CROMATOGRAFIA DE

LICHIDE PE COLOANĂ

CURS NR.
Prof. Dr. Daniela-Lucia MUNTEAN

1
APARATURA ÎN HPLC

2
În principiu un cromatograf de lichide este format din:
• pompă
• injector
• coloană cromatografică cu sau fără termostat
• detector
• sistem de achiziţie şi prelucrare a datelor (computer)

3
 1.REZERVOARELE DE SOLVENT ŞI
DEGAZAREA SOLVENTULUI

REZERVOARELE:
-sunt confecţionate din sticlă
- au capacitatea de minim 500 mL
- conductele de alimentare cu solvent spre
pompe sunt prevăzute cu filtre pentru prevenirea
intrării impurităţilor mecanice
DEGAZAREA: este necesară pentru că oxigenul sau
azotul dizolvate în faza mobilă afectează separarea
cromatografică( se poate face prin menţinerea fazei
lichide în baie cu ultrasunete, sub vid sau există
dispozitive moderne de degazare intercalate între 4
solvent şi pompă).
 2.POMPELE

Sunt elementele sistemului HPLC care determină vehicularea sub

presiune a fazei mobile în acesta.
Pot funcţiona la:
debit constant – în cazul pompelor actuale;
presiune constantă – se întâlnesc la primele sisteme HPLC
apărute pe piaţă; dau reproductibilitate slabă a timpilor de retenţie.
În funcţie de numărul de solvenţi pe care îi poate manipula o
singură pompă există:
pompe simple – faza mobilă este preluată dintr-un singur
rezervor;
pompe binare, ternare sau cuaternare – permit amestecarea
automată a doi, trei, respectiv, patru solvenţi aflaţi în rezervoare 5
diferite.
CARACTERISTICI ALE POMPELOR

Cele mai importante caracteristici ale unei pompe HPLC sunt

următoarele:
a) determină în sistem presiuni de până la 400 - 500 bari
(uzual 400 bari);
b) produc debite exacte şi precise pe domenii largi cuprinse
între 0,1 – 10,0 mL/min – acest domeniu diferă de la un
producător la altul;
c) debitul trebuie să fie practic fără pulsaţii şi să rămână
constant indiferent de compoziţia fazei mobile;
d) în cazul pompelor care permit amestecarea automată a
mai multor solvenţi, să aibă un volum intern mic, în aşa
fel încât să permită schimbarea rapidă a compoziţiei
solvenţilor; 6
e) trebuie să prezinte rezistenţă chimică faţă de fazele
mobile uzuale în HPLC.
 POMPE-CONTINUARE
Pompe
cu faza mobilă este împinsă cu
piston
ajutorul unui piston,
simultan cu închiderea şi
deschiderea valvelor de
acces şi evacuare a
solvenţilor
Pompe
tip În cazul pompelor tip
seringă seringă, solventul este
introdus într-un rezervor
mare şi deplasat constant,
ca în cazul utilizării unei
seringi, cu ajutorul unui
piston acţionat de un
motor . Prin presurizarea
rezervorului, faza mobilă
este deplasată cu un debit
predefinit spre coloană.
7
 3.ELUŢIA ÎN HPLC

În funcţie de compoziţia fazei mobile, eluţia în cromatografia de

lichide de înaltă performanţă poate fi:
 izocratică – compoziţia fazei mobile rămâne constantă pe
toată durata analizei;
 cu gradient de compoziţie – compoziţia fazei mobile
variază în timpul analizei.
Crearea gradientului de compoziţie a apărut din necesitatea
rezolvării separării amestecurilor complexe. Se poate face la:
 la presiune joasă – solvenţii sunt amestecaţi la presiune
joasă şi apoi sunt preluaţi de pompa de înaltă presiune;
 la presiune mare – fiecare solvent este preluat de câte o
pompă, amestecarea făcându-se la presiune mare într-un
mixer

8
 4.SISTEMUL DE INTRODUCERE A PROBEI

manual Cu ajutorul unei automat un sistem robotizat

seringi manipulate preia proba dintr-o
de analist fiolă de injectare şi
o introduce în
portul de injectare

9
Indiferent de modul de injectare, introducerea probei în
coloana cromatografică presupune două etape, încărcarea
buclei de injectare şi apoi injectarea probei în sistem, etapă
în care faza mobilă preia proba din bucla de injectare

Procesul de injectare are un rol important în

determinarea lăţimii totale a picului, fiind una din sursele
importante de variabilitate a analizei cromatografice.

Este important de menţionat faptul că injectoarele

automate sunt prevăzute cu camere în care pot fi
introduse zeci sau sute de fiole cu probe, camere a căror
temperatură poate fi controlată.
Controlul temperaturii este crucial în cazul probelor
termolabile.

10
5.COLOANELE ŞI PRECOLOANELE CROMATOGRAFICE

COLOANELE: tuburi confecţionate în special din oţel inoxidabil

în care se introduce faza staţionară
Dimensiuni: diametrul interior:1-8 mm
lungime : 3-30 cm
diametrul particulelor: 4-5µm
Cele mai multe aplicaţii HPLC folosesc în prezent coloane cu
următoarele dimensiuni:
diametru interior: 2-3 mm
lungime: 5-10 cm
diametrul particulelor: 3-3,5µm
Microcoloanele: diametru intern: 0,3; 0,5; 1mm
lungime: 3-25mm-se utilizează în cazul
cuplării HPLC cu SM
Pentru prelungirea timpului de viaţă a unei coloane aceasta se
protejează cu o precoloană de dimensiuni mici, montată 11
înaintea acesteia.
 6.DETECTORII

Detectorul este elementul esenţial al unui sistem HPLC şi permite

monitorizarea continuă a efluentului care părăseşte coloana prin
măsurarea unei proprietăţi a acestuia (absorbanţă, fluorescenţă, indice
de refracţie, unghi de rotaţie, conductanţă, potenţial de oxidare sau
reducere, etc.).
sensibilitate
zgomot de fond
limită de detecţie
Caracteristici stabilitate
linearitate
timp de răspuns optim
volum mic al celulei de măsură

12
CLASIFICAREA DETECTORILOR

1.Detectori care măsoară o proprietate specifică

analitului
• Detectorul spectrofotometric
• Detectorul de fluorescenţă
• Detectorii electrochimici
• Spectrometrul de masă
• Spectrometru RMN
• Spectrometru în IR

2.Detectori care măsoară o proprietate de volum

• Detectorul refractometric
• Detectorul de conductivitate
• Detectorul dielcometric
13
7.SISTEMUL DE CONTROL, ACHIZIŢIE ŞI PRELUCRARE A DATELOR

Sistemele HPLC actuale sunt, de regulă, controlate cu

ajutorul computerului. Softurile care însoţesc astfel de
echipamente sunt din ce în ce mai complexe, dar mai
uşor de utilizat, cu ajutorul lor urmărindu-se:

- controlul complet al analizei cromatografice

- achiziţia şi prelucrarea avansată a cromatogramelor
- validarea metodelor de analiză
- verificarea şi validarea funcţionalităţii componentelor
cromatografului
- diagnosticarea problemelor tehnice care pot să apară

14
 8.FAZE STAŢIONARE ÎN HPLC

O fază staţionară ideală trebuie să fie formată din

particule mici, cu mărime uniformă, poroase şi rigide,
iar materialul să aibă o puritate foarte mare şi să fie
inert chimic faţă de solvenţii folosiţi ca fază mobilă. Încă nu
există materialul care să îndeplinească în totalitate aceste
criterii, dar trebuie menţionat faptul că astăzi sunt disponibile
multe tipuri de umpluturi care soluţionează un număr foarte
mare de probleme de separare.

Fazele staţionare pot fi: solide,

lichide depuse pe un suport solid
faze legate chimic de un suport
solid.
15
FAZE STAŢIONARE-CONTINUARE
Materialele din care sunt confecţionate fazele staţionare se pot
clasifica în funcţie de:
a. Porozitate
Particule total poroase – aceste umpluturi sunt des utilizate
astăzi
Particule superficial poroase – un strat subţire de silicagel sau
alumină este depus pe un miez solid; sunt umpluturi folosite astăzi
la fabricarea precoloanelor sau ca material pentru refacerea
coloanelor analitice deteriorate
Particule neporoase – un strat polimeric organic neporos este
depus pe un miez solid
Particule perfuzive – sunt utilizate pentru separarea rapidă a
biopolimerilor; conţin două tipuri de pori, pori de difuzie la nivelul
cărora are loc retenţia solutului şi pori de trecere rapidă a fazei
mobile

16
 FAZE STAŢIONARE-CONTINUARE
b. Forma particulelor
Particule neregulate
Particule sferice – des utilizate
c. Mărimea particulelor:
normală – diametrul particulelor este cuprins între 3 şi 10 m
micro – diametrul particulelor  3 m
monolit – faza staţionară este formată dintr-un material în
bloc, poros, faza mobilă trecând prin canale cu diametre medii de 2 m
până la 12 nm de-a lungul coloanei
Fazele staţionare în HPLC pot fi obţinute din foarte multe
substanţe: silicagel, hidroxizi, alumina, polimeri organici, carbon
grafitic poros etc., fiind folosite ca atare sau, unele dintre ele, după
modificare chimică prin grefarea unor resturi organice: alchil,
amino, ciano, alcool, selectori chirali, etc.
Forme ale
particulelor
fazei staţionare:
a. sferice, b. 17
neregulate
 9.FAZE MOBILE ÎN HPLC

Fazele mobile sunt amestecuri de solvenţi miscibili, de puritate

ridicată („pentru cromatografie”), filtrate şi degazate înainte de a
fi introduse în rezervoarele cu solvenţi ale sistemului HPLC.

Proprietăţile de care trebuie să se ţină cont la alegerea solvenţilor

organici utilizaţi în HPLC sunt următoarele:

Puterea de eluţie a solventului – definită ca puterea de eluţie

atunci când este folosit ca fază mobilă pe silicagel

Vâscozitatea – solvenţii cu viscozitate mai mare decât a apei

sunt nerecomandabili în HPLC datorită presiunii mari pe care o
creează în sistemul cromatografic

Indicele de refracţie

18
FAZELE MOBILE-CONTINUARE
Lungimea de undă limită la care absorbanţa solventului măsurată în
cuva de 1 cm este 1, folosind ca referinţă cuva cu aer. Solvenţii cu
puritate redusă au această limită situată la valori mai mari, ceea ce
afectează măsurătorile spectrofotometrice în UV-VIS
Punctul de fierbere – un punct de fierbere scăzut este impropriu dacă
eluţia necesită temperaturi de lucru mari
Polaritatea – capacitatea solventului de a interacţiona prin legături
dipolare cu substanţele de separat din probă
Aciditatea – capacitatea solventului de a funcţiona ca donor de protoni
în raport cu un solut bazic
Bazicitatea – capacitatea solventului de a funcţiona ca acceptor de
protoni în raport cu un solut acid

Apa, solventul de bază al cromatografiei de lichide în fază inversă,

trebuie să aibă puritate ridicată („apă ultrapură”), această calitate fiind
obţinută cu ajutorul unor sisteme speciale de purificare.

19
 MODURI DE SEPARARE ÎN HPLC

HPLC include mai multe metode de cromatografie de lichide (CL)

care acoperă un număr mare de aplicaţii.
Aceste metode pot fi împărţite în două mari categorii .
În cromatografia de lichide de retenţie, separarea se datorează
interacţiunii solutului cu suportul fazei staţionare sau cu faza legată
de suport (adsorbţie, repartiţie, schimb ionic, afinitate),
iar în cromatografia de nonretenţie, separarea se face în funcţie
de mărimea particulelor de solut care sunt selectate diferenţiat de-a
lungul reţelei de pori a fazei staţionare (cromatografia de lichide de
excluziune).

20
MODURI DE SEPARARE ÎN HPLC
Metode CL

DE RETENŢIE DE NONRETENŢIE

CL de adsorbţie CL de excluziune

CL de repartiţie

CL cu faze legate chimic

CL de repartiţie lichid-lichid

CL de schimb ionic

21
CL de afinitate
 MODURI DE SEPARARE ÎN HPLC-
CONTINUARE

O altă clasificare a metodelor de separare în HPLC ţine cont de

diferenţa de polaritate între faza staţionară şi cea mobilă,
deosebind:

HPLC în fază normală – polaritatea fazei staţionare (ex. silicagel

Sin(OH)m)  polaritatea fazei mobile (ex. amestec de
hexan/dietilamină/etanol)

HPLC în fază inversă – polaritatea fazei staţionare (ex. silicagel

grefat cu resturi de octan C8)  polaritatea fazei mobile (ex.
amestec apă/metanol)

22
MODURI DE SEPARARE ÎN HPLC
CONTINUARE

Alegerea unei metode de separare are în vedere câteva reguli

generale:
I. Compuşii de separat au masele moleculare sub 2000
daltoni.
a. Compuşii sunt insolubili în apă şi au grupe alifatice
sau aromatice.
1. Cromatografia de adsorbţie lichid-solid se poate
aplica pentru separarea pe clase sau pentru separarea
izomerilor.
2. Cromatografia lichid-lichid se poate aplica pentru
separarea compuşilor din serii omoloage.
b. Compuşii sunt ionici sau posedă grupe ionizabile.
1. Cromatografia în fază inversă
2. Cromatografia ionică

23
MODURI DE SEPARARE ÎN HPLC-
CONTINUARE

II. Compuşii de separat au mase moleculare mai

mari de 2000 de daltoni
Cromatografia de excluziune este metoda
recomandată
1. Dacă proba conţine compuşi solubili în apă,
faza mobilă este apoasă.
2. Dacă proba conţine compuşi insolubili în apă,
faza mobilă este neapoasă.

24
1.CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE
Principiul cromatografiei de adsorbţie stă la baza
cromatografiei de lichide clasice, în strat subţire şi pe coloană,
şi a cromatografiei de adsorbţie gaz-solid.
Adsorbţia corespunde fixării energice a unui gaz, lichid sau
solid pe o suprafaţă solidă, procesul este reversibil, iar forţele
responsabile de adsorbţie nu sunt specifice .

25
CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE-CONTINUARE

Legături de natură Legături de natură Legături de

ionică electrostatică hidrogen

• Moleculele acide • Moleculele polare • Soluţii pot forma

sau bazice, în cu moment în funcţie de
funcţie de pH sau dipolar structura lor
pKa pot să se permanent legături de
ionizeze formând generează atracţii hidrogen cu faza
cu adsorbantul electrostatice mobilă,provocând
leg.ionice dificil responsabile de modificări
de rupt adsorbţie sau neaşteptate.
eluţie.

26
CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE-CONTINUARE
Substanţele adsorbante
Adsorbanţii se aleg în funcţie de puterea de separare raportată la
amestecurile de substanţe, de inerţia lor faţă de acestea şi de
solventul utilizat ca eluant.
Exemple de adsorbanţi: bentonite (silicaţi de aluminiu hidrataţi),
alumină (Al2O3 nH2O), silice (SiO2), oxidul de magneziu.
Solvenţii
Solvenţii trebuie să fie inerţi faţă de adsorbant şi substanţa adsorbită.
Se întâmplă foarte rar ca un singur solvent să fie utilizat atât pentru
adsorbţie cât şi pentru eluţie. În cromatografie se alege în general un
solvent de fixare şi unul de eluţie, în funcţie de natura substanţelor de
separat.
Când adsorbantul este polar, solventul de fixare trebuie să fie cât mai
puţin polar.
Eluţia se începe cu solvenţi puţin polari şi se continuă cu solvenţi din
ce în ce mai polari.
În cromatografia de adsorbţie puterea eluotropică a unui solvent este
definită prin parametrul o din ecuaţia Snyder. 27
CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE-CONTINUARE

Creşterea
Solvent o
polarităţii
hexan 0
eter de petrol 0,01
tetraclorură de carbon 0,14
benzen 0,25
cloroform 0,31
acetat de etil 0,48
piridină 0,55
metanol 0,73

Valorile o ale câtorva solvenţi utilizaţi în HPLC de

adsorbţie
28
CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE-CONTINUARE

Ca regulă în cromatografia de adsorbţie,

compuşii polari sunt eluaţi mai târziu decât compuşii nepolari.

sesseSemnal

Timps

Ordinea de eluţie în cromatografia de adsorbţie

29
CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE-CONTINUARE
Adsorbţia unei substanţe depinde de:

STRUCTURA GREUTATEA Ph-ul FAZEI

CHIMICĂ MOLECULARĂ MOBILE
structura solutului influenţează
fenomenele de adsorbţie; diferenţe
minore stau la baza separării în seriile analoage, – pentru
diastereoizomerilor; compuşii polari cu cât greutatea
şi hidrocarburile lineare se adsorb substanţele acide
mai uşor decât structurile cu moleculară este sau bazice, gradul
ramificaţii, puterea de adsorbţie mai mare cu atât de adsorbţie
variază în ordinea: adsorbţia este mai depinde de pKa-ul
• hidrocarburi saturate  olefine  puternică; pentru
compuşi aromatici  compuşi
lor, de natura acidă
organici halogenaţi < sulfuri < eteri
derivaţii aromatici sau bazică a
< compuşi nitro < esteri  aldehide numărul de cicluri adsorbantului şi de
 cetone < alcooli  amine < este un factor pH-ul solventului.
sulfone < sulfoxizi < amide < acizi important:
carboxilici
Dacă o moleculă are mai multe • benzen 
grupări funcţionale, atunci
proprietăţile de retenţie sunt
naftalină 
determinate de gruparea cea mai antracen
polară

30
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE
Sub această denumire se reunesc cromatografia de repartiţie
lichid-lichid şi cromatografia cu faze legate, iar principiul de
separare se bazează pe echilibrul de repartiţie între două faze
(solubilitatea diferită)

Principiul cromatografiei de
repartiţie

31
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE-
CONTINUARE

• În cromatografia de repartiţie lichid-lichid,

Cromatografia de componentele probei sunt distribuite între două
repartiţie lichid- faze lichide nemiscibile, unul dintre lichide este
lichid
faza mobilă, iar celălalt este un film subţire
care acoperă suprafaţa granulelor (granulele
reprezintă suportul, ele neparticipând la
procesul cromatografic).

• În acest tip de cromatografie faza staţionară

Cromatografia
este formată dintr-un suport solid de care sunt
de repartiţie
legate prin legături chimice resturi
cu faze legate
hidrocarbonate sau grupări funcţionale.

32
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE CU FAZE LEGATE
Suporţii
Printre cele mai cunoscute substanţe utilizate ca suporţi în
cromatografia de repartiţie sunt:
celuloza
kiselgur
silicagel (silice)
polimeri sintetici
Fazele staţionare
Fazele staţionare sunt grefate adică sunt faze în care se stabilesc
legături chimice între faza staţionară şi suport. Cele mai utilizate
sunt lanţurile alifatice de lungime şi polaritate diferită grefate pe
suporturi solide de tip silicagel

33
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE CU FAZE LEGATE-
CONTINUARE

• unde faza • faza staţionară este • pe faza staţionară

Cromatografia cu faze staţionare chirale

Cromatografia în fază normală

Cromatografia în fază inversă

staţionară este de lipofilă (lanţuri alchil este grefat un
natură hidrofilă, iar C4 – C30, propil, selector chiral; se
faza mobilă este fenil) şi faza mobilă disting faze
lipofilă. Pe faza este hidrofilă; dacă staţionare chirale:
staţionară tip silice fazele staţionare • Sintetice
sunt grefate grupări C18 sunt foarte des • Pe bază de
de tipul: utilizate –Si- ciclodextrine
• amino sau amino- (CH2)17-CH3,
• Pe bază de
propil –Si-(CH2)3- coloanele cu faze
celuloză
NH2 staţionare C4 se
întâlnesc în analiza • Proteice
• nitro sau nitril –Si-
peptidelor şi • Faze alchil
(CH2)3-CN
proteinelor, iar cu • Silice fluorurată
• dialcool –Si-
(CH2)3-O-CH2-
faze C30, la • Zirconiu grefat
separarea
CHOH-CH2-OH carotenoidelor şi
flavonoidelor.

34
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE CU FAZE LEGATE-
CONTINUARE

Fazele mobile
Trebuie să fie caracterizate prin putere eluotropică şi inerţie
chimică faţă de probele de analizat.
Cel mai adesea fazele mobile sunt constituite din
amestecuri de solvenţi (frecvent sunt amestecuri de apă sau soluţii
tampon şi un solvent organic) a căror proporţie poate varia în
cursul procesului cromatografic. Pentru cromatografie, în general,
cel mai puternic mediu de eluţie a fost considerat apa, acest lucru
fiind adevărat numai în cazul proceselor de adsorbţie
În cromatografia de repartiţie în fază inversă apa nu poate
uda grupările alchil nepolare (hidrofobe) şi nu interacţionează cu
acestea. Din această cauză apa este cea mai slabă fază mobilă şi
dă vitezele de eluţie cele mai scăzute în cromatografia cu fază
inversată. Creşterea cantităţii de apă în faza mobilă creşte timpul
de retenţie.
35
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE CU FAZE LEGATE-
CONTINUARE

Cei mai utilizaţi solvenţi în cromatografia în fază inversă sunt

următorii:

metanol
acetonitril
anol
Scăderea polarităţii
isopropanol
Creşterea puterii de eluţie
dimetilformami
dã
n-propanol
dioxan
tetrahidrofuran
et
36
CROMATOGRAFIA CU SCHIMBĂTORI DE IONI

Acest tip de cromatografie constă în utilizarea unei faze staţionare

constituită din macromolecule cu structură poroasă, insolubile în apă şi
solvenţi organici, cu proprietatea de a schimba ioni cu faza mobilă

Principiul cromatografiei cu
schimbători de ioni

37
CROMATOGRAFIA CU SCHIMBĂTORI DE IONI-

CONTINUARE

Schimbătorii de ioni. Aspecte generale

Un schimbător de ioni este format dintr-o matrice, un polimer cu

structură reticulată, pe care sunt grefate grupe cu caracter slab
acid(-COOH,-PO(OH)2, OH fenolic) sau puternic acid (-SO3H), slab
bazic (-NH2), cu bazicitate medie (amine secundare, terţiare) sau
puternic bazice(bazele cuaternare de amoniu).
Grupe schimbătoare de ioni

Schimbătorii anionici (referitor la grupele fixate pe suport) sunt

schimbători de cationi (referitor la ionii susceptibili de a se fixa pe
schimbător) şi schimbătorii cationici, de anioni
38
CROMATOGRAFIA CU SCHIMBĂTORI DE IONI-

CONTINUARE

Schimbători de cationi pot fi:

1.acizi tari ce conţin resturi de acizi sulfonici aromatici; rezultă
prin sulfonarea copolimerului stiren-divinilbenzen la nivelul
nucleelor aromatice
2.acizi slabi ce conţin grupe carboxilice puţin disociate până la
pH 4; se prepară prin copolimerizarea acidului metacrilic cu bis-
metacrilatul de glicol
3.acizi foarte slabi cu grupări fenolice

Schimbători de anioni. Se disting:

1.baze tari de tipul hidroxizilor de amoniu cuaternari; rezultă
prin clorometilarea copolimerului stiren-divinilbenzen la nivelul
nucleelor aromatice
2.baze slabe de tipul polialchilaminelor a căror sarcină depinde
de pH; aceste răşini sunt comercializate sub formă acidă şi
bazică dar şi sub formă de sare de sodiu sau clorhidrat 39
CROMATOGRAFIA CU PERECHI DE IONI
Acest tip de cromatografie reprezintă o alternativă a cromatografiei
cu schimbători de ioni.
Probele ionice pot fi separate prin cromatografie în fază inversă
numai dacă sunt formate din compuşi neutri şi pot conţine acizi sau
baze slabe în formă nedisociată. Asigurarea formei neionizate
printr-un pH corespunzător poartă numele de supresie de ioni.
Cromatografia cu perechi de ioni este o extindere a acestui
principiu şi constă în adăugarea unei substanţe ionice la faza
mobilă ce formează o pereche de ioni cu un component al probei
de sarcină opusă:
Proba+ + Contraion-  Perechea [ Proba+ Contraion- ]

Proba- + Contraion+  Perechea [ Proba- Contraion+ ]

Perechea formată se comportă cromatografic ca o moleculă

organică neionică şi se poate folosi în acest caz cromatografia cu
fază inversă.
40
CROMATOGRAFIA CU PERECHI DE IONI-
CONTINUARE

Sunt propuse două mecanisme:

•repartiţia perechilor de ioni între două faze lichide nemiscibile (metodă
neutilizată astăzi)
•cromatografia de perechi de ioni pe fază staţionară nepolară
Aspecte practice
În practică se adaugă un alchilsulfonat în probe cationice şi
fosfat de tetrabutilamoniu în probe anionice. O probă ce conţine
componente anionice şi cationice are unul din ioni mascat de un
contraion iar celălalt este supresat prin pH.
Avantajele cromatografiei cu perechi de ioni :
1.se pot folosi sisteme cu fază inversă;
2.pot fi separate amestecuri acide, bazice, neutre sau soluţii ce conţin
molecule amfoterice;
3.selectivitatea este uneori influenţată de contraion.

41
 CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE STERICĂ

Principiu
Cromatografia prin excluziune sterică se bazează pe un proces
de repartiţie lichid-lichid în care moleculele componenţilor de separat
sunt reţinute în funcţie de forma şi mărimea lor.
Mecanismul prin care are loc separarea în cromatografia prin
excluziune sterică nu este suficient elucidat

Principiul cromatografiei Ordinea de eluţie în 42

de excluziune sterică cromatografia
prin excluziune sterică
CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE STERICĂ-
CONTINUARE
Aspecte practice
Alegerea fazei staţionare
Se face în funcţie de masa moleculară a substanţelor supuse separării. Ca
suport se utilizează o serie de substanţe granulare, microporoase, care
permit difuzia moleculelor în porii acestora. Cu cât moleculele sunt mai
mici, ele difuzează mai uşor în porii gelului şi sunt reţinute un timp mai
îndelungat pe coloană, în timp ce moleculele mai mari rămân în
majoritatea timpului în spaţiile interstiţiale dintre particulele de gel, fiind
eluate primele. Acestea sunt materiale de tip Sephadex - geluri dextranice
reticulate care se umflă în mediul apos, şi geluri polistirenice cu grad înalt
de reticulare, folosite în special în solvenţi organici.
Alegerea fazei mobile
Faza mobilă trebuie să îndeplinească anumite condiţii:
- dizolvarea probei
- impregnarea şi gonflarea gelului
- compatibilitatea cu sistemul de detecţie
- să nu distrugă faza staţionară
43
CROMATOGRAFIA DE AFINITATE
La baza procesului de afinitate stau interacţiuni de natură biochimică:
•antigen-anticorp;
•enzime-inhibitor sau substrat;
•hormon-transportor sau receptor

Caracteristica cea mai importantă a

acesteia constă în faptul că este nevoie
să existe, pe lângă interacţiuni
electrostatice, orientare spaţială şi
mărime favorabile. Procesul de afinitate
fiind de natură biochimică se produce
într-un mediu specific şi, deci, va fi
afectat de utilizarea unui gradient de
concentraţie sau pH. Ca liganzi se
folosesc anti-imunoglobulina G, lectine,
Cibacrom Blue, etc.
44
. Principiul cromatografiei de afinitate: compus cu
afinitate,
,  ,compuşi fără afinitate faţă de ligand