uoare ale condiiilor experimentale, tocmai
datorit asemnrii fizice dintre substana etalon i prob. Analitic, concentraia
necunoscut se calculeaz, n acest caz, n funcie de standardul intern i proba
cunoscut:

23
unde CX,N este concentraia substanei X n proba de analizat (necunoscut), CX,S -
concentraia substanei X, ce urmeaz a fi analizat, n proba etalon (cunoscut), AX,N
aria picului substanei X n proba de analizat, ASI,N - aria picului corespunztoare
standardului intern din proba necunoscut, ASI,S - aria picului standardului intern n proba
etalon. Se observ c raportul ASI,N /ASI,S, apropiat de unu, corecteaz micile abateri care
apar la analiza probei necunoscute n timpul cromatografierii, n raport cu proba
cunoscut, de concentraie CX,S (denumit prob etalon i executat pe o alt
cromatogram, separat).

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA

PERFORMANTA
Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC1) acoper azi, n proporie
aproximativ 80%, analiza substanelor moleculare:organice, organo-metalice i
anorganice inclusiv compuii foarte polari sau labili termic precum i compuii cu mas
molecular ridicat(naturali sau sintetici).
De aceea, mpreun cu cromatografia de gazeconstituie un punct de sprijin
important n analizele chimice moderne.Dei eficacitatea coloanelor nu o egaleaz nc
pe cea din GC, prinfaptul c se poate modifica, pe lng faza staionar, i faza
mobil,cromatografia de lichide (LC) face posibile separri i analize uneori imposibil de
realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de mas a transformat, n ultimul
timp, aceast metod n principalul mijloc de analiza a compuilor moleculari naturali sau
sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijin chimia sintetic actual i pe care
s-a dezvoltat biochimia moderna.

Coloanele n LC
Locul n care sepetrece separarea propriu-zis i - n funcie de calitatea acesteia - se

mrete sau micoreaz raportul semnal/zgomot, este coloana cromatografic. Dei muli
autori denumesc coloana piesa cea mai important dintr-un cromatograf, acesta din
urm, fiind format
dintr-o serie de componente, rezult c fiecare compartiment n parte, contribuie separat
la obinerea rezultatului analitic. Pentru un practician din domeniul LC ns, locul unde

24
acesta intervine efectiv i unde se concepe logic separarea este ntr-adevr coloana.

Se cunosc pn n prezent mai multe mecanisme de separare prin coloane, care

depind mult de fazele mobil i staionar. Mai exact, depind de natura fenomenului
fizico-chimic pe care se bazeaz retenia difereniat i separarea. Metodele LC (HPLC)
se pot clasifica, dup
mecanismele principale amintite , astfel:
(1) cromatografie de adsorbie,
(2) cromatografie de repartiie,
(3) cromatografie ionic,
(4) cromatografie de excluziune steric.
Fiecare dintre aceste variante este preferat n cazul unor grupuri de substane,
asemntoare structural , neexistnd din pcate un mecanism universal.
Se disting dou moduri de realizare a cromatografiei de
repartiie:
a) Cromatografie de repartiie direct (sau cu faze normale - clasic);
b) Cromatografia de repartiie cu faze inversate metoda preferat n zilele
noastre pe care se realizeaz cele mai numeroase separri.
Cromatografia ionic (IC) are mai multe variante. Cea mai frecvent ntlnit astzi
folosete n calitate de faz mobil solveni apoi diluai de electrolii iar ca faz
staionar schimbtori de ioni. Metoda va fi descris ntr-un capitol special (cap. 18)
datorit implicaiilor actuale n analizele de ape legate de protecia mediului. O alt
variant denumit cromatografie prin perechi de ioni folosete faze staionare capabile s
fixeze anumii ioni care fixeaz ioni de semn contrar (perechi de ioni).Acest mecanism se
prefer n cazul substanelor ionice sau ionizabile.

Faza staionar
Silicagelul (SiO2) este considerat materialul cel mai important utilizat ca faz
staionar. Acesta a devenit, n ultimii 20 de ani, doar suportul adevratelor faze fazele
chimic legate ceea ce nu schimb importana sa. Silicagelul s-a obinut la nceput n
form granular, neregulat, apoi n form sferic. Indiferent de form, granulaia trebuie
s fie uniform (se eliminpartea fin) pentru c astfel caracteristicile curgerii eluentului
sunt mult mbuntite.
Obinerea silicagelului sferic se face plecnd de la soluii coninnd silicat de
sodiu dar i ali compui hidrolizabili ai siliciului (tetraclorur de siliciu, silicat de etil
etc.). De la acetia, printr-o reaciecu apa urmat de o pulverizare i apoi de o sinterizare,
se obin granule cu aspect sferic. Puritatea sa avansat este o condiie a bunei funcionri
a materialului n LC deoarece prezena unor ioni metalici modific structura determinnd
apariia unor centre de adsorbie puternice i de aici apariia unor cozi ale picurilor.
Silicagelul are o structur tridimensional cu o reea de baz, tridimensional, format din
legturi Si O Si iar pe suprafaa porilor sau cea exterioar mai prezint grupe silanol,
Si-OH. Punile de oxigen apar ntre atomii de siliciu cu ocazia polimerizrii acidului
silicic, Si(OH)4.
Fazele staionare chimic legate au aprut n urma ncercrilor mai puin eficace de
utilizare a unor faze staionare lichide depuse pe un suport poros solid - permeabil pentru

25
eluent (a fost preferat kieselgur-ul sau pmntul diatomitic n esen tot SiO2 dar cu
pori mari i o
suprafa mult mai mic. Deoarece n toate aceste ncercri faza staionar era splat de
pe suport de ctre eluentul n micare i n felul acesta deranja funcionarea detectorului,
s-a recurs la soluia crerii unor faze care s fie fixate prin legturi chimice - mult mai
puternice dect
cele fizice.

Faza mobil
Faza mobil sau eluentul n LC nu reprezint un mediu inert ca gazul purttor din
GC. De aceea alegerea fazei mobile se face aici n perfect concordan cu faza
staionar. Astfel faza mobil difer destul de mult n funcie de tipul interaciunilor
componentelor separate cu faza
staionar din coloan. Singurele caracteristici generale sunt urmtoarele: (1) faza mobil
trebuie s aib o viscozitate cobort, (2) aceasta trebuie s dizolve bine componentele,
(3) nu trebuie s afecteze funcionarea coloanei i (4) trebuie s permit funcionarea
detectorului.
Unii elueni provoac migrarea unui anumit component mai repede prin coloan. Se
spune c acetia au o trie relativ mai mare sau, altfel spus, au o putere de eluie mai
ridicat. Aceast denumire provine de la faptul c factorul de capacitate, k, este mai mare
i de
aceea componentul migreaz mai repede. Dar totul depinde de trio-ul component faz
mobil - faz staionar. Astfel, pe o faz staionar polar, folosind o faz mobil
nepolar, se vorbete de cromatografie de repartiie normal (sau cu faze directe). Din
contr, pe o faz staionar
nepolar utilizndu-se o faz mobil polar se vorbete de cromatografie de repartiie cu
faze inverse (sau inversate). n acest ultim caz au devenit uzuale fazele mobile formate
din amestecuri metanol ap care n cromatografia de repartiie sunt considerate printre
fazele mobile mai
puin tari.
n cromatografia ionic (IC) se folosesc soluii diluate de electrolii ca: NaOH,
NaHCO3, HCl, iar n cea de excluziune steric solveni simpli evident compatibili cu
polimerii, separai unii de alii dup dimensiuni.
O alt cale de mbuntire a separrilor existent n LC (cale inexistent n GC)
este folosirea gradienilor de eluie. De exemplu, n GC, prin modificarea eluentului
gazos nu se constat nici o mbuntire a calitii separrii, n sensul mririi selectivitii.
n HPLC, din contr,
solventul are o contribuie important n procesul de separare, dar nu trebuie neglijat
importana decisiv a cuplului faz mobil faz staionar. Dei unii compui sunt
reinui slab prin coloan, ieind destul de repede, cei reinui puternic ies din coloan
dup un timp cteodat nepractic de lung, lucru care determin diluarea n eluent a
componentul n urma parcurgerii coloanei, aceasta micorndu-se calitatea analizei. De
aceea s-a recurs la introducerea treptat peste primul solvent (eluent), a unui al doilea
solvent mai tare sau a celui de-al treilea, ceea ce n limbajul de specialitate se numete
gradient de eluie (sau de concentraie).

26
CROMATOGRAFIA IONICA
Utilizarea cromatografiei ionice a aprut datorit necesitilor de a analiza
amestecurile de anioni, cationi sau compui polari lucru dificil sau imposibil de realizat
eficient prin celelalte variante ale cromatografiei de lichide. Aceast variant a
cromatografiei de lichide
de nalt presiune se bazeaz pe utilizarea coloanelor cu schimbtori de ioni respectiv a
materialelor rezistente la agresivitatea acizilor, bazelor sau srurilor substane a cror
soluii apoase care servesc drept elueni.
Schimbtorii de ioni sunt materiale solide - derivai ai unor polimeri reticulai
(poroi), obinui prin legarea de catenele hidrocarbonate, ramificate, ale unor grupe
funcionale.
Granulele de rin se solvateaz cu ap tinznd spre un volum- limit maxim.
Prin spaiile dintre catenele unui cationit pot ptrunde prin difuziune n faz lichid doar
molecule neutre sau cationi, anionii fiind exclui. Ptrunderea n granule a ionilor
de semn contrar este ngreunat i de un alt efect, numit efectul Donnan de membran,
care apare pe suprafaa granulei i provoac o selectivitate a acesteia la ptrunderea
ionului, n funcie de dimensiunile acestuia. Mai exist i un al treilea mecanism util n
cazul substanelor
neionice sau a celor ionice dar cu gruparea ionic identic dar cu geometria moleculei
diferit difuzia prin granule. Analog stau lucrurile ntr-un anionit, cu deosebirea c de
ast dat sunt exclui cationii.
Dac pe o coloan umplut cu un cationit se introduce un amestec de doi ioni, s
zicem cel format din sodiu i potasiu, acetia vor fi fixai pe rin, elibernd o cantitate
echivalent de ioni hidroniu. Fenomenul chimic care are loc se poate scrie:
R-H + Na+ R-Na + H+
R-H + K+R-K + H+
Pompnd un eluent prin coloan, de exemplu o soluie diluat de acid clorhidric,
ionii H+ din acid, fiind n concentraie mai mare, vor deplasa ionii fixai, prin echilibre
ionice similare spre o poriune inferioar:
R-Na + H+R-H + Na+
R-K + H+R-H + K+
iar acetia se vor putea fixa din nou, puin mai jos, pe alte centre de schimb din coloan.
Procesul se repet ionii migrnd de sus n jos prin coloan. Deoarece gruprile
funcionale -SO3- au o afinitate ceva mai mare pentru ionii de potasiu dect fa de cei de
sodiu, primul grup de ioni (sau prima zon) care va iei din coloan va fi cel format din
ionii de sodiu i abia dup un timp va iei grupul coninnd ionii de potasiu. Astfel se
realizeaz separarea celor doi ioni. Similar stau lucrurile cu amestecuri mai complicate,
uneori fiind necesare coloane mai lungi.
ntruct cu ct diametrul granulelor este mai mare zonele sunt mai largi i,
totodat, separarea mai de durat iar granulele se deformeaz mecanic, n timp mai uor,
ulterior rina a fost aplicat sub form de pelicul subire pe un miez de sticl sferic,
eficacitatea separrii i fiabilitatea coloanelor crescnd foarte mult.
Fazele mobile n IC sunt simple - soluii apoase diluate de acizi sau baze i doar

27
cnd este necesar, se mai adaug o concentraie cobort de metanol pentru a se facilita
dizolvarea moleculelor puin ionizate n ap. Pentru separarea cationilor se utilizeaz ca
faze staionare cationii (schimtori de cationi) i drept elueni, soluii de acizi, iar pentru
separarea bazelor se folosesc anionii (schimbtori de anioni) i ca elueni soluii de baze,
de exemplu, o soluie de hidrogenocarbonat de sodiu.

Detecia
La prsirea coloanei ionii nu pot fi detectai suficient de sensibil, conductometric,
n mod direct, deoarece au concentraii coborte i sunt coninui n eluentul format dintr-
un electrolit - cu o concentraie comparabil sau chiar mai mare. De aceea s-a recurs la
"supresorul ionic". Acesta a fost realizat pentru prima dat de un grup de cercettori
american, n 1975 (H. Small i colab.) iar iniial a constat dintr-o coloan-supresor,
plasat n continuarea celei de separare, cu rolul de a transforma eluentul (un acid sau o
baz tare) n ap. De exemplu, pentru eluentul amintit anterior - acidul clorhidric
coloana supresor este umplut cu o rin schimbtoare de anioni, avnd o capacitate de
schimb mare cu o formul general: R-OH. Prsind coloana de separare eluentul,
coninnd acid clorhidric diluat, va ptrunde n coloana supresor unde se va petrece
reacia:
R-OH + (H+ + Cl-)R-Cl + H2O
prin care acidul utilizat drept eluent se transform n ap un neelectrolit.
ntre timp, srurile se transform n hidroxizii corespunztori:
R-Cl + (Na+ + OH-)R-OH + (Na+ + Cl-)
R-OH + (K+ + Cl-)R-Cl + (K+ + OH-)
Apa fiind practic neionizat va permite detecia sensibil a hidroxizilor total ionizai -
ce au aprut din zonele formate iniial din cele dou sruri.
Dac se urmrete separarea a doi anioni, de exemplu Cl- i Br-,eluentul ar putea fi,
nu un acid ci o baz diluat, de ex. NaOH, sau NaHCO3. n cazul acesta separarea se va
realiza pe coloane de anionii i eluentul ar fi de exemplu NaOH, la ieirea din coloana de
separare avem
n eluentul folosit zonele separate ale srurilor anionilor supui analizei, adic NaCl i
NaBr. Supresorul utilizat n acest caz va fi format dintr-o rin de forma R-H n exces pe
care se va petrece reacia:
R-H + (Na+ + OH-)R-Na + H2O

CROMATOGRAFIA PLANARA
Cromatografia planar (PC) ntlnit adesea sub denumirea de cromatografie n strat
subire este cea mai simpl i ieftin dintre toate metodele cromatografice cunoscute. Mai
este denumit i cromatografia de lichide a sracului.
n literatura de specialitate se utilizeaz mai multe denumiri (cu prescurtrile
asociate acestora). Pe lng termenul consacrat cromatografia planar (planar
chromatography PC1) se mai ntlnesc denumiri ca cromatografia n strat subire de
nalt performan.
n aceast variant a cromatografiei de lichide, separarea nu mai are loc ntr-o
coloan nchis ci pe o faz staionar similar, granular (poroas) dispus ntr-un strat

28
subire, formnd un plan . Acest strat denumit subire, se realizeaz dintr-un adsorbent
cu grosimi cuprinse ntre 100 250 m i poate fi simplu sau legat adeziv de un plan
rigid, fiind pe tot parcursul separrii n contact cu o faz gazoas - mai mult sau mai puin
saturat cu vapori de eluent. Primul caz a fost mult utilizat n trecut n cazul aa-numitei
cromatografii pe hrtie unde faza staionar consta dintr-o band de hrtie de filtru,
confecionat din celuloz pur, sau, extrem de rar, prin folosirea unor plci din materiale
ceramice sinterizate poroase. Cellalt caz mult mai utilizat (chiar n zilele noastre) face
apel la straturi subiri realizate dintr-un adsorbent pulverulent (silicagel, celuloz,
alumin, poliamid sau derivate ale acestora) dispuse n straturi subiri pe plci rigide din
sticl sau, pe folii flexibile din aluminiu, poliester sau alte materiale inerte fa de
sistemul pe care are loc separarea. Se mai poate recurge i la straturi formate pe baghete
de sticl sau tuburi din sticl.
Obinerea straturilor subiri se realiza la nceput n laborator, pornindu-se de la o
suspensie apoas a adsorbentului pulverulent (10 40 m) mpreun cu un liant
anorganic (de exemplu ghips, SiO2 - coloidal ) sau organic (amidon,
carboximetilceluloz), iar pentru aplicare se foloseau nite dispozitive mecanice simple.
Straturile subiri mai pot include i indicatori de fluorescen care n lumin UV fac
posibil vizualizarea spoturilor substanelor care absorb n acest domeniu prin stingerea
fluorescenei, adic prin apariia unor spoturi ntunecate pe fond luminos. Straturile
subiri pot fi achiziionate gata preparate de la firme productoare specializate (Camag,
Cole-Parmer etc.).
Aplicarea probei. Pentru a se putea demara procesul de eluie, n prealabil pe placa
cu strat subire se aplic proba. Acest lucru se realizeaz cu seringi sau micro-pipete, dar
i alte dispozitive specializate, astfel nct s se obin aliniate, pe linia de start,
mai multe spoturi de probe, respectiv de amestecuri etalon supuse simultan separrii.
ntruct probele se aplic din soluii diluate (1 2%), n anumii solveni, pentru a se
evita interferena acestora n procesul de eluie, plcile se usuc nainte de introducerea n
amestecul de solveni.
Migrarea eluentului prin coloana deschis, care acioneaz cu totul analog celei
nchise, are loc sub aciunea forelor capilare i provoac migrarea difereniat a
componentelor amestecului deseparat. Acest lucru se realizeaz n urma simplei
scufundri (manuale) a plcii cromatografice n eluentul potrivit. Din acest moment,
eluentul irignd prin capilaritate stratul poros migreaz ascendent prin stratul subire,
provocnd separarea. Timpul de separare variaz ntre 3 i 60 min.
Nu este totui exclus utilizarea unor dispozitive mai sofisticate de alimentare cu
solveni (minipompe) fcndu-se uneori apel chiar la gradieni de concentraie. Se poate
de asemenea practica migrarea eluentului pe orizontal sau descendent. Se poate elua o
plac chiar de mai multe ori sau se poate evapora solventul n timpul migrrii, n acest fel
mrindu-se eficiena pe seama timpului de separare.
Pentru realizarea separrii (eluiei) se utilizeaz camere de developare. Formele
preferate sunt cele paralelipipedice sau cilindrice (pahare), prevzute cu un capac i
eventual cu un dispozitiv de fixare a plcii plane (hrtie sau strat subire) i pot fi saturate
cu amestecul de solveni din tanc, pentru a se mri viteza de eluie. Camerele
paralelipipedice se numesc camere de tip N (normale) iar cele subiri poart numele de
camere de tip S (sandwich). Ultimele prezint avantajul unui volum mai redus al fazei
gazoase avnd o vitez de saturare mai mare i o durat a procesului de separare cu ceva

29
mai mic.
Eluia are loc dup introducerea plcii n camera cromatografic, pn cnd
amestecul de solveni atinge o nlime final, fixat de obicei ntre 5 i 18 cm, sau un
anumit timp stabilit, n prealabil, prin ncercri preliminare. Solvenii utilizai se aleg n
funcie de proprietile de eluie
ale substanelor supuse separrii (analizei). [1]

30
Bibliografie
[1] Metode si tehnici de analiz fizico- chimic a compuilor farmaceutici
Rodica Srbu, Ticuta Negreanu- Prjol, Iuliana Stoicescu, Bogdan Stefan
Negreanu- Prjol, Carmen Elena Lupu.

31