8.

ELECTROFOREZA CAPILARĂ

8.1. INTRODUCERE
Electroforeza este definită ca mişcarea diferenţială a speciilor încărcate (ioni) prin
atracţie sau respingere într-un câmp electric fiind introdusă ca tehnică de separare de Tiselius în
1937. Punând un amestec de proteine în soluţie tampon, într-un tub în formă de “U” şi aplicând
un câmp electric, compuşii probei au migrat într-o direcţie cu viteze determinate de sarcina şi
mobilitatea lor. Pentru această lucrare Tiselius a primit premiul Nobel.
Eficacitatea separării în soluţii libere, aşa cum a fost realizată de către Tiselius, este
limitată de difuzie termică şi convecţie. Din aceste motive, electroforeza a fost efectuată în medii
anticonvective ca poliacrilamida şi gelul de aragoză. Gelurile depuse pe un suport sau într-un tub
au fost utilizate iniţial pentru separarea, după mărime, a macromoleculelor biologice cum ar fi
acizii nucleici şi proteinele. Dar aceste separări au eficacitate scăzută, timpi de analiză mari, şi
dificultăţi în detecţie şi automatizare. Performanţele au fost îmbunătăţite prin utilizarea tuburilor cu
diametru mic din teflon sau silice topită cu soluţii sau cu gel (electroforeză capilară – EC) [1-15].
Deplasarea lichidului în raport cu un solid sub acţiunea câmpului electric (lichidul
aflându-se într-un tub capilar) se numeşte electroosmoză. Această deplasare se datorează
existenţei stratului dublu electric la suprafaţa tubului capilar. Mecanismele de separare în
electroforeza capilară extind domeniul de aplicabilitate al electroforezei. Astfel, dacă electroforeza
clasică se limitează la separarea macromoleculelor, prin această metodă pot fi separaţi cationi,
anioni şi molecule neutre într-o singură analiză.

8.2. PRINCIPIILE ELECTROFOREZEI CAPILARE

8.2.1. Electroforeza

Separarea prin electroforeză se bazează pe deplasarea cu viteze diferite a soluţilor într-

un câmp electric. Viteza unui ion este dată de:

(8.1)

unde - mobilitatea electroforetică şi

E - intensitatea câmpului electric (V/cm).
Intensitatea câmpului electric este funcţie de tensiunea aplicată şi lungimea capilarului.
Mobilitatea unui ion, într-un mediu dat, este o constantă a ionului respectiv. Aceasta este
determinată de forţa electrică ce acţionează asupra moleculei raportată la forţa de frecare
datorată mediului.

Forţa electrică este dată de:

1
 (8.2)

iar forţa de frecare pentru un ion sferic este:

(8.3)
q = sarcina ionului;
 = vâscozitatea soluţiei;
r = raza ionului;
v = viteza ionului.

La echilibru, cele două forţe sunt egale

(8.4)

Din ecuaţiile 8.1 şi 8.4 rezultă o ecuaţie care descrie mobilitatea în termeni de parametrii
fizici:

(8.5)

Rezultă că particulele mici, cu sarcină mare au mobilităţi mari.

8.2.2. Fluxul electroosmotic

Fluxul electroosmotic (FEO) reprezintă deplasarea lichidului prin capilar şi rezultă ca

urmare a aplicării câmpului electric pe dublul strat electric de la peretele capilarului. Timpul cât
compuşii rămân în capilar depinde de FEO şi de mobilitatea acestora.

8.2.2.1. Teoria stratului dublu

În soluţii apoase, suprafeţele solide posedă un exces de sarcini negative.

Acestea pot rezulta prin ionizarea suprafeţei (adică echilibru acid-bază) şi/sau din absorbţia unor
ioni la suprafaţă. La capilarele “fused silica” au loc probabil ambele procese dar fluxul
electroosmotic este determinat mai ales de grupările SiOH, în formă anionică. SiO–. Debitul
electroosmotic apare şi la capilarele de teflon datorită absorbţiei ionilor la suprafaţă. Contraionii
se grupează lângă suprafaţa capilarului şi formează stratul dublu electric.
În figura 8.1 este prezentat schematic stratul dublul electric, după Stern. Planul situat la
distanţa  de suprafaţă, dincolo de care nu se pot apropia ionii de peretele capilarului, se
numeşte planul extremei apropieri.

2
 Valo
Armătura fixă
de la valoarea  (a peretelui
–
capilarului faţă de interiorul
– +
– soluţiei) la valoarea , în
– planul extremei apropieri.
– Acesta se numeşte potenţial
Strat difuz
–
electrocinetic sau potenţial
– + zeta şi joacă un rol însemnat
– într-o serie de fenomene
– –
superficiale, datorită mobilităţii
stratului difuz care poate fi
a pus în mişcare odată cu
 soluţia, la aplicarea unui câmp
 electric. Viteza liniară de
curgere a lichidului prin capilar
este:


 = /e (8.6)
şi
 x
b

Figura 8.1 Stratul dublu (Stern) (8.7)

D=
mediului.
Potenţialul electrocinetic , este determinat de :
- sarcina de suprafaţă a peretelui capilarului, care la rândul ei este puternic dependentă
de pH (la pH mic grupele SiO– sunt protonate iar la pH mare sunt libere). În funcţie de condiţiile
specifice, FEO poate varia cu mai mult de un ordin de mărime, între pH 2 şi 12.
- tăria ionică a soluţiei tampon; creşterea tăriei ionice duce la comprimarea stratului
dublu electric şi reduce potenţialul electrocinetic.

3
 b

Figura 8.2 Formarea fluxului electroosmotic. a) suprafaţa tubului capilar de fused silica încărcată
negativ; b) formarea stratului dublu electric; c) deplasarea FEO spre catod la aplicarea câmpului
electric.

FEO determină deplasarea tuturor speciilor, indiferent de sarcină, în aceeaşi direcţie.

Când suprafaţa capilarului este încărcată negativ, fluxul este orientat de la anod la catod. Anionii
vor fi antrenaţi spre catod dacă valoarea FEO este cu un ordin de mărime mai mare decât
mobilităţile lor electroforetice. Astfel, cationii, compuşii neutrii şi anionii pot fi determinaţi într-o
singură analiză deoarece toţi migrează în aceeaşi direcţie (figura 8.3).

N
N

+
4
 N

Figura 8.3 Migrarea diferenţiată a soluţilor în electroforeza capilară zonală.

Din figura 8.3 se observă că spre catod migrează mai întâi cationii, apoi compuşii neutri
care nu sunt separaţi şi, în final, anionii.

8.2.2.2. Reglarea fluxului electroosmotic

Reuşita analizei depinde de reglarea FEO. De exemplu, la pH mare, FEO poate fi foarte
rapid şi compuşii n-au timp să se separe. La pH mic sau moderat peretele încărcat negativ al
capilarului poate adsorbi soluţi cationici prin interacţii coulombiene. În principiu, reglarea FEO
implică schimbarea sarcinii de suprafaţă a capilarului sau a vâscozităţii soluţiei tampon. În tabelul
8.1 sunt prezentate metodele folosite pentru reglarea FEO. Condiţiile care afectează sarcina de
suprafaţă a peretelui, afectează adesea şi solutul (precum pH-ul soluţiei tampon). Separări optime
se obţin când se optimizează atât FEO cât şi factorii care determină mobilitatea solutului.

Tabelul 8.1 Metode de reglare FEO.

Parametrul Efectul Observaţii
Intensitatea Schimbarea proporţională a FEO – Dacă E creşte, eficacitatea şi
câmpului electric rezoluţia cresc;
(E) – Dacă E creşte, creşte
temperatura prin efect Joule.
PH-ul soluţiei FEO creşte cu creşterea pH-ului Poate schimba sarcina sau
tampon structura solutului.
Forţa ionică sau Creşterea forţei ionice duce la Scăderea forţei ionice poate duce
concentraţia scăderea potenţialului zeta şi deci la absorbţia probei pe pereţii
soluţiei tampon a FEO capilarului
Temperatura Modifică vâscozitatea soluţiei Utilă întrucât temperatura este
tampon controlată instrumental.
Modificatori Modifică vâscozitatea şi Îmbunătăţesc selectivitatea.
organici potenţialul zeta (de obicei scade
FEO).
Substanţe Se absorb la peretele capilarei – Anionici, cresc FEO

5
 tensioactive – Cationici, descresc sau
inversează FEO
– Pot modifica selectivitatea

8.2.2.3. Parametrii analitici

Parametrii analitici în EC pot fi descrişi în termeni similari cu cromatografia pe coloană.

Cel mai simplu mod de operare în EC este electroforeza capilară zonală ai cărei parametrii sunt
prezentaţi în acest capitol.
Mobilitate şi timp de migrare
Timpul necesar pentru migrarea solutului până la punctul de detecţie este denumit timp
de migrare.
Mobilitatea aparentă a solutului:

(8.8)
unde:

V = tensiunea aplicată;
l = lungimea efectivă a capilarului (la detector);
L = lungimea totală a capilarului:
t = timp de migrare;
E = intensitatea câmpului electric.
Mobilitatea electroforetică, e , se poate determina din mobilitatea aparentă, prin
măsurarea FEO utilizând un solut care se deplasează odată cu FEO. Astfel de soluţi sunt
acetona, oxidul de mesitil, dimetilsulfoxidul. Lungimea efectivă a capilarului este măsurată de la
punctul de injecţie până la punctul de detecţie.

8.2.2.4. Eficacitate şi selectivitate

Dispersia zonei de solut

Separarea se bazează pe diferenţele de mobilitate ale soluţilor. Diferenţa necesară
separării a două zone este dependentă de lungimea zonelor care, la rândul lor, sunt dependente
de procesele de dispersie din interiorul lor. Dispersia zonei rezultă din viteze diferite ale soltului în
interiorul zonei, acestea având ca efect lăţirea picului. Dispersia descrisă prin ecuaţia 8.9 este o
sumă de mai multe surse de lărgire a zonei: difuzia longitudinală, dispersia datorată injecţiei, dis-
persia datorată încălzirii locale prin efect Joule, dispersia datorată adsorbţiei soluţilor pe peretele
capilarului, dispersia datorată volumului detectorului şi electrodispersia datorată diferenţelor de
conductibilitate dintre compuşii probei şi soluţia tampon.

6
 (8.9)

În EC difuzia longitudinală este mică datorită profilului plat al debitului electroosmotic.

Pentru a minimiza dispersia datorată injecţiei, mărimea dopului de probă trebuie să fie 1 - 2 % din
lungimea capilarului. Datorită încălzirilor locale prin efect Joule apar gradienţi de temperatură care
duc la schimbări ale vâscozităţii şi, deci la lărgirea zonei. Pentru a micşora acest efect, trebuie
controlată temperatura prin termostatarea capilarului. Adsorbţia soluţilor pe peretele capilarului
poate fi înlăturată prin creşterea concentraţiei soluţiei tampon (care are ca efect negativ scăderea
FEO) şi prin creşterea pH-ului.
Pentru a micşora electrodispersia compuşii din probă şi soluţia tampon trebuie să aibă
conductivităţi de valori apropiate.
Ţinând cont numai de difuzia longitudinală,

(8.10)

numărul de talere teoretice devine:

(8.11)

D = coeficientul de difuzie al solutului

Se observă că este necesară aplicarea unei tensiuni ridicate pentru obţinerea unui
număr ridicat de talere teoretice. Pentru molecule mari cum ar fi proteinele şi ADN care au
coeficienţi de difuzie mici, dispersia va fi mai mică decât în cazul moleculelor mici. Numărul de
talere teoretice calculat direct din electroferogramă se calculează cu relaţia cunoscută

(8.12)
unde: t = timpul de migrare
wh = lăţimea picului la jumătatea înălţimii, în unităţi de timp.

Înălţimea echivalentă a talerului teoretic este .

Rezoluţia
Rezoluţia este cel mai simplu definită prin relaţia:

7
 (8.13)

unde: w = lăţimea picului la bază, în unităţi de timp:

 = deviaţia standard.
Separarea în EC este determinată de eficacitate şi nu de selectivitate spre deosebire de
cromatografie. Datorită zonelor înguste de solut sunt suficiente adesea diferenţe mici de
mobilitate a soluţilor ( 0,05%) pentru o rezoluţie completă.
Selectivitatea poate fi reglată prin introducerea în soluţia tampon a unor aditivi, aşa cum
se va vedea în capitolul următor.

8.3. MODURI DE OPERARE ÎN ELECTROFOREZA CAPILARĂ

Versatilitatea EC se datorează în mare măsură diferitelor moduri de operare.

Mecanismele de separare ale fiecărui mod sunt diferite şi oferă informaţii complementare.
Metodele de operare în EC sunt:
- electroforeză capilară zonală (ECZ);
- cromatografie electrocinetică micelară (CEM);
- electroforeză capilară pe gel (ECG);
- electroforeza cu focalizare izoelectrică (EFI);
- izotahoforeză capilară (ITC).
Aceste variante de operare în EC determină selectivităţi diferite datorită mecanismelor
de separare diferite.

8.3.1. Electroforeza capilară zonală (ECZ)

Electroforeză capilară zonală este cel mai simplu mod de operare în EC deoarece
capilarul este umplut numai cu soluţie tampon. Separarea se face pe baza migrării soluţiilor în
zone discrete şi cu viteze diferite. Are aplicaţii în analiza aminoacizilor, peptidelor, ionilor şi unui
număr mare de enantiomeri. Aspectele teoretice ale ECZ au prezentate în capitolul anterior. În
ECZ selectivitatea poate fi modificată prin schimbarea pH-ului soluţiei tampon sau prin
introducerea unor aditivi în soluţia tampon. De remarcat că, deşi aceste metode modifică FEO,
acesta nu influenţează decât timpul de migrare şi rezoluţia, şi nu selectivitatea.
Selectarea soluţiei tampon. Sensibilitatea FEO la variaţiile de pH impune folosirea
soluţiilor tampon care să menţină pH-ul constant. Sistemele tampon au un interval de aproximativ
două unităţi de pH, centrat în jurul valorii pKa. Soluţiile tampon polibazice, cum ar fi fosfatul şi
citratul au mai mult de un pKa util şi de aceea pot fi folosite pe mai multe intervale de pH. O
soluţie tampon trebuie să aibă următoarele proprietăţi:
8
 - capacitate de tamponare mare în domeniul de pH ales;
- absorbţie scăzută la lungimea de undă la care se face detecţia;
- mobilitate scăzută (adică ion cu volum mare şi sarcină mică) pentru a reduce la minim
curentul generat.

A (+) - - - - - - - - - - - - - (-) C
+
- -+ - + - + + + + + + + +
+ +μF + μFE
+
μE μFE O μE
+ EO
- O
-
μR μR

+ + + + + + + + + + +
- - - - - - - - - - - - -
+ + +
- - - -
Figura 8.4 Migrarea în electroforeza capilară zonală (O – anioni, + - cationi, □–
molecule neutre)

Aditivii folosiţi în ECZ sunt:

- substanţe tensioactive, anionice, cationice sau neutre; la concentraţii mai mici decât
concentraţia critică micelară determină modificarea FEO, solubilizarea soluţilor hidrofobe,
cuplarea ionilor;
- amfoliţi care determină creşterea forţei ionice fără să crească conductivitatea şi
modifică selectivitatea proteinelor;
- polimeri liniari hidrofili ca: metilceluloza, poliacrilamida, polietilenglicolul; modifică FEO
şi micşoreză absorbţia soluţilor la suprafaţa peretelui capilarului;
- modificatori organici ca: metanolul, acetonitril, acid trifluoracetic: modifică FEO şi
selectivitatea;
- selectori chirali ca: ciclodextrine, eteri ciclici, săruri biliare. Ciclodextrinele, cei mai
folosiţi selectori chirali, sunt oligozaharide ciclice neionice alcătuite din 6,7 sau 8 unităţi de
glucoză; au formă de trunchi de con cu diametrul cavităţii determinat de numărul de unităţi de
glucoză. Cavitatea este relativ hidrofobă în timp ce suprafaţa externă este hidrofilă. Circumferinţa
conţine grupe hidroxil secundare chirale. Selectivitatea chirală apare din incluziunea părţilor
hidrofobe ale solutului în cavitate şi prin legarea prin punţi de hidrogen a părţilor chirale cu
hidroxilul ciclodextrinei.
Aplicaţii: separarea aminoacizilor D, L, a medicamentelor chirale, a izomerilor de poziţie.

8.3.2. Cromatografia electrocinetică micelară (CEM)

Este o metodă hibrid între electroforeză şi cromatografie, avantajul principal fiind acela
că separă soluţi neutri alături de cei cu sarcină. Prin introducerea în soluţia tampon a substanţelor
tensioactive în concentraţii mai mari decât concentraţia critică micelară se formează agregate de

9
molecule numite micele. Acestea sunt sferice, cu catene hidrofobe orientate spre centru pentru a
evita interacţia cu soluţia tampon hidrofilă şi cu părţile cu sarcină, orientate spre soluţia tampon.
Micelele sunt încărcate electric şi migrează în acelaşi sens sau în sens invers cu FEO. Cele
anionice migrează spre anod, adică în direcţie opusă FEO, dar, cum FEO este mai rapid decât
viteza de migrare a micelelor, la pH neutru sau bazic, mişcarea netă este în direcţia FEO. În
timpul migraţiei micelele pot interacţiona cu soluţii în manieră cromatografică (prin interacţii
hidrofobe) şi prin interacţii electrostatice.
Pentru speciile neutre, separarea este efectuată numai prin repartizarea înăuntrul şi în
afara micelei. Cu cât solutul interacţionează mai puternic cu micela, cu atât timpul de migrare este
mai mare deoarece micela îl transportă în sens invers faţă de FEO. Compuşii hidrofili
interacţionează mai puternic cu micela şi sunt mai puternic reţinuţi. În figura 8.5 este descris
schematic, procesul de separare în CEM.

A (+) - - - - - - - - - - - - - - - (-) C
+
- -+ + + + + + + + + + + +
μFEO
+ - -

μFEO
- μE
- μFEO
-
+ + + + + + + + + + + + +
- +- - - - - - - - - - - - - -
- -

Figura 8.5 Separarea în CEM

Aplicaţii: aminoacizi, nucleotide, vitamine, medicamente, hidrocarburi aromatice.

8.3.3. Electroforeza capilară pe gel (ECG)

ECG este comparabilă cu electroforeza clasică, pe placă sau în tub. Separarea are loc
în funcţie de mărimea moleculelor, pe geluri care acţionează ca nişte site moleculare. Cele mai
folosite geluri sunt poliacrilamida cu fibre intercalate şi agaroza. Concentraţia de polimeri
necesară este invers proporţională cu mărimea moleculei analitului. Peretele capilarului este
acoperit cu un suport pentru a elimina FEO. Macromoleculele cum ar fi ADN-ul nu pot fi separate
decât pe gel deoarece conţin rapoarte masă-sarcină care nu variază cu mărimea, adică fiecare
nucleotidă adăugată la lanţul ADN adaugă unitate de masă şi sarcină şi nu modifică mobilitatea.
Aplicaţii: în biologia moleculară şi chimia proteinelor. Prima include analiza de puritate a
oligonucleotidelor, terapia cu gene antisens, secvenţa de ADN.

10
 8.3.4. Electroforeza cu focalizare izoelectrică (EFI).

Electroforeza cu focalizare izoelectrică (EFI) este o tehnică electroforetică de mare

rezoluţie folosită pentru a separa peptidele şi proteinele, pe baza punctului izoelectric. În funcţie
de pH, proteinele şi peptidele pot fi anioni ,cationi sau amfioni. Punctul izoelectric este egal cu
acel pH la care concentraţia anionilor este egală cu concentraţia cationilor. Deci sarcina netă este
zero. Această tehnică, la fel ca electroforeza pe gel a fost adaptată recent pentru EC. În EFI se
formează un gradient de pH în capilar cu ajutorul amfoliţilor cu valori ale pi care să acopere
intervalul de pH necesar în experiment. După umplerea capilarului, cu un amestec de solut şi
amfoliţi apare un gradient de pH. Cu o soluţie bazică la catod şi una acidă la anod, la aplicarea
unui câmp electric, amfoliţii cu sarcină şi proteinele migrează prin mediu până când ajung într-o
regiune unde nu mai au sarcină (la pi-ul lor). Acest proces este cunoscut sub numele de
focalizare. După focalizare, soluţii şi amfoliţii sunt antrenaţi spre detectori prin aplicarea unei
presiuni. În EFI fluxul electroosmotic trebuie redus sau eliminat deoarece poate avea loc
deplasarea amfoliţilor şi a probei înainte de focalizare. Reducerea FEO se poate realiza cu
suporturi dinamice sau covalente.
Aplicaţii: determinarea pI-urilor proteinelor şi separarea proteinelor izoforme, dificil de
separat prin alte metode, cum ar fi imunoglobulinele şi hemoglobinele.

8.3.5. Izotahoforeză capilară (ITC)

În ITC se foloseşte o combinaţie de două sisteme tampon pentru a crea condiţii în care
zonele separate se deplasează cu aceeaşi viteză. Zonele sunt sub formă de sandwich între un
electrolit conducător şi unul terminal. Prin această metodă se analizează anioni şi cationi. Pentru
analizele de anioni soluţia tampon trebuie să conţină electrolitul conducător, un anion cu o
mobilitate efectivă mai mare decât a solutului şi anionul terminal care trebuie să aibă o mobilitate
mai scăzută decât a solutului. La aplicarea câmpului electric, anionii migrează spre anod cu
aceeaşi viteză dată de anionul conducător. Câmpul se autoreglează (v = eE) pentru a menţine
viteza constantă.

8.4. APARATURA FOLOSITĂ ÎN ELECTROFOREZA CAPILARĂ

Schema aparatului pentru electroforeză capilară fabricat de firma Hewlett-Packard este

prezentată în figura 8.6.
Coloana capilară este din silice topită sau teflon şi are dimensiunile 25-75 m diametrul
interior şi 350 - 450 m diametrul exterior. Lungimea efectivă, l, este de la 10 cm în electroforeza
capilară pe gel până la 80 - 100 cm în ECZ. Lungimea totală, L, este cu 5-10 cm mai mare.
În EC se utilizează o sursă de curent continuu de 200 - 300 mA şi 30 kV.

11
 Capilară din silice topită

Detector

+ 15–30 kV –

Soluţie
tampon

Figura 8.6 Schema aparatului de EC.

Absorbţia în UV-VIS este ca mai folosită metodă de detecţie în EC. Deoarece

fereastra optică este chiar în capilar, nu apare o lărgire a zonei de component datorită volumului
mort al detectorului. Drumul optic scurt este factorul care limitează cel mai puternic sensibilitatea.
Sensibilitatea şi domeniul de liniaritate pot fi crescute prin creşterea diametrului capilarei în zona
de detecţie. În acest scop s-au realizat capilare cu drum optic extins. În zona de detecţie
diametrul capilarului este mărit de trei ori. Pentru detecţie se utilizează detectori
spectrofotometrici sau spectrofluorimetrici. Se mai pot utiliza şi detectori electrochimici de
conductivitate, spectrometrul de masă sau detectori refractometrici.

8.5. APLICAŢII ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE

Una dintre marile probleme ale societăţii actuale este producerea şi comercializarea
ilicită a drogurilor şi în general a substanţelor stimulatoare cu efecte psiho- sociale grave.
De aici şi importanţa metodelor de analiză a medicamentelor ce conţin astfel de
substanţe, dintre acestea electroforeza capilară (E.C.) fiind tot mai mult utilizată.
Se poate aprecia că G.C se caracterizează printr-o rezoluţie mai bună decât HPLC însă
compuşii nevolatili, termolabili sau foarte polari nu se pot determina prin GC fără o derivatizare
prealabilă care să le confere stabilitate şi volatilitate. În schimb, aceste substanţe se pot analiza
prin E.C. fără derivatizare, metoda este mult mai uşor de aplicat şi cu cheltuieli mult mai reduse
decât HPLC. Dintre tehnicile E.C. foarte utilizată este cromatografia capilară electrocinetică
(C.C.E.).

12
 În urma unei analize este înregistrată electroforegrama, identificarea compuşilor din
amestec realizându-se pe baza timpilor relativi de migrare care se compară cu valorile existente
în biblioteci de date.
Cromatografia capilară electrocinetică (C.C.E.) poate fi aplicată cu succes la
identificarea şi dozarea medicamentelor de interes juridic cum sunt: heroina şi alţi alcaloizi
opiacei, cocaina, barbiturice, amfetamine, halucinogene, benzodiazepine.

13