PROTEINE. SEPARAREA PRIN ELECTROFOREZĂ. DIALIZA.

I. ELECTROFOREZA

Electroforeza reprezintă procesul prin care particulele încărcate electric

migrează într-un mediu lichid sub influenţa unui câmp electric (curent electric continuu).
Particula se mişcă cu o viteză constantă, deci forţa electrică (E ∙ q) trebuie să
compenseze forţa de frecare (f ∙ v).
E∙q=f∙v
E = câmp electric (volţi/cm);
q = sarcina netă a particulei (unităţi electrostatice);
f = coeficient de frecare (funcţie de mărimea şi forma particulei);
v = viteza particulei (cm/sec).

Câmpul electric E poate fi exprimat fie prin tensiune, fie prin intensitate, din
acest motiv în electroforeză se menţine constantă fie tensiunea, fie intensitatea.
Viteza particulei v este definită prin relaţia:
E·q
v=
f
Dacă E este constant, viteza depinde de raportul dintre sarcina şi masa particulei
în mişcare. Dintre două particule care au aceeaşi formă, cea cu sarcina netă mai mare
(q) se va mişca mai repede. Dintre două particule având aceeaşi masă şi aceeaşi
sarcină netă, cea care este mai simetrică (mai sferică – raport axial mai apropiat de 1,0)
se va mişca mai repede decât cea care este mai asimetrică (mai alungită – raport axial
mai depărtat de 1,0) deoarece particula asimetrică are un coeficient de frecare mai
mare decât cea simetrică.
Mobilitatea electroforetică (μ) este definită drept distanţa d parcursă în
intervalul de timp t de o particulă aflată sub influenţa gradientului de potenţial E:
d v
μ = txE sau μ = E
Relaţia de mai sus este doar parţial adevărată, ea fiind influenţată de o serie de
factori ce includ îndeosebi efectele excesului de căldură generat de creşterea intensităţii
curentului.
Migrarea proteinelor în câmp electric se datorează naturii amfoterice a acestora, care
permite o încărcare electrică dependentă de pH-ul soluţiei:

La pH izoelectric
+ H+ HO - -
H3N CH COOH H2N CH COOH H2N CH COO
R R R
Forma cationică Fără sarcină Forma anionică

Viteza de migrare electroforetică depinde de următorii factori:

- sarcina electrică a moleculei;
- mărimea şi forma moleculei;
 - tensiunea câmpului electric aplicat;
- natura suportului solid utilizat;
- temperatura de lucru.
q
μ=
krη
 - mobilitate electroforetică, cm/(volt)(secundă)
q – sarcina moleculei
k – constantă
r – raza ionică a particulei ce migrează
 - vâscozitatea soluţiei

Astfel mobilitatea electroforetică este direct proporţională cu sarcina proteinei ce

migrează sub acţiunea câmpului electric şi invers proporţională cu mărimea proteinei şi
vâscozitatea mediului (a tamponului utilizat în electroforeză).
După natura mediului în care acţionează există două tipuri de electroforeză:
- electroforeza în soluţie, în care migrarea particulelor se desfăşoară în soluţie.
Acest sistem, elaborat de Tiselius, având o putere de rezoluţie redusă şi un
consum mare de materiale, nu se mai foloseşte în scopuri analitice, ci doar în
măsurători de mobilitate electroforetică.
- electroforeza zonală, în care soluţia apoasă, conţinând particulele încărcate
electric, este aplicată pe un material sau o matrice solidă. În urma electroforezei
zonale se obţin electroforegrame în care particulele încărcate electric, de obicei
proteine, sunt net delimitate între ele sub forma unor benzi.
Electroforeza zonală este cea mai răspândită tehnică de electroforeză în
biochimie, fiind utilizată îndeosebi la analiza proteinelor din ser, urină, fluid
cerebrospinal, ca şi a proteinelor din eritrocite şi ţesuturi .
În funcţie de materialul solid utilizat există următoarele variante:
a. Electroforeză pe hârtie de filtru. Este o tehnică tot mai puţin folosită datorită
rezoluţiei scăzute şi a timpului foarte lung necesar separării. De asemenea separarea
electroforetică este asociată cu un efect cromatografic datorat adsorbţiei moleculelor de
către grupările hidroxil ale celulozei, efect ce scade viteza de migrare şi afectează
separarea particulelor.
b. Electroforeză pe acetat de celuloză. Metoda prezintă îmbunătăţiri faţa de
cea precedentă, deoarece în acetatul de celuloză majoritatea grupărilor hidroxil au fost
acetilate, reducându-se astfel adsorbţia moleculelor pe suportul electroforetic, ceea ce
permite o rezoluţie şi o viteză de migrare superioară. În plus, acetatul de celuloză mai
prezintă şi alte avantaje ca:
 necesită cantităţi mai mici de material de analizat;
 este transparent, ceea ce permite cuantificarea directă prin spectrofotometrie a
benzilor electroforetice separate;
 se dizolvă în diferiţi solvenţi, ceea ce permite o uşoară şi rapidă izolare a benzilor
electroforetice separate.
 Figura 27. Schema generală a unui aparat de electroforeză verticală în gel

c. Gel electroforeza. Este cea mai răspândită formă de electroforeză care

utilizează geluri ca material suport. Figura 27 redă schema unui aparat folosit pentru
gel-elctroforeză verticală.
Gelurile folosite sunt inerte din punct de vedere chimic, au structuri uniforme, se
prepară rapid şi reproductibil. Gelurile cele mai folosite, care îndeplinesc aceste condiţii,
sunt cele de poliacrilamidă, ele având în plus şi avantajul de a putea fi modificate
controlat pentru a realiza o separare optimă a componentelor urmărite. Gelurile de
poliacrilamidă rezultă prin polimerizarea acrilamidei (monomer) şi a N,N–metilen–bis–
acrilamidei (agent de reticulare). Cei doi polimerizează în prezenţa unui sistem
generator de radicali liberi (persulfat de amoniu – iniţiator de radicali şi N,N,N’,N’-
tetrametilendiamina, TEMED - un catalizator). Concentraţia de poliacrilamidă utilizată
determină lungimea lanţului de polimer, în timp ce concentraţia de N,N–metilen–bis-
acrilamidă determină gradul de reticulare. Ambele concentraţii decid astfel proprietăţile
fizice ale gelului, precum densitatea, elasticitatea, rezistenţa mecanică şi dimensiunea
porilor. Alegerea condiţiilor în care se desfăşoară electroforeza (pH, forţă ionică,
dimensiuni pori, gradient de potenţial, timp de desfăşurare) se face în funcţie de
caracteristicile particulelor de separat (pH izoelectric, mărimea moleculei, mărimea
sarcinii etc.). O variantă foarte folosită, atât la separarea proteinelor cât şi a acizilor
nucleici, este SDS-PAGE electroforeza. Această variantă separă particulele (proteine
şi acizi nucleici) pe baza mărimii lor pe un gel de poliacrilamidă reticulată, în prezenţa
dodecilsulfatului de sodiu (SDS) şi a unui agent reducător ca -mercaptoetanolul. SDS
denaturează structura proteică, iar agentul reducător rupe punţile disulfidice, forma
tuturor moleculelor devenind o baghetă. De asemenea, SDS formează cu proteinele
micele încărcate negativ, pierzându-se astfel încărcarea electrică proprie a moleculei.
Micelele SDS-proteină vor migra la polul pozitiv, porii gelului de poliacrilamidă acţionând
ca o sită moleculară care va separa proteinele pe baza mărimii lor. Moleculele mici vor
migra mai repede decât cele mari.
d. Focalizarea izoelectrică. Este electroforeza în gradient de pH şi reprezintă o
metodă destinată fracţionării speciilor moleculare care diferă strict prin sarcina netă.
Proteinele migrează prin gradient atâta vreme cât deţin o sarcină electrică, iar când
ajung în punctul în care valoarea pH-ului gradientului este egală cu valoarea pH-ului lor
izoelectric (pI), punct în care sarcina particulei devine zero, migrarea încetează şi
speciile moleculare se separă sub forma unor benzi de precipitare distincte. Gradientul
de pH se stabileşte cu ajutorul unui amestec de substanţe amfotere cu masă mică (acizi
poliamino-policarboxilici sau amfoliţi).
e. Electroforeza capilară. În această metodă migrarea particulelor are loc în
tuburi capilare foarte înguste (diametru 0,05–0,3 mm) umplute fie cu o soluţie, fie cu un
material solid. Nu există pericol de supraîncălzire şi din acest motiv se pot utiliza
tensiuni mari
(10 kV), tensiuni ce pot creşte semnificativ viteza de migrare a particulelor.
Aplicaţie practică
Gel electroforeza proteinelor serice
O tehnică curentă de separare a fracţiunilor proteice din ser şi urină o reprezintă
electroforeza pe gel de agaroză în tampon alcalin (pH 8,8). Pentru rapiditatea şi
reproductibilitatea determinărilor se utilizează un set complet de reactivi şi materiale
numit kit. Kit-ul pentru electroforeză poate fi utilizat în condiţiile în care se foloseşte şi
un aparat semiautomat de electroforeză, de exemplu tipul HYDRASYS System SEBIA,
PN 1210 aflat în exploatare curentă la Laboratorul Central al Spitalului Clinic Judeţean
nr.1 Timişoara.

Principiul
Metoda se bazează pe principiul electroforezei zonale folosind un mediu suport
adecvat. Un astfel de mediu suport versatil este agaroza. Pentru diagnosticul de rutină,
proteinele serice se separă în 5 fracţiuni în acord cu sarcina lor la un pH dat: albumină,
1-globuline, 2-globuline, -globuline şi -globuline. Profilul proteinelor urinare urmează
pe cel din ser deşi intensităţile relative sau prezenţa fracţiunilor poate varia în funcţie de
capacitatea de filtrare a rinichiului.
Compoziţia kit-ului pentru electroforeză
Reactivi
1. Gelul de agaroză - Gelul de agaroză este gata preparat. Fiecare gel conţine:
agaroză, 0,8 g/dL, tampon Tris-barbital pH 8,8±0,1, aditivi, nepericuloşi la concentraţiile
folosite, necesari pentru o performanţă optimă. Se păstrează în poziţie orizontală, în
ambalajul de protecţie original la temperatura camerei; nu se congelează; se aruncă
atunci când apar cristale sau precipitat pe suprafaţa gelului sau suprafaţa devine foarte
moale.
2. Strip-urile tampon (benzi de hârtie îmbibate cu soluţie tampon). Sunt gata
preparate, conţin tampon Tris-barbital pH 9,0±0,3, azidă de sodiu, aditivi. Se folosesc
ca tampon pentru electroforeză şi asigură contactul între electrozi şi gel. Se păstrează
la temperatura camerei sau la rece. Nu se congelează.
3. Colorantul amidoblack - Colorantul este livrat sub formă de soluţie stoc (100
mL). Înaintea analizei soluţia stoc se diluează la 300 mL cu apă distilată sau deionizată.
După diluţie soluţia de colorare conţine 0,4 g/dL colorant amidoblack în acid acetic 10%.
Se păstrează la temperatura camerei sau la rece în recipiente închise. Soluţia de lucru
este stabilă 1 an.
 4. Aplicatoarele (dispozitive de aplicare a probelor, de unică folosinţă).
5. Hârtie de filtru.
6. Soluţie de decolorare - Se livrează sub formă de soluţie stoc care după diluţie
la soluţie de lucru va conţine acid citric 0,05 g/dL.
7. Soluţie de spălare - Se livrează sub formă de soluţie stoc care după diluţie la
soluţie de lucru va conţine tampon alcalin pH 8,8. Soluţia este utilizată pentru spălarea
cuvei de colorare.
8. Fluidil - Soluţie de diluţie a probelor ce prezintă turbiditate.
Materiale
1. Sistem de electroforeză HYDRASYS System SEBIA.
2. Micropipetor manual sau automat.
3. Cameră umedă, tip HYDRASYS.
4. Pipete de 10 L şi 200 L.
5. Densitometru/scanner capabil să scaneze geluri de 82x102 mm sau 82x51 mm
la 570 nm (filtru galben). Se folosesc tipurile HYRYS SEBIA.
6. Suport pentru geluri tip SEBIA.
Probe pentru analiză
1. Colectarea şi conservarea probelor
Se recomandă pentru analiză folosirea de probe de ser proaspăt. Colectarea
probelor de ser şi urină se face după metode standard folosite în laboratoarele clinice
de testare.
Probele pot fi refrigerate (2–8˚C) imediat după colectare şi în acest caz pot fi
utilizate maximum o săptămână.
Pentru o stocare mai îndelungată (maximum o lună) probele pot fi congelate,
adăugându-se în acest caz azidă de sodiu 0,02 g/dL la probele de ser sau 0,02 g/dL
azidă de sodiu în tampon HEPES 0,1M (pH 6,75) în cazul probelor de urină.
2. Pregătirea probelor pentru analiză
Probele de ser nu se diluează. În cazul probelor conservate prin refrigerare sau
congelare, unele seruri (în special cele ce conţin crioglobulină sau criogel) pot deveni
vâscoase sau turbidiscente. În acest caz se adaugă 25 L fluidil la 75 L ser şi se
vortexează (agitare energică prin vibraţie pe un aparat tip VORTEX ) 15 secunde.
Nu se folosesc seruri hemolizate şi nici probe de plasmă (fibrinogenul
interferează cu banda imunoglobulinelor).
Probele de urină trebuie concentrate astfel încât conţinutul proteic să fie de
aproximativ 1,5–2 g/dL. Concentrarea se face cu un dispozitiv special care evaporă
probele de urină. În cazul în care urina conţine cantităţi mari de săruri, care produc
distorsiuni în timpul migrării electroforetice, probele de urină trebuie mai întâi dializate
pentru îndepărtarea sărurilor. Se evită probele vechi de urină sau probele conservate
necorespunzător.
Modul de lucru
Sistemul HYDRASYS este un sistem semiautomat. Etapele automatizate cuprind
procesarea gelurilor de agaroză (HYDRAGEL), în următoarea secvenţă:
- aplicarea probelor;
- migrarea electroforetică;
 - uscarea gelurilor;
- colorarea gelurilor;
- decolorarea gelurilor;
- uscarea finală a gelurilor.
Etapele manuale constau în mânuirea probelor şi gelurilor şi programarea
instrumentului pentru operare. Gelurile obţinute (Figura 28) se interpretează fie prin
citire directă, fie se scanează şi se calculează automat, utilizând programe speciale de
integrare şi comparare.

Figura 28. Electroforeza pe gel a proteinelor serice, probe recoltate de la opt

pacienţi

În tabelul 5 sunt redate limitele valorilor normale şi în paralel valorile unei

proteinograme electroforetice.

Tabelul 5. Valorile absolute şi relative ale proteinelor serice

Limitele Valori absolute în
Fracţiunea Valori
valorilor % la o proteinemie
proteică determinate în %
normale în % de 7 - 9 g %
Serum albumine 50 - 60 4,5 - 5,5 58,0
Serum globuline 1 4-7 0,3 - 0,8 4,0
Serum globuline 2 6 - 12 0,48 7,0
Serum globuline  9 - 12 0,55 - 1,11 14,0
Serum globuline  13 - 23 0,64 - 1,28 17,0
Prin integrare se obţin valori relative. Pentru obţinerea valorilor absolute se
determină cantitativ concentraţia proteinelor totale ale serului sanguin apoi se
raportează la fiecare fracţiunea serică.
De exemplu: avem 8 grame proteine totale la 100 ml ser şi 58,0 % albumine:

8 grame .......... 100 %

x grame .......... 58 %

8⋅58 464
= =4,64 grame/100 ml ser
x (grame albumine) = 100 100

În acest caz se obţin următoarele valori în grame: albumine=4,64; globuline

1=0,32; globuline 2=0,56; globuline =1,12; globuline =1,36.
 Aplicaţie practică
Interpretarea Electroforezei (ELFO) proteinelor serice:

1. Modificări ale albuminelor serice:

2. Modificări ale alfa-1-globulinelor

3. Modificări ale alfa-2-globulinelor

4. Modificări ale beta-globulinelor

5. Modificari ale gama-globulinelor
6. Prezenţa fibrinogenului
 II. DIALIZA
Osmoza reprezintă procesul de difuziune a uneia sau mai multor substanţe
(dintr-o soluţie) printr-o membrană semipermeabilă sau permeabilă.
Presiunea osmotică reprezintă presiunea care trebuie aplicată unei soluţii
pentru a împiedica trecerea solventului (din mediul exterior) prin membrana
semipermeabilă.
Dializa este o metodă de separare a unui amestec de substanţe pe baza
capacităţii diferite de difuzie a componentelor amestecului printr-o membrană
semipermeabilă.
Membranele reprezintă structuri ce delimitează două compartimente (sau mai
multe). Simplist, membrana se poate imagina ca o suprafaţă - barieră la interfaţa dintre
două lichide. De asemenea, membrana este şi o punte de legătură între
compartimentele fazelor pe care le separă (datorită permeabilităţii sale); este totodată şi
sediul unor activităţi complexe legate de fenomenele de transport. În figura 4 se redă
schematizat principiul procesului de dializă.
Fenomenele de transport prin membrană depind de permeabilitatea membranei,
de capacitatea de difuzie a substanţelor prin membrană sau de alte forţe de natură
fizică (gradient electrochimic, gradient de presiune osmotică, gradient de presiune
hidrostatică) şi de temperatură. Viteza procesului de dializă este cu atât mai mare cu
cât temperatura este mai ridicată. La temperaturi ridicate, vâscozitatea solventului este
mică şi viteza de difuzie este crescută. Din păcate, dializa soluţiilor de proteine cu
activitate biologică (enzime, anticorpi, hormoni), soluţiilor de acizi nucleici, etc. trebuie
realizată la temperaturi de 4ºC pentru a evita denaturarea acestora.
Materialele folosite pentru confecţionarea membranelor de dializă trebuie să fie
sub formă de film, sau substanţe cu grad ridicat de polimerizare, care în prezenţa
solvenţilor se umflă, transformându-se în site moleculare ai căror pori permit trecerea
soluţiilor şi solvenţilor cu masă moleculară mică, împiedicând trecerea componenţilor cu
masă moleculară mare (de exemplu proteine).

Membrană

În interiorul sacului În exteriorul sacului

de dializă de dializă

Figura 4. Redarea principiului dializei

 Membrana trebuie să fie inertă din punct de vedere chimic pentru a nu provoca
legarea componenţilor de membrană. În prezent, membranele sunt confecţionate din
celofan (celuloză) prelucrat prin procedee speciale.
Metoda dializei, aplicată volumelor de 1-100 mililitri, presupune următorul mod de
lucru:
- Soluţia de dializat este închisă într-un săculeţ, confecţionat din materialul cu
proprietăţi de membrană semipermeabilă, suspendat într-un volum mult mai mare de
solvent, într-un recipient menţinut la temperatura dorită (Figura 5).
- Dializa, fiind un proces de difuziune controlată, trecerea substanţelor dializabile
din sac în solvent duce la creşterea concentraţiei acestora în exterior.
- Este necesară agitarea pentru a disipa difuzatul în solvent, reducând
concentraţia acestuia pe suprafaţa externă a membranei.

Figura 5. Principiul de funcţionare al dializorului

În prezent sunt disponibile mai multe variante ale tehnicii de dializă:

- cu dializor înclinat;
- cu dializor rotativ;
- dializa în contracurent (pentru volume mari de probă);
- dializa pentru volume mici de probe.

Dezavantajele acestei tehnici sunt:

- timpul relativ lung de stabilire a echilibrului între cele două faze;
- nu se poate aplica în cazul în care liganzii (grupările prostetice) la proteine sunt
macromolecule.

Dializa este o tehnică simplă utilizată în special în studiul proteinelor: la

demonstrarea naturii macromoleculare a proteinelor, la determinarea şi compararea
proprietăţilor de difuzie a proteinelor, pentru studiul reacţiilor de complexare a proteinelor
cu diferiţi liganzi, pentru separarea macromoleculelor, pentru separarea contaminanţilor
cu masă moleculară mică de proteine, acizi nucleici, polizaharide, etc.
 Efectul de dializă a fost folosit pentru realizarea unui dispozitiv extracorporal,
numit „rinichi artificial”, folosit pentru purificarea sângelui de compuşii cu masă
moleculară mică, ce sunt în mod normal excretaţi în urină.

Figura 6. Schema circuitului sanguin în hemodializă

 Figura 7. Schema în dializa peritoneală

Combinaţia de lactat cu bicarbonat (ca soluţie tampon) se consideră a fi cea mai

potrivită, deoarece astfel se previne pierderea HCO 3- (se evită creşterea pCO2) în
lichidul de dializă, ceea ce ar putea determina acidoză intracelulară şi vasodilataţie în
timpul dializei.

Tabelul 1. Compoziţia soluţiei de dializă cu bicarbonat:

Na+ 140 mmol/l 136-142mmol/l (valoare cât mai apropiată de cea
plasmatică a pacientului)
Ca ++
1,5mmol/l 0,5-1,75mmol/l (valoare cât mai apropiată de cea
plasmatică a pacientului)
Mg ++
1mmol/l 0.5-1mmol/l (valoare cât mai apropiată de cea plasmatică
  a pacientului)
Cl         109mmol/l 
- 
 (valoare cât mai apropiată de cea plasmatică a
pacientului)
lactat   15mmol/l   soluţie tampon
HCO3-   25mmol/l soluţie tampon
  28-40mmol/l
Glucoză agent osmotic
15-42,5 g/l
pH 7.0-7.6
 Aplicaţie practică
Dializa cu cernere moleculară a unui amestec de proteină şi sulfat de
amoniu

Principiu
În sacul de dializă (MW/CO = 1000; MW–molecular weight; CO–cut off  sunt
lăsate să treacă prin porii membranei doar molecule cu masa moleculară mai mică de
1000 Da) se introduce un amestec de proteină (albumină) şi sulfat de amoniu. În urma
imersării sacului de dializă într-o cantitate mare de apă distilată (solventul), membrana
din care este confecţionat sacul de dializă va permite schimbul de substanţe între cele
două faze (amestecul de dializat şi solvent), doar componenţii cu masă moleculară mai
mică de 1000 Da din amestecul de dializat (ionii SO 42- M = 96 şi NH 4+ M = 18) vor trece
din sacul de dializă în apa din recipientul exterior, iar apa din exterior va trece în sacul
de dializă. Albumina (M = 47000 Da) va rămâne în sacul de dializă. Se spune că soluţia
de proteină a fost dializată contra apei.
Prezenţa ionilor NH4+ se pune în evidenţă cu reactivul Nessler; ionii SO 42- se
identifică cu clorură de bariu; proteina se pune în evidenţă cu reactivul Coomassie
(CBB).

Reactivi şi materiale
 Membrană semipermeabilă (MW/CO = 1000);
 Pahar Berzelius de 400 mililitri;
 Cleme de etanşare şi de susţinere;
 Baghetă de sticlă; baghetă magnetică;
 Apă distilată;
 Agitator magnetic;
 Pipete; eprubete;
 Soluţie 1% de albumină cu conţinut de sulfat de amoniu. Se dizolvă 1 gram
proteină în 100 ml apă distilată la care se adaugă puţin câte puţin 10 grame
sulfat de amoniu;
 Soluţie CBB: 60 mg Coomassie Brilliant Blue G250 se dizolvă într-un litru acid
percloric 3% şi se filtrează pentru îndepărtarea colorantului nedizolvat;
 Reactiv Nessler - într-o cantitate mică de apă se dizolvă 50 grame KI; se adaugă
o soluţie saturată de HgCl 2 până la formarea unui precipitat. Se adaugă 200
mililitri soluţie NaOH 5 N şi se diluează la 1000 mililitri. Se lasă să se depună şi
se separă lichidul limpede;
 Soluţie 5% BaCl2. Se dizolvă 5 g clorură de bariu în 95 ml apă distilată.

Mod de lucru
1. În săculeţele de dializă se introduce soluţia de albumină+sulfat de amoniu. Se
sigilează la capăt şi se păstrează, cufundate în soluţia de proteină–sulfat de
amoniu, în frigider, până în momentul utilizării.
2. Se scote săculeţul de dializă din frigider şi se spală la exterior cu piseta, cu apă
distilată.
 3. Într-un pahar Berzelius se introduc 600 ml apă distilată. Se introduce săculeţul de
dializă (săculeţul flotează!!) şi o bară magnetică. Se aşează paharul pe un
agitator magnetic şi se porneşte agitarea, cu o turaţie medie (3 sau 4).
4. Se introduc în trei eprubete câte 1 ml apă distilată şi se testează prezenţa ionilor
NH4+ cu reactiv Nessler, a ionilor SO 42- cu clorură de bariu, prezenţa proteinei cu
reactiv CBB.
5. Se introduc în trei eprubete câte 1 ml din soluţia de dializat iniţială şi se testează
prezenţa ionilor NH4+ cu reactiv Nessler, a ionilor SO42- cu clorură de bariu,
prezenţa proteinei cu reactiv CBB.
6. Din oră în oră se iau probe din săculeţul de dializă, se introduc în trei eprubete şi
se testează prezenţa ionilor NH4+ cu reactiv Nessler, a ionilor SO42- cu clorură de
bariu, prezenţa proteinei cu reactiv CBB.
7. Din oră în oră se iau probe şi din apa în care s-a realizat dializarea, se introduc în
trei eprubete câte 1 ml şi se testează prezenţa ionilor NH 4+ cu reactiv Nessler, a
ionilor SO42- cu clorură de bariu, prezenţa proteinei cu reactiv CBB.

Identificarea ionului amoniu NH4+

În eprubeta cu soluţie de analizat se adaugă 1-2 picături de reactiv Nessler.
Ionul NH4+ în prezenţa reactivului Nessler formează un precipitat galben-
portocaliu.

Identificarea ionului sulfat SO42-

În eprubeta cu soluţie de analizat se adaugă 2-3 picături de soluţie de clorură de
bariu. Apariţia unui precipitat alb indică prezenţa ionilor SO42-.

Identificarea proteinelor
În eprubeta cu soluţie de analizat se adaugă 1 ml reactiv CBB. Se constată
apariţia unei coloraţii violete, coloraţie ce se intensifică pe măsura trecerii
timpului de reacţie.