Cromatografia de lichide

INTRODUCERE

Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentru a denumi o gamă extinsă de sisteme
cromatografice care au în comun faptul ca utilizează o fază mobilă lichidă.
Comparativ cu cromatografia de gaze, cea de lichide are avantajul ca permite si analizarea probelor
greu volatile sau instabile termic, iar faptul că si faza mobilă participă la separare oferă posibilităţi
suplimentare pentru realizarea unor separări eficiente.
comparativ cu cromatografia de gaze, cea de lichide are avantajul ca permite si analizarea probelor greu volatile sau
instabile termic, iar faptul ca si faza mobila participa la separare oferă posibilităţi suplimentare pentru realizarea unor
separări eficiente.
Cromatografia de lichide clasică a fost caracterizată de utilizarea unor coloane cu diametre mari,
umplute cu particule de fază stationară de o granulație fină și prin care faza mobilă trecea sub influenta forței
gravitaționale. Aceste sisteme, care se mai folosesc azi în separările cromatografice lichid-solid, au permis
realizarea separării unor amestecuri complexe de substanţe în condiţii foarte bune, însa viteza de separare
este mica iar analiza suplimentara a compuşilor separaţi prin metode spectroscopice este mai dificila. Apariţia
cromatografiei de lichide de înalta performanta (HPLC) a permis eliminarea acestor deficiente si chiar
impunerea cromatografiei de lichide ca o metoda mai performanta de analiza decât cromatografia de gaze.
Principalele avantaje ale cromatografiei de lichide de înalta performanta sunt:
- Capacitate de separare ridicata
- Viteza ridicata a separării
- Posibilitatea monitorizării continue a efluentului coloanei
- Realizarea unor analize repetate si reproductibile utilizând aceeaşi coloana
- Automatizarea procedurii analitice si a prelucrării datelor.

Primul cromatograf de lichide modern a fost construit de Csaba Horváth la Universitatea din Yale în
1964 si a tehnica fost denumita cromatografie de lichide de înalta presiune (HPLC). În continuare, termenul
care s-a impus a fost cel de cromatografie de lichide de înalta performanta. Prima separare realizata de grupul
lui Horváth a fost cea a unor componente ale acizilor nucleici. Dezvoltarea extraordinara a acestei tehnici în
ultimii zeci de ani se datorează în mare măsură faptului ca a permis analiza unor compuşi care puteau fi
separaţi foarte greu pe alte cai, de exemplu a biomoleculelor.
Principalele tipuri de cromatografie de lichide sunt:
- cromatografia de adsorbţie lichid-solid (LSC)
- cromatografia de repartiţie lichid-lichid (LLC)
- cromatografia ionica (IC)
- cromatografia prin excluziune (SEC)
Factorii care influenţează separarea în cromatografia de lichide
Pentru a putea utiliza cromatografia de lichide ca metoda de analiza în condiţii satisfăcătoare, nu este
necesara cunoaşterea în amănunt a teoriei cromatografiei de lichide, dar este indispensabila stăpânirea
noţiunilor de baza, mai ales pentru a se putea face selecţia fazelor cromatografice într-o maniera corecta.
În ciuda complexităţii aparente a instrumentului, partea inițială a analizei cromatografice este procesul
de separare care are loc în coloana, restul aparaturii având doar rolul auxiliar de a asigura depozitarea fazei
mobile, asigurarea compoziţiei sale stabilite si a presiunii de intrare în coloana, introducerea probei,
detectarea componentelor separate si procesarea datelor. Ca urmare a modului în care este conceput designul
aparatelor moderne, aceasta esenţă se pierde însa de multe ori în spatele complexităţii electronice sau inginereşti a
întregului sistem. Rezultatul este ca rolul important al funcţiunii coloanei este înţeles doar superficial si tehnica
cromatografica nu este utilizata într-o maniera adecvata.
În timpul separării cromatografice în coloana au loc doua procese care se produc simultan, continuu si
aparent independent una de alta. Prima este deplasarea fiecărui solut printr-o succesiune de echilibre de
distribuţie între faza mobila si cea staţionară, în conformitate cu coeficientul sau de distribuire. Al doilea
proces este specific coloanei, care trebuie sa limiteze dispersia naturala a soluţiilor astfel încât la ieşirea din
coloana fiecare solut sa se găsească sub forma unei benzi de eluţie cât mai înguste si distincte de celelalte.
Primul proces, cel al retenţiei componentelor, este de natura termodinamica si poate fi controlat prin alegerea
corespunzătoare a naturii fazelor cromatografice. Cel de-al doilea proces este, în esenţă, de natura cinetica si
depinde de proprietăţile fizice ale componentelor sistemului de separare cromatografica: faza staţionara si
faza mobila. Pentru a putea realiza o separare optima, pentru fiecare proba va trebui găsit perechea de faze
cea mai potrivita si selectata coloana corespunzatoare.
În cromatografia de lichide, ecuaţia esenţiala care permite înţelegerea procesului de retenţie si
identificarea parametrilor cu ajutorul cărora va fi posibila optimizarea analizei este ecuaţia volumului de
retenţie.

 
unde VM este volumul mort al coloanei, K este coeficientul de distribuţie al solutului, iar V S este
volumul fazei staţionare. Aceasta relaţie este dedusa pe baza teoriei talerelor a lui Martin si Synge,
perfecţionata apoi de alti autori. În cromatografia de lichide, spre deosebire de cromatografia de gaze, volumul
fazei staţionare din coloana nu mai poate fi definit aşa de net. În majoritatea cazurilor, în separare nu intervine
întregul acest volum ci numai volumul fazei staţionare disponibil solutului.
Separarea a doi compuşi va fi posibila daca volumele lor de retenţie vor fi diferite, adică în cazul în care fie
coeficienţii de distribuţie ai celor doi soluti vor fi diferiţi, fie volumul de faza staţionara disponibil fiecărui
component al amestecului analizat va fi diferit. Aşadar pentru a realiza separarea dorita trebuie studiaţi
factorii care influenţează aceşti doi parametri, coeficientul de distribuţie si volumul fazei staţionare disponibile.
Coeficientul de distribuţie este raportul dintre concentraţia solutului în faza staţionara si concentraţia
în faza mobila, fiind o măsură a interacţiunilor moleculare dintre solut si cele doua faze.
Interacţiuni moleculare care influenţează coeficientul de distribuţie
Aceste interacţiuni sunt consecinţele forţelor ce se manifesta între moleculele celor doua faze
cromatografice si cele ale solutului Aceste forte pot fi de patru tipuri: forte chimice, forte ionice, forte polare si
forte de dispersie. Exista si alte forte, cele bazate pe legături de hidrogen, însa pentru simplificare acestea sunt
considerate ca fiind o categorie de forte polare foarte puternice. Prin alegerea corespunzătoare a fazelor,
toate aceste interacţiuni pot fi astfel dirijate încât sa se realizeze retenţia dorita.
Forţele chimice pot fi considerate practic ireversibile, cel putin în cromatografie si drept consecinţă
coeficientul de distribuţie al solutului legat prin asemenea forte de faza staţionara este apropiat de infinit. Un
exemplu de cromatografie de lichide bazat pe asemenea interacţiuni este cea de afinitate, în care una dintre
moleculele probei analizate interacţionează chimic cu gruparea de afinitate a fazei staţionare si substanţa
respectiva este extrasa selectiv dintre compuşii prezenţi în sistem. Acest tip de cromatografie reprezintă
aşadar mai mult o extracţie decât o separare cromatografica, iar în celelte tipuri de cromatografie forţele
chimice nu au un rol semnificativ.
Forţele ionice se bazează pe sarcinile electrice care rezulta în urma ionizării moleculelor în soluţie. Aceste
interacţiuni sunt exploatate de cromatografia ionica. Daca solutul se prezintă sub forma de anioni, ca de
exemplu în cazul acizilor organici, faza staţionară va trebui sa conţină cationi cu sarcina pozitiva drept
contraioni pentru a interacţiona cu anionii respectivi si a încetini deplasarea lor prin coloana. În mod
corespunzător, pentru separarea compuşilor cu caracter cationic prezenţi în proba analizata, faza staţionară va
trebui sa contina contraioni de tip anionic. Fazele stationare ionice sunt constituite în mod obisnuit din
polimeri reticulati care au fost modificati chimic pentru a li se grefa gruparile schimbatoare de ioni dorite. O
alta alternativa este utilizarea unor faze chimic legate cu grupari schimbatoare de ioni, în acest caz gruparile
respective fiind legate chimic de un suport de silicagel, asemenanator ca în cazul altor faze stationare chimic
legate. A treia posibilitate este de a adsorbi compusul schimbator de ioni pe suprafata fazei stationare, acest
tip de cromatografie fiind denumit cromatografie prin perechi de ioni. Compusul respectiv este introdus în faza
mobila în concentratie redusa (în jur de 1%), de unde se adsoarbe pe faza stationara chimic legata.
Fortele polare au la baza de asemenea sarcinile electrice ale moleculelor, însa în acest caz este vorba de dipoli
permanenti sau indusi. Trebuie menţionat că o moleculă polară nu poseda sarcini nete, exceptând situaţia în
care molecula respectivă este în acelaşi timp şi ionizată. Exemple de substanţe cu dipoli permanenţi sunt
alcoolii, esterii, aldehidele, etc. Molecule polarizabile sunt, printre altele, hidrocarburile aromatice ca
benzenul, toluenul sau xilenii. Există compuşi cu dipoli permanenţi care în acelaşi timp sunt şi polarizabili, ca de
exemplu 2-fenil-etanolul. Pentru a separa compuşii polari sau polarizabili, va trebui utilizată o fază staţionara
polară în combinaţie cu o fază mobila relativ nepolara. Realizarea de interacţiuni moleculare diferite în cele
două faze reprezintă o modalitate generală pentru a obţine selectivitate în separările cromatografice. Pentru a
realiza retenţia şi selectivitatea necesară, trebuie ca un anumit tip de interacţiuni specifice să fie dominante în
faza staţionară, iar interacţiunile din faza mobila să fie diferite faţă de cele din faza staţionara pentru a
menţine selectivitatea fazei staţionare. De exemplu pentru a separa nişte hidrocarburi aromatice, care sunt
compuşi polarizabili, se va folosi o fază staţionara puternic polară, cum este silicagelul şi a faza mobila
nepolara, cum este hexanul.
Forţele de dispersie sunt mult mai dificile de caracterizat. Ele sunt în esenţă electrice prin natura lor, însa
rezulta mai mult din fluctuaţiile de sarcina decât din sarcinile electrice propriu-zise ale moleculelor. Exemple
de interacţiuni de dispersie sunt forţele care se manifestă între moleculele hidrocarburilor săturate. Aceşti
compuşi nu au caracter ionic, nu sunt polarizabile şi nu au momente dipol, totuşi cele superioare nu sunt gaze
ci lichide sau solide întrucât moleculele lor sunt ţinute laolaltă de forţele de dispersie. Pentru că fenomenul de
retenţie să fie bazat pe interacţiuni de dispersie trebuie că faza staţionara să nu conţină grupări ionice sau
polare ci numai grupări hidrofobe, aşa cum este cazul fazelor staţionare inverse din cromatografia HPLC. În
plus, faza mobilă trebuie să fie puternic polară pentru că intercatiunile de dispersie în această fază să fie
minime. Asemenea faze sunt cele de tipul amestecurilor metanol-apa sau acetonitril-apa.
În sistemele reale, doar în puţine cazuri este întâlnita situaţia în care distribuţia este determinată doar
de un singur tip de interacţiuni. Dacă totuşi se întâmpla acest lucru, poate fi vorba numai despre interacţiuni
de dispersie. Interacţiunile polare sunt însoţite întotdeauna de interacţiuni ionice şi de dispersie, iar cele ionice
de interacţiuni polare şi de dispersie.
Factorii care influenţează disponibilitatea fazei staţionare
Aşa cum rezultă din ecuaţia volumului de retenţie, nu numai tăria interacţiunii dintre solut şi faza
staţionara va fi cea care determină retenţia solutului ci şi volumul fazei staţionare prezente în sistem şi
accesibile solutului. Volumul fazei staţionare cu care componentele amestecului de analizat pot interacţiona
depinde de starea fizică a fazei staţionare şi a suportului. Dacă faza staţionara este un solid poros şi
dimensiunile porilor suportului sunt comparabile cu diametrele moleculare ale componentelor de separat,
atunci faza staţionara va fi selectiva pentru mărimea moleculelor acestora. Moleculele anumitor soluti vor
putea pătrunde în interiorul porilor şi vor interacţiona cu mai multă faza staţionara decât alte molecule mai
mari care vor fi parţial excluse de la aceste interacţiuni. Aşadar, separarea va fi controlată de fenomenul de
excluziune bazat pe mărimea moleculelor şi de aceea se numeşte cromatografie de excluziune. Dacă faza
staţionara va fi chirala, cantitatea de faza staţionara disponibilă pentru a interacţiona cu solutul va fi doar
aceea care din punct de vedere steric se potriveşte cu orientarea spaţială a moleculei de solut. Acest tip de
cromatografie se numeşte cromatografie de lichide chirala. Trebuie menţionat că în funcţie de natura fazei
staţionare ambele aceste tipuri, cromatografia de excluziune sau cromatografia chirala, pot să se încadreze fie
în categoria cromatografiei lichid-lichid fie în a celei de tip lichid-solid.
Eficienta de separare a coloanei cromatografice
În timpul deplasării prin coloana cromatografică nu este suficient că benzile de eluţie ale celor doi
soluti să migreze diferenţiat, ci este necesar ca ele să fie destul de înguste pentru ca să se separe cât mai
complet una de alta. Parametrul de eficienta care ne arată posibilitatea separării a doi compuşi pe baza
selectivităţii termodinamice este coeficientul de separare α, definit pe baza raportului factorilor de capacitate
a celor doi soluti.

 
Se observa că coeficientul de separare corelează interacţiunile din faza staţionară şi cele din faza
mobila. Aşadar în cromatografia de lichide, coeficientul de separare poate fi optimizat prin două modalităţi:
- alegerea corespunzătoare a fazei staţionare;
- alegerea corespunzătoare a fazei mobile.
Toţi factorii care modifică interacţiunile moleculare sau intensitatea acestora, atât în faza mobila cât şi
în sau faza staţionara vor determina în acelaşi timp şi modificarea selectivităţii.
În cromatografia de lichide, faza staţionară (indiferent că este polară sau nepolara) va adsorbi
întotdeauna în mod preferenţial o anumită componentă a eluentului, iar grosimea stratului de adsorbţie
(df) depinde de natura fazei staţionare şi a solventului adsorbit (Figura 4.1). Cu cât ne îndepărtăm de suprafaţă,
cu atât scade tăria legăturii acestei adsorbţii şi este discutabil unde trebuie plasată delimitarea dintre faza
mobila adsorbita şi cea neadsorbita. Dacă se modifica compoziţia fazei mobile acest lucru determina automat
şi schimbarea compoziţiei stratului de faza mobila adsorbita la suprafaţa fazei staţionare, iar drept consecinţă
modificarea interctiunilor dintre solut şi cele două faze.

Formarea stratului de faza mobila adsorbita pe suprafaţa fazei staţionare

Valoarea calculată a coeficientului de separare depinde de timpul mort al coloanei respective în
condiţiile de lucru. Determinarea acestui timp mort nu este însa aşa de simplă ca în cromatografia de gaze,
deoarece într-o coloană cromatografică de gaze volumul mort poate fi net delimitat, în timp ce într-una de
lichide aceasta delimitare depinde de grosimea filmului de faza mobila adsorbita la suprafaţa fazei staţionare.
O altă problemă în cromatografia de lichide este că majoritatea adsorbentilor (fazelor staţionare)
utilizaţi fiind poroşi, într-o parte a porilor faza mobila va stagna şi aici compoziţia fazei mobile poate fi diferită
de cea din zonele unde ea se găseşte în mişcare. Pentru a avea valori reproductibile ale timpului mort (t M=L/v),
acesta ar trebui determinat folosind un compus care nu interacţionează cu faza mobila adsorbita. În realitate
un asemenea compus nu exista, de aceea întotdeauna trebuie precizat cu ce substanţa s-a făcut determinarea
timpului sau volumului mort. Aceasta relativitate în determinarea timpului mort are influenţă şi asupra
valorilor parametrilor de retenţie, mai ales a factorului de capacitate.
Cromatografia de lichide este capabilă de rezolvarea unor probleme de separare foarte complexe în
bună parte datorită faptului că prin modificarea sistematică a compoziţiei eluentului se pot obţine valori ale
coeficientului de separare într-un interval destul de larg.
Realizarea unui coeficient de separare diferit de 1 este o condiţie necesară, nu însa şi suficientă pentru o
separare corespunzătoare, deoarece la aceeaşi valoare a acestui coeficient putem avea o separare foarte
bună, dar şi total nesatisfăcătoare a componetelor respective .

Influenta abaterii standard asupra separării cromatografice

 Pentru separarea să fie corespunzătoare, trebuie ca selectivitatea termodinamică să fie asociată cu o
eficienţă cinetică corespunzătoare, adică cu o viteză mare de transfer a moleculelor de solut din faza mobila în
faza staţionară şi invers. Măsura acestei eficiente cinetice este lăţimea picului, respectiv abatarea standard σ.
Această abatere standard se poate măsura pe baza curbei Gauss care caracterizează picul respectiv. Dispersia
picului, respectiv creşterea abaterii standard depinde însa nu numai de eficienta cinetică a coloanei ci şi de
distanţa parcursă de solut în coloană, adică de lungimea coloanei. Pentru a se putea face o comparaţie între
diferite coloane, trebuie utilizată o valoare relativă a dispersiei solutului (şi implicit a lărgirii picului), ceea ce se
face cu ajutorul unui parametru de numit număr de talere teoretice N. Valoarea acestuia se calculează cu
relaţia:

 
unde σt şi σL reprezintă abaterea standard exprimată în unităţi de timp, respectiv în unităţi de lungime.
Numărul de talere teoretice depinde însa şi el de lungimea coloanei, de aceea pentru eliminarea acestor
diferenţe se utilizează lungimea de coloană echivalenta unui taler teoretic. Acesta poartă numele de înălţimea
echivalentă a talerului teoretic (H) şi se calculează prin raportarea lungimii coloanei la numărul de talere
teoretice. Cu cât această înălţime este mai mică, eficienta cinetică de separare a coloanei va fi mai mare.
Parametrii N şi H (ca şi cei efectivi Nef şi Hef, care se referă la dispersia picului în faza staţionară) se pot utiliza
pentru a compara eficientă de separare a diferitelor coloane. Ele sunt deduse pe baza teoriei talerelor în
cromatografie, însa nu ne dau nici un fel de informaţii despre fenomenele care se produc în coloana şi
parametrii care infuenteaza aceste fenomene. Pentru a explica aceste fenomene, în special rolul proceselor
difuzionale în cromatografie, a fost elaborată o altă teorie, teoria cinetică. Teoria cinetică explica dispersia
picurilor cromatografice în timpul deplasării prin coloana, considerându-le drept rezultatul a trei procese:

- difuzia turbulentă
- difuzia moleculară
- rezistenta la transferul de masă
Corelarea acestor procese este dată de ecuaţia lui Van Deemter, care a fost dedusa pentru
cromatografia de gaze, înainte ca cromatografia de lichide să fi fost răspândită pe scară largă. Această ecuaţie
ne dă corespondenta dintre înălţimea echivalentă a talerului teoretic şi viteza fazei mobile şi poate fi scrisă în
formă restrânsa astfel:

 
Cei trei termeni ai ecuaţiei reprezintă contribuţia la înălţimea echivalentă a talerului şi implicit la
lărgirea picului cromatografic a celor trei factori menţionaţi: difuzia turbulenţă, difuzia moleculară şi rezistenţa
la transferul de masă. Această relaţie este valabilă în principiu pentru toate sistemele cromatografice. În
cromatografia de lichide, rolul principal în dispersia zonei îi revine rezistenţei la transferul de masă şi termenul
de rezistenţă la transferul de masă conţine două asemenea rezistente, una în faza mobilă şi una în faza
staţionară. Aşadar fata de cromatografia de gaze apare în plus termenul de rezistenţă la transferul de masă în
faza mobilă, care are un rol foarte important în dispersia zonei cromatografice. Ecuaţia Van Deemter pentru
cromatografia de lichide se scrie în forma generală astfel:

unde CS şi CM repezinta coeficientul de rezistenţă la transferul de masă în faza staţionară, respectiv în faza
mobila.
La deplasarea fazei mobile în coloana avem mai multe cauze care determină diferenţe în ce priveşte
rezistenţa la transferul de masă din faza mobila pe fază staţionară şi invers. Majoritatea fazei mobile este în
mişcare, însa exista zone stagnante care se găsesc fie adsorbite pe suprafaţa granulelor de faza staţionara fie în
interiorul porilor.
Rezistenta la transferul de masă în umpluturi poroase
Solutul ajunge la suprafaţa fazei staţionare trecând prin filmul de faza mobilă care stagnează. Relaţia
matematică ce reda componentă de rezistenţă la transferul de masă pentru acest proces de difuzie în
interiorul particulei este complicată, esenţial fiind însa faptul că conţine termenul d p2.

sau mai simplu:    

unde θ este o constantă care depinde de structura poroasa a particulei, k0 este raportul dintre volumul
interior al particulei şi volumul liber dintre particule, ν e este viteza de curgere a fazei mobile în spaţiul dintre
particule, iar Dm este coeficientul de difuziune în faza mobila.
Aşadar rezistenta la transferul de masă şi deci contribuţia la lărgirea zonei este proporţională cu
pătratul diametrului particulei. Pentru a avea eficienta cinetică ridicată în procesele cromatografice de lichide,
este neapărat necesară folosirea unor umpluturi cu diametre mici de particule. În acelaşi timp, aceasta
componentă difuzionala este invers proporţională cu coeficientul de difuziune în faza mobilă, ceea ce
înseamnă că va fi avantajoasă folosirea unor solvenţi cu vâscozitate cât mai mică.
Influenţa diametrului particulei asupra înălţimii echivalente a talerului teoretic se poate observa şi din
Figura 4.4, care reda graficul ecuaţiei Van Deemter pentru diferite dimensiuni de particule. Cu cât d p este mai
mic şi în consecinţă H mai mic, cu atât eficientă de separarea a coloanei va fi mai ridicată şi şansele de a separa
compuşi având proprietăţi fizico-chimice asemănătoare vor fi mai mari.
Influenţa diametrului particulelor asupra ecuaţiei Van Deemter
Diferenţa de eficienta dintre coloanele cu diametre diferite ale particulelor este importantă atunci
când valoarea lui H este determinată în cea mai mare parte de termenii A şi C, adică la viteze mari ale fazei
mobile. Aşadar din punct de vedere analitic ar fi indicată folosirea unei umpluturi cu diametru mic la viteze
mari ale fazei mobile, când influenţa teremului C·v este determinanta, însa posibilitatea modificării acestora
este limitată din cauza pierderilor de presiune pe coloana cromatografică.
Pierderea de presiune pe coloana este dată de următoarea relaţie:

 
unde φ reprezintă rezistenta coloanei la curgere, iar η este vâscozitatea eluentului. Aşadar pierderea
de presiune este direct proporţională cu lungimea coloanei, vâscozitatea eluentului şi viteza fazei mobile şi
invers proporţională cu pătratul diametrului particulelor de umplutură.
Dacă se utilizează coloane de lungimi mici, pierderea de presiune poate fi redusă, însa şi reducerea
lungimii coloanei se poate face doar până la o anumită limita (ea influenţează nefavorabil eficienta coloanei
exprimată prin numărul de talere teoretice). O altă problemă este că, lucrându-se cu umpluturi cu diametre
mici de particule la debite mari, apare un gradient termic atât pe lungimea cât şi pe secţiunea coloanei.
Creşterea de temperatura pe lungimea coloanei poate fi foarte importantă ajungând la 20-30ºC, ceea ce
modifică vâscozitatea eluentului şi poate crea o serie de alte probleme, cum ar fi lărgirea picurilor sau
asimetria acestora. Pe baza acestor considerente, se poate afirma că în condiţiile tehnice actuale diametrul de
2 μm al particulelor de umplutură reprezintă acea limită la care se atinge eficienta cinetică maximă, fără a
afecta funcţionalitatea coloanei.
O altă posibilitate de a mari eficientă de separare a coloanei ar fi creşterea lungimii coloanei, ţinând
cont de faptul că numărul de talere teoretice este proporţional cu pătratul lungimii coloanei. Folosirea unor
coloane mai lungi de 30 cm este însa limitată de faptul că umplerea uniformă a unei coloane lungi este dificilă
de realizat din punct de vedere practic, iar o umplutură neuniformă va avea o eficienţă mai scăzută datorită
creşterii termenului difuzional A din ecuaţia Van Deemter. Pe de altă parte, s-a văzut că şi pierderea de
presiune în coloana creşte odată cu creşterea lungimii acesteia. S-a constatat însa ca la legarea mai multor
coloane cu umplutură de dimensiuni mici în serie, în anumite cazuri s-a obţinut o însumare a numărului de
talere teoretice, dar numai când coloanele au fost foarte asemănătoare, pentru că proprietăţile de curgere
prin aceste coloane să nu fie diferite.
Un alt parametru de eficientă a separării este rezoluţia R S. Relaţia de calcul a rezoluţiei, care corelează
toate tipurile de interacţiuni care influenţează separarea, este:
  
În această relaţie, atât numărul de talere teoretice cât şi factorul de capacitate sunt calculate pentru
componentă cu timp de retenţie mai mare. Primul termen al acestei relaţii ne arată dependenta rezoluţiei de
factorii cinetici (dispersia picului cromatografic), cel de-al doilea termen de factorii termodinamici (exprimaţi
prin coeficientul de separare) iar cel de-al treilea termen de factorii care determină retenţia componentei.
Pentru că o separare să fie corespunzătoare trebuie ca:
α > 1,05
1< k' < 10 (optim 2 < k' 5)
N > 12000
În aceste condiţii, rezoluţia minimă a două componente trebuie să fie de cel puţin 1 (preferabil 1,5). În
cromatografia de lichide se realizează eficiente înalte de separare ale coloanelor, mai ales dacă diametrul
particulelor de umplutură este mic, ajungându-se curent la un număr de talere de 100.000 sau chiar mai mult.
Aceasta înseamnă că se pot atinge şi rezoluţii ridicate ale separărilor.
Analiza calitativa în cromatografia de lichide
Primul parametru care a fost utilizat pentru identificare în cromatografia de lichide a fost volumul de
retenţie ajustat VR'. Există însa o problemă majoră privind utilizarea acestui parametru, aceea legată de
determinarea volumului mort. Volumul de retenţie ajustat este diferenţa dintre volumul de retenţie şi volumul
mort, însa volumul mort (VM) ar trebui să fie doar volumul fazei mobile din coloana şi nu volumul total de lichid
care se găseşte între injector şi detector. Volumul mort total (VMt) va include şi volumele aferente injectorului,
tubulaturii de conectare între injector, detector şi coloana şi celulei de măsură. El se poate determinat doar
utilizând un solut care nu se adsoarbe pe fază staţionară şi care are aceeaşi mărime moleculară cu cea a
solutului analizat pentru a avea aceleaşi interacţiuni de excluziune. Dacă însa volumul de retenţie ajustat este
mult mai mare decât volumul mort total, atunci orice solut care nu se adsoarbe poate fi utilizat pentru
determinarea volumului mort şi în acest caz volumul de retenţie ajustat poate fi utilizat drept parametru
calitativ. Aceasta utilizare este însa limitată de dependenţa volumului de retenţie ajustat de condiţiile de
analiza, mai ales de lungimea coloanei şi debitul fazei mobile.
Factorul de capacitate poate fi de asemenea utilizat pentru scopuri de identificare, însa şi el depinde
de volumul mort, fiind în realitate exprimat în funcţie de volumul mort total întrucât acesta este cel
determinat experimental. Este mai potrivit pentru analiza calitativa decât volumul de retenţie ajustat, însa are
dezavantajul că depinde de raportul fazelor, care diferă de la coloană la coloană.
Utilizarea coficientului de separare α are avantajul că elimina efectul erorilor de identificare datorate
rapoartelor de faze diferite şi debitelor de faza mobila diferite care pot apare la trecerea de la o coloană la
alta. În cromatografia de lichide, coficientul de separare se poate exprima şi că raportul volumelor de retenţie
ajustate a doi soluti prin relaţia:

 
Dacă ignorăm efectele de excluziune şi considerăm că mărimile moleculelor celor doi soluti sunt
apropiate, rezultă că coeficientul de separare va fi egal cu raportul coeficienţilor de distribuţie, adică va fi
independent de raportul fazelor şi de debitul fazei mobile. Pentru a uşura obţinerea unor valori mai
reproductibile care să fie utilizate în scopul identificării calitative, de multe ori în sistem se introduce o
substanţă standard şi coeficientul de separare al tuturor componentelor probei de analizat este exprimat faţă
de acest standard. Valorile astfel calculate reprezintă de fapt retenţiile relative (r) faţă de standardul ales.
Trebuie însa precizat că nici una dintre metodele prezentate bazate pe retenţie nu poate duce la
identificări calitative certe şi lipsite de ambiguităţi. Pentru aceasta este nevoie şi în cazul cromatografiei de
lichide de utilizarea unor metode auxiliare de identificare, dintre care cele mai bune sunt cele spectrometrice:
IR, RMN, masa. Există la ora actuală sisteme LC-MS sau LC-IR care permit o analiză calitativa lipsită de erori. De
multe ori este foarte utilă şi confirmarea omogenităţii picului cromatografic, adică a faptului că picul respectiv
reprezintă semnalul doar a unei singure componente. Acest lucru poate fi realizat prin folosirea unui detector
cu şir de diode.
Tehnici ale cromatografiei de lichide
Cromatografia de adsorbţie lichid-solid
Cromatografia lichid-solid (LSC), numită şi cromatografie de adsorbţie, utilizează o fază mobila lichidă
şi o fază staţionara solidă formată dintr-o pulbere poroasă având capacitate mare de adsorbţie şi o suprafaţă
specifică ce variază într-un domeniu foarte larg, între 50-1000 m 2/g. Acest tip de cromatografie se bazează pe
interacţiunea moleculelor solutului cu centrii activi aflaţi pe suprafaţa unui adsorbent solid care reprezintă faza
staţionară. Adsorbentul se poate găsi fie într-o coloană (în cazul cromatografiei pe coloana) fie pe suprafaţa
unei plăci (în cazul cromatografiei în strat subţire). Granulaţia umpluturii variază pe un domeniu larg, de la 5
μm în cazul celor folosiţi în HPLC şi până la mai mult de 100 μm în cazul celor folosiţi în cromatografia pe
coloane clasice.
Cromatografia lichid-solid poate fi utilizată cu rezultate bune atât pentru separarea compuşilor polari
cât şi a celor nepolari şi este folosită cu precădere în separările cantitative ale amestecurilor de substanţe
organice, atunci când aceste amestecuri nu sunt foarte complexe. În general, compuşii care se pot separa cel
mai bine prin tehnica LSC sunt cei care au caracter neionic şi sunt solubili în solvenţi organici. Compuşii neionici
solubili în apă se separă mai bine prin cromatografie de lichide pe fază inversă sau cromatografie cu faze
chimic legate.
Din punct de vedere istoric, a fost prima tehnică cromatografică utilizată (Ţvet).
Teoria echilibrului de adsorbţie
Teoria echilibrului de adsorbţie în cazul LSC se bazează în cea mai mare parte pe izotermele de
adsorbţie de tip Langmuir. Aceste izoterme sunt presupuse a fi specifice adsorbţiei moleculelor plane sau
orizontale, aria necesară adsorbţiei unei molecule în acest caz fiind mai mare decât la adsorbţia în configuraţie
verticală. Acest lucru influenţează cantitatea de probă necesară a fi adsorbita pentru formarea unui strat
monomolecular.
Expresia matematică a izotermei Langmuir pentru adsorbţia din fază lichidă este de formă:

 
unde θ este fracţia molară de acoperire a suprafeţei adsorbentului de către componenta adsorbită, K0 este
constantă termodinamică a procesului de adsorbţie, iar x i(M) este fracţia molară a componenţei respective în
faza mobila.
În majoritatea cazurilor, suprafaţa adsorbentului este complet acoperită de un strat monomolecular format
din moleculele componentei i şi moleculele solventului S. La adsorbţia lichid-solid, exista întotdeauna o
competiţie între moleculele probei şi moleculele solventului pentru ocuparea unui loc de pe suprafaţa
adsorbentului.
Dacă se considera stratul monomolecular de solvent drept o fază lichidă distinctă adiacenta la suprafaţă
adsorbentului, atunci echilibrul de adsorbţie se va putea scrie că o simplă repartiţie a componenţei i între cele
două faze lichide:

unde indicii (M) şi (a) reprezintă starea neadsorbita şi respectiv adsorbita.

Constantă de echilibru a acestei distribuţii reprezintă coeficientul de repatitie şi este dat de:

 (71)
x reprezentând fracţia molară a componenţei i în faza adsorbită, respectiv faza mobila.
Constantă termodinamică de distribuţie inte cele două faze este dată de relaţia:
  (72)
ai(a) şi ai(M) fiind activităţile respective.
La concentraţii mici se poate considera că K x = K0. Din punct de vedere practic este însa mai comod să
definim un alt coeficient de repartiţie bazat pe concentraţii molare, conform relaţiei :

 
unde:
ni(a) reprezintă numărul de moli de compus i adsorbit, raportat la cantitatea de adsorbent W (grame)
ni(M) reprezintă numărul de moli de compus din faza mobilă, raportat la volumul fazei mobile V M (ml).
Volumul de retenţie VR şi migrarea relativă Rf se exprimă în cromatografia de adsorbţie cu ajutorul
relaţiilor:

 (74)

 
Valoarea factorului de capacitate k' va fi în acest caz:

 
Faze staţionare utilizate în cromatografia lichid-solid
În cromatografia LSC se folosesc drept faze staţionare o serie de materiale pulverulente, dintre care
cele mai utilizate sunt alumina şi silicagelul. În măsura mai mică se folosesc silicatul de magneziu, pământul de
diatomee, cât şi o serie de alţi adsorbenti: amidon, inulina, fosfat de calciu, carbonat de calciu, hidroxid de
calciu. Acestea din urmă se utilizează numai pentru cazuri speciale şi deoarece se prezintă sub formă de
pulberi fine trebuie amestecate cu pământ de diatomee pentru a permite trecerea fazei mobile.
Un anumit adsorbent poate manifesta variaţii mari ale suprafeţei specifice şi ale energiei superficiale în funcţie
de metoda de preparare, modul de activare şi gradul final de dezactivare. Aceste diferenţe se vor regăsi şi în
valorile parametrilor de retenţie cromatografici. Suprafaţa acestor adsorbenti este în general eterogena,
prezentând activităţi diferite. Suprimarea poziţiilor active (mai ales în ce priveşte formarea legăturilor de
hidrogen, dar şi a centrilor acizi sau bazici) sau dezactivarea prin acoperirea selectivă a acestora duce la
creşterea capacităţii liniare de adsorbţie. În cele mai multe cazuri pentru dezactivare se foloseşte apa,
deoarece s-a constatat că cele mai bune rezultate se obţin când apa acoperă în monostrat 50-100% din
suprafaţa solidului, ceea ce înseamnă 0,04 g apa la 100 m 2 suprafaţă (sau 4-15% apa faţă de cantitatea de
adsorbent). Ca dezactivator se mai pot folosi alţi compuşi puternic polari ca etilenglicolul sau glicerina.
Pentru obţinerea unui adsorbent de o anumită activitate reproductibilă trebuie să fie parcurse următoarele
etape:
alegerea tipului de adsorbent;
îndepărtarea apei prin încălzire timp de 8-16 ore la aer (125-250ºC pentru silicagel, 200-400ºC pentru
alumina);
adăugarea unei anumite cantităţi de apă după răcire, cu care se lăsa timp de 8-16 ore pentru
echilibrare.
Adsorbentii utilizaţi în cromatografia LSC se pot prezenta sub două forme:
 granule poroase neregulate, numite faze staţionare poroase. Ele au suprafeţe specifice cuprinse între
100-400 m2/g şi au o capacitate de încărcare cu proba de 0,5-1 mg/g.
sfere solide compacte acoperite cu un strat de adsorbent poros, care se numesc faze staţionare
superficial poroase sau peliculare. Ele au suprafeţe specifice mult mai mici decât adsorbentii
poroşi, cuprinse între 5-15 m2/g şi pot fi încărcate cu probă la un raport de 0,1 mg/g adsorbent,
deci cantitatea de probă pe care o pot separa va fi mult mai mică. Eficienta de separare a
adsorbentilor superficial poroşi este însa mult mai mare.
Alumina se poate obţine în funcţie de temperatură de preparare şi activare în mai multe forme. Dacă
activarea se face la temperatură mai mică de 700ºC se obţine alumina γ, în amestec cu alte forme. Dacă
activarea se face la o temperatură mai mare decât 1000ºC, se obţine alumina α inactivă. Sorturile de alumina
cromatografică au în general suprafeţe specifice cuprinse între 100-200 m 2/g. Diametrul particulelor
sortimentelor comerciale de alumina este cuprins între 50-200 μm (70-290 mesh). Aceste dimensiuni permit o
aşezare uniformă a umpluturii în coloană, atingerea unui debit rezonabil de faza mobila sub influenţa doar a
gravităţii şi atingerea rapidă a echilibrelor de distribuţie ale solutilor între adsorbent şi faza mobila.
Alumina normală conţine şi diferite cantităţi de apă, fie provenită din forma hidratata a aluminei, fie
sub formă de apă adsorbită. În ce priveşte structura poroasă, s-a observat că ea conţine un sistem de
macropori de formă cilindrică având un diametru de 27 Å, la care se adauga pori neregulaţi cu diametre mai
mari.
Activitatea de adsorbţie a aluminei depinde se sortimentul realizat. Există trei forme de bază de alumina,
bazica (pH 10), neutră (pH 7) şi acidă (pH 4) şi este importantă folosirea tipului corect într-o anumită aplicaţie
din cauza unui posibil efect catalitic. Astfel, alumina bazică poate cataliza hidroliza unor esteri, iar cea acidă
dehidrogenarea unor alcooli, în special a celor terţiari. Activitatea tuturor celor trei forme de alumina este
clasificată în cinci grade (scala Brockmann), pe baza conţinutului de apă. Gradul I, cel mai activ, se obţine prin
activare la 300-400ºC timp de mai multe ore, iar celelalte grade prin adăugare de diverse proporţii de apă,
după răcire: 3-4% (gradul II), 5-7% (gradul III), 9-11% (gradul IV), respectiv 15-19% (gradul V). Faptul că gradul I
este cel mai activ înseamnă că va reţine cel mai puternic compuşii polari.
Silicagelul reprezintă adsorbentul cel mai mult utilizat. Ca structură chimică, este un produs de
policondensare al acidului ortosilicic. Silicagelul cromatografic se obţine la pH 7, adică în formă neutră. şi acest
adsorbent se poate obţine în diferite grade, în conformitate cu conţinutul său de apă. Gradul I se obţine prin
încălzire la 250ºC timp de mai multe ore, iar celelalte prin adăugarea unor cantităţi diferite de apă după răcire:
5% (gradul II), 15% (gradul III), 25% (gradul IV) şi 38% (gradul V). În cazul sortimentelor cu conţinut ridicat de
apă se formează un film consistent de apă la suprafaţă adsorbentului, deci aceste separări pot fi considerate
mai curând pe bază de repartiţie decât de adsorbţie.

Pe suprafaţa silicagelului se găsesc o serie de grupări silanolice Şi-OH. O parte dintre acestea se pot
transforma în grupări siloxanice prin eliminarea apei.

Suprafaţa specifică a silicagelului este cuprinsă între 200-800 m 2/g. Se considera că singurele centre de
adsorbţie pe care le conţine silicagelul sunt grupările hidroxil de la suprafaţă. Între aceste grupări şi moleculele
componentelor adsorbite se stabilesc legături de hidrogen, moleculele adsorbite având rol de donori de
electroni. Există trei tipuri de grupări silanolice superficiale: vicinale dar nelegate prin legături de hidrogen,
legate şi izolate (Figura 4.5). De asemenea, mai pot exista la suprafaţa silicagelului grupări silanolice hidratate.
Dacă temperatura de uscare depăşeşte 400ºC, se produce o sinterizare a particulelor, determinând reducerea
activităţii specifice şi a capacităţii de adsorbţie.
Tipuri de grupări silanolice superficiale
Aşadar mecanismul adsorbţiei este diferit în cazul silicagelului faţă de alumina, unde activitatea de
adsorbţie nu se datoreşte grupărilor hidroxilice superficiale ci unor interacţiuni de natura electrostatică. Acest
lucru s-a confirmat prin faptul că în urma încălzirii la temperatură ridicată, când are loc pierderea grupărilor
hidroxilice superficiale, activitatea silicagelului scade iar cea a aluminei creşte.
Silicatul de magneziu şi Florisilul. Silicatul de magneziu are o activitate de adsorbţie mai mare decât alumina,
fiind utilizată pentru separarea unor anumite clase de substanţe, cum ar fi lipidele. Florisilul este un silicat de
magneziu şi sodiu cu suprafaţa specifică de 300 m2/g, iar ca activitate de adsorbţie se situează între silicagel şi
alumina. Prezintă însa şi fenomen de chemosorbţie, motiv pentru care utilizarea sa este mai limitată.
Cărbunele a reprezentat cel mai popular adsorbent la începuturile cromatografiei, însa la ora aceasta nu prea
mai este utilizat.
Dezvoltarea cromatografiei de înalta performanţă a determinat realizarea unor adsorbenti cu particule având
diametre mai mici de 30μm. Au existat în această direcţie doua tendinţe:
obţinerea unor adsorbenti poroşi cu diametrul în jur de 5 μm;
obţinerea unor adsorbenti superficial poroşi cu diametrul în jur de 30 μm şi având un strat superficial
poros cu grosimea de 1-2 μm.
La ora actuală adsorbentii poroşi sunt utilizaţi cu precădere. În cromatografia lichid-solid clasica
diametrul particulelor este de până la 100 μm, în timp ce în cromatografia în strat subţire clasică, granulaţia
suportului este cuprinsă între 10-40 μm, utilizându-se ca suport în general silicagel şi alumina.
Câteva exemple de adsorbenti pe bază de silicagel poros accesibili comercial, utilizaţi în mod curent în LSC
sunt: Lichrospher (Merck), Porasil (Waters).
Faze mobile utilizate în cromatografia lichid-solid
În cromatografia LSC se utilizează un mare număr de faze mobile lichide, cât şi amestecuri ale acestora
de compoziţie fixa sau compoziţie variabilă în timp. În cromatografia de lichide, faza mobila poartă numele de
eluent, iar procesul de antrenare a solutului prin coloana de către faza mobila se numeşte eluţie. Pentru o
separare bună, în special în cazul componentelor cu polarităţi mult diferite, trebuie utilizată o fază mobila a
cărei putere de eluţie creşte. Această putere de eluţie este influenţată de trei factori:
interacţiunile dintre moleculele eluentului şi moleculele solutului;
interacţiunile dintre moleculele fazei mobile adsorbite şi moleculele de solut aflate în faza mobila
adsorbita;
interacţiunile dintre moleculele de faza mobila adsorbite şi adsorbent.
Rolul solvenţilor în LSC este foarte important, deoarece ei sunt în competiţie cu moleculele solutului
pentru centrii activi polari ai adsorbentului. Cu cât interacţiunile dintre faza mobilă şi faza staţionara sunt mai
puternice, cu atât adsorbţia solutului va fi mai slabă şi invers. Chiar de la începuturile cromatografiei de
adsorbţie s-a constatat că în cazul adsorbentilor polari solvenţii nepolari (de exemplu hidrocarburile alifatice
saturate sau halogenate) sunt eluenţi slabi în comparaţie cu solvenţii polari (alcooli, acizi).
Puritatea solvenţilor este un aspect foarte important în LSC, deoarece prezenţa apei sau a altor
compuşi polari poate afecta mult performanţele coloanei, iar eventuala prezenţa a unor compuşi care absorb
în UV este nedorită atunci când se folosesc detectoare în UV.
 Mărimea caracteristică pe baza căreia se poate stabili faza mobilă care trebuie utilizată pentru o
anumită separare în condiţiile unui adsorbent dat este tăria eluentului, care se defineşte ca fiind energia de
adsorbţie a moleculelor eluentului pe unitatea de suprafaţă a adsorbentului. Tăriile relative, notate cu ε 0, au
fost determinate pentru o serie de solvenţi pe diferiţi adsorbenti, considerând că referinţă pentanul. În cazul
unor amestecuri de eluenţi, tăriile acestora se pot calcula în funcţie de fracţiile molare şi tăriile solvenţilor ce
constituie amestecul.
Clasificarea solvenţilor în funcţie de tăria legăturii lor cu adsorbentul se face în serii eluotrope, care pot
fi utilizate pentru găsirea unui eluent cu o tărie potrivită pentru realizarea unei anumite separări. Este însa
indicat să se facă şi o testare a eluentului ales şi acest lucru se poate face mai rapid prin cromatografie în strat
subţire decât prin cromatografie pe coloana. Seria eluotropa reprezintă o serie de solvenţi cu putere de eluţie
crescătoare. În cazul adsorbentilor nepolari, tăria eluentului se datoreşte existenţei unor interacţiuni
nespecifice de tip Van der Waals şi creşte aproximativ cu masa moleculară a eluentului. Astfel, pentru cărbune
activ, seria eluotropa în ordinea creşterii puterii de eluţie este: apa, metanol, etanol, acetona, propanol, eter
etilic, butanol, acetat de etil, hexan. În cazul adsorbentilor polari, tăria eluentului creşte odată cu polaritatea
solventului, deci aproximativ invers decât la adsorbentii nepolari. Astfel, în cazul aluminei, seria eluotropa este
dată în tabelul de mai jos.
Seria eluotropa a tăriilor relative de solvenţi pe alumina

Solventul Tăria
relativă ε0

Pentan

Tetraclorura de carbon

Toluen

Benzen

Cloroform

Acetona

Dioxan

Acetat de etil

Acetonitril

Etanol

Metanol

Există serii eluotrope formate din amestecuri de mai mulţi solvenţi de polarităţi diferite, care pot fi
folosite pentru a realiza serii de eluenţi de o anumită tărie. Asemenea serii au fost propuse de Snyder şi un
exemplu, pe silicagel, este dat în tabelul de mai jos
Serii eluotrope din amestecuri de solvenţi, pe silicagel

Tăria relativă ε0 A B C

100% pentan 100% pentan 100% pentan

4,2% i-PrCl/pentan 3% diclormetan/pentan 4% benzen/pentan

10% i-PrCl /pentan 7% diclormetan/pentan 11% benzen/pentan

21% i-PrCl /pentan 14% diclormetan/pentan 26% benzen/pentan

 4 % eter/ pentan 26% diclormetan/pentan 4% acetat de etil/pentan

11 % eter/ pentan 50% diclormetan/pentan 11% acetat de etil/pentan

23 % eter/ pentan 82% diclormetan/pentan 23% acetat de etil/pentan

56% eter/pentan 3% acetonitril/benzen 56% acetat de etil/pentan

2 % metanol/eter 11 % acetonitril/benzen

4 % metanol/eter 31 % acetonitril/benzen

8 % metanol/eter 100% acetonitril

20 % metanol/eter

50 % metanol/eter

Se poate observa că amestecurile de 21% clorura de izopropil/pentan, 14% clorura de metile/pentan şi

26% benzen/pentan au aceeaşi putere de eluţie pe silicagel (egală cu 0,15), de aceea se numesc
echieluotropice. Putem avea cazuri de separări când, deşi factorii de capacitate au valori potrivite, separarea
componentelor, reflectată de valorile coeficientului de separare α, este necorespunzătoare. În asemenea
situaţii pentru creşterea coeficientului de separare este suficientă de multe ori doar modificarea eluentului
prin înlocuirea componentei mai polare, fără a modifica tăria eluentului. Acest lucru se poate face folosind un
eluent echieluotrop cu primul.
Pot exista şi anumite anomalii în comportarea unor solvenţi, acestea datorându-se unor efecte
secundare care nu au legătură cu procesul de adsorbţie, de exemplu formarea unor legături de hidrogen între
moleculele solutului şi eluentului.
În mod uzual, în cromatografia lichid-solid se foloseşte un adsorbent polar şi eluţia se realizează la
început cu un eluent nepolar, apoi cu tărie crescătoare a fazei mobile, fie prin tehnica eluţiei în trepte fie prin
cea cu gradient. Nu se recomanda utilizarea unui amestec de solvenţi în care o componentă foarte polară să fie
prezentă în cantitate prea mică, deorece acesta se va adsorbi preferenţial şi separarea va fi
necorespunzătoare. Se poate lucra şi cu faze inverse, când se folosesc adsorbenti nepolari cum sunt cărbunele
activ sau silicagelul cu suprafaţa silanizata. În aceste situaţii, eluentul este constituit dintr-un amestec de apă şi
un solvent organic miscibil cu apa, iar creşterea tăriei eluentului se realizează prin creşterea proporţiei de
solvent organic în acest amestec.
Tehnica cromatografiei lichid-solid pe coloana
Cromatografia de adsorbţie este potrivită mai ales pentru separarea compuşilor cu mase moleculare medii,
polari şi nepolari dar fără sarcini electrice.
Cromatografia de lichid-solid se poate realiza prin trei tehnici posibile:
- cromatografie lichid-solid clasică, pe coloana;
- cromatografie în strat subţire;
- cromatografie lichid-solid de înalta performanţa.
Dintre acestea, cromatografia lichid-solid pe coloana se utilizează practic numai în scopuri preparative, în timp
ce cea de înalta performanta se utilizează mai ales în scop analitic, dar şi preparativ.
Pentru a testa posibilitatea separării unui amestec de compuşi prin cromatografie lichid-solid este indicată
cromatografia în strat subţire. În acest scop se foloseşte adsorbentul care se preconizează a se utiliza în
separarea LSC (alumina sau silicagel în majoritatea cazurilor) şi prin TLC se poate stabili eluentul sau sistemul
de eluenţi cel mai potrivit. Pentru realizarea unei separări corespunzătoare sunt importante natura
adsorbentului, dimensiunile sale, dimensiunile coloanei şi viteza de eluţie.
Coloanele utilizate în LSC sunt confecţionate în general din sticlă, având lungimea cuprinsă între 10-90 cm şi
diametrul interior între 1-5 cm. Raportul dintre lungimea şi diametrul coloanei trebuie să fie în intervalul 10-
20. Aceste coloane pot fi prevăzute cu şlifuri la ambele capete, pentru a permite ataşarea unei pâlnii de
separare pe post de rezervor de solvent în partea superioară, respectiv a unui vas de tip Büchner în partea
inferioară pentru colectarea fracţiunilor eluate.

Coloana utilizată pentru cromatografia lichid-solid

Tehnica cromatografiei LSC pe coloana consta din trei etape principale:
- umplerea şi pregătirea coloanei;
- încărcarea probei;
- eluţia componentelor probei.
Umplerea coloanei se poate face prin două tehnici: uscată şi umedă. Tehnica umplerii uscate se utilizează mai
puţin, deoarece necesită cantităţi mai mari de adsorbent. Pentru a realiza separări cu o coloană umplută prin
tehnica umedă, este necesară o cantitate de adsorbent de 20-50 de ori mai mare faţă de cantitatea de probă
care va fi supusă separării. Dacă componentele separate au polaritate apropiată, acest raport trebuie mărit la
100-200. Diametrul particulelor de adsorbent utilizate în separările LSC este cuprins între 0,05-0,5 mm.
Particule mai mici duc la o viteză de curgere mult prea redusă prin coloana, în timp ce particule mai mari
determina o separare necorespunzătoare. Viteza optimă de eluţie depinde de mulţi factori, cum este natura şi
diametrul particulelor de adsorbent, lungimea coloanei şi natura compuşilor care trebuie separaţi. Pentru a
realiza umplerea prin tehnica umedă, se realizează o suspensie de o parte adsorbent la cinci părţi faza mobilă
şi aceasta suspensie este introdusă în coloană. Coloana trebuie să fie uscată şi să aibă în partea inferioară un
opritor din sticlă sinterizată, vată de sticlă sau nisip, cât şi un robinet pentru se a putea regla debitul de eluţie.
În timpul umplerii coloana trebuie să se găsească în poziţie verticală, iar introducerea suspensiei este dirijată
cu ajutorul unei baghete de sticlă pentru că aşezarea ei în coloana să fie uniforma. După introducerea primei
porţiuni de suspensie, se deschide robinetul pentru evacuarea solventului cu viteză mică şi numai după aceea
se adauga următoare porţiune. Aceasta adăugare trebuie efectuată înainte că porţiunea precedenta să se fi
aşezat complet, altfel umplutura se va aşeza în straturi. De asemenea, nu este permis că nivelul lichidului să
scadă sub nivelul stratului de adorbent, acesta trebuind să se găsească permanent în lichid. După umplere,
coloana nu are voie să prezinte goluri, canale, crăpături sau alte neuniformităţi. După terminarea umplerii,
peste partea superioară a stratului de adsorbent se pune în general un disc de hâtrie de filtru cu diametrul egal
cu diametrul interior al coloanei sau un strat de nisip de 0,5 cm grosime, pentru a preveni dislocarea sa în
momentul introducerii probei. Apoi se scurge solventul din coloana până când nivelul lichidului ajunge chiar
deasupra nivelului umpluturii. În acest moment coloana este pregătită pentru utilizare.
Introducerea probei se face prin aplicarea ei în partea superioară a coloanei, cel mai bine cu ajutorul unei
pipete Pasteur. Proba trebuie să se găsească într-un volum minim de solvent, de preferinţă acelaşi cu cel
folosit pentru eluare. Pentru o coloană de 40 cm lungime şi 2 cm diametru volumul ideal de soluţie de probă
este de 1-2 ml. După aplicarea probei se deschide robinetul de la partea inferioară a coloanei şi probă este
lăsată să intre complet în adsorbent. Apoi cu un volum cât mai mic de solvent se spala pereţii coloanei şi
această porţiune de solvent este de asemenea lăsată să intre în adsorbent. Intrarea completă a probei în
stratul de adsorbent înainte de începerea eluţiei este necesară pentru a preveni diluarea probei. Apoi coloana
se umple complet cu eluent şi în partea sa superioară se ataşează rezervorul de eluent. După începerea eluării,
fluxul de solvent prin coloana nu mai este permis să fie oprit, deoarece ar duce la dispersia excesivă a
componentelor.

Introducerea probei în coloana LSC: (a) nivelul solventului se găseşte chiar deasupra nivelului umpluturii; (b)
aplicarea probei; (c) intrarea probei în adsorbent; (d) spălarea pereţilor coloanei cu solvent; (e) intrarea acestei
soluţii în adsorbent; (f) umplerea coloanei cu eluent.
Uneori proba nu este complet solubilă în solventul sau amestecul de solvenţi folosit pentru eluare, dar se
dizolvă într-un solvent mai polar. Nu este permisă introducerea unei probe incomplet dizolvate, dar nici
dizolvate într-un alt solvent mai polar, deoarece ar duce la separări necorespunzătoare. În aceste situaţii se
recomanda dizolvarea probei în solventul mai polar, adăugarea la această soluţie a unei cantităţi de adsorbent
de 2-10 ori mai mare decât greutatea probei şi evaporarea solventului (la un evaporator rotativ) astfel ca
proba să rămână adsorbita. Acest material se introduce apoi în partea superioară a coloanei şi va fi desorbita
în timpul trecerii eluentului.
Eluţia componentelor se poate realiza în trei moduri:
Eluţie izocratica, cu un singur eluent sau cu un amestec de eluenţi de compoziţie constantă;
Eluţie în trepte, utilizând o serie eluotropa de solvenţi cu putere de eluţie crescătoare sau o serie
eluotropa de amestecuri de doi solvenţi, având în general valori ε0 apropiate, pentru separări mai
fine.
Eluţie cu gradient, utilizând un amestec de doi solvenţi a cărui compoziţie este modificată continuu în
timpul eluţiei.
În cazul în care adsorbentul este polar, alumina sau silicagel, componentele nepolare vor avea o interctiune
mai slabă cu adsorbentul şi vor elua primele. Eluţia izocratica este recomandată mai ales atunci când se
urmăreşte separarea unei componente nepolare dintr-un amestec cu altele mai polare. În acest caz se
foloseşte un eluent cu polaritate apropiată de cea a componenţei urmărite, care va elua doar compusul
respectiv, ceilalţi compuşi, mai polari, rămânând adsorbiţi în partea superioară a coloanei.
Dacă după eluarea componentei sau componentelor mai puţin polare vrem să eluam şi componentele mai
polare, avem nevoie de un eluent cu tărie mai mare. O asemenea eluţie se poate face în trepte, folosind o
serie eluotropa de polaritate crescătoare. Nu se recomanda o variaţie prea bruscă a compoziţiei fazei mobile,
mai ales dacă se face o trecere de la solvenţi aprotici la solvenţi protici. Astfel, dacă se face trecerea de la
pentan la toluen, aceasta se face secvenţial cu amestecuri de 10%, 50% şi 70% toluen în pentan, iar în cazul
trecerii de la acetona la metanol numărul treptelor trebuie să fie mai mare, de exemplu 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40,
70 şi în final 100% metanol.
Eluarea cu gradient este utilizată atunci când se urmăreşte schimbarea compoziţiei eluentului într-o manieră
constantă şi uniforma, nu abruptă decât în cazul eluţiei în trepte. Acest tip de eluţie se poate realiza utilizând
două rezervoare, unul conţinând solventul mai polar iar celălalt pe cel nepolar (Figura 4.8). Solventul mai polar
trece, cu debitul F1, într-o cameră de amestecare în care se găseşte solventul mai puţin polar. Din această
cameră, are loc trecerea amestecului de solvenţi în coloană, cu debitul F 2. Se pot genera diferiţi gradienţi prin
variaţia celor două debite. Prin utilizare eluţiei cu gradient, se pot separa într-o singură analiza compuşi cu
polarităţi mult diferite.
Regula cea mai importantă în cromatografia de adsorbţie lichid-solid este ca polaritatea (tăria) fazei mobile
este fie menţinută constantă în timpul analizei (în cazul eluţiei izocratice) fie este crescătoare, dar niciodată ea
nu este descrescătoare.

Realizarea gradientului de faza mobila

Detectarea componentelor separate în coloana se poate face prin diferite metode. Pentru aceasta, se
colectează în general fracţiuni de volume egale, manual sau utilizând un colector de fracţiuni. Aceste fracţiuni
se analizează prin cromatografie în strat subţire, cromatografie de gaze sau spectrofotometrie în UV, apoi
fracţiunile cu compoziţie identică se reunesc şi se supun evaporării pentru îndepărtarea solventului. Aceasta
evaporare se face în general la un evaporator rotativ de vid. Există şi posibilitatea utilizării unor detectoare UV-
VIS automate care se conectează la ieşirea din coloana şi permit monitorizarea componentelor eluate, cu
condiţia ca acestea să absoarbă în domeniul UV sau vizibil, iar eluentul utilizat să nu aibă absorbţie .
Detectarea şi colectarea fracţiunilor eluate
Cromatografia de repartiţie lichid-lichid
Cromatografia lichid-lichid (LLC) are acelaşi principiu ca şi extracţia, adică se bazează pe distribuţia moleculelor
solutului între două faze lichide nemiscibile, în conformitate cu solubilitatea acestora în cele două faze. Mediul
care realizează separarea consta dintr-un suport inert (silicagel, kieselguhr) pe care este depus un strat de faza
staţionara lichidă, iar separarea se realizează prin trecerea unui flux de faza mobila ce conţine proba analizată
peste faza staţionară. Faza staţionara se poate găsi împachetata într-o coloană sau dispusă în strat subţire pe o
placă de sticlă sau folie de aluminiu.
Faze staţionare. Faze staţionare legate chimic
Cromatografia lichid-lichid se clasifica în funcţie de polaritatea relativă a fazei staţionare şi fazei mobile în două
categorii:
Cromatografie lichid-lichid pe faze normale, în care faza staţionara este polară iar faza mobila
nepolara;
Cromatografie lichid-lichid pe faze inverse, în care faza staţionara este nepolara iar faza mobila polară .
În cazul cromatografiei pe faze normale, ordinea de eluţie este bazată pe principiul că componenţii
nepolari vor avea o preferinţă pentru faza mobilă şi vor elua mai repede, în timp ce componenţii mai polari vor
avea o afinitate mai mare faţă de faza staţionară şi vor elua mai târziu. În cazul cromatografiei pe faze inverse,
ordinea de eluţie va fi inversată, în sensul că primii vor elua componenţii mai polari. Utilizarea pe scară foarte
largă a cromatografiei pe faze inverse (RPC) la ora actuală se bazează pe faptul că majoritatea compuşilor
organici au în structura lor regiuni hidrofobe şi în consecinţă vor putea interacţiona cu fazele staţionare
nepolare. Întrucât faza mobila în cazul RPC conţine în mod uzual apa, această metodă este foarte bună pentru
şi pentru separarea substanţelor polare care sunt fie insolubile în solvenţi organici, fie se leagă prea puternic
de adsorbentii polari pentru a putea fi separate prin cromatografie lichid-solid. Un alt avantaj important al
cromatografie pe faze inverse este ca solvenţii utilizaţi nu trebuie anhidrificati.
 Câteva faze staţionare tipice şi faze mobile utilizate în cromatografia de lichide pe faze normale şi faze
inverse sunt prezentate în tabelul de mai jos.
Faze mobile şi faze staţionare în cromatografia lichid-lichid

Faze staţionare Faze mobile

Faze normale

β,β'-oxi-dipropionitril Hidrocarburi săturate (hexan, heptan),

Polietilenglicoli (Carbowax)

Glicoli (etilen, dietilen) Hidrocarburi aromatice (toluen, xilen),

Cloroform, clorura de metilen

Faze inverse

Squalan Apa, amestecuri apa-alcool (metanol),

Amestecuri apa-acetonitril
Dimetilpolisiloxan

Cianoetilsilicon

Deşi faza staţionară şi cea mobila sunt astfel alese încât miscibilitatea lor să fie minimă, chiar şi o
solubilitate foarte mică a fazei staţionare în faza mobila duce la antrenarea ei în timpul curgerii fazei mobile
prin coloana. Din acest motiv, faza mobilă trebuie să fie saturata cu faza staţionara respectivă înainte de a intra
în coloană. Acest lucru se realizează în general prin utilizarea unei precoloane (coloane de protecţie) situate
înaintea coloanei cromatografice. Aceasta trebuie să conţină o umplutură cu granulaţie mare (silicagel de 30-
60 mesh, de exemplu) pe care să fie depusă o concentraţie ridicată (30-40%) din aceeaşi fază staţionara care se
găseşte şi în coloana de analiza.
Suportul fazei staţionare este constituit dintr-un material relativ inert, ca de exemplu: alumina,
polimeri sintetici (polimetacrilat, copolimer stiren-divinilbenzen), sticla şi mai ales silicagel, care are avantajul
că poate fi uşor modificat chimic. Este important că suportul să nu interacţioneze cu solutul, astfel că
mecanismul retenţiei să nu fie unul mixt, de repartiţie şi adsorbţie ci numai de repartiţie. Din acest motiv,
atunci când se folosesc adsorbenti poroşi drept suport este necesar să se realizeze o încărcare avansată a
suportului cu faza staţionară, pentru a acoperi toţi centrii activi. Suporturile pot să fie de două tipuri: poroase
sau superficial poroase. Cele poroase pot fi încărcate cu o cantitate mai mare de faza staţionară (între 10-30%),
dar eficientă lor de separare este mai scăzută. Suporturile superficial poroase se pot încărca numai cu 0,5-1,5%
faza staţionară, însa au o eficienţă de separare mai mare. Eficienta de separare depinde foarte mult de
dimensiunile particulelor de suport, fiind cu atât mai mare cu cât aceste dimensiuni sunt mai mici. La ora
actuală în cromatografia de lichide de înalta performanta se utilizează suporturi de silicagel total poros cu
dimensiuni uniforme, între 3 şi 10 μm, de formă neregulată sau sferică. Cele mai eficiente sunt cele sferice
Imaginea la microscopul electronic a unui suport cromatografic de silicagel poros
Pentru a elimina problemele legate de pierderea fazei staţionare de pe suport în timpul eluţiei, se utilizează
legarea chimică a fazei staţionare de materialul suportului. Acest tip de cromatografie de lichide se
numeşte cromatografie cu faze chimic legate (BPC). Reacţiile cele mai mult utilizate pentru obţinerea acestui
tip de faze staţionare sunt cele de sililare. Ele constau în reacţia grupărilor silanolice de la suprafaţa
silicagelului cu clorsilani substituiţi. Un exemplu în acest sens este reacţia cu un alchil-dimetilclorsilan, în urma
căreia ia naştere o fază chimic legată monomerica, întrucât fiecare moleculă de agent de sililare poate
reacţiona doar cu o singură grupă silanolica .

Dacă se utilizează di- sau triclorsilani în prezenţa de umiditate se va forma un strat polimeric pe suprafaţa
silicagelului, adică o fază chimic legată polimerică.
 Grupările silanolice Şi-OH vor fi capabile să adsoarbă compuşii polari şi deci vor afecta proprietăţile
fazei chimic legate, în general în mod nedorit. Aceste deficienţe pot fi eliminate prin inactivarea grupărilor
silanolice reziduale prin reacţie cu trimetilclorsilan sau hexametildisilazan.
Modul de interacţiune al fazei staţionare chimic legate cu soluţii va depinde de natura grupării
funcţionale R, cele mai utilizate faze fiind cele nepolare, la care gruparea R este octadecil C-18. Acestea vor fi
aşadar faze staţionare inverse. Alte grupări R de tip nepolar care se folosesc în cazul suporturilor chimic legate
sunt cele de tip octil sau ciclohexil. Se utilizează şi faze staţionare chimic legate care au grupări polarizabile, de
tip fenil, sau polare, de tip aminopropil, cianopropil sau diol. Cele cu grupări polare vor fi faze staţionare
normale, utilizate pentru separarea compuşilor polari.
O proprietate importanta a fazelor staţionare siloxanice este stabilitatea lor ridicată în condiţiile de analiza. Ele
sunt atacate doar în condiţii puternic acide (pH < 2) sau puternic bazice (pH > 9). Un mare număr de asemenea
faze staţionare destinate analizelor HPLC sunt comercializate sub diverse denumiri.
Faza mobila
În cromatografia de lichide, alegerea naturii şi compoziţiei fazei mobile are o importanţă crucială
pentru a obţine o separare eficienta. Puritatea solvenţilor utilizaţi este esenţială. Ele nu pot conţine alte
materiale decât în urme. În cazul utilizării de detectoare în UV, solvenţii trebuie să fie lipsiţi chiar şi de urme de
substanţe care să absoarbă în UV. De asemenea, prezenţa unor particule solide în faza mobila poate determina
distrugerea pompei sau injectorului sau înfundarea coloanei. Din aceste motive, solvenţii cromatografici sunt
scumpi şi costul lor reprezintă cea mai mare parte a costului unei analize cromatografice. Au apărut sisteme
cromatografice care realizează recircularea solventului în cazul în care acesta nu conţine un solut detectabil,
pentru a reduce costurile.
Proprietatea cea mai importantă a solvenţilor utilizaţi în cromatografia de lichide este polaritatea.
Puterea de eluţie a unei faze mobile depinde de polaritatea sa totală, polaritatea fazei staţionare şi natura
componenţilor analizaţi. În cazul separărilor pe faze normale, puterea de eluţie creşte odată cu creşterea
polarităţii solventului, iar în cazul separărilor pe faze inverse ea scade cu creşterea polarităţii solventului.
Popularitatea cromatografiei pe faze inverse este determinată în mare parte de avantajele utilizării unor faze
mobile polare ca apa şi metanolul: ele sunt mai ieftine, în general mai pure şi mai puţin toxice decât solvenţii
nepolari.
 Deşi nu exista o metodă care să permită determinarea exactă a valorii polarităţii, cea mai răspândită
este utilizarea indicelui de polaritate P care reprezintă coeficientul de repartiţie al substanţei respective între
octanol şi apă şi a fost introdus de Snyder. Aceşti indici au fost determinaţi pe baza unor date gaz-
cromatografice şi ele sunt accesibile pentru un număr de 81 de solvenţi. Pe baza indicelui de polaritate
solvenţii se clasifica în 8 categorii. Se considera că utilizarea indicelui de polaritate este mai adecvată decât
varianta mai veche care clasifica solvenţii în serii eluotrope pe baza tăriei relative de eluţie a solventului ε0.
Indicele de polaritate ia valori între -2 şi 10,2 şi practic orice valoare în cadrul acestui interval poate fi obţinută
prin amestecarea a doi sau mai mulţi solvenţi. Valorile indicelui de polaritate şi tăriei de eluţie pentru câţiva
solvenţi uzuali sunt date în tabelul de mai jos.
Proprietăţile unor solvenţi utilizaţi în cromatografia de lichide.

Denumirea solventului Indicele de polaritate P Tăria de eluţie ε0

(pe oxid de aluminiu)

Fluoroalcani < -2

Ciclohexan

n-Hexan

Tetraclorura de carbon

Toluen 

Clorbenzen

Eter etilic

Clorura de metilen

Tetrahidrofuran

Cloroform

Etanol

1,4-Dioxan

Metanol

2-Propanona

Acetonitril

Nitrometan

Etilenglicol

Dimetilsulfoxid

Apa mare

Există şi o serie de alte proprietăţi ale solvenţilor în afară de polaritate care au importanţă în
cromatografia de lichide: temperatura de fierbere, vâscozitatea, inflamabilitatea, toxicitatea.
Solventul trebuie întotdeauna filtrat înainte de a fi introdus în rezervorul de solvent al cromatografului.
Este foarte importantă de asemenea eliminarea aerului dizolvat sau sub formă de bule din solvent, ceea ce se
face prin degazare în vid, prin barbotare de heliu, prin încălzire sau ultrasonare, primele două metode fiind
cele uzuale.
 Eluţia în cromatografia de lichide de înalta performanta se poate face în două variante:
- eluţie izocratica
- eluţie cu gradient
Eluţia cu gradient se utilizează mai ales în cromatografia de lichide cu faze chimic legate şi în special în
cea cu faze inverse. Cele mai mult folosite sisteme binare pentru eluţia cu gradient sunt metanol-apa şi
acetonitril-apa. Dintre acestea, sistemul metanol-apa se foloseşte pentru eluarea compuşilor mai polari. Dacă
polaritatea compuşilor analizaţi este foarte asemănătoare, de multe ori este nevoie de folosirea unui sitem
ternar de eluţie pentru a ajusta mai fin polaritatea fazei mobile. Cel de-al treilea solvent folosit este de multe
ori tetrahidrofuranul.
Optimizarea compoziţiei fazei mobile
Modificarea compoziţiei fazei mobile reprezintă cea mai simplă metoda pentru a influenţa rezoluţia
componenţilor în cromatografia de lichide. Pentru separări relativ simple, este posibil ca analiza să fie
efectuată cu un singur amestec de solvenţi, adică în sistem izocratic. Totuşi, găsirea amestecului optim nu este
uşoară ţinând cont de faptul că în general este vorba despre un amestec de doi (binar) până la patru
(cuaternar) solvenţi. Există o serie de metode pentru determinarea acestui punct optim bazate pe secvenţe de
analize care permit ajustarea compoziţiei până la atingerea celei optime, pe baza unor algoritmuri de tip
simplex. Dezavantajul unei asemenea metode este că necesita un număr mare de determinări cromatografice.
Cea mai bună metodă de determinare a compoziţiei optime consta în folosirea unui triunghi (în cazul
sistemelor ternare) respectiv a unui tetraedru (în cazul sistemelor cuaternare), compoziţia optimă fiind data de
un punct în interiorul aceşti triunghi sau tetraedru.

Optimizarea compoziţiei fazei mobile

Aceste optimizări încep realizarea unor analize cu gradient de eluţie de la 0 la 100% pentru perechile
de solvenţi, care duc la stabilirea unei drepte (pentru sistemele ternare) respectiv a unui plan (pentru
sistemele cuaternare) în interiorul căruia se determina apoi compoziţia optimă.
Se pot folosi şi metode care să necesite un număr mai mic de experimente, pe baza unor programe de
calculator care sunt accesibile comercial. Asemenea optimizări se practică mai ales în cazul cromatografiei cu
faza inversă şi ele permit înlocuirea eluţiei cu gradient de solvent cu eluţia izocratica. Avantajul eluţiei
izocratice sunt că este mai rapidă, ceea ce este avantajos mai ales în cazul analizelor în serie şi că nu necesită
reechilibrarea (revenirea la compoziţia iniţială) după fiecare analiză, ceea ce duce la reducerea timpului de
analiza.
Aparatura utilizată în cromatografia lichid-lichid
Aşa cum s-a arătat, cromatografia de lichide de înalta performanta s-a dezvoltat după ce teoria separărilor
cromatografice a demonstrat că pentru obţinerea unei eficiente de separare ridicate, comparabilă cu cea
realizată în cromatografia de gaze, este nevoie de utilizarea unor umpluturi cu granulaţie fină, de ordinul a 5-
10 μm. Pentru a avea însa viteze de eluţie corespunzătoare, în aceste situaţii se impune folosirea unor presiuni
ridicate la intrarea eluentului în coloană. Pe de altă parte, folosirea unor coloane scurte a dus la scăderea
importanta a capacităţii de încărcare cu proba, ceea ce a necesitat construirea unor detectoare de mare
sensibilitate.
 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide de înalta performanta este dată în figură de mai jos:

Schema unui cromatograf de lichide de înalta performanţa (HPLC)

Principalele componente ale cromatografului de lichide sunt:
- sistemul de alimentare cu faza mobila
- dispozitivul pentru introducerea probei
- una sau două pompe
- coloană
- detectorul
- sistemul de prelucrare a datelor
Sistemul de alimentare cu faza mobila
Cuprinde următoarele dispozitive, care pot fi asamblate în diferite configuraţii:
- rezervoarele de solvenţi ;
- dispozitivul pentru degazarea solvenţilor;
- dispozitivul pentru realizarea gradientului de solvenţi.
Dispozitivul pentru degazare este necesar pentru îndepărtarea din solvenţi a gazelor dizolvate, mai
ales a oxigenului, care în timpul trecerii prin coloana ar putea reacţiona cu faza staţionară, sau ar putea forma
bule de gaz cu influenţa nefavorabila atât asupra separării cât mai ales a detecţiei, ţinând cont de volumul
foarte mic al celulelor detectoarelor moderne. Degazarea se realizează în două moduri:
prin barbotare de heliu în rezervorul de solvent;
prin trecerea solventului printr-o unitate de degazare cu vid, unitate prevăzută cu o tubulatură de
teflon care permite difuzarea prin pereţi a gazelor prezente în solvent, dar nu şi a moleculelor
solventului.
 Rezervor de solvent utilizat în cromatografia HPLC

Dispozitiv de degazare a solvenţilor cu vid

Dispozitivul pentru alimentarea cu solvenţi poate fi foarte diferit ca şi complexitate, de la un simplu
rezervor de solvenţi în cazul eluţiei izocratice până la un programator de eluent pentru doi sau trei solvenţi.
Prin eluţia cu gradient de solvent se poate realiza separarea componentelor care nu se separă prin eluţie
izocratica. Este foarte eficientă mai ales dacă polaritatea componentelor analizate diferă foarte mult.
Există două tipuri de sisteme de eluţie cu gradient de solvent:
Sistemul cu gradient de joasă presiune, în care solvenţii se preiau din rezervoare diferite într-o cameră
de amestecare, apoi amestecul de solvenţi este pompat prin coloana . Cromatografele moderne poseda
electrovalve de proporţionare pentru solvenţi, comandate de un microprocesor. În acest mod creşte rezoluţia,
se reduce timpul de analiză şi creşte şi sensibilitatea analizei.
Formarea gradientului de solvenţi cu ajutorul sistemului cu vâlvă de proporţionare
Multe cromatografe de lichide moderne poseda sisteme pentru vehicularea solvenţilor care pot
amesteca doi sau mai mulţi solvenţi, progresiv, într-un raport cuprins între 0 şi 100% pentru oricare solvent. Se
obţine o diagramă de compoziţie în funcţie de timp care poate avea forma liniara, convexa sau concava.
Programerea compoziţiei eluentului îndeplineşte acelaşi rol în cromatografia de lichide ca programarea de
temperatură în cromatografia de gaze, permiţând separarea picurilor neseparate corespunzător, fără a afecta
rezoluţia celorlalte picuri. Găsirea programului optim necesita timp şi eluţia cu gradient poate avea şi anumite
inconveniente. De exemplu, este nevoie de un timp la sfârşitul fiecărei analize pentru a reveni la compoziţia
iniţială a eluentului, iar dacă unul din solvenţi are un semnal mai puternic în detector decât ceilalţi, se va
înregistra o derivă a liniei de bază (drift). Din acest motiv, pentru separarea unor amestecuri mai simple, se
preferă eluţia izocratica deşi timpul de analiză este mai mare, însa nu se mai consuma timp pentru găsirea
programului ideal pentru eluţia cu gradient.
Avantajul acestui sistem de gradient este că se foloseşte o singură pompa, deşi până la urma sistemul
de programare cu ventile de proporţionare este aproape tot aşa de complicat şi de scump ca şi utilizarea unei a
două pompe.
Sistemul cu gradient de înalta presiune, care operează cu câte o pompă pentru fiecare solvent. În
general, aceste pompe sunt deservite de motoare pas cu pas, iar debitul pompei este controlat de frecvenţă
de alimentare a motorului respectiv. Acest sistem este mai scump decât celalat, însa reproductibilitatea
rezultatelor este mai bună.
Dispozitive pentru introducerea probei
Introducerea probelor poate fi realizată în două moduri: prin injecţie cu ajutorul unei seringi sau prin
folosirea unei valve (robinet) de injecţie cu mai multe canale . Injecţia cu seringi se aplică mult mai puţin decât
în cromatografia de gaze pentru că ea necesita seringi rezistente la presiune ridicată şi un septum construit
dintr-un material care să nu permită extragerea unor compuşi de către faza mobilă, care să dea naştere unor
picuri-fantoma.
Valvele de injecţie permit introducerea reproductibilă a probelor în coloanele cromatografice aflate
sub presiune, fără întreruperea curgerii fazei mobile. Probă este încărcată la presiune atmosferică într-o buclă
exterioară a valvei de injecţie şi este apoi introdusă în faza mobila printr-o simplă rotire a valvei. Volumul de
probă introdusa variază între 2μl şi mai mult de 100 μl şi poate fi modificat prin schimbarea buclei de injecţie
sau folosind valve speciale cu volum variabil de probă. Pentru analize în serie se recomanda folosirea unor
dispozitive de introducere automată a probelor.
Dispozitiv pentru introducerea probei cu bucla de probă cu volum determinat
Coloana cromatografică
În mod obişnuit, coloanele cromatografice utilizate în analizele HPLC sunt confecţionate din oţel inoxidabil, au
lungimea cuprinsă între 10-30 cm şi diametrul interior de 4 sau 5 mm. Pentru reţinerea fazei staţionare în
coloană, la capetele acesteia se găsesc două frite din oţel inoxidabil cu ochiuri de 2 μm sau mai puţin.
Umpluturile folosite în cromatografia de lichide modernă au dimensiuni mici, sunt rigide şi uniforme.
Ele pot fi clasificate în următoarele categorii:
Particule polimerice pe bază de copolimer stiren-divinilbenzen. Acestea se folosesc pentru
cromatografia de schimb ionic şi cromatografia de excluziune sterică, însa au fost înlocuite pentru
o serie de aplicaţii de umpluturi pe bază de silicagel care sunt mai eficiente şi mai stabile mecanic.
Particule superficial poroase (peliculare), cu diametrul cuprins între 30-55 μm, care constau dintr-un
înveliş subţire (1-3 μm) de silicagel, dispus pe un nucleu dintr-un material inert, de exemplu
granule sferice de sticlă. Asemenea umpluturi peliculare se mai folosesc în anumite aplicaţii de
cromatografie de schimb ionic, însa utilizarea lor a înregistrat un puternic regres odată cu
dezvoltarea umputurilor total poroase.
Particule total poroase de silicagel, cu diametre mai mici decât 10 μm care sunt cele mai folosite la ora
actuală pentru coloanele analitice HPLC. Comparativ cu umpluturile peliculare, ele oferă o serie de
avantaje în ce priveşte eficienta coloanei, capacitatea de încărcare cu probă şi viteza analizei.
Dezvoltarea fazelor staţionare chimic legate a avut de asemenea o mare importanţă pentru pentru
cromatografia lichid-lichid pe coloane de silicagel.
Procedura aleasă pentru umplerea coloanei depinde în mare măsură de caracteristicile mecanice ale
umpluturii. În cazul umpluturilor cu particule de diametre mai mari de 20 μm se poate folosi tehnica de
umplere uscată, în timp ce în cazul celor cu diametre mai mici de 20 μm se face umplere umedă, adică
particulele se suspendă într-un solvent şi suspensia rezultată se introduce în coloană, sub presiune. În general
se preferă achiziţionarea unor coloane gata umplute de la firmele de specialitate, având caracteristici definite
în cataloagele acestor firme. Lungimea coloanelor este standardizată, fiind de 300, 250, 150, 100 şi 75 mm.
Coloanele mai lungi vor avea un număr mai mare de talere teoretice, ele fiind considerate standard. Coloanele
mai scurte au avantajul unei viteze de separare mai mari şi a unui timp de analiza mai redus.
Diametrul standard al umpluturilor folosite în HPLC este de 5 μm. Umpluturile mai fine sunt mai
eficiente (reducerea la jumătate a diametrului particulelor determina dublarea eficienţei de separare), însa mai
scumpe.
Se fabrică o gamă largă de coloane analitice, având diametrele interioare cuprinse în intervalul de la
4,6 mm la mai puţin de 0,2 mm. Coloanele preparative au diametrul mai mare de 50 mm. În principiu, cu cât
diametrul coloanei este mai mare, încărcarea cu probă vă fi mai mare, deci se va putea injecta o cantitate mai
mare de probă. Pe de altă parte, exista o serie de elemente care fac coloanele mai înguste mai atractive pentru
separările analitice. Astfel, coloanele mai înguste vor necesita un consum mai mic de solvent, determinând
economii importante. Un alt avantaj important este ca picul solutului va elua într-un volum mai mic şi întrucât
răspunsul majorităţii detectoarelor depinde de concentraţie rezultă că înălţimea picului va fi mai mare iar
limita de detecţie va fi redusă. Aceste avantaje au dus la dezvoltarea unor coloane capilare cu diametrul
interior redus până la 0,1 mm, însa folosirea acestora creează o serie de alte probleme, cum ar fi cele generate
de necesitatea de a lucra cu debite foarte mici de faza mobila sau de a reduce foarte mult volumele moarte, de
exemplu cele care apar la conexiunea dintre diferitele componente ale aparatului.
În general, pentru coloanele înguste cu diametre între 2 şi 0,5 mm se foloseşte termenul "microbore",
în timp ce coloanele cu diametre mai mici decât 0,5 mm sunt denumite microcoloane. Microcolanele, la rândul
lor, se subîmpart în coloane capilare umplute (diametre între 0,04-0,3 mm) şi coloane capilare deschise, cu
diametre între 3-50 μm. Acestea din urmă sunt construite din sticlă specială şi din punct de vedere constructiv
sunt similare cu coloanele capilare folosite în cromatografia de gaze. Deşi folosirea lor necesită o aparatura
specială în ce priveşte construcţia pompei şi a detectorului, care să opereze la debite de faza mobila foarte
mici, de până la 1μl/min, ele permit realizarea unor separări cu o eficienţă mai mare de 100.000 talere
teoretice într-un timp de analiza mai mic de 30 de minute, cu un consum foarte scăzut de faza mobila.
Pentru creşterea duratei de utilizare a unei coloane de analiza HPLC se recomanda introducerea unei
coloane de protecţie (precoloana, guard column). Aceasta este o coloană mică ce se amplasează între injector
şi coloana analitică şi previne pierderea eficienţei coloanei analitice datorită prezenţei anumitor impurităţi
prezente în proba sau solvent, de exemplu a celor care se adsorb foarte puternic. Un alt rol posibil al acestei
coloane este de a satura solventul cu faza staţionară şi a preveni astfel antrenarea fazei staţionare din coloana
analitică. Coloanele de protecţie sunt umplute cu faza staţionara microporoasa sau peliculara. Cele peliculare
sunt mai uşoare de manipulat la umplere însa trebuie schimbate mai frecvent deoarece capacitatea lor de
reţinere este mai scăzută.
Pompe utilizate în cromatografia de lichide
La ora actuală exista un mare număr de pompe care pot fi utilizate în cromatografia de lichide, dintre
care unele sunt destinate numai unor aplicaţii specifice.
Aceste pompe sunt de două tipuri:
- pompe pneumatice, care sunt pompe cu presiune constantă;
- pompe mecanice, care sunt pompe cu debit constant.
Pompele pneumatice sunt acţionate sub influenţa presiunii aerului. Avantajele lor sunt construcţia
simplă, costul redus şi posibilitatea realizării unor presiuni foarte mari. Pe ansamblu însa ele sunt inferioare
pompelor mecanice, dezavantajul major fiind acela că viteza de curgere se modifica la schimbarea vâscozităţii
eluentului, ceea ce le face neoperabile în cazul sistemelor de eluţie cu gradient. Pompele pneumatice se
folosesc la ora actuală pentru umplerea coloanelor cu faza staţionara prin metoda umedă şi, în anumite cazuri,
pentru realizarea debitelor mari necesare pentru cromatografia preparativa.

Pompele mecanice sunt utilizate în majoritatea aplicaţiilor. Ele sunt pompe cu piston, care eliberează
solventul în mod constant, fără a necesita oprire pentru reîncărcare că pompele pneumatice. Debitul lor
rămâne constant chiar în condiţiile modificării unor caracteristici ale eluentului ca vâscozitatea sau
temperatura şi de aceea pot fi folosite în combinaţie cu detectoarele de mare sensibilitate, întrucât nu duc la
modificări ale zgomotului de fond al acestora. Dezavantajul lor principal este ca orice defecţiune care
afectează curgerea eluentului duce la creşterea bruscă a presiunii în sistem. Pentru evitarea accidentelor,
aceste pompe sunt prevăzute cu limitatoare de presiune, care opresc pompa dacă se atinge o presiune
maximă stabilită.
Cel mai simplu, mai ieftin şi drept urmare mai folosit tip de pompă este pompa cu un singur piston (cu
mişcare alternativă - "reciprocating"). Aceasta a fost prima pompă de presiune înalta folosită pentru coloane
cu particule de dimensiuni mici. Schema acestei pompe este prezentată în figură de mai jos.
Pompă de înalta presiune cu un singur piston
Aceasta pompa consta dintr-un piston confecţionat din safir, în mod uzual având diametru de 3-4 mm
şi lungime de aproximativ 4 cm care se găseşte într-un cilindru din oţel inoxidabil. Mişcarea pistonului este
comandată de un rotor excentric care are un profil special ce permite ca mişcarea de refulare să fie liniara şi
uniforma iar cea de aspiraţie neliniară şi rapidă. Întoarcerea pistonului pentru cursa de aspiraţie este
determinată de un arc de întoarcere. Intrarea şi ieşirea solventului din pompa sunt reglate cu ajutorul a doua
robinete cu o singură cale, care nu permit deplasarea sa decât într-o singură direcţie. Volumul de solvent
pompat la o cursă a pistonului este în mod uzual în jur de 250 μl, dar poate fi redus până la 2-5 μl dacă se
utilizează coloane înguste.
Acest tip de pompă este de uz general şi potrivită pentru majoritatea aplicaţiilor LC. Din cauza faptului
că în timpul realimentării cilindrului fluxul de lichid este oprit pentru o scurtă perioadă, se creează nişte pulsaţii
ale debitului de faza mobila. Aceste pulsaţii nu influenţează negativ separarea în majoritatea cazurilor,
deoarece coloana conţine suficientă faza mobilă pentru a atenua pulsaţiile. Se poate folosi şi un atenuator de
pulsaţii. Pulsaţiile de debit pot determina creşterea zgomotului de fond pentru anumite detectoare, care nu
mai pot fi în aceste condiţii folosite la sensibilitatea lor maximă. Totuşi, în majoritatea cazurilor ele nu
reprezintă o problemă reală şi nu justifica achiziţionarea unor pompe lipsite de pulsaţii, care sunt mult mai
scumpe.
Există două variante de asemenea pompe lipsite de pulsaţii. Prima este pompa cu două capete şi dublu
efect, care a fost realizată prima oară de firma Waters şi constă în utilizarea a două pompe cuplate astfel încât
atunci când una este în faza de umplere cealaltă să fie în faza de refulare (Figura 4.18). Acest lucru este
asigurat prin proiectarea corespunzătoare a rotorului excentric, care comanda mişcarea ambelor pistoane.
Reprezentarea schematică a unei pompe cu dublu efect şi două capete
1- piston; 2- rotor excentric; 3- arc; 4- corpul (cilindrul) pompei.
Acest tip constituie una dintre cele mai populare şi mai trainice pompe care se fabrică la ora actuală.
Cea de-a doua variantă de pompă fără pulsaţii este pompa cu realimentare rapidă. Aceasta foloseşte
de asemenea doi cilindri şi un singur piston comun. Diferenţa este că cea de-a doua pompa este folosită numai
pentru realimentarea rapidă a primei pompe, care realizează pomparea fazei mobile în coloană. Aceasta
realimentare are loc de aproximativ 100 de ori mai repede decât refularea, motiv pentru care pulsaţiile
pompei sunt reduse la minim.
Există şi un alt tip de pompă cu piston care se foloseşte în cromatografia de lichide, pompa cu
membrana. În acest caz, pistonul nu mai este în contact direct cu faza mobila ci doar cu un fluid numit fluid de
acţionare (driving fluid). Din acest motiv cerinţele de etanşeitate între piston şi corpul pompei nu mai sunt atât
de stricte. Schema de funcţionare a unui asemenea pompe este prezentată în Figură 4.19.
În urma mişcării aspiratoare şi respingătoare a pistonului, fluidul de acţionare determina o oscilaţie
alternativă a diafragmei, care se transmite asupra solventului aflat de cealaltă parte. În felul acesta, solventul
este aspirat din rezervor şi trimis în coloană. Suprafaţa diafragmei este relativ mare, ceea ce face ca mişcarea
diafragmei să nu fie amplă şi pompa poate fi exploatată la frecventa suficient de ridicată. Pulsaţiile cu
frecvenţa ridicată sunt atenuate mai uşor de coloană. Cu toate acestea, trebuie menţionat că pompele cu
membrana nu sunt complet lipsite de pulsaţii.

Pompa cu diafragmă
Utilizarea pompelor trebuie făcută cu multă atenţie, nefiind voie ca ele să funcţioneze în gol, fără solvent.
Utilizarea ca solvenţi a acizilor clorhidric şi bromhidric trebuie evitată deoarece aceştia corodează chair şi
otelurile inoxidabile. De asemenea, dacă se folosesc ca faze mobile soluţii tampon, în special cele care conţin
cloruri, acestea nu trebuie să rămână în pompa după terminarea analizei, deoarece pot cauza coroziune.
Detectoare utilizate în cromatografia de lichide
Funcţia detectorului este de a monitoriza faza mobila pe măsură ce ea iese din coloană. Detecţia prezintă mai
multe probleme în cromatografia de lichide decât în cea de gaze, neexistând detectoare universale de tipul
detectorului cu ionizare în flacără.
Clasificarea detectoarelor se poate face în două categorii:
Detectoare care măsoară modificarea unei proprietăţi fizice a efluentului coloanei. Asemenea
detectoare înregistrează modificarea unei proprietăţi fizice a fazei lichide constituite din eluent şi
componenta separată în coloana comparativ cu eluentul, de exemplu detectoarele de indice de
refracţie sau de conductivitate. Deşi ele au o aplicabilitate destul de largă, au sensibilitate scăzută
şi sunt afectate de schimbarea compoziţiei fazei mobile, deci nu pot fi folosite dacă eluţia se face
cu gradient.
Detectoare care măsoară modificarea unei proprietăţi a solutului. Din această categorie fac parte
detectoarele spectrofotometrice, cu fluorescenta şi electrochimice. Ele răspund la o proprietate
fizică caracteristică numai solutului şi în principiu sunt independente de eluent. Au sensibilitate
ridicată şi un domeniu larg de răspuns liniar, dar datorită specificităţii lor în general este nevoie de
mai mult decât un detector pentru a realiza o analiză mai complexă. Există asemenea unităţi care
conţin mai multe detectoare situate în serie, de exemplu de UV, fluorescenta şi conductivitate.
Principalele cerinţe pe care trebuie să le îndeplinească un detector sunt în bună măsură identice cu
cerinţele pentru detectoarele folosite în cromatografia de gaze:
Sensibilitate ridicată
Domeniu de răspuns liniar cât mai extins
Răspunsul detectorului să depindă cât mai puţin de condiţiile de lucru: temperatura şi debitul fazei
mobile.
La ora actuală exista un mare număr de detectoare folosite în cromatografia de lichide. Cele mai
importante, împreuna cu caracteristicile lor, sunt prezentate în tabelul de mai jos.
Principalele detectoare folosite în cromatografia de lichide

Denumirea Limită de detecţie Eluţie cu Caracteristici

detectorului (μg/ml) gradient

Spectrofotometric DA Selectiv, versatil

UV-VIS

Fluorescenţa DA Selectiv, aplicabil la un

număr limitat de
compuşi

Chemiluminiscenţa 2 x 10-7 DA Selectiv, aplicabil la un

număr redus de compuşi

Flourescenta Scăzută DA Selectiv, aplicabil la un

indusă prin laser număr limitat de
compuşi

FT-IR DA Selectiv, versatil

Conductivitate DA/NU Aplicabil pentru ioni şi

specii ionizabile

Amperometric NU Selectiv, aplicabil pentru

 compuşi cu caracter
oxidant sau reducător

Indice de refracţie NU Detector universal

Spectrometru de DA Detector universal

masă

Activitate optică NU Aplicabil pentru compuşi

chirali

ICP-MS 2,5 x 10-3 DA Aplicabil pentru metale

(ICP = inductive
coupled plasmă)

Există peste 30 de tipuri de detectoare, cele mai numeroase fiind cele spectrofotometrice, urmate de
cele electrochimice şi de detectoarele pentru anumite aplicaţii specifice. Un aspect important la alegerea
detectoarelor este compatibilatatea lor cu colanele înguste sau cele capilare, deorece acestea impun anumite
condiţii pentru utilizarea detectoarelor.
Detectorul spectrofotometric în UV-VIS
Se bazează pe măsurarea transmitantei celulei de măsură atunci când aceasta este străbătută de
eluentul care conţine componentele separate în coloana cromatografică. Condiţia necesară este că aceste
componente să aibă absorbţie suficient de mare în domeniul spectral în care funcţionează detectorul, iar
eluentul să fie transparent în domeniul respectiv. Detectoarele spectrofotometrice în UV-VIS se pot utiliza
pentru analiza compuşilor aromatici şi a celor care poseda legături p conjugate: olefine, compuşi carbonilici,
dervati azoici, nitroderivaţi, dar şi a proteinelor, enzimelor, acizilor nucleici şi steroizilor. Ele se pot folosi în
eluţia cu gradient şi sunt aproape insensibile la variaţiile de flux date de pulsaţiile provocate de pompe.
Dezavantajul lor major, alături de acela că substanţele analizate trebuie să absoarbă în UV sau vizibil, este ca
solvenţii utilizaţi trebuie să fie de puritate deosebită, pentru ca absorbţia lor în UV să fie nulă. Lipsa de
absorbţie a solventului este o condiţie esenţială mai ales în cazul eluţiei cu gradient, deorece nerespectarea
acestei condiţii ar duce la o deviere continuă a liniei de bază. În aceste circumstanţe, detectorul
spectrofotometric poate fi considerat un detector cu răspuns la modificarea proprietăţilor solutului. Mărimea
absorbţiei unei componente este dată de cunoscută lege Lambert-Beer:

 
unde I0 este intensitatea luminii incidente, I este intensitatea luminii transmise, A este absorbantă, ε este
coeficientul molar de extincţie (în l/mol·cm), l este lungimea parcursă de raza luminoasă în soluţie (în cm),
iar c este concentraţia componentei în soluţie (în mol/l).
Detectorul spectrofotometric în UV-VIS este caracterizat de sensibilitate ridicată, limita detecţie fiind 1·10 -
9
 g/ml pentru compuşii cu absorbţie puternică şi este relativ puţin sensibil la variaţiile de temperatură şi debit
ale fazei mobile.
Trebuie menţionat faptul că aceste detectoare se pot utiliza şi în cazul substanţelor care nu prezintă
absorbţie sau au absorbţie slabă în domeniul de lungimi de unda al detectorului, dacă ele se pot transforma în
derivaţi care să aibă o asemenea absorbţie. Acest lucru se face prin procedeul numit derivatizare postcoloana,
în care efluentului coloanei i se adaugă un reactiv corespunzător şi reacţia de derivatizare are loc înainte ca
efluentul să ajungă în detector. Astfel unii aminoacizi, care nu prezintă decât o absorbţie slabă în UV datorată
grupării carbonilice, se pot detecta mult mai uşor după transformarea în derivaţi coloraţi prin reacţie cu
ninhidrina.
Există trei tipuri de detectoare în UV-VIS:
Detectorul cu lungime de unda fixă
Detectorul cu lungime de unda variabilă
 Detectorul cu şir de diode.
Detectorul cu lungime de unda fixa poate fi realizat în varianta cu un singur fascicul sau cu două
fascicule. Detectorul cu două fascicule este prezentat schematic în figură de mai jos.

Schema detectorului UV-VIS cu dublu fascicul

Lumina provenită de la o sursă de radiaţii (în general o lampă de mercur) este focalizată cu ajutorul
unui sistem de lentile pe cele două celule, celula de măsură şi celule de referinţă, apoi ajunge pe două celule
fotolelectrice. Semnalul acestor fotocelule este modificat electronic şi apoi reprezintă semnalul de intrare
pentru sistemul de achiziţii de date al unui calculator sau integrator. Volumul celulei trebuie să fie cât mai mic
cu putinţă pentru a reduce dispersia picurilor şi a asigura o separare corespunzătoare. Coloanele moderne sunt
capabile să reducă volumul în care elueaza un pic la câţiva μl şi dacă volumul celulei este prea mare în celula va
intra mai mult decât un pic, ceea ce va face imposibilă rezoluţia picurilor respective. Volumul celulei de măsură
la un detector modern nu are voie să fie mai mare decât 5 μl şi este recomandat să fie mai puţin de 2 μl.
Deoarece absorbanta este proporţională cu lungimea celulei, rezultă că pentru a avea o celulă cu sensibilitate
mare ar fi indicată mărirea lungimii acesteia. Creşterea lungimii celulei este însa limitată de necesitatea ca
volumul celulei să fie cât mai mic. Pentru a avea o lungime cât mai mare corespunzătoare unui volum cât mai
mic, rezultă că ar trebui redus diametrul celulei, însa şi aceasta reducere este limitată pentru că se reduce
concomitent şi energia luminoasă care ajunge pe fotocelula şi creşte zgomotul de fond al detectorului. Celulele
detectoarelor moderne au lungimi cuprinse între 1 şi 10 mm şi diametre interioare de 1 mm sau mai puţin.
Detectorul cu lungime de unda variabilă utilizează drept sursă o lampă care emite o radiaţie pe un
spectru larg de lungimi de undă (de exemplu o lampă de deuteriu) şi prin utilizarea unui monocromator se
poate selecta o radiaţie cu o anumită lungime de unda dorită, în intervalul 190-350 nm. La unele dintre aceste
detectoare, exista şi posibilitatea de a opri fluxul de faza mobilă, de a reţine componenta respectivă în celulă şi
de a-i face spectrul complet în ultraviolet. Uneori aceste spectre pot fi utilizate pentru identificarea calitativă a
componentelor respective, deşi utilizarea spectrelor în UV în acest scop este limitată. Un alt avantaj al acestui
tip de detector este că pentru fiecare componentă se poate selecta lungimea de unda la care aceasta are
absorbanta maximă şi astfel de a creşte sensibilitatea analizei.
Detectorul cu şir de diode utilizează o lampă de deuteriu sau de xenon care emite pe tot domeniul
spectrului de UV. Lumina acestei lămpi este focalizată cu ajutorul unui sistem de lentile prin celula de măsură
şi apoi ajunge pe o reţea de difracţie. Lumina dispersata de această reţea cade pe un şir de diode. Fiecare
diodă măsoară câte o bandă îngusta a spectrului (aproximativ 2 nm), iar măsurătoarea are loc într-un timp
extrem de scurt (mai puţin de 10 milisecunde). Astfel, practic la interval de milisecunde se obţine câte un
spectru UV. Utilizarea acestui detector are următoarele avantaje importante:
Se obţin spectrele tuturor componentelor separate, care pot fi utilizate pentru identificarea calitativă a
acestora.
Prin alegerea unei anumite lungimi de unda se obţine cromatograma în care apar doar compuşii care
absorb la lungimea de unda respectivă.
Rezultatele unei asemenea analize pot fi prezentate sub forma unor grafice tridimensionale
absorbanta-timp-lungime de undă. Sensibilitatea detectoarelor cu şir de diode ajunge la 1,5·10-7 g/ml.

Schema detectorului UV-VIS cu şir de diode

Cromatograma tridimensională care prezintă absorbanta în funcţie de timp şi lungimea de undă, realizată cu
un detector UV-VIS cu şir de diode
Detectorul cu fluorescentă
 Este probabil cel mai sensibil detector folosit în cromatografia de lichide, cantitatea minimă
detectabilă fiind de până la 100 de ori mai mică decât în cazul detectoarelor UV-VIS. El poate detecta compuşii
care prezintă fluorescenta sau pe aceia care pot fi transformaţi în compuşi flourescenti.
Prin fluorescenta se înţelege proprietatea unor molecule de a emite o radiaţie în momentul în care au
atins o stare electronică excitată în urma absorbţiei unei radiaţii. Un proces de fluorescenţă cuprinde două
etape. În prima etapă, absorbţia unui foton determina trecerea moleculei respective într-o stare electronică
excitată. Revenirea într-o stare energetică stabilă are loc de asemenea prin emisia unui foton, adică prin ceea
ce este numit fluorescentă. Energiile fotonilor absorbiţi, respectiv emişi pot varia în funcţie de nivelele
energetice între care are loc tranziţia. În general, emisia se face la lungimi de undă mai mari (adică energii mai
mici) decât excitaţia. Intensitatea fluoprescentei este proporţională cu concentraţia compusului respectiv.
Numărul compuşilor care manifesta proprietatea de fluorescenţă naturală este destul de redus, în
această categorie întrând compuşii aromatici, mai ales cei polinucleari condensaţi. O serie de compuşi care nu
manifesta fluorescenta naturală pot fi însa transformaţi în derivaţi fluorescenţi. Această transformare se poate
face înaintea separării cromatografice, numindu-se derivatizare precoloana, sau după separarea
cromatografică, adică prin derivatizare postcoloana. Derivatizarea precoloana prezintă avantajele că se pot
alege condiţiile de reacţie pentru derivatizare fără a se ţine cont de sistemul de eluent, se poate elimina fără
probleme excesul de reactiv de derivatizare, iar în unele cazuri selectivitatea separării cromatografice pentru
compusul derivatizat este mai mare decât pentru cel nederivatizat. De asemenea, nu reprezintă un
impediment dacă reacţia de derivatizare are loc mai lent. Avantajul principal al derivatizarii postcoloana este
că se poate realiza automat, prin dozarea reactivului de derivatizare în efluentul coloanei, fără a fi necesară
efectuarea acestei reacţii în afara sistemului cromatografic.
Reactivul de derivatizare cel mai mult folosit este clorura de dansil (5-dimetil-amino-naftalin-1-
sulfoclorura). Acest reactiv se poate utiliza şi în cromatografia în strat subţire, de exemplu pentru analiza
aminoacizilor, sau în cromatografia HPLC pentru analiza compuşilor farmaceutici. Un alt reactiv de fluorescenţă
utilizat este dansilhidrazina, care s-a utilizat cu succes pentru analiza aldehidelor şi cetonelor.
Un model simplu de detector cu fluorescenta este prezentat în figură de mai jos:
Lampa de UV care emite radiaţia de excitaţie este în general o lampă de mercur de presiune redusă
care emite la 253,4 nm. O serie de substanţe fluorescente sunt excitate de lumina emisă la această lungime de
undă. Radiaţia este dirijată cu ajutorul unor lentile prin celula de măsură, iar radiaţia fluorescenta emisă este
focalizată cu ajutorul altor lentile pe o fotocelulă.
Există detectoare de construcţie mai complexă, care permit detectarea selectivă a radiaţiei
fluorescente de o anumită lungime de undă, sau chiar obţinerea unui spectru de fluorescenţă al substanţei
respective.
 Detectorul cu fluorescentă
Detectorul refractometric diferenţial
Este un detector universal, cu bună stabilitate dar mai puţin sensibil, care măsoară variaţia indicelui de
refracţie în prezenţa componentelor separate în coloana cromatografică. Are şi dezavantajul că este foarte
sensibil la schimbările de temperatură, deci trebuie termostatat cu mare precizie ( 0,001ºC pentru a putea fi
utilizat la sensibilitatea maximă). De asemenea, nu poate fi utilizat în cazul în care eluţia se face cu gradient şi
nu se pot folosi decât solvenţi care au indice de refracţie mult diferit de cel al compuşilor analizaţi. Cu toate
aceste limitări, detectorul de indice de refracţie este extrem de util pentru analiza compuşilor neionici, care nu
absorb în UV şi nu prezintă fluorescentă.
Există două tipuri de detectoare refractometrice: cu deflecţie şi cu reflexie sub unghi limita (de tip Fresnel).
Schema de principiu a unui refractometru cu deflecţie este prezentată în figură de mai jos.

Detectorul refractometric diferenţial

Raza de lumină incidenta, provenită de la un bec cu incandescentă, în general o lampă cu filament de wolfram,
trece printr-o lentilă de focalizare şi este dirijată pe celula detectorului. La trecerea din celula de referinţă în
cea de măsură, raza va fi deviată cu un unghi proporţional cu diferenţa dintre indicii de refracţie ai lichidelor
care se găsesc în cele două celule. Raza reflectată de oglinda trece din nou prin cele două celule, după care
este focalizată de o altă lentila pe o celulă fotoelectrică. Când raza de lumină îşi schimbă poziţia pe celulă,
semnalul pe care acesta îl emite se va modifica, iar diferenţa faţă de semnalul de bază este amplificată şi
constituie de fapt răspunsul detectorului, fiind proporţională cu concentraţia componentei în celula
refractometrului.
Sensibilitatea acestui detector ajunge până la 10 -6 g/ml (deci de ordinul ppm). Este utilizat cu rezultate bune
pentru analiza hidraţilor de carbon şi a unor polimeri.
Cromatografia ionică
Cromatografia ionică (IC) reprezintă de fapt versiunea de înalta performanţă a cromatografiei de
schimb ionic clasice. Poate fi realizată atât utilizând echipamente HPLC uzuale cât şi cromatografe construite
special pentru această tehnică. Se pot separa atât cationi cât şi anioni, folosind răşini schimbătoare de ioni
corespunzătoare, însa schimbătorii coventionali au creat probleme pentru separările HPLC datorită vitezei mici
de difuzie prin masa de răşină şi datorită compresibilităţii materialului. Aceste probleme au fost rezolvate prin
legarea răşinii pe suprafaţa unor particule sferice de sticlă cu diametre cuprinse între 30-50 μm, realizând o
umplutură peliculară, sau prin legare de suprafaţa unor microparticule rigide, realizând o umplutură de tip faza
inversă. Asemenea faze staţionare pot fi folosite pentru separarea cu rezoluţii ridicate atât ale unor amestecuri
conţinând cationi cât şi a celor care conţin anioni. Eluarea se face cu o fază mobila tamponata şi cu tărie ionică
crescătoare.
Detectoarele convenţionale utilizate în HPLC, cum ar fi cele de UV, pot fi utilizate pentru detectarea
ionilor organici, dar nu şi a celor anorganici care au necesitat dezvoltarea unor sisteme noi de detecţie, printre
care s-a impus detectorul de conductivitate electrică. O altă posibilitate este utilizarea detecţiei indirecte în
UV, când solventul de eluţie conţine o concentraţie constantă dintr-o substanţă cu absorbţie mare, de exemple
biftalat de potasiu sau benzoat de sodiu, care dă un semnal puternic în detectorul de UV. Apariţia în detector a
unei alte componente care nu absoarbe în UV va determina scăderea absorbantei şi apariţia unui pic negativ în
forma originală, care însa prin inversarea polarităţii înregistratorului se poate transforma uşor într-un pic
obişnuit.
Cromatografia prin excluziune
Cromatografia prin excluziune (SEC) se bazează pe separarea moleculelor de solut în conformitate cu
mărimea lor. Tehnica separării compuşilor solubili în apă şi care are loc în soluţii apoase este
denumită cromatografie prin gel-filtrare şi este utilizată de exemplu pentru purificarea proteinelor. Separările
care au loc în soluţii neapoase sunt cunoscute sub numele de cromatografie de permeatie prin gel. În ambele
cazuri mecanismul separării este identic şi se bazează doar pe mărimea relativă a porilor fazei staţionare
comparativ cu mărimea moleculelor de solut, neavând loc interacţiuni între solut şi faza staţionară.
Fazele staţionare utilizate în acest tip de cromatografie sunt materiale porase cu porozitate strict
controlată, iar mecanismul retenţiei consta în penetrarea diferită a moleculelor de solut în interiorul
particulelor de gel. Moleculele mari nu vor putea pătrunde în interiorul gelului şi vor fi antrenate de faza
mobila prin spaţiile dintre particulele reţelei de gel. Moleculele mici vor putea pătrunde în interiorul gelului, în
funcţie de dimensiunile lor şi dimensiunile porilor şi deci vor fi reţinute mai puternic.
În cromatografia de excluziune sterică clasică, drept materiale pentru faza staţionara s-au utilizat
dextrani reticulaţi (Sephadex) sau geluri de poliacrilamida (Bio-Gel). Aceste geluri semirigide nu pot fi însa
folosite în condiţiile presiunilor ridicate utilizate în tehnicile HPLC, de aceea fazele staţionare moderne sunt
realizate pe bază de microparticule din copolimer stiren-divinilbenzen (Ultrastyragel), silice, sau sticla poroasă.
Cromatografia prin excluziune are aplicaţii analitice atât pentru separarea compuşilor organici cât şi a
celor anorganici. Deşi exista asemenea aplicaţii şi pentru separarea moleculelor simple, ea este utilizată cu
precădere pentru separarea biomoleculelor şi a altor compuşi cu grad ridicat de polimerizare.
Volumul total Vt al unei coloane de excluziune este constituit din trei părţi:
Volumul ocupat de particulele solide ale umpluturii, care constituie aproximativ 20% din volumul total.
 Volumul porilor Vp, care reprezintă aproximativ 40% din volumul total. Moleculele mici şi moleculele
de solvent pot trece prin aceşti pori în timp ce străbat coloana.
Volumul mort Vm, care reprezintă restul de 40% şi este volumul spaţiilor dintre particulele de
umplutură. Moleculele mari, care nu pot să intre în pori, vor trece doar prin aceste spaţii.
Rezultă de aici ca volumul de eluţie util (în care se găsesc componentele separate) este aproximativ
jumătate din volumul total al coloanei. O altă observaţie importantă este ca o umplutură de anumită
porozitate va putea separa efectiv doar moleculele pe un interval de diferenţa de masă de 1,5-2,5 ordine de
mărime. Umpluturile comerciale au mărimile porilor cuprinse între 50 Å şi 10 Å. Aceste mărimi ale porilor nu
înseamnă dimensiunile efective ale porilor umpluturii din coloana ci dimensiunea minimă a standardului de
polietilena care nu este reţinut, adică limita de excluziune a umpluturii respective.
În cromatografia de excluziune este uzual să se cupleze mai multe coloane pentru a îmbunătăţi
separarea. Dacă se cuplează doua sau mai multe coloane cu aceeaşi limita de excluziune se urmăreşte
creşterea numărului de talere, adică rezoluţia, fără a modifica domeniul de masă al compuşilor care pot fi
separaţi. Dacă se cuplează doua sau mai multe coloane cu porozităţi diferite, se urmăreşte extinderea
domeniului de masă al compuşilor care pot fi separaţi. O serie de coloane comerciale sunt umplute utilizând
un anumit solvent şi ele trebuie păstrate sub acelaşi solvent. Eluenţii cei mai utilizaţi sunt toluenul,
tetrahidrofuranul, diclormetanul, cloroformul, dimetilformamida şi dimetilsulfoxidul.
Alegerea tipului de cromatografie de lichide pentru o anumită separare
Pentru alegerea tipului de cromatografie pentru o anumită separare este necesară cunoaşterea
caracteristicilor fizice ale amestecului respectiv. La mase moleculare mai mari de 2000, metoda de separare
este cromatografia prin gel-filtrare sau permeatia prin gel. În cazul separării compuşilor cu mase moleculare
mai mici de 2000, alegerea metodei celei mai potrivite se poate face conform schemei prezentate în figură de
mai jos.

Alegerea sistemului cromatografic: IC = cromatografie ionică; LSC = cromatografie lichid-solid; BPC =

cromatografie cu faze chimic legate; RPC = cromatografie cu faze inverse.
Trebuie însa menţionat că o anticipare corectă a metodei cromatografice potrivite nu se poate face cu
certitudine şi ea trebuie confirmată de experimente, iar în cazul amestecurilor complexe de multe ori este
necesară o combinare a mai multor tehnici.
BIBLIOGRAFIE:

https://www.scritub.com/stiinta/chimie/Cromatografia-de-lichide54483.php

http://cachescan.bcub.ro/2008_05_28/cap_11_1_pagini_179_188.pdf

https://www.creeaza.com/chimie/CROMATOGRAFIA-DE-LICHIDE755.php