Electroforeza

• Electroforeza este o metodă analitică şi preparativă de

separare a particulelor sau ansamblurilor de particule
încărcate electric, sub acţiunea unui câmp electric
uniform aplicat din exterior.
• Metoda are la bază fenomenul fizico-chimic de
deplasare sau migrare diferenţială a diferitelor specii
de particule într-un câmp electric. Deplasarea se face
spre unul din electrozi, fără ca între aceştia şi
componentele separate să aibă loc reacţii. Particulele
pot fi: ioni simpli, macromolecule, coloizi sau particule
de substanţe, agregate macromoleculare, organite
celulare, celule vii sau materiale inerte (emulsii de
ulei).
Definiţii
• Mobilitatea electroforetică – viteza cu care se
deplasează particulele purtătoare de sarcini electrice,
în câmp electric în condiţiile experimentale date:

• În care d- distanţa de migrare parcursă în timpul t (m)

• E – gradientul de potenţial (V/m)
• T – timpul (s)
• – mobilitatea electroforetică (m2/Vs)
Mobilitatea electroforetică depinde:
• Particulă (mărime, natură, formă, sarcină,
gradul de hidratare şi disociere, coeficientul de
frecare)
• Soluţia de electrolit (natură, concentraţie,
forţă ionică, pH, viscozitate, temperatură)
Clasificarea metodelor de electroforeză
În funcţie de mediul în care se efectuează
separarea, metodele de electroforeză sau
electroforetice se împart în două clase:
• Electroforeza în mediu liber
• Electroforeza în mediu stabilizat.
 Electroforeza în mediu liber

• Este cea mai veche metodă şi a fost introdusă de

Tiselius, în 1937, pentru separarea proteinelor serice.
Ulterior, s-au adus îmbunătăţiri atât metodei cât şi
aparaturii folosite. Este utilizată în principal pentru
unele studii fundamentale privitoare la natura şi
puritatea proteinelor.
• Principiul de funcţionare: migrarea proteinelor într-o
soluţie tampon de electroliţi, într-un aparat cu o celulă
în formă de U din sticlă transparentă astfel încât să se
poată observa migrarea proteinelor cu un
spectrometru/spectrofotometru.
Factori care influenteaza electroforeza

Natura moleculelor separate

– Marimea moleculelor
– Mobilitatea
– Natura
– Sarcina
Aparatura
– suportul
Curentul electric
Deplasarea electroforetica este proportionala cu
• Mobilitatea
• Campul electric
• Timpul de trecere a campului electric
pH - ul
In cazul acizilor si bazelor tari (electroliti tari) pH-ul nu influenteaza migrarea
Natura solutiei
• natura sarurilor
• natura acizilor
• natura bazelor
• natura altor substante
 Electroforeza capilara
• Electroforeza capilară, numită datorită performanţelor sale şi
electroforeză capilară de mare performanţă (HPCE – high
performance capillary electrophoresis), realizează separarea
electroforetică pe o capilară foarte îngustă (din silice sau teflon, cu
diametrul între 25 şi 75 μm, iar lungimea cuprinsă între 10 şi 80
cm), în care se găseşte o soluţie tampon. Utilizarea capilarei are
multe avantaje, dar primul şi cel mai important este înlăturarea
efectului Joule de încălzire. Rezistenţa electrică mare a capilarei
permite aplicarea unui potenţial electric foarte mare (între 100 şi
500 V/cm), cu generarea unei cantităţi minime de căldură. In plus,
datorită raportului mare suprafaţă/volum în cazul capilarei, are loc
o disipare eficientă a căldurii care este generată la transportul
speciilor încărcate prin mediul lichid.
• Contraionii, dispuşi în straturi lângă suprafaţa internă a
capilarei de cuarţ, vor genera un potenţial, denumit
potenţial zeta ξ pentru a egaliza sarcina suprafeţei,.
Contraionii din stratul rigid (Stern), la aplicarea
potenţialului E, se vor deplasa către catod. Această
migrare în câmp electric va atrage după sine deplasarea
ionilor electrolitului, din straturile difuze, dar şi a
moleculelor de apă care hidratează ionii. In consecinţă,
va apărea în interiorul coloanei o deplasare de la anod
către catod, cunoscută sub numele de migrare
electroosmotică, sau electroendosmotică. Viteza de
deplasare electroosmotică este dependentă de
mobilitatea electroosmotică a ionilor din electrolitul
suport, potenţialul zeta ξ generat la interfaţa
capilară/electrolit suport, constanta dielectrică ε,
vâscozitatea electrolitului suport η şi câmpul aplicat.
Avantajele electroforezei capilare:
• timpi de analiza relativ scurti;
• volume mici de proba;
• cantitati mici de solventi (tampon);
• posibilitatea automatizarii intregului ciclu de
analiza;
• poate opera atat in medii apoase cat si in medii
neapoase;
• detectia se face in capilar (UV);
• sensibilitate inalta.
• Instrumentaţie
• Instalaţia implică un capilar ce trece prin
instalaţia optică a unui detector, un dispozitiv
de introducere a probei şi o sursă de voltaj
înalt.
• Capilarul umplut cu tampon are capetele
introduse în rezervoarele tampon. Electrozii
fabriocaţi dintr-un material inert (Pt) sunt
introduşi în tampon pentru a completa circuitul
electric. La un capăt al capilatului se injectează
proba, apoi se aplică tensiunea. Ionii probei se
deplasează spre electrodul corespunzător, trecând
prin detectorul ce răspunde cu o înregistrare a
componenţilor separaţi în funcţie de timp –
respectiv cu o electroforegramă.
Etapele analizei
Injectarea probei
• Proba nu este mai mare de 100 nl (10 – 20 μl în
HPLC), introducerea se face hidrodinamic sau
electrocinetic.
Condiţiile de separare
• Capilarul este confecţionat din silice topită, inert
chimic, transparent pentru spectrul UV şi vizibil.
Flexibil, robust şi ieftin. Tensiunea câmpului şi
amperajul V 10 – 30 kV, 100 – 500 V/cm, A până la
300 μA.
• Detecţia
• Absorbţia în UV-VIS este cea mai frecventă, se desfăşoară în domeniul sub
200 nm până la vizibil. Timpul de răspuns trebuie să fie scurt (până la 0,5
s, pentru a evita peak-urile largi, distorsionate). Analitul, trecând prin sursa
de lumină, absoarbe radiaţia UV, ce se transformă în semnal şi evaluarea
cantitativă se face prin calibrare,
• Fluorescenţa clasică şi cea indusă cu laser au ca avantaj limita de detectare
extrem de joasă. Moleculele se marchează cu fluoruri ce sunt excitaţi de
sursa de lumină. Analiţii, trecând prin fereastra detectorului, determină
excitarea fluorurilor ce emit radiaţii de o anumită lungime de undă. În
cazul fluoroforilor excitaţi de laser, sensibilitatea creşte semnificativ. Din
nefericire, prin laser se limitează lungimile de undă pentru excitare la un
număr mic de valori în domeniul vizibil.
• Spectrometria de masă, importantă prin sensibilitate, selectivitate şi
universabilitatea sa, furnizează informaţii asupra greutăţii moleculare şi a
structurii solvitului – date utile identificării sale. Pentru a obţine acestea,
electroforeza capilară se cuplează cu ionizarea prin electropulverizare şi cu
desorbţia cu laser a matriţei asistate.
• Tipurile de electroforeză capilară
• Electroforeza capilară zonală este cea mai
utilizată, datorită simplităţii şi versatilităţii
sale. Capilarul se umple cu tampon şi solviţii
migrează în zone discrete, cu viteze diferite.
Fluxul electroosmotiv influenţează timpul de
migrare şi rezoluţia.
• Electroforeza capilară în gel
• Termenul de gel nu este foarte potrivit, acesta implicând o
structură oarecum solidă. Ori, multe din „gelurile” folosite
nu posedă această proprietate, un termen mai potrivit ar fi
„reţea de polimeri”.
• Deşi există o identitate a mecanismului de separare capilară
cu cel al electroforezei clasice în gel, câmpul electric folosit
în primul caz este de 10 – 100 ori mai intens şi aparatura
este automată. Posibilitatea în electroforeza clasică de a
separa concomitent mai multe probe este compensată în
electroforeza capilară în gel cu timpul scurt necesar
separării unei singure probe.
• Focalizarea capilară izoelectrică
• Moleculele au şi grupări acide şi bazice. La un anumit pH
(punct izoelectric), încărcătura lor electrică se echilibrează şi
ele devin neutre. Gradientul de pH formează cu ajutorul
unei soluţii de amfoliţi, ce posedă şi grupare acidă şi bazică
un punct izoelectric de-a lungul unui domeniu larg. Când se
aplică câmpul electric, amfoliţii formează un gradient de pH,
analiţii migrează prin mediu, până ajung într-o zonă când
devin neîncărcaţi atingând propriul lor punct izoelectric.
Pentru a detecta substanţele separate, zonele sunt
mobilizate (prin aplicarea unei presiuni capilarului sau
adăugarea unei sări la unul din rezervoare) şi trec prin
detector, care îi înregistrează în funcţie de timp.
• Izotacoforeza capilară
• Izotacoforeza capilară analizează fie anioni, fie
cationi. Toate zonele separate se deplasează
cu aceeaşi viteză, folosind două sisteme
tampon: în frunte un electrolit cu un ion de
mobilitate mai mare ca a solviţilor, în urmă un
electrolit cu o mobilitate mai mică faţă de a
lor.