Analiză Instrumentală

Curs 7 – sem 2
 CROMATOGRAFIA DE LICHIDE
• În cadrul cromatografiei in lichide (LC) se
disting mai multe variante, în functie de
mecanismele de separare, astfel există :

- cromatografia de lichide pe coloana inchisa;

- cromatografia de lichide pe coloana deschisa;
 CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE
INALTA PERFORMANTA (HPLC)
• Cromatografia de lichide de înaltă performanţă
( engl. HPLC - High Performance Liquid
Chromatography ) cunoscută în literatură şi sub
denumirea de cromatografie de înaltă presiune
(High Pressure Liquid Chromatography) este metoda
cromatografică cea performantă şi este folosită în
separarea şi identificarea calitativă şi cantitativă a
substanţelor din amestecuri lichide. Separări şi
analize de substanţe imposibul de realizat prin alte
metode pot fi realizate uşor prin HPLC.
• Pe de altă parte la această tehnică pot fi
făcute şi multe greşeli. Acesta este motivul
pentru care este nevoie de o experienţă
practică bogată dar şi de cunostiinţe
stiinţifice fundamentale. Avînd în vedere că
atît în cromatografia de gaze (GC) cît şi in
cromatografia de lichide HPLC starea de
agregare iniţială a probelor este cea lichidă
trebuie luată decizia asupra metodei
cromatografice folosite pentru acel amestec.
 In acest scop trebuie avute în
vedere următoarele:
• la cromatografia de gaze proba trebuie adusă în stare
gazoasă prin încălzire fără ca această operaţie să ducă la
distrugere integrităţii moleculare a speciei anlizate , in
practică numai cca 20 % din speciile moleculare
îndeplinesc această condiţie
• la cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai
mare şi au limite de detecţie mai bune decît la
cromatografia de lichide
• comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile
au o comportare cromatografică necorespunzătoare în
gazcromatografie ca urmare analiza lor trebuie făcută in
cromatografie lichidă
• în cromatografia de gaze există numai o singură fază
staţionară care poate interacţiona cu moleculele probei , faza
solidă sau faza lichidă, cu aceasta fază poate absorbi proba
gazoasă în orice raport
• în HPLC atît faza staţionară cît şi cea mobilă pot interacţiona
mai selectiv cu proba . Multitudinea acestor interacţiuni
selective face cromatografia HPLC multilaterală faţă de
cromatografia de gaze cu ea putînt fi rezolvate probleme de
separare avansată deosebit de complexe.
• În situaţiile în care ambele metode pot fi aplicate decizia este
pentru gazcromatografie aceste analize au sensibilitate mai
mare şi sînt mai rapide, iar dacă este vorba de determinări
curente la anumite clase de compuşi trebuie avut in vdere că
un gazcromatograf este sensibil mai ieftin decît un
cromatograf pentru HPLC.
• La cromatografia HPLC faza mobilă purtătoare
denumită "Eluent" împreună cu substanţele
lichide de analizat este pompată cu ajutorul
unei pompe printr-o coloană cromatografică
de separare ce conţine faza staţionară. În mod
obişnuit înaintea coloanei de separare
propriu zise se cuplează o pre - coloană de
separare pentru reţinerea impurităţilor,
coloană care este sensibil mai ieftină decît
coloana de bază. O coloană de separare într-
un cromatograf HPLC are lungimea cuprinsă
între 5 şi 30 cm iar debitul de fază mobilă este
cuprins între 1-5 ml/min.
 Aparatura folosită în
cromatografia HPLC
• Cromatografele de lichide de înaltă
performanţă sînt formate dint-un sistem de
vase cu solvenţi (1) , o pompă de înaltă
presiune (3), o coloană cromatografică (6),
unul sau mai mulţi detectori (8), şi un sistem
de prelucrare a datelor (9), ele mai sînt
completate cu elemente de reglare automată
a debitului , a presiunii şi a temperaturii. In
figura 1 este reprezentată schema de
principiu a unui cromatograf de lichide.
• Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 7,8- recipiente cu solvent, 9-
filtru, 10-pompă cu sistem de gradient, 11-sistem de măsurare a presiunii şi a
debitului, 12-sistem de introducere probă, 13,14-injector, 15-precoloana
cromatografică, 16, 17 regulatoare de presiune si debit, 18-coloană
cromatografică, 19- incinta de termostatare a coloanei, 20-detector, 21-
preamplificator electronic, 22-sistem de achiziţie şi prelucrare date, 23-calculator
electronic
• Trebuie avut în vedere că în HPLC se
folosesc solvenţi organici puternici sau
soluâii tampon care pot ataca chimic orice
componentă ce se găseşte în traseul lor de
la recipientele de stocare pină la detector ,
ca atare toate materialele folosite pe acest
traseu trebuie să prezinte o rezistenţă
chimică corespunzătoare.
• O altă recomandare este aceea ca volumul
mort , denumit şi volum extracolumnar, între
introducerea probei şi traversarea detectorului
să fie menţinut cît mai mic posibil prin
aceasta evitîndu-se o lăţire de bandă (vezi şi
cap). Reducerea volumului mort se realizează
în primul rînd prin măsuri constructive ale
furnizorului de cromatograf şi prin de alegerea
corespunzătoare a coloanei cromatografice. In
continuare vor fi descrise pe rînd elementele
componente ale unui cromatograf de tip HPLC