6.

METODE CROMATOGRAFICE APLICATE ÎN CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Cromatografia este una dintre cele mai utilizate metode instrumentale de analiză cu
aplicaţii în separarea, detecţia şi determinarea substanţelor chimice în general şi în particular a
celor medicamentoase.
Metoda cromatografică se bazează pe repartiţia diferită a componenţilor unui amestec
între o fază mobilă şi una staţionară având ca rezultat deplasarea cu viteze diferite a
componenţilor în coloană, separarea lor urmată de detecţie şi înregistrare.
O clasificare a metodelor cromatografice se poate realiza funcţie de natura fazei mobile
şi a celei staţionare, astfel:

Cromatografia (C)

Cromatografia în fază Cromatografia în fază

gazoasă(CG) lichidă(CL)

Cromatografia Cromatografia
gaz- lichid gaz- solid Cromatografia pe Cromatografia plană
C.G.L. C.G.S. coloană

Pe strat Pe hârtie
subţire(C.S..S) (C.H)

C. lichid-solid C. lichid- C. prin schimb C.de afinitate C. de excludere

lichid ionic sterică

În funcţie de procesele care stau la baza separărilor cromatografice există:

1
 - cromatografia de adsorbţie (C.G.S., CL.S.) în care faza staţionară este un suport
solid(Al2O3, SiO2, etc) cu proprietăţi adsorbante;
- cromatografia de repartiţie (C.G.L., C.L.L.) în care faza staţionară este o peliculă de
lichid fixată pe un suport solid şi nefiind miscibilă cu faza mobilă;
- cromatografia de schimb ionic în care faza staţionară e un compus macromolecular
reticulat, schimbători de ioni cationi sau anionici care conţin un număr mare de grupări funcţionale
acide sau bazice capabile să schimbe cationi sau anioni;
- cromatografia de excludere sterică în care faza staţionară este un gel ce se comportă
ca o sită moleculară fixând anumite molecule şi eliminând altele, funcţie de mărimea respectiv
masa lor moleculară;
- cromatografia de afinitate se bazează pe proprietatea unor adsorbanţi macromoleculari
de a manifesta o afinitate pentru anumite molecule. Aceste molecule de analit pot realiza
interacţiuni specifice cu un ligand fixat pe un suport inert.
- cromatografia chirală de adsorbţie sau repartiţie care conţine o fază staţionară sau
mobilă cu structura chirală ceea ce permite separarea unor enantiomeri.

6.1. TEORIA METODEI CROMATOGRAFICE

Parametrii cromatografici
Trebuie menţionat faptul că există o serie de noţiuni teoretice general- valabile tuturor
metodelor cromatogarfice (legate de procesul de separare cromatografică).
Câţiva parametrii cromatografici înlocuiţi în C.L. bazată pe repartiţia analiţilor între 2
faze.
Considerând o probă ce conţine 2 analiţi (A şi B) introdusă într-o coloană cromatografică
ce conţine ca fază staţionară un lichid fixat pe un suport inert. Prin aducerea fazei mobile în
coloană are loc migrarea analiţilor cu viteze diferite, procesul de separare producându-se treptat,
între concentraţiile celor 2 analiţi între faza staţionară şi faza moleculară realizându-se un
echilibru:
AM  AS
[ A ] S C AS BM  BS vA
K DA = = R R=
[ A ]M C A M vM

Puterea de separare a unei coloane depinde în primul rând de vitezele de eluţie ale celor
doi compuşi care sunt determinate de coeficienţii lor de repartiţie între faza staţionară şi faza
mobilă.
Din figură se constată că B este mai puternic reţinută pe faza staţionară decât A şi se
deplasează cu viteză mai mică.

2
 Faza mobilă

B
A B
A
Faza staţionară

A B

Timp (s)
tA
tB tB

Deci viteza de deplasare a analiţilor în coloană este raportul dintre lungimea coloanei şi
timpul de retenţie, adică timpul scurs de la introducerea probei în coloană şi înregistrarea sa de
către detector.
L L
vA= vB 
tA tB

6.1.1. Mărimi de retenţie

Toate mărimile de retenţie care caracterizează reţinerea analiţilor în coloana
cromatografică
Semnalsunt legate de coeficientul de distribuţie al analitului.
tR
(V
R)

Timp (min) Volum (mL)

3
 Timpul de retenţie, notat tR este timpul scurs de la introducerea probei în coloană şi
momentul înregistrării maximului picului caracteristic.
Elementul( faza mobilă) nereţinut pe coloană iese mult mai repede în timpul necesar ca faza
mobilă să ajungă la detector se numeşte timp mort (t0 sau tM)
De regulă, timpul de retenţie al analitului se măsoară din momentul apariţiei picului
elementului, numindu- se timp de retenţie corectat.

tR’ = tR - tM

Volumul de retenţie, notat VR, reprezintă volumul de fază mobilă necesară pentru a
aduce analitul în concentraţie maximă la detector. Şi în acest caz trebuie să se ţină seama de
volumul mort de fază mobilă care trebuie scăzut din volumul de retenţie pentru a se obţine
volumul de retenţie corectat.
VR’ = VR - VM

Raportul de retenţie notat RR se exprimă prin raportul dintre viteza medie de deplasare a
analitului şi cea a fazei mobile.

vA L L tM
R R= v A= v M= R R=
vM tA tM tA

Este posibil să se înlocuiească raportul timpilor cu cel al volumelor:

Raportul de retenţie are valoare subunitară, valoarea maximă poate fi 1 atunci când
analitulul nu este reţinut deloc în coloană.

Factor de retenţie sau de capacitate , notat cu K’ este raportul dintre cantitatea de analit
din faza staţionară QS şi cantitatea de analit din faza mobilă QM.

QS C S⋅V S VS
Volumul de retenţie VR poatek fi=exprimat
= şi funcţie =Kde coeficientul
D de distribuţie K D şi
fracţia molară. Atunci când se deplasează prin
Q C M⋅Vanalitul
M coloană M V M în faza mobilă iar
se găseşte
cantitatea lui în faza mobilă se poate exprima prin fracţia sa molară în fază mobilă.
Fracţia molară este raportul dintre cantitatea de analit din faza mobilă QM şi cantitatea
totală introdusă în coloană QT.

Deci QT = QM + QS

Raportul de retenţie se exprimă astfel:

QM QM
=
RR = Q T QM +Q S dar Q M =C M⋅V M şi QS =C S⋅V S
4
 C M⋅V M VM VM tM
R R= = = = ⇒V R =V M + K D⋅V S
C M⋅V M + K D⋅C M⋅V S V M + K D⋅V S VR tR

V R=V M +K D V S

6.1.2. Eficacitatea coloanei cromatografice

Condiţia necesară pentru separarea componentelor unui amestec este diferenţa dintre
vitezele lor de migrare prin coloană.
Pe măsură ce compuşi înaintează prin coloană are loc odată cu mărirea distanţei dintre
ele şi o lărgire a zonelor lor. Această lărgire este rezultatul difuziei longitudinale a componentelor
în faza mobilă, al vitezei cu care are loc procesul de repartiţie între cele 2 faze, al fluctuaţiilor de
viteză ale fazei mobile în diferite puncte ale coloanei.
Parametrul experimental ce caracterizează eficacitatea unei coloane este lăţimea picului
cromatografic. Forma unui pic poate fi aproximată în cazul cromatografiei prin curba Gauss.
Curba Gauss este caracterizată printr-o mărime numită deviaţie standard σ.
hmax – înălţimea picului
wi – lăţimea picului la punctul de inflexiune
wh – lăţimea picului la ½ înălţimii
wb – lăţimea picului la bază

În teoria elaborată de Martin şi Synge, coloana cromatografică se consideră a fi împărţită

într-o serie de segmente consecutive denumite talere teoretice, prin analogie cu separarea prin
distilare.
Talerul teoretic reprezintă segmentul din coloană în care se produce repartiţia
componentelor între faze, echilibrul de repartiţie stabilindu-se treptat de la taler la taler.
Mărimea talerului teoretic se numeşte înălţime echivalentă a unui taler teoretic şi se
notează cu H.
L
N=
Numărul de talere teoretice al unei coloane se calculează H .

5
 hmax

0,6 Wi = 2σ
0,5 Wh =
2,345σ

Wb = 4σ

Eficacitatea unei coloane este cu atât mai bună cu cât N este mai mare. Acest lucru se
poate realiza fie mărind coloana, fie micşorând înălţimea talerului teoretic.

6.1.3. Simetria picurilor. Izoterme de distribuţie

Atunci când un pic cromatografic are o formă Gaussiană se poate considera că
distribuţia analitului între faza staţionară şi mobilă s-a făcut într-un mod regulat şi nu depinde de
concentraţie, fiind aplicată relaţia Cs=KD.CM.

CS S

CM t

În acest caz izoterma de distribuţie, adică reprezentarea grafică a C S = f . CM este

liniară.
Totuşi distribuţia analitului nu este totdeauna perfect regulată datorită fenomenelor de
adsorbţie care pot intreveni sau când este vorba de cantităţi mari de substanţă care trebuie
separate.

6
 În aceste cazuri izotermele de distribuţie nu mai sunt liniare şi variază funcţie de
concentraţie
CS = KD .CMα
α - constantă ce depinde de substanţa de adsorbant şi de faza mobilă.

Pot apărea 2 situaţii:

a) izotermele de distribuţie pot fi concave în raport cu abscisa cînd α < 1, deci când
concentraţia substanţei este mai mare în faza mobilă. În acest caz picul de eluţie se deformează
prezentând o "coadă".
S
CS

CM t

b) izotermele de distribuţie pot fi convexe caz în care α > 1, viteza de migrare fiind invers
proporţională cu concentraţia.

C S
S

CM t

6.1.4. Rezoluţia separării cromatografice

În cazul unui amestec de două substanţeA şi B, separarea este cu atât mai bună cu cât
substanţele A şi B au viteze de migrare diferite şi coeficienţi de repartiţie diferiţi.
Rezoluţia separării cromatografice RS arată capacitatea unui sistem cromatografic de a
separa componenţii dintr-un amestec.
Rezoluţia separării se exprimă prin 2 parametrii:

7
 - distanţa care separă vârfurile picurilor şi care se poate exprima prin mărimi de retenţie
ca tR sau VR.
- lăţimea picurilor la bază.
Rezoluţia se calculează astfel:

2(t R −t R ) 2 Δt R
B A
RS = =
W A +W B W A +W B

Cu cât RS are o valoare mai mare cu atât rezoluţia este mai bună.
Când RS= 1, cele 2 picuri nu sunt suprapuse decât în proporţie de 2%, acest lucru fiind
suficient pentru o bună separare.

tRB

t R −t R =4 σ
tRA B A

A B

Când
RS ≥1,5 diferenţa dintre timpii de retenţie este de 6σ , în acest caz
suprapunerea picurilor este de numai 0,3%, rezoluţia fiind foarte bună.
S

t RB  t R A  6

A B

Când RS < 1 separarea este complet nesatisfăcătoare.

8
 S

t RB  t R A  3,2

A B

Comportarea cromatografică diferită a celor 2 analiţi este determinată de selectivitatea

fazei staţionare prin factorul de selectivitate:

' 'R
RB
t V B
K'B
K
α S= = = = ΔB
'R 'R
K '
A
K ΔA
t A
V A

Rezoluţia este o funcţie de selectivitate a fazei staţionare:

'

RS =
√ N ( α S −1 )( K B
)
4 αS '
B
1+ K

Selectivitatea fazei staţionare este determinată de natura interacţiilor analit - fază

staţionară şi de diferenţele dintre formele şi dimensiunile compuşilor şi fazei staţionare.
Se disting următoarele tipuri de legături intermoleculare compus - fază staţionară:
- legătura dipol-dipol - se formează între molecule cu dipoli permanenţi;
- legătura de inducţie - se formează între un dipol permanent şi un dipol indus în celălalt;
- legături de dispersie - apar datorită câmpului electric al dipolilor cu viaţă scurtă care
exercită o influenţă asupra moleculeleor invecinate.
- legături de hidrogen;
- legături donor- acceptor.

6.1.5. Detecţia analiţilor separaţi cromatografic

După ce au fost separaţi analiţii trebuie detectaţi în vederea determinării lor calitativă şi
cantitativă.
Detecţia se realizează cu diverse tipuri de detectori aleşi în funcţie de procedeele
cromatografice aplicate, de natura proceselor de separare (adsorbţie repartiţie, schimb ionic, etc.)
şi chiar de natura analiţilor separaţi.

9
 La alegerea detectorului trebuie să se ţină seama de principalele caracteristici ale lor.
- Specificitatea şi selectivitatea este caracteristica detectorilor care dau un răspuns
specific față de proprietăţile fizico-chimice ale unui număr mic de analiţi care au aceleaşi
caracteristici. În acest caz este vorba de o înaltă selectivitate. Specificitatea presupune că
detectorul dă un singur răspuns pentru un singur analit. Este cazul detectorilor cu electrozi
enzimă.
- Sensibilitatea - se exprimă prin raportul dintre variaţia semnalului ΔS (în mV sau unităţi
ΔS
S=
de absorbanţă) şi variaţia concentraţiei ΔC a analitului care ajunge la detector. ΔC sau
ΔS
S=
ΔQ
- Limita de detecţie este cantitatea cea mai mică de substanţă (analit) care dă un semnal
de 2-3 ori mai mare decât semnalul de fond (semnalul dat de faza mobilă în absenţa analitului).
- Liniaritatea- exprimă raportul dintre semnalul detectorului şi concentraţia analitului într-
un interval de concentraţie cuprins între cantităţile, minimă şi maximă, pentru care se asigură
exactitatea şi precizia determinărilor.
- Timpul de răspuns reprezintă timpul în care detectorul răspunde la variaţia
concentraţiei sau cantităţii de substanţă. Detectorul nu răspunde instantaneu la aceste variaţii ci
după un anumit timp, deoarece fiecare aparat are o anumită inerţie.

6.2. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ (HPLC)

Sub această denumire se întâlnesc cele mai moderne metode de analiză cromatografică
bazate pe repartiţia lichid-lichid, adsorbţia lichid-solid, pe schimbători de ioni şi pe procese de
excludere-difuzie.
Această metodă se poate aplica pe coloană sau pe o suprafaţă plană cu straturi subţiri
de fază staţionară (CSS).

6.2.1. Cromatografia HPLC de adsorbţie

Cromatografia de adsorbţie sau cromatografia lichid-solid utilizează fazele staţionare cu

proprietăţi adsorbante, în principal silicagelurile şi alumina. Cromatografia de adsorbţie se aplică
cu bune rezultate la separarea compuşilor care au grupe funcţionale diferite şi anumiţi izomeri.
Separarea moleculelor foarte polare, uneori adsorbite ireversibil, poate prezenta dificultăţi mari,
caz în care se preferă cromatografia de repartiţie [19-21].
Fazele staţionare pentru cromatografia de adsorbţie, mai ales silicagelurile cu granulaţie
fină au atins un înalt grad de perfecţiune, ca şi tehnicile de umplere a coloanelor, chiar dacă sunt
eclipsate în ultima perioadă de cele din cromatografia de repartiţie obţinute prin legarea chimică
10
de silice a anumitor grupe funcţionare. Pe de altă parte, costul redus al gelurilor de silice face ca
aceste faze să fie utilizabile în cromatografia preparativă.

6.2.1.1. Mecanismul de adsorbţie.

Se consideră în general că silicea are grupări silanol Si – OH libere, altele legate şi
grupări siloxan Si – O – Si corespunzând deshidratării a doi silanoli vecini (numărul de punţi
siloxan creşte cu temperatura la care a fost activată silicea). Schema suprafeţei unui gel de silice
pentru cromatografie este redată mai jos:

H H H

O O O O

Si Si O Si Si O Si

Silanol liber Silanoli legaţi Siloxan

Figura 6.1 Suprafaţa silicagelului.

În cromatografia de adsorbţie apa joacă un rol important în măsura în care este

adsorbită preferenţial la suprafaţa gelurilor de silice. Se consideră de asemenea că silicele sunt
acoperite cu un înveliş monomolecular de apă puternic adsorbită şi, eventual, de învelişuri
succesive. Suprafaţa silicei poate fi acoperită parţial de molecule de apă şi de molecule de
solvent (fază mobilă) în echilibru.
Volumul de retenţie al unui solut depinde de competiţia dintre moleculele de solut S şi
moleculele fazei mobile M la suprafaţa adsorbentului (a). Există de asemenea un proces de
adsorbţie-desorbţie care poate fi schematizat astfel:

S(FM) + n M(a) S(a) + n M(FM) (6.19)

unde FM este faza mobilă.

Valoarea lui n depinde de mărimea relativă a moleculelor de solut şi de solvent la
suprafaţa adsorbentului.
În schema de mai jos, o moleculă de solut deplasează, adsorbindu-se, două molecule
de fază mobilă de la suprafaţa suportului:

S(FM) + 2 M(a) S(a) + 2 M(FM) (6.20)

11
 Factorul de capacitate, k, este dat de relaţia:

Wa
k =K s⋅
VM (6.21)
unde:
Ks - coeficient de distribuţie a solutului S între faza staţionară şi cea mobilă;
Wa - masa adsorbentului din coloană;
VM - volumul total al fazei mobile din coloană.

6.2.1.2. Clasificarea adsorbenţilor utilizaţi în cromatografia lichid-solid

a) După textură
Se disting suporţi peliculari care sunt constituiţi din bile de sticlă cu diametrul de aprox.
40m, acoperite cu o peliculă de absorbent de 2-3m grosime şi suporţi poroşi. Din cauză că au
capacitatea disponibilă (cantitatea de solut care provoacă saturarea fazei staţionare din coloană)
de aproape 100 de ori mai mică decât suporţii poroşi, suporţii peliculari sunt înlocuiţi de suporţii
poroşi cu granulaţie fină.
b) După afinităţile legate de proprietăţile acido-bazice ale soluţilor.
Experienţa arată că silicea este preferată pentru separarea soluţilor bazici (ex. amine
alifatice şi aromatice). Aceste faze au un caracter acid. Invers, fazele precum alumina se
utilizează pentru separarea soluţilor acizi precum fenolii şi acizii carboxilici. Pentru aceşti doi
suporţi, ordinea de afinitate pentru moleculele multifuncţionale este:
hidrocarburi saturate  hidrocarburi nesaturate  hidrocarburi aromatice  eteri  esteri
 cetone  alcooli  amide  acizi carboxilici.

6.2.1.3. Alegerea adsorbentului

În cazul solvenţilor slab polari Snyder [21], a arătat că factorul de capacitate k se

defineşte prin relaţia:
Wa
log
log k = log Va + * (E0 - AS0) + VM (6.22)
unde
Va - volumul de fază mobilă adsorbită pe gram de adsorbent;
W a - masa adsorbentului din coloana cromatografică;
V M - volumul fazei mobile din coloană;

12
 * - activitatea adsorbentului: permite luarea în considerare a numărului de grupări
silanol libere (adică neacoperite de molecule de apă). * este un număr fără
dimensiuni, cuprins între 0 şi 1.
E0 - energia liberă de adsorbţie a moleculelor de solut în condiţiile de activitate standard
(* =1).
Energia liberă de adsorbţie, E0, este:
0
DG S
E0 =-
2,3 RT (6.23)
unde:
0
DG S - variaţia energiei libere de adsorbţie a unei molecule de solut;
R - constanta gazelor perfecte;
T - temperatura absolută.
AS - suprafaţa ocupată pe un adsorbent de către o moleculă de solut;
0 - energia liberă de adsorbţie a moleculelor fazei mobile pe unitatea de suprafaţă de
adsorbent, în condiţii de activitate standard (* = 1).

0
DG M
e 0 =-
2,3 RT A M (6.24)

AM - suprafaţa ocupată pe adsorbent de către o moleculă de solvent;

DG0M - variaţia energiei libere de adsorbţie a unei molecule de solvent.
Dacă notăm n = AS/AM ,înlocuind Eo şi o cu valorile lor se obţine:

1
(nDG 0M −DG0S )
(Eo – ASo) = 2,3 RT (6.25)

nDG 0M −DG 0S reprezintă variaţia energiei libere G0 la deplasarea a n molecule de solvent
adsorbite de o moleculă de solut (reacţia 6.19).
În cazul particular când * este egal cu 1 este suficient să se scrie:

VaW a DG
0
k ' =K ln K =-
WM cu RT (6.26)

pentru a regăsi relaţia 6.22.

Va Wa reprezintă volumul de fază mobilă adsorbită pe adsorbentul conţinut în coloana
cromatografică. Coeficientul de activitate * introdus de Snyder măsoară reţinerea de apă din

13
faza mobilă de grupele silanol libere ale adsorbentului. Când reţinerea de apă este redusă, * are
valori apropiate de 1, activitatea adsorbentului fiind în acest caz mare. Când grupele silanol sunt
acoperite cu un strat monomolecular de apă, coeficientul de distribuţie este scăzut.

Suprafaţa specifică.
Pentru particule sferice, suprafaţa externă a particulelor, în m2/g este dată de relaţia:
6
S e=
d p ρs (6.27)
unde:
dp- diametrul particulelor (în m);
s- densitatea fazei staţionare (în g cm–3).
Suprafaţa internă a porilor este mult mai mare decât suprafaţa externă, fiind de ordinul a
câtorva sute de m2/g. Capacitatea disponibilă a fazei staţionare (cantitatea de solut care provoacă
saturarea fazei staţionare din coloană, în condiţii determinate) este proporţională cu suprafaţa
specifică; un suport cu suprafaţă specifică mare face posibilă utilizarea unei coloane de
dimensiuni mici. Dar suprafeţele specifice mari presupun adsorbenţi cu diametrul porilor mic, care
poată să ducă la un fenomen de excluziune în cazul moleculelor mari.
Suporţii poroşi utilizaţi în general au suprafeţe cuprinse între 300 şi 600 m 2g–1, iar
suporţii peliculari între 7 şi 14 m2g–1, ceea ce conduce la o capacitate disponibilă mică.
Activitatea
Activitatea * a unui adsorbent depinde de retenţia apei. Activitatea standard
corespunde la valoarea * = 1, ceea ce este cazul suporţilor activaţi prin uscare prelungită la
200oC sub vid. În practică nu este recomandat să se utilizeze faze staţionare prea active întrucât
se pot obţine adsorbţii ireversibile sau reacţii catalitice. În general, se dezactivează fazele
staţionare prin adăugarea de puţină apă sau solvent polar ceea ce are ca efect diminuarea valorii
lui * şi nivelarea activităţii suportului.
Se poate admite că fenomenul de adsorbţie este preponderent până la retenţii de apă în
jur de 5%, pentru o silice având suprafaţa specifică de 550 m 2g–1. Pentru a obţine separări
reproductibile, adsorbentul trebuie să aibă reţinută o cantitate constantă de apă, adică să se
utilizeze solvenţi având o cantitate de apă în echilibru cu cea a adsorbentului.

6.2.1.4. Faza mobilă

Selectivitatea şi durata unei separări depind în primul rând de natura fazei mobile.
Alegerea solventului depinde de considerente practice şi de forţa sa eluantă. Forţa eluantă a unui
solvent, 0, este energia de adsorbţie a moleculelor solventului pe suprafaţa adsorbentului.
Faza mobilă trebuie să fie compatibilă cu sistemul de detecţie. De exemplu, detectorii
UV nu pot fi utilizaţi cu solvenţi care absorb în UV.
Dacă faza mobilă este alcătuită din mai mulţi solvenţi, aceştia trebuie să fie miscibili;
soluţii trebuie să fie solubili în faza mobilă.
14
 Vâscozitatea fazei mobile are o influenţă asupra cineticii adsorbţiei şi asupra presiunii
din coloană. O creştere a vâscozităţii diminuează coeficienţii de difuzie şi transferul de masă al
soluţilor şi deci, numărul de talere teoretice. În cromatografia de adsorbţie se utilizează în general
solvenţi cu vâscozitatea cuprinsă între 0,3 şi 2 x 10–3 Pas.
Solvenţi izoactivi sunt solvenţi care produc aceeaşi stare de activare a adsorbentului.
Retenţia în apă a unui solvent este funcţie de forţa sa eluantă şi de activitatea adsorbentului.
Activitatea adsorbentului este mai mare când retenţia apei de către solvenţi este mai slabă; pe de
altă parte, retenţia de apă a unui solvent va fi cu atât mai mare cu cât forţa sa eluantă va fi mai
mare. Se pot determina serii de solvenţi izoactivi, fie trasând cu precizie izoterma de adsorbţie a
apei între adsorbent şi faza mobilă, fie realizând o analiză frontală pe o coloană cu adsorbent de
volum mare.
Forţa eluantă a fazei mobile
O rezoluţie maximă a două picuri necesită valori ale factorului de capacitate k, cuprinse
între 2 şi 5. Alegerea unui solvent cu o forţă eluantă, 0 , convenabilă permite controlul valorilor
factorilor de capacitate. Dacă solventul are o forţă elulantă mare, factorii de capacitate sunt mici.
O variaţie a forţei eluante de 0,05 unităţi determină schimbarea factorului de capacitate de la 2 la
4.
Este importantă clasificarea solvenţilor în ordinea crescătoare a forţei lor eluante.
Aceasta este numită serie eluotropică (vezi tabelul 6.1). Forţa eluantă a solvenţilor este măsurată
în raport cu hexanul pentru care s-a stabilit arbitrar valoarea zero.
Foarte rar un solvent unic permite să se obţină valori convenabile pentru factorii de
capacitate şi o rezoluţie optimă. De aceea, se folosesc amestecuri de solvenţi.
Gradient de eluţie. Cu un amestec de solvenţi de compoziţie constantă nu se poate
obţine întotdeauna o separare bună într-un timp convenabil. Aceasta în cazul în care soluţii de
separat au polarităţi foarte diferite. Un solvent slab polar va separa bine soluţi slab polari, dar
pentru eluţia compuşilor puternic absorbiţi va fi nevoie de un volum de solvent considerabil; din
contră, un solvent foarte polar va fi potrivit pentru compuşii puternic reţinuţi, dar rezoluţia va fi
proastă pentru soluţii slab reţinuţi. Pentru a obţine un compromis între rezoluţie şi durata analizei,
se operează cu o eluţie graduală care constă în creşterea, pe parcursul separării, a procentului
de solvent cu forţă eluantă mai mare pentru a scădea factorul de capacitate al soluţilor polari.
Eluţia cu gradient necesită o etapă de regenerare a coloanei cromatografice.

Tabelul 6.1 Serie eulotropică

Solvent Forţă eluantă, 0
silice alumină
Hexane 0 0
Octane 0,01 0,01
Tetraclorură de carbon 0,11 0,18
Eter izopropilic 0,22 0,28
Clorură de izopropil 0,22 0,29
Cloroform 0,26 0,40
15
 Clorură de metilen 0,32 0,42
Tetrahidrofuran 0,35 0,45
Acetat de etil 0,38 0,58
Dioxan 0,49 0,63
Acetonitril 0,50 0,65
Izopropanol 0,63 0,82
Metanol 0,73 0,95
Apă 0,73 0,95
Acid acetic 0,73 0,95

Influenţa naturii solventului asupra selectivităţii. Formula lui Snyder se aplică satisfăcător
în medii slab polare. Pentru solvenţi cu forţă eluantă mare trebuie adăugat un termen de corecţie
ES care reuneşte aşa-numitele “efecte secundare” datorate asociaţiilor dintre moleculele de
solut şi solvent, de exemplu, legături de hidrogen. Formula lui Snyder devine:

Wa
log
log k = log Va + * (E0 - AS0) + V M + E (6.28)
S

Conform teoriei lui Snyder, dacă doi compuşi au energii de adsorbţie, E0, şi suprafeţe
moleculare, AS, apropiate, ei nu pot fi separaţi oricare ar fi sistemul de solvenţi utilizaţi. Dacă
există efectul secundar al unui solvent, acesta nu poate fi identic pentru ambii compuşi; de unde
şi posibilitatea separării acestora. De exemplu, dacă presupunem că amestecul conţine un
compus care poate forma legături de hidrogen şi că solventul conţine un alcool, se poate
modifica factorul de capacitate al compusului care formează legături de hidrogen, modificând
procentul de alcool din solvent. Formarea legăturilor de hidrogen diminuează energia de
adsorbţie a acestui compus, rezultând modificarea factorului de capacitate. Creşterea procentului
de alcool în solvent micşorează factorul de capacitate deoarece, în acest caz, cea mai mare parte
a moleculelor de compus formează legături cu solventul şi nu cu faza staţionară (adsorbent). De
aceea trebuie ales procentul optim de alcool din faza mobilă [22].
Influenţa naturii solutului asupra factorului de capacitate
Energia de adsorbţie a solutului Eo
Energia de adsorbţie a unei molecule de solut pe grupările active ale fazei staţionare
este egală cu suma energiilor de adsorbţie ale diferitelor grupări care constituie molecula. Se
poate calcula energia de adsorbţie şi deci factorul de capacitate, dacă se cunosc aceste energii.
Energia de adsorbţie a unei grupări este diferită dacă este ataşată unui compus alifatic
sau aromatic. S-a constatat că energia de adsorbţie este mai mare în primul caz. Energiile de
adsorbţie foarte mici ale grupării metilen nu permit separarea compuşilor omologi prin
cromatografie de adsorbţie.
Suprafaţa moleculei de solut

16
 Din ecuaţia lui Snyder se observă că dacă se micşorează forţa eluantă, 0, a unei faze
mobile, factorul de capacitate al compuşilor cu AS mare creşte foarte mult. Rezultă de aici că o
variaţie a forţei eluante antrenează o variaţie a selectivităţii pentru molecule cu suprafeţe diferite.

6.2.2. Cromatografia HPLC de repartiţie

Este cea mai utilizată dintre tehnicile cromatografice în fază lichidă.

Faza staţionară şi lichidă se fixează pe un suport solid fie prin adsorbţie fizică fie printr-
un proces chimic( faza staţionară legată).
În cromatografia de repartiţie se utilizează 2 procedee de lucru:
- cromatografia pe fază normală care utilizează o fază staţionară foarte polară
(trietilenglicol) şi o fază mobilă nepolară ( sau slab polară) cum este hexanul;
- cromatografia pe fază inversă în care faza staţionară este nepolară ( ex. hidrocarburi
lichide), iar faza mobilă este polară.
Practic se observă că atunci când se lucrează pe fază normală, la separarea unui
amestec de compuşi, primul care eluează este analitul cel mai puţin polar, iar prin creşterea
polarităţii fazei mobile se reduce timpul de eluţie al acestuia.
În cromatografia pe fază inversă este eluat mai întâi analitul cel mai polar, iar creşterea
polarităţii fazei mobile măreşte timpul de eluţie al analitului.

6.2.2.1. Faze staționare

În cromatografia de repartiţie există două tipuri de faze staţionare, funcţie de modul lor
de obţinere:
- faza staţionară lichidă impregnată, formată din particule solide poroase de silicagel
care pot fixa pe suprafaţă o cantitate de lichid ce constituie faza staţionară propriu-zisă. În acest
caz faza staționară adsorbită prin legături slabe pe suprafaţa suportului poate fi antrenată de faza
mobilă, de aceea aceste faze sunt puţin utilizate;
- faze staționare legate chimic (grefate) sunt faze legate printr-un proces chimic (de
silanizare) de suport mărindu-se stabilitatea lor.
Fazele staţionare se pot lega de suport prin reacţii de silanizare.
Reacţii de silanizare a suporturilor de silicagel:

17
 CH 3 CH 3
OH CH 3 O Si
Si Si CH 3
+ 2 Cl Si CH 3
Si Si CH 3
OH CH 3 O Si

CH 3 CH 3
Silicagel cu grupe Trimetil clorsilan
silanolice Silicagel silanizat

CH3 CH3 CH3

R-OH
Si OH + Cl Si Cl Si O Si Cl Si O Si O-R
- HCl
CH3 CH3 CH3

Silicagel silanizat Silicagel silanizat şi eterificat

Formarea monomerilor organici şi a polimerilor pe suprafaţa silicagelului:

OH O Si-Me 2 -R
Si 2 Cl-Si-Me 2 -R Si
OH OH
Si Si
OH O Si-Me 2 -R

Me Me
OH O Si O Si ..............
Si n Cl2 -Si-Me-R Si R R
OH OH
Si Si R R
OH O Si O Si ................
Me Me

R: -C8H17 (octil)
-C18H37 (octadecil)
-(CH2)n-NH2 (amino)
-(CH2)n-CN (nitril)

Pentru realizarea unei bune eficienţe a separării cromatografice prin repartiţie trebuie să
existe un echilibru între forţele intermoleculare care se realizează între cei trei participanţi la
procesul de separare: analitul, faza staţionară şi faza mobilă.

18
 Forţele intermoleculare depind de polaritatea grupărilor funcţionale organice implicate în
procesul de separare, polaritate care creşte în ordinea: hidrocarburi alifatice < arene < halogenuri
< eteri < nitroderivaţi < esteri = aldehide = cetone < acizi carboxilici < apă.
Ca o regulă generală pentru a realiza separări eficiente, în majoritatea cazurilor
polaritatea fazei staţionare trebuie să fie asemănătoare cu cea a analitului în timp ce polaritatea
fazei mobile trebuie să fie diferită. Nu este de dorit nici cazul în care polaritatea fazei staţionare şi
a analitului să fie foarte apropiate.
Eluţia analiţilor de pe coloană se poare realiza utilizând ca faza mobilă un singur solvent
cu compoziţia constantă, caz în care eluţia se numeşte eluţie izocratică. Atunci când faza mobilă
este formată dintr-un amestec de 2 sau mai mulţi solvenţi cu o compoziţie programată (solvenţi cu
polarităţi diferite) eluţia poartă numele de eluţie cu gradient de compoziţie.

6.2.2.2. Cromatografia prin perechi de ioni

În cromatografia de repartiţie, este recomandat să se separe substanțele la un pH care
suprimă ionizarea sau la un pH în cazul în care substanțele sunt complet ionizate, caz în care
retenţia s-a dovedit a fi prea slabă. În această situaţie ar trebui să fie luată în considerare
cromatografia prin perechi de ioni. Tehnica este deosebit de utilă pentru separarea compușilor
bazici prin cromatografia în fază inversă.
În cromatografia prin perechi de ioni , analiții trebuie să fie ionizati prin controlarea pH-
ului. Faza mobila are de obicei pH-ul 7, atunci când atât acizi carboxilici cât și aminele alifatice
sunt ionizate. Toți ionii din sistem sunt înconjurati de ioni cu sarcină opusă (contraioni), în scopul
de a menține neutralitatea electrică a sistemului. În cromatografia prin perechi de ioni, în faza
mobilă sunt adăugați ionii hidrofobi mari. Procesul de formare a perechilor de ioni este un proces
dinamic, în care moleculele sunt schimbate tot timpul, dar când se adaugă un contraion în exces,
există o mare probabilitate pentru formarea unei perechi de ioni cu analitul.
Perechea de ioni este hidrofobă și are o retenție în funcție de natura și concentrația
contraionului. Când dimensiunea moleculară sau concentrația contraionului crește, crește şi
retenția. Cu toate acestea, efectul creșterii concentrației de contraion scade la concentrații mai
mari și, prin urmare, se recomandă concentrații cuprinse în intervalul 1-5 mM.
Acizii sulfonici și acizii perflurocarboxilici (anionii octansulfonat şi heptafluorobutirat) sunt
contraioni comuni pentru bazele protonate, iar compușii cuaternari de amoniu (cationul
tetrabutilamoniu) sunt utilizați în mod obișnuit pentru separarea acizilor ionizati. Acidul
octansulfonic are un pKa sub 1, este încărcat negativ în toată gama de pH utilizat și formează
perechi de ioni cu baze încărcate pozitiv. Heptaflurobutiratul se comportă în mod similar și, poate
fi considerat încărcat negativ în întreaga gamă de pH. Tetrabutilammoniu este un compus
cuaternar de amoniu, care este încărcat pozitiv în întreaga gamă de pH.
Retenția cromatografia ioni pereche este crescută prin schimbarea fazei mobile, după
cum urmează:
• Reducerea concentrației de modificator organic;
• Creșterea concentrației contraionului:
• Creșterea dimensiunii moleculare a contraionului.

6.2.2.3. Cromatografia de interacţiune hidrofilică (HILIC)

19
 Cromatografia de interacțiune hidrofilică (HILIC) este un tip de cromatografie utilizat
pentru separarea analiților relativi polari, atunci când modul cu fază inversă nu oferă suficientă
retenție. Fazele mobile utilizate în HILIC au adesea un conținut ridicat de solvent organic (de
exemplu acetonitril) între 80 și 100%. Fazele staționare sunt foarte polare (de exemplu silicea sau
silicea derivatizată cu grupe polare (dioli, ioni twitter, etc). Cu cât concentraţia în apă a fazei
mobile este mai mică cu atât retenţia analiţilor este mai puternică. Astfel, apa este cel mai
puternic solvent folosit în HILIC. Dacă este aplicat un gradient de eluție în HILIC trebuie să plece
de la un conținut ridicat de solvent organic și progresează cu cantități crescute de apă. Modul de
HILIC a devenit foarte popular pentru analiza substanțelor polare în cazul în care cromatografia
cu fază inversă a avut mai puțin succes. Conținutul ridicat de solvent organic ușurează ionizarea
electrospray în spectrometria de masă şi îmbunătățește sensibilitatea în metode LC-MS. Cu toate
că HILIC lucrează în modul cu fază normală, conținutul de apă din faza mobilă face posibilă
utilizarea acestei metode cromatografică în bioanaliză, care nu poate fi aplicată atunci când se
utilizează cromatografia în fază normală neapoasă.

6.2.2.4. Separări chirale

Separarea perechilor de enantiomeri care au aceleași caracteristici fizico- chimice, în

afară de capacitatea lor de a roti lumina plan-polarizata, reprezintă o provocare în cromatografie.
Dacă cele două substanțe au aceleași constante de distribuție nu pot fi separate într-un sistem
cromatografic. Prin urmare, cei doi enantiomeri pot fi separați pe sistemele cromatografice numai
dacă este posibil să se inducă o diferență în constantele lor de distribuție. În principiu acest lucru
poate să fie făcut în două moduri: un mod indirect și un mod direct.
Prin calea indirectă enantiomerii sunt derivatizați cu un reactiv optic activ pentru a forma
diastereoizomeri. Diastereoizomerii au mai mult de un centru chiral și au caracteristici fizico-
chimice diferite și, prin urmare pot avea constante de distribuție diferite. Prin urmare, este posibil
să se separe enantiomerii după derivatizare la diastereoizomeri într-un sistem cromatografic, prin
LC sau GC. Atunci când se efectuează derivatizare cu reactivi chirali, este important să se
cunoască exact puritatea reactivului de derivatizare.
Atunci când se utilizează separarea directă a enantiomerilor aceștia sunt injectați direct
în sistemul cromatografic similar cu ceea ce se utilizează în alte metode cromatografice.
Separarea chirală directă (fără derivatizare) a enantiomerilor este posibilă folosind faze mobile
sau staționare chirale. În GC este posibil să existe o fază staționară chirală și acest lucru poate fi
realizat folosind faze bazate pe ciclodextrină sau faze pe bază de polimeri în care au fost
încorporaţi aminoacizi optici activi. În LC chiralitatea poate fi introdusă atât în faza mobilă cât şi în
faza staționară putând fi aplicate ambele moduri. Dacă se foloseşte o fază mobilă cu proprietăţi
chirale, separarea se va realiza pe o fază staționară achirală. De obicei însă se utilizează fazele
staționare chirale, fiind disponibile un număr mare de astfel de faze staţionare pe piață. Fazele
constau dintr-un polimer (silicagel, celuloză, metacrilat) la care este atașată o moleculă chirală.
Moleculele chirale naturale utilizate sunt foarte diferite (proteine, polizaharide, ciclodextrine,
20
antibiotice, metacrilati elicoidali, etc.) și, prin urmare, furnizează o selectivitate diferită . Din
păcate, realizarea separărilor chirale este încă în studiu şi poate introduce erori, fiind important să
se consulte literatura de specialitate și furnizorii de faze staționare, înainte de începerea
experimentelor.

6.2.3. Cromatografia prin schimb ionic

Cromatografia prin schimb ionic este o tehnică lichid-cromatografică în care coloana

conţine o fază staţionară polimerică, reticulată, pe care sunt grefate grupări acide sau bazice
ionizabile, capabile să fixeze cationi sau anioni în anumite condiţii experimentale.
Fazele staţionare schimbătoare de ioni pot fi naturale (zeoliţii) sau sintetice obţinute prin
reacţii de copolimerizare sau policondensare. Grupările funcţionale ionice pot exista în structura
monomerului sau se fixează pe macromolecula obţinută după policondensare.
Schimbătorii de ioni sunt insolubili în apă şi în solvenţi organici obişnuiţi fiind folosiţi sub
formă de granule mici cu o suprafaţă de contact mare.
În funcţie de grupările funcţionale fixate pe reţeaua macromoleculară se disting:
- răşini schimbătoare de cationi (cationiţi)
- cu grupe sulfonice (-SO3-H+)- puternic
- cu grupe carboxil (-COO-H+)- slabe.
- răşini schimbătoare de anioni ( anoiniţi)
- cu grupe bazice de amoniu cuaternar ( -N+R3Cl-) - puternic
- cu grupe aminice (-N+H3Cl-)- slab.
Cei mai utilizaţi schimbători de ioni sunt cei obţinuşi prin copolimerizarea stirenului cu
divinilbenzenul, pe care se introduc grupările schimbătoare de ioni.

21
 CH CH2 CH CH2 CH CH2

R R

CH CH2 CH CH2 CH CH2

R R

− +
R :−SO3 H

 CH 2  N   (CH 3 ) 3 Cl 

Schimbătorii de ioni se utilizează în special la separarea moleculelor ionizate sau

ionizabile , a unor clase de compuşi biomedicali:
- alcaloizi şi aminoacizi
- acizi nucleici
- peptide şi proteine
- ioni metalici esenţiali şi toxici.
În ultimul deceniu s-a acordat o mare atenţie obţinerii şi utilizării unor schimbători de ioni
mai aparte care conţin:
- grupări aminodiacetat: -N(CH2COOH)2 cu proprietăţi chelatante;
- grupări acrilice: -CH=CH-COOH;
- grupări metilencarboxilice: (-CH2-COOH) fixate pe celuloză;
- grupări dietilaminoetil: - CH2-CH2-N(C2H5)2 fixate pe celuloză;

6.2.3.1. Proprietăţile schimbătorilor de ioni

a) Stabilitatea chimică- reprezintă rezistenţa la soluţii apoase şi la diverşi reactivi

organici.
Schimbătorii de ioni nu sunt solubili în apă dar în contact cu apa se umflă. Procesul de
umflare depinde pe de o parte de numărul şi natura grupărilor funcţionale de pe reţeaua
schimbătorilor de ioni şi pe de altă parte de gradul de reticulare (procentul de divinil benzen din
structura copolimerului). Gradul de reticulare se exprimă în procente şi este cuprins între 1-30%.
Răşinile puţin reticulate (≤ 2%) absorb o cantitate de apă de 5 ori mai mare decât
volumul lor, nefiind utilzate. În situaţia unui grad de reticulare de 30% capacitatea de umflare este
mai mică, ochiurile reţelei sunt mai mici, neputând fi reţinuţi ionii mai mari, mai voluminoşi.
b) Stabilitatea termică.
De obicei procesele de schimb se realizau la temperatură obişnuită, dar uneori este
indicat să se lucreze la o temperatură mai mare. Schimbătorii de tip răşini sulfonice rezistă până
la la 800 în schimb cei cu grupe de tip amoniu cuaternar rezistă până la 500 C.
22
 c) Ionizarea
Ionizarea grupărilor schimbătoare depinde de natura chimică a lor .
Astfel, grupările sulfonice şi cele de amoniu cuaternar ionizează puternic în timp ce
grupările carboxil şi amino ionizează într-o măsură mai mică.

 SO3 H   H 2O  SO3  H 3 O 

 COOH  H 2O  COO  H 3O 

d) Capacitatea de schimb
La baza racţiilor de schimb stau următoarele echilibre:

2H+r + M2+s ↔ M2+r + 2H+s - pentru cationiţi

2Cl-r + X2-s ↔ X2-r + 2Cl-s - pentru anioniţi

Aceste reacţii de schimb ionic se produc cu respectarea conservării sarcinilor, fiind

reacţii de echilibru cărora li se poate aplica legea acţiunii maselor:
Considerând reacţia: Ar + Bs ↔ As +Br

[ A ] s [ B ]r
KA =
B
[ A ] r [ B ] s constanta de echilibru

Deci cei doi ioni se repartizează între faza staţionară (răşina) şi soluţie, deci putem scrie
coeficienţii de repartiţie:

[ A ]r [ B ]r ⇒ K = P B
P A= PB= A
PA
[A]S [B]S B

⇒K A
Dacă răşina are o afinitate mai mare pentru B decât pentru A, atunci P B > PA B >

1, iar separarea este eficientă.

Referitor la afinitatea unei răşini schimbătoare pentru anuniţi ioni se poate spune că nu
există o regulă, dar pentru fiecare tip de răşină există o anumită preferinţă.
- pentru răşinile sulfonice, afinitatea creşte cu sarcina cationului: Na+ < Ca2+ < Al3+ , iar
pentru cationii cu aceeaşi sarcină, creşte odată cu volumul ionic: Li+ < Na+ < K+ < Rb+ < Cs+; Ca2+
< Sr2+ < Ba2+;
- pentru răşinile de tip amoniu cuaternar F- < HO- < Cl- < CN- < Br- < NO3- < I- < ClO4- <
SO4 2- .
Faza mobilă în cromatografia prin schimb ionic este formată din soluţii apoase, apa
având o capacitate ionizantă mare.
23
 Faza mobilă are un rol important în favorizarea ionizării analiţilor dar şi a grupărilor
funcţionale conţinute pe răşină.
Ionizarea schimbătorilor cationici şi anionici puternic acizi sau bazici nu este influenţată
de pH-ul fazei mobile dar în cazul schimbătorilor slab acizi şi bazici pH-ul fazei mobile
influenţează capacitatea lor de schimb.
Faza mobilă poate conţine şi cantităţi mici de metanol sau etanol necesare solubilizării
analiţilor.

6.2.4. Cromatografia de excludere sterică

C.E.S. se bazează pe diferenţele dintre mărimile moleculelor, funcţie de care acestea

pot sau nu pătrunde în interiorul fazei staţionare.
Această metodă a fost utilizată iniţial în biochimie pentru separarea polipeptidelor şi a
proteinelor, iar pe măsură ce fazele staţionare s-au dezvoltat, şi la purificarea medicamentelor
precum şi la analize de amestecuri complexe.
CES include trei tehnici mai importante:
- filtrarea pe gel- atunci când nu este apoasă
- permeaţia prin gel- faza mobilă este organică
- excluderea de mărime.
Separările de acest fel implică existenţa unei faze staţionare care este un gel format din
granule mici foarte regulate, de formă sferică, alcătuite din macromolecule legate între ele astfel
încât să formeze un ansamblu reticulat, având în interiorul lor pori de dimensiuni bine
determinate. Mărimea acestor pori determină selectivitatea fazei staţionare.
În acest sens foarte utilizate foarte utilizate sut α, ß, γ- ciclodextrine.
Dacă perlele de gel intră în contact cu un solvent, acesta pătrunde în pori producând
umflarea lor. Dacă solventul utilizat conţine şi analiţi, moleculele care sunt mai mici decât
diametrul porilor difuzează în interiorul acestora fiind separate de moleculele mai mari decât
diametrul porilor, care rămân în spaţiile interstiţiale fiind astfel excluse.
Cele mai utilizate geluri sunt:
- gelurile de dextran- care se obţine din dextran, polizaharid cu M mare. În dextran
moleculele de glucoză sunt legate între ele prin legături α - 1,6 glicozidice şi într-o mică măsură
prin legături α - 1,3 glicozidice.
Ele se întâlnesc sub determinarea de Sephadex existând mai multe tipuri notate:
G10,G15, G50 ..... G200 care se obţin din dextran printr-o reacţie de reticulare cu epiclorhidrina
glicerinei.
- gelurile de agaroză şi agar-agar (Sepharose)
Agar-agarul numit şi geloză este un ploizaharid ce se obţine prin extracţie din alge. Se
dizolvă în apă caldă iar prin răcire formează un gel.
- gelurile de poliacrilamidă, denumite şi biogeluri se obţin prin polimerizarea acrilamidei
în prezenţa unui agent de reticulare: N,N'-metilen-bis-acrilamidă (CH2=CHCONH)2CH2
- geluri de polistiren (Styragel) obţinute prin copolimerizarea stirenului cu divinilbenzenul
ca agent de reticulare.

24
 6.2.5. Cromatografia de afinitate

Cromatografia de afinitate (CA) ocupă un loc aparte în tehnologia de separare întrucât

este singura tehnică ce permite purificarea a aproape oricărei biomolecule pe baza funcţiei sale
biologice sau a structurii chimice individuale. Deşi a intrat în rutină de puţini ani, aplicarea ei s-a
dezvoltat atât de rapid că, în prezent se întâlneşte în aproape fiecare laborator unde se face
purificarea substanţelor biologice. Adoptarea pe scară largă a CA reflectă succesul ei în obţinerea
separărilor rapide, dificil sau imposibil de realizat cu tehnici convenţionale [28-32].
CA este un tip de cromatografie de adsorbţie în care molecula care urmează să fie
purificată este adsorbită specific şi reversibil de o substanţă de legătură complementară (ligand),
imobilizată pe un suport insolubil (matrice). Selectivităţile de separare foarte mari se datorează
specificităţilor naturale ale moleculelor care interacţionează. Din acest motiv, CA poate fi utilizată
pentru:
 purificarea substanţelor din amestecuri biologice complexe;
 separarea formelor native de cele modificate ale aceleiaşi substanţe;
 îndepărtarea cantităţilor mici de material biologic din cantităţi mari de substanţe
contaminante.

6.2.5.1. Principiul cromatografiei de afinitate

Principiul CA este ilustrat în figura 6.2.

Aplicaţii :
- enzime: substrat analog, inhibitor, cofactor;
- anticorpi: antigen, virus, celulă;
- lectină: polizaharide, glicoproteină, receptor de suprafaţă a celulei, celulă
- acid nucleic: secvenţa de bază complementară, histonă, acid nucleic polimerază,
proteină de legătură;
- hormon, vitamină: receptor, proteină purtătoare;
- celulă: proteină cu suprafaţă specifică celulei, lectină.

Imobilizarea ligandului:

+ L L

Adsorbţia substanţei S:
S S + impurităţi
L

25
 Desorbţia substanţei S:

L S L + S

Figura 6.2 Principiul cromatografiei de afinitate

O separare reuşită necesită existenţa unui ligand (L) biospecific care să poată fi
legat de matrice, patul cromatografic. Este, de asemenea, important ca ligandul imobilizat să-şi
păstreze afinitatea de legătură pentru substanţa de interes (S) şi să existe metode de desorbţie
selectivă a substanţelor legate într-o formă activă, după spălarea şi îndepărtarea materialului
nelegat. Aplicaţiile biologice în care este utilizată cu predilecţie CA sunt menţionate mai jos.
Oricare component poate fi utilizat ca ligand pentru purificarea substanţei sale de asociere.
6.2.5.2. Matricea

Sefaroza este un gel de agaroză care prezintă practic toate caracteristicile necesare
unei matrice bune pentru imobilizarea biologică a moleculelor active. Grupele hidroxil de pe
reziduurile de polizaharidă pot fi uşor derivatizate pentru ataşarea covalentă a unui ligand.
Sefaroza 4B este cea mai larg utilizată matrice. Structura de por deschis face interiorul matricei
disponibil pentru ataşarea ligandului şi asigură capacităţi de asociere, chiar pentru molecule mari.
Sefaroza 4B prezintă o adsorbţie nespecifică extrem de scăzută; acesta este un lucru esenţial
întrucât puterea cromatografiei de afinitate se bazează pe interacţiuni specifice. Particulele de
formă sferică ale gelului îi conferă acestuia proprietăţi bune de curgere, cu canale minime, care
asigură obţinerea unor separări rapide. Adsorbenţii bazaţi pe Sefaroză sunt stabili pe un domeniu
larg de condiţii experimentale precum: pH mare şi scăzut, detergenţi şi agenţi de disociere.

6.2.5.3. Ligandul

Alegerea ligandului pentru CA este determinată de doi factori. Primul: ligandul trebuie să
prezinte afinitate specifică şi să formeze o legătură reversibilă cu substanţa care trebuie separată.
Al doilea: trebuie să aibă grupe care să îi permită să se ataşeze la matrice fără a-i distruge
activitatea specifică de legare de moleculele de separat. Ligandul trebuie să aibă o afinitate ideală
pentru substanţa de legătură în domeniul 10–410–8 M, în soluţie liberă. Interacţiuni care presupun
constante de disociere mai mari de 10–4, de ex. reacţii de legătură între o enzimă şi un inhibitor
slab, este posibil să fie prea slabe pentru o CA cu rezultate bune.
Invers, dacă constanta de disociere este mai mică decât aprox. 10 –8 M, de ex. afinitatea
dintre un hormon şi un receptor de hormon, eluţia substanţei de legătură fără inactivare este
foarte probabil dificilă. S-au găsit metode care să promoveze cu succes CA când constanta de
disociere este în afara acestui domeniu. Este important a se lua în considerare regiunea
ligandului care este ataşatî la matrice. Dacă sunt disponibile câteva grupe funcţionale, ligandul
trebuie legat de matrice prin intermediul grupului care este cel mai puţin probabil a fi implicat în
interacţiunea sa specifică cu molecula de izolat.
26
 Braţ de legătură
Partea activă a substanţelor biologice este adesea localizată adânc în moleculă şi
adsorbenţii preparaţi prin cuplarea liganzilor mici direct de Sefaroză prezintă capacităţi mici
datorită interferenţei sterice dintre matrice şi substanţa ataşată de ligand. În aceste condiţii, se
interpune un “braţ de legătură” între matrice şi ligand pentru a uşura legarea. Lungimea braţului
este critică. Dacă este prea scurt, braţul este ineficient şi ligandul nu reuşeşte să lege substanţe
din probă. Dacă este prea lung, apar efecte nespecifice care reduc selectivitatea separării; s-a
demonstrat că braţele de legătură foarte lungi pot lega substanţe din probă prin interacţiuni
hidrofobe.
Geluri de cuplare
S-au dezvoltat metode pentru imobilizarea rapidă, simplă şi sigură prin intermediul
grupei funcţionale alese. Alegerea corectă a metodei de cuplare se face în funcţie de substanţa
care trebuie imobilizată. Următorii derivaţi ai Sefarozei permit o imobilizare corespunzătoare a
liganzilor fără a fi necesare sinteze chimice complexe sau echipament special:
 Sefaroza 4B CNBr-activată permite liganzi care conţin grupe amino primare
pentru a fi bine, uşor şi rapid imobilizate printr-o reacţie spontană;
 AH-Sefaroza 4B şi CH-Serafoza 4B cu au fiecare câte un braţ de legătură lung cu
şase atomi de carbon şi permit cuplarea prin grupele carboxil, respectiv, amino;
 Sefaroza 4B CH-activată pune la dispoziţie un braţ de legătură cu şase atomi de
carbon şi un ester activ pentru cuplarea instantanee prin grupe amino;
 Sefaroza 6B epoxi-activată are un braţ de legătură hidrofilic lung şi oferă o metodă
pentru cuplare prin grupe hidroxil, amino sau tiol;
 Tiopropil-Sefaroza 6B are un braţ de legătură hidrofil scurt şi pune la dispoziţie o
metodă pentru cuplarea reversibilă a proteinelor şi a liganzilor mici prin grupe tiol;
reacţionează de asemenea cu ioni de metale grele, cu halogenuri de alchil şi aril
şi sunt supuse la reacţii de adiţie cu compuşi care conţin legături C = O, C = C şi
N = N.
În tabelul 6.2 sunt prezentate grupe frecvent utilizate pentru imobilizarea ligandului
precum şi geluri de cuplare pentru ataşarea de ligand, prin intermediul acestor grupe.

Tabelul 6.2 Grupe utilzate pentru imobilizarea ligandului şi geluri de cuplare

Ligandul Grupa funcţională Gelul de cuplare
Proteină, peptidă, Amino Sefaroză 4B CNBr-activată
Aminoacid CH-Serafoza 4B
Serafoza 4B CH-activată
Sefaroză 6B epoxy-activată
Carboxil AH-Sefaroză 4B
Tiol Tiopropil-Sefaroză 4B
Sefaroză 4B tiol-activată
Sefaroză 6B epoxy-activată
Zaharidă Hidroxil Sefaroza 6B epoxi-activată
Amino CH-Sefaroza 4B

27
 Ligandul Grupa funcţională Gelul de cuplare
Sefaroza 4B CH activată
Sefaroza 6B epoxi-activată
Carboxil AH-Sefaroza 4B
Polinucleotidă Amino Sefaroza 4B CNBr-activată
coenzimă, cofactor, amino, carboxil, se utilizează gel cu braţ
Antibiotic, steroid tiol sau hidroxil de legătură

NH

OH + CNBr O – C – NHR
O – C – N + R–NH2
–HBr

a) Sefaroză 4B CNBr-activată. Activarea şi cuplarea

b) Sefaroză – NH – (CH2)6 – NH2
c) Sefaroză – NH – (CH2)6 – COOH

d) Sefaroză – NH – (CH2)6 – CO – O –N

O
e) Sefaroză – O – CH2 – CH – CH2 – O – (CH2)4 – CH2 – O – CH – CH2

OH O
Structura parţială: a) Sefaroză 4B CNBr-activată; b) AH-Sefaroză 4B; c) CH-Sefaroză 4B;
d) Sefaroză 4B CH-activată; e) Sefaroză 4B epoxi-activată

Adsorbţia şi eluţia
În CA substanţele de separat se leagă de ligand prin legături reversibile, care se
întâlnesc în următoarele cazuri: enzimă-inhibitor sau enzimă-substrat, anticorpi-antigenă,
proteină-proteină, proteină-carbohidrat şi proteină-acid nucleic. Gradul de separare care se poate
obţine prin CA depinde de specificitatea procesului de adsorbţie şi de eluţie. Rezultate
satisfăcătoare se obţin când una dintre aceste două etape este foarte specifică. Dacă dintr-un
amestec un compus este puternic reţinut faţă de ceilalţi, etapa eluţiei poate fi realizată cu un
mediu disociativ, chiar mai puţin specific.

28
 6.2.6. Aparatura în cromatografia de lichide

Schema unui cromatograf de lichide:

2 3

4 5 6

1 1

1. Rezervoare cu solvenţi
2. Pompă de mare presiune
3. Dispozitiv de introducere automată a probei
4. Coloană cromatografică
5. Detector
6. Înregistrator

6.2.6.1. Dispozitive de introducere a probei

Principalele cerinţe ale unui dispozitiv de introducere a probei se referă la o bună

precizie a volumelor injectate, reducerea la minim a efectului probei anterioare, posibilitatea de a
se utiliza probe vâscoase şi injectarea de volume variabile.
Sistemele de introducere a probei utilizează în mod obişnuit un ventil cu şase căi de
acces cu ajutorul căruia se introduce proba în două etape: în prima etapă, încărcarea, proba este
aspirată sub efectul vidului (în sistemele automate) sau introdusă cu o seringă (în sistemele
manuale) într-un spaţiu (buclă pentru probă) unde rămâne până când ventilul este comutat pe
injectare. În această a doua etapă se pun în contact pompa şi faza mobilă cu coloana. Proba
este antrenată în debitul de solvent şi, mai departe, în coloană [1].
Calitatea separării în coloană depinde de calitatea injecţiei: o injecţie rapidă, bine
dozată, determină picuri, ascuţite. Se recomandă de asemenea utilizarea unui număr cât mai mic
de elemente de legătură (fitinguri) care sunt de tip “cu volum mort minim” şi care nu oferă spaţii
unde solventul şi proba s-ar putea amesteca.
Injectoare manuale
Cu o seringă de precizie, se umple bucla pentru probă la presiunea atmosferică, prin
calea de admisie a ventilului de introducere a probei. Ventilul este comutat manual pe poziţia

29
injectare care asigură intrarea probei în coloană, în timp ce, în urma acesteia se asigură un flux
de spălare continuu.

Normal Încărcare Injectare

Figura 6.3 Valvă de injecţie cu 6 căi

Injectoare automate
Injectoarele automate constau din acelaşi tip de ventil (cu şase căi) care este acţionat de
un dispozitiv mecanic. Dispozitive de acţionare pneumatice sau electrice controlează ventilul în
cele două faze ale ciclului de injecţie. Un dispozitiv de dozare permite injectarea de volume de
0,1–1,5l. Se pot utiliza recipiente pentru păstrarea volumelor de ordinul microlitrilor pentru a se
obţine injecţii de 1–5l probă.
Injectoarele automate pot asigura diferite tratamente probei, înainte de intrarea acesteia
în coloană, precum: derivatizarea, diluarea volumelor mici de probă şi adăugarea de standard
intern.
Derivatizarea poate fi necesară dacă analiţii nu au cromofori şi dacă detecţia nu este
suficient de precisă. În acest proces, este adăugată analitului o grupare cromoforă utilizând un
agent de derivatizare. Derivatizarea poate avea loc înainte sau după coloană şi este utilizată
pentru a îmbunătăţi sensibilitatea şi/sau precizia. Automatizarea acestui proces asigură o precizie
foarte bună, manevrând volume mici, de ordinul microlitrilor. Braţul robot al unor injectoare
automate pot asigura extragerea şi apoi amestecarea probei cu reactivul de derivatizare.

Buclă pentru probă

Dispozitiv de Dispozitiv de
derivatizare dozare

30 de la pompă

spre coloană
 Evacuare Ventil cu 6 căi

Figura 6.4 Injector automat cu derivatizare

6.2.6.2. Pompe pentru faza mobilă şi degazori

Pompa este cel mai critic component al cromatografului de lichide care condiţionează
succesul analizei în CL. Performanţa depinde decisiv de modul de deplasare al amestecului de
solvenţi utilizat ca fază mobilă deoarece deplasarea solventului la diferite debite înseamnă timpi
de retenţie diferiţi şi suprafeţe de pic diferite. Fără obţinerea unor date reproductibile nu se poate
trage nici o concluzie privind identificarea sau cuantificarea.
O pompă trebuie să îndeplinească următoarele cerinţe:
- să furnizeze un debit fără pulsuri;
- să aibă un domeniu larg de debite;
- protecţie la depăşirea presiunii maxime;
- un volum mort scăzut;
- control asupra a cel puţin două surse de solvent pentru eluţia cu gradient;
- precizie şi acurateţe în obţinerea amestecurilor diferite de fază mobilă.
Există două tipuri de pompe: pentru coloane convenţionale (debite între 0,5 şi 10 ml/min)
şi pentru coloane înguste (debite de la 50 µl/min până la 5 ml/min) [1].
Un exemplu de pompă utilizată în CL este pompa cu două pistoane. Faza mobilă intră în
camera primei pompe prin intermediul unui ventil acţionat electronic, de mare viteză, care
amestecă până la 4 solvenţi. Ventilul este sincronizat cu mişcarea pistonului şi amestecă solvenţii
în faza de admisie a pompei. Pentru a favoriza amestecarea solvenţilor, fluidul intră pe la partea
de jos a fiecărei camere şi se deplasează în sus între piston şi peretele cilindrului creând
turbulenţe care produc amestecarea necesară. După ieşirea din prima cameră, fluxul trece prin al
doilea ventil şi apoi într-un amortizor de puls, cu volum redus (900 l) şi de aici în a doua cameră
de pompă. Mai departe, fluxul intră în unitatea de injecţie şi apoi în coloană. Pistoanele camerelor
de pompă sunt acţionate de un motor şi funcţionează cu un defazaj de 180 o, astfel că, în timp ce
unul scoate faza mobilă, celălalt se reîncarcă. Volumul vehiculat la fiecare ciclu poate fi redus
pentru a optimiza debitul şi precizia compoziţiei la debite mici. Volumul vasului de amortizare a
pulsurilor fiind foarte mic, valoarea pulsului (saltului) este mică, obţinându-se arii şi timpi de
retenţie reproductibili şi un zgomot mic al liniei de bază.

Degazarea este un proces de înlăturare a gazelor dizolvate în faza mobilă, înainte ca

aceasta să fie pompată în coloană. Aceasta previne formarea de bule pe traseu. O curgere

31
instabilă afectează retenţia pe coloană şi poate determina creşterea zgomotului de fond şi a
derivei de curent a unor detectoare.
Degazarea poate fi făcută on-line sau off-line. Se folosesc în mod obişnuit câteva
tehnici: degazarea cu vid (on-line sau off-line), degazarea ultrasonică off-line şi degazarea cu
heliu on-line.
Degazarea cu heliu. Aceasta presupune crearea continuă de bule de gaz în rezervorul
fazei mobile pentru a satura solventul şi a forţa alte gaze să iasă deasupra. Degazarea cu heliu
necesită un regulator de presiune simplu. Pot fi purjate simultan mai multe canale, fără volum
mort suplimentar. Dezavantajul este că heliul este scump şi că poate determina evaporarea
componenţilor mai volatili din amestec. Oxigenul este mai bine purjat prin degazarea cu vid.
Degazarea cu vid. Aceasta presupune trecerea solventului printr-un tub făcut dintr-un
polimer special care, sub presiune, este permeabil la gaze, dar nu la lichide. Diferenţele de
presiune dintre interiorul şi exteriorul membranei produc degazarea continuă a solventului.

6.2.6.3 Detectori

Principalii detectori utilizaţi în prezent în CL sunt: detectorul UV cu lungime de undă

variabilă, detectorul UV cu reţea de diode, detectorul de fluorescenţă, detectorul electrochimic şi
spectrometrul de masă.

 Detectorul UV

Traseul optic al unui detector convenţional cu lungime de undă variabilă este arătat în
figura 6.5. Lumina policromatică de la o lampă cu deuteriu este focalizată pe fanta de intrare a
unui cromator prin intermediul unor oglinzi sferice şi plane [33,34]. Monocromatorul transmite
selectiv, către fanta de ieşire o bandă îngustă de lumină. Fascicolul de lumină trece din fanta de
ieşire prin celula cu probă unde este parţial absorbit de soluţia din interiorul celulei. Cantitatea
absorbită de probă este determinată prin măsurarea intensităţii luminii care ajunge la fotodioda
fără probă (referinţă) şi a intensităţii luminii care ajunge la detector după trecerea prin probă.

Filtre
Reţea de Oglinzi
Fantă optice
difracţie

Lampă
Fantă
cu
deuteriu

Fotodiodă Celulă 32Divizor

probă de
fascicol Fantă
 Fotodiodă
de referinţă

Figura 6.5 Detectorul UV cu lungime de undă variabilă.

Fascicolul de referinţă şi fotodioda de referinţă sunt utilizate pentru a compensa

fluctuaţiile de lumină de la lampă. În regim de sensibilitate maximă, detectorul UV poate fi
programat pentru fiecare pic dintr-o analiză cromatografică, schimbând lungimea de undă
automat. Detectorul cu lungime de undă variabilă este realizat astfel ca să înregistreze
absorbanţa într-un singur punct din spectru, la oricare moment de timp. Totuşi, în practică, este
frecvent necesar să se facă măsurători simultan, la diferite lungimi de undă, de exemplu, când doi
compuşi nu pot fi separaţi cromatografic dar au maxime de absorbanţă diferite, iar dacă sunt
necesare spectrele compusului, debitul de solvent trebuie oprit pentru a se face o scanare pe tot
domeniul, întrucât scanarea durează mai mult decât eluţia.

 Detectorul UV cu reţea de diode

O diagramă schematică a unui detector cu reţea de fotodiode este prezentat în fig 6.6.
[1]. Un sistem de lentile acromatic focalizează lumina policromatică în celula de probă. Fascicolul
se dispersează pe suprafaţa unui plan de difracţie şi apoi cade pe reţeaua de fotodiode. Reţeaua
este constituită dintr-un anumit număr de diode (de ex. 211), fiecare de o anumită lăţime (de ex.
50 mm) şi fiecare destinată a măsura un spectru de bandă îngust. Prin măsurarea variaţiei
intensităţii luminii pe întregul domeniu de lungimi de undă, se obţine un spectru de absorbţie.
Lungimea de bandă a luminii detectate de către o diodă depinde de dimensiunea fantei de intrare.
Poziţia celulei cu probă şi a reţelei de difracţie sunt inversate faţă de un instrument UV
convenţional.

Reţea de fotodiode

33 Reţea de difracţie
 Sursă Lentilă focalizare Probă

Figura 6.6 Detector UV cu reţea de diode.

Detectorii cu reţea de diode conectaţi la unităţi de achiziţie a datelor corespunzătoare

oferă avantaje pentru dezvoltarea metodei: ajută la optimizarea lungimilor de undă pentru diferiţi
compuşi în cursul desfăşurării analizei. Posibilitatea de a achiziţiona şi stoca spectre permite
bibliotecilor spectrale să fie create electronic şi să fie accesate pe perioada dezvoltării metodei,
pentru identificarea compuşilor din probă. Se poate utiliza detecţia multisemnal pentru a se
optimiza sensibilitatea pe un domeniu spectral larg.
Având în vedere complexitatea celor mai multe probe, faptul că se poate verifica
puritatea picului este de ajutor pentru cuantificarea erorilor. Cea mai obişnuită metodă de
verificare a purităţii vârfului compară câteva spectre obţinute pe timpul eluţiei picului. Dacă s-a
întocmit o bibliotecă spectrală pe durata dezvoltării metodei, aceasta poate fi utilizată mai departe
pentru confirmarea identităţii unui pic. Spectrele analitice pot fi comparate cu acelea din
bibliotecă, fie interactiv, sau automat, după fiecare analiză.

 Detectorul de fluorescenţă

Fluorescenţa este un tip specific de luminiscenţă generată atunci când anumite molecule
emit energia anterior absorbită [35,36]. Detectorii de fluorescenţă au o selectivitate mai ridicată
decât detectorii în UV deoarece nu toate moleculele care absorb lumină o şi emit. Detectorii de
fluorescenţă sunt, de asemenea, mai sensibili decât detectorii de absorbţie datorită zgomotului lor
de fond mai scăzut. Cele mai multe detectoare de fluorescenţă sunt configurate astfel că lumina
fluorescentă emisă face un unghi (adesea unghi drept) cu fascicolul incident. Această geometrie
reduce posibilitatea luminii incidente parazite de a interfera ca semnal de fond şi asigură raportul
maxim semnal/zgomot pentru nivele de detecţie sensibile.
Figura 6.7. prezintă schematic un detector de fluorescenţă. Lumina de la o lampă cu
xenon este dispersată de către o reţea de difracţie (de excitaţie) şi focalizată în celula cu probă.
Radiaţia emisă de către probă este colectată la 90 0 faţă de fascicolul de lumină incident şi
măsurată folosind un tub fotomultiplicator. Pentru selectarea bandei de trecere, se plasează fante
între reţeaua de difracţie (de excitaţie) şi celula cu probă, între această celulă şi reţeaua de
difracţie (de emisie) şi încă o dată înainte de tubul fotomultiplicator. Un filtru de tăiere instalat în
partea frontală a reţelei de emisie opreşte lumina parazită care, dacă ar fi inclusă în măsurători ar
falsifica rezultatele. În trecut, detectorii de fluorescenţă aveau două dezavantaje: durata mare de
încălzire a lămpii şi deviaţia semnalului care însoţeşte acest transfer de căldură. Lămpile
moderne pot fi aprinse imediat şi, întrucât energia se eliberează numai când este necesară,
detectorii de fluorescenţă nu suferă datorită efectelor derivei de semnal la apariţia unui transfer de
căldură.
34
 Reţea de
difracţie
Tub (excitaţie)
fotomultiplicator

Lampă cu
xenon

Reţea de Fante
difracţie
(emisie)

Celulă cu probă
Filtru de tăiere

Figura 6.7 Detectorul de fluorescenţă.

Eficienţa transferului excitaţie-emisie este proporţională cu volumul iluminat: cu cât este
mai mare celula cu probă, cu atât este mai bun semnalul. Pe de altă parte, orice volum
suplimentar după coloană strică forma picului. Având în vedere aceşti doi factori, celula cu probă
poate fi optimizată prin reducere la un volum până la 5 μl. Când analiţii sunt foarte concentraţi
poate să apară absorbţia luminii emise la suprafaţa celulei de restul probei. Din acest motiv se
recomandă ca probele să fie diluate. Pe timpul dezvoltării metodei este avantajos să se poată
scana ambele spectre, de emisie şi de excitaţie prin oprirea debitului. Aceste date pot fi
transferate la un sistem computerizat de stocare şi prelucrare. Odată stabilite lungimile de undă
optime pentru excitaţie şi pentru emisie, aceşti detectori pot fi programaţi să comute între aceste
lungimi de undă pe durata analizei.

 Detectorul electrochimic

Detectorul electrochimic se utilizează pentru detecţia substanţelor care se pot oxida sau
reduce electrolitic [37,38]. Astfel, se măsoară curentul care apare la oxidarea sau reducerea
solutului din faza mobilă şi care este dat de relaţia:

i = n F (Ci – Cf) D
unde:
n - numărul de electroni participanţi la reacţia electrochimică;
F - numărul lui Faraday;
Ci - concentraţia iniţială a analitului (la intrarea în celulă), moll–1;
Cf - concentraţia analitului la ieşirea din celulă, moll–1;
35
 D - debitul fazei mobile prin celulă, ls–1 .
Se pot utiliza două metode de măsurare:
– fie realizarea unei electrolize parţiale la potenţial fix şi măsurarea curentului
(amperometrie);
– fie realizarea unei electrolize totale a analitului la trecerea acestuia prin celulă şi
măsurarea curentului necesar pentru a atinge o valoare Cf = 0 (coulometrie).
Detecţia se bazează pe trei electrozi: electrodul de lucru, electrodul auxiliar şi electrodul
de referinţă (figura 6.8.).
Electrod de
referinţă

Electrod
auxiliar
+
-

Electrod de
V lucru

Figura 6.8 Detectorul electrochimic

Oxidarea sau reducerea se desfăşoară pe suprafaţa aşa numitului electrod de lucru.

Pentru determinarea potenţialului optim de lucru trebuie trasat graficul curent-potenţial aplicat
pentru fiecare component. Potenţialul optim este cel corespunzător curentului limită (figura 6.9.).

Curent

E2

E1/2 Potenţial optim

E1

0,40,60,81,0
Figuar 6.9 Reprezentare grafică current/ potential optim

Câteva materiale sunt utilizate pentru electrozii de lucru, cel mai comun fiind din
cărbunele. Alte tipuri de materiale sunt: aur (pentru zaharuri şi alcooli), platină (pentru cloruri,
sulfuri, hidrazină şi peroxid de hidrogen), argint (pentru halogeni), cupru (pentru aminoacizi),

36
mercur (pentru tiosulfat) şi combiniat mercur-aur (în reacţie de reducere pentru compuşi organici
cu azot).

6.2.6.4. Aplicaţii ale cromatografiei de lichide

 Determinarea concentraţiei de fentanil din soluţii injectabile cu citrat de fentanil

prin HPLC

Procedeu:
Se efectuează metoda lichid cromatografică, utilizând următoarele soluții.
- soluția (1) proba, dacă este necesar se diluează cu faza mobilă, pentru a conține
echivalentul a 0,005 % g/v fenlanil;
- soluția (2) soluție standard 0,008 % g/v citrat de fentanil în faza mobilă.

Condiţii HPLC:
Coloană: C18 – octadecil silica
Fază mobilă: amestec în volume: acetonitril, metanol, apă (4:40:56) cu 0,3% fosfat dipotasic,
pH = 3,2 ajustat cu acid ortofosforic.
Detecţie: UV la 215 nm

Principiul metodei
Proba este diluată pentru a evita suprasaturarea sistemului HPLC, apoi este injectată
direct, fără nici o pregătire suplimentară, măsurându-se aria picului pentru substanţa activă.
Această suprafaţă de pic este comparată cu suprafața picului soluției de citrat de fentanil de
0,008% în faza mobilă, pentru a calcula conținutul de fentanil.
Se analizează o soluţie injectabilă care conține citrat de fentanil, corespunzând la 50 µg/ml
fentanil. 50 µg/ml corespunde la 0,050 mg/ml, adică 0,0050% g/v, iar proba poate fi injectată
direct în sistemul HPLC conform metodei descrisă anterior. Ca un exemplu, injectarea directă a
probei oferă un pic principal, cu o anumită suprafață S 1. Soluția de referință (2) se prepară din
citrat de fentanil de puritate 99,7%. Se dizolvă 0,0810 g citrat de fentanil (81,0 mg) şi se dizolvă în
faza mobilă, volumul fiind ajustat la 100 ml. 10 ml din această soluție se diluează la 100 ml cu
fază mobilă. Se determină în urma cromatografieri, în aceleaşi condiţii, suprafața picului pentru
fentanil din soluţia etalon, S2 .
Conţinutul de fentanil per ml se calculează după cum urmează:
- concentraţia de citrat de fentanil din soluţia de referinţă, calculată în funcţie de puritate şi
ţinând seama de diluţie (de la 10 la 100 ml):

81 mg 99,7 10 ml
x x =0,0808 mg /ml
100 ml 100 100 ml

37
 - această valoare corespunde la o suprafaţă de pic notată S2. Suprafaţa de pic măsurată
pentru soluţia injectabilă a fost de S1. Concentraţia de citrat de fentanil din soluţia
injectabilă se calculează cu relaţia:

S1 mg
x 0,0808 =C1 mg /ml
S2 ml

Aceasta este concentraţia de citrat de fentanil. Pentru a calcula concentraţia în fentanil

trebuie să ţinem seama de masele molare ale fentanilului (336,5 g/mol) şi citratului de fentanil
(528,6 g/mol). Conţinutul de fentanil din soluţia injectabilă se calculează astfel:

g
336,5
mg mol
C1 x =C 2 μg /ml
ml g
528,6
mo l

Abaterea găsită faţă de conţinutul specificat în substanţă activă este:

[C 2 μg/ml - 50,0 μg/ml / 50,0 μg/ml] x 100 %=± C 3 %

 Analiza hidrocortizonului din unguente prin HPLC

Procedeu:
Se efectuează o metodă de cromatografie de lichide (pentru unguente care conțin mai mult
de 0,5% g/g de hidrocortizon) utilizând următoarele soluții:
- soluția (1): se dizolvă 25 mg hidrocortizon substanţă pură în 45 ml metanol, se adaugă 5
ml dintr-o soluție de 0,5% g/v de betametazonă (standard intern) în metanol și se
completează cu apă până la 100 ml;
- soluția (2): se dispersează o cantitate de unguent conținând 25 mg hidrocortizon în 100
ml de hexan la cald, se răcește și se extrage cu 20 ml dintr-o soluție preparată prin
amestecarea a 3 volume metanol cu 1 volum soluție de clorură de sodiu 15% g/v. Se
repetă extracția de două ori cu câte 10 ml soluție metanolică de clorură de sodiu. La
extractele combinate se adaugă 5 ml soluție de 0,5% g/v de betametazonă (standard
intern) în metanol și se completează cu apă la 100 ml, se amestecă și se filtrează.

Condiţii HPLC:
- Coloană: C18 – octadecil silica
- Fază mobilă: amestec metanol - apă (50 : 50 v/v).
- Detecţie: UV la 240 nm

38
 Principiul metodei:
Proba de unguent este dispersată în hexan fierbinte care dezintegrează formularea semi-
solidă, iar cantitatea totală de substanţă activă devine accesibilă. Această dispersie în hexan este
extrasă apoi (extracție lichid-lichid) cu un amestec de metanol și apă care formează un sistem
bifazic cu hexan. Faza de metanol / apă conține cantități mari de clorură de sodiu, în vederea
creșterii polarității fazei de extracție. Hidrocortizonul este un compus relativ hidrofil și este extras
în faza de metanol / apă. Această extracție se repetă de încă două ori cu amestec metanol / apă
pentru a asigura un transfer cantitativ al hidrocortizonului din unguent. Cele trei extracte se
combină și se adaugă o cantitate mică de betametazonă ca standard intern. Hidrocortizonul este
măsurat în raport cu standardul intern, pentru a îmbunătăți precizia și acuratețea metodei.
Extractele combinate sunt diluate până la 100 ml într-un balon cotat și un volum din aceasta este
filtrată înainte de HPLC. Filtrarea este necesară pentru a elimina orice particule care pot înfunda
coloana HPLC. Suprafața picului de soluție (1) este comparată cu suprafața picului soluției de
referință (2) pentru a calcula conținutul de substanţă activă. Principiul cromatografică este
cromatografia cu fază inversă.

Mod de lucru
Se analizează unguentul cu hidrocortizon 1% m/m.
Ca exemplu:
- soluția standard intern se prepară prin dizolvarea a 0,1249 g betametazonă în 25,0 ml
metanol.
- soluția (1) se prepară prin dizolvarea a 25,2 mg hidrocortizon cu un conținut specificat de
99,8% m/m. Concentrația de hidrocortizon în soluția (1) se calculează în funcţie de
puritatea sa:

[25,2mg/100 ml ]x [99,8 % /100 %]=0,252 mg/ml

Presupunând că 2,4896 g unguent a fost preparat așa cum este specificat pentru soluția (2).
Pentru soluția (1) suprafeţele de pic măsurate pentru hidrocortizon și pentru standardul intern au
fost 87635 și 56933. Pentru soluția (2) suprafeţele de pic măsurate pentru hidrocortizon și pentru
standardul intern au fost 86701 respectiv 57255. Conținutul de hidrocortizon în unguent se
calculează după cum urmează:
Pentru soluția (1) care este o soluție de referință, la o concentrație de 0,252 mg / ml în funcţie de
suprafaţa obţinută:
87653
=1,539
56933

Pentru soluția (2) care este soluția de lucru, în funcţie de suprafaţa de pic înregistrată, obţinem:

86701
=1,514
57255

39
Această valoare a concentraţiei este puţin mai mică decât soluţia de referinţă. Concentraţia în
soluţia de probă se calculează ţinând seama şi de diluţie, astfel:

1,514 mg
x 0,252 =0,248 mg /ml
1,539 ml
❑
0,248 mg/ ml x 100 ml=24,8 mg

Raportând la masa de unguent luată în lucru:

[24,8 mg/2489,6 mg] x 100 %=0,996 %

Abaterea găsită faţă de conţinutul specificat în substanţă activă este:

[(0,996 %−1,00 % )/1,00 % ] x 100=−0,386 %

Acest conținut este în intervalul de toleranță de ±5% pentru substanţa farmaceutic

activă.

40