UNIVERSITATEA „ VALAHIA ” DIN TÂRGOVIȘTE

MASTERAT: CONTROLUL ȘI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE

TEMĂ PROIECT
CUPRINS:

1. Introducere în Cromatografia de Lichide de Înaltă Performanţă ........... 3

1.1. Cromatografia de Lichide Comparată cu Cromatografia de Gaze ........... 5
1.2. Cromatografia de Lichide Modernă Comparată cu cea Tradiţională ....... 6
1.3. Echipamentul Folosit în Cromatografia de Lichide ................................. 9
1.4. Diferitele Variante ale Cromatografiei de Lichide ................................. 11
1.5. Cromatografia Lichid-Lichid în Fază Inversată ..................................... 12
1.5.1. Fazele staţionare utilizate în cromatografia în fază inversată .......... 13
1.5.2. Parametri ce afectează retenţia cromatografică ................................ 14
2. Etapele analizei cromatografice................................................................. 15
3. Sisteme de introducere a probe ................................................................. 16
4. HPLC – metoda utilizata pentru determinarea îndulcitorilor artificiali
din băuturile răcoritoare .................................................................................. 17
5. HPLC – metoda utilizata in studiul coloranţilor din băuturi nealcoolice
şi alcoolice ... …………………………………………………………………...26
BIBLOGRAFIE ................................................................................................. 30

2
 1. INTRODUCERE ÎN CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE ÎNALTĂ
PERFORMANŢĂ
Prin cromatografie se înţelege procedeul de separare a două sau mai multor substanţe pe
baza afinităţilor lor diferite faţă de o fază staţionară şi o fază mobilă care este în mişcare în
raport cu faza staţionară. Figura 8.1. ilustrează clasica schemă a separării cromatografice a doi
soluţi pe o coloană împachetată cu un adsorbent solid, prin care circulă un solvent. Solutul A
are o afinitate relativă mai mare faţă de materialul fazei staţionare decât solutul A. Ca urmare
solutul B este eluat din coloană mai încet decât solutul A, rezultând separarea lor.

Cromatografia de lichide (LC) este cea mai veche şi probabil cea mai puternică formă de
cromatografie. Cromatografia, ca tehnică de separare, a fost descoperită şi denumită astfel de
Tswett în 1903 [65, 66]. De atunci, dezvoltarea tehnicii cromatografice s-a realizat destul de
încet şi numai în ultimii ani a cunoscut o dezvoltare foarte rapidă.

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă se bazează pe dezvoltarea câtorva domenii

din cadrul LC: aparatura, coloane speciale şi materiale de umplere (suporturi cromatografice),
teoria procesului cromatografic, etc. Un rol important l-a jucat realizarea unor echipamente
ce pot realiza presiuni ridicate, volume-moarte (dead-volume) reduse şi detectoare foarte
sensibile. La acestea se adaugă realizarea unor suporturi cromatografice speciale, care au
permis separări cromatografice rapide, reproductibile şi de mare performanţă. Putem
considera că începuturile cromatografiei de lichide moderne au avut loc pe la sfârşitul anilor
‘50, când Spackman, Stein [67] şi Moore [68] au introdus analiza automată a amestecurilor de
aminoacizi. Aceasta a fost urmată de lucrările de pionierat ale lui Hamilton [69] şi Giddings
[70] în fundamentarea teoretică a HPLC, cât şi de lucrările HPLC de schimb-ionic ale lui
Scott şi de permeaţie în gel ale lui J.C. Moore [68]. Din 1969 lucrările publicate referitoare la
HPLC s-au înmulţit enorm de mult, orice cuantificare fiind subevaluată. Tehnica şi teoria
HPLC au ajuns astăzi la maturitate, deşi există încă multe porţi deschise spre perfecţionarea
lor.

3
 Figura.1. Ilustrare a separării cromatografice: (a) amestecul de soluţi A şi
B sunt adăugaţi la capătul superior al coloanei cromatografice ; (b) după
ce faza mobilă (solventul) a percolat coloana pentru câtva timp, soluţii A
şi B sunt separaţi în coloană; (c) solutul A eluează din coloană; (d) solutul
B eluează din coloană, separarea fiind încheiată cu succes.
HPLC are foarte multe aplicaţii, în diferite domenii:

 Industria farmaceutică: controlul calităţii medicamentelor; analize de medicamente şi

metaboliţi

 Cercetarea medicală clinică: dozare de medicamente şi metaboliţi

 Industria alimentară: dozare de aditivi, pesticide şi alte substanţe toxice contaminante

 Toxicologie: dozare de medicamente (droguri) şi metaboliţi

 Protecţia mediului: dozare de pesticide, clorofenoli, hidrocarburi aromatice policiclice

cât şi a altor poluanţi

 Biochimie: elucidarea structurii proteinelor cât şi a altor substanţe de interes biochimic

 Petrochimie: analiza unor compuşi specifici

 Industria polimerilor: analiza monomerilor, aditivilor şi a altor compuşi specifici.

 la care se adaugă şi domeniul foarte nou al sistematicii biochimice.

Cromatografia tradiţională pe coloană (fie ea de orice tip - de adsorbţie, partiţie sau de
schimb ionic), în strat subţire şi pe hârtie, şi cromatografia de lichide modernă sunt toate
forme ale cromatografiei de lichide. Diferenţele dintre toate aceste procedee se referă la
detalii de echipament, material cromatografic, tehnica de lucru, dar cromatografia de lichide
modernă are câteva avantaje majore faţă de celelalte tehnici menţionate: viteză sporită de
separare, posibilitatea de a separa amestecuri complexe, uşurinţă în executare, etc. Pentru a

4
aprecia mai bine avantajele cromatografiei de lichide moderne să facem două comparaţii:
între cromatografia de lichide şi cea de gaze şi între cromatografia de lichide modernă şi cea
tradiţională.

1.1. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE COMPARATĂ CU CROMATOGRAFIA DE GAZE

Capacitatea excepţională a cromatografiei de gaze (GC) de a separa şi analiza

amestecuri foarte complexe este astăzi unanim recunoscută. Comparată cu metodele
cromatografice anterioare, GC realizează separări mult mai rapide şi eficiente. Există sisteme
cromatografice pentru GC total automatizate, la preţuri acceptabile, cu performanţe excelente.
Totuşi multe amestecuri nu pot fi rezolvate de GC, fie din cauză că substanţele respective nu
sunt volatile, fie că sunt instabile termic şi se descompun în timpul cromatografierii. S-a
estimat că numai 10% din compuşii organici pot fi separaţi corespunzător cu ajutorul GC, fără
modificări chimice prealabile.

Cromatografia de lichide, pe de altă parte, nu cunoaşte limitări datorită volatilităţii sau

instabilităţii termice a probelor. Astfel, LC este ideală pentru separări de macromolecule şi
specii ionice (de interes biomedical), pentru produşi naturali sensibili şi pentru o mare
varietate de alte substanţe cu masă moleculară mare, mai puţin stabili, cum ar fi: proteinele,
aminoacizii, acizii nucleici, polizaharidele, pigmenţii vegetali, lipidele polare, substanţele de
interes farmaceutic (hormoni, vitamine, antibiotice, etc.), coloranţii, surfactanţii, medica-
mentele, pesticidele, etc.

Cromatografia de lichide are unele avantaje faţă de GC şi poate rezolva (de cele mai
multe ori) separări mai complexe deoarece:

 În LC sunt utilizate două faze (una staţionară şi alta mobilă) cu selectivităţi diferite faţă de
moleculele supuse separării, faţă de doar una în GC. Separarea cromatografică este
rezultatul unor interacţii specifice între moleculele probei cu fazele staţionară şi mobilă.
Aceste interacţiuni sunt absente în ce priveşte faza gazoasă mobilă a GC, dar sunt prezente
în cazul LC, furnizând astfel o variabilă în plus în ce priveşte controlul şi îmbunătăţirea
separării.

 În LC există (cel puţin până acum) o mai mare varietate de suporturi cromatografice;

 În LC se utilizează temperaturi scăzute (cel mai adesea temperatura ambiantă).

5
 În LC se poate utiliza o mare varietate de detectoare: colorimetre (eventual combinate cu
reactoare unde se desfăşoară reacţii de formare a compuşilor coloraţi), spectrofotometre în
UV, fluorimetre, detectoare de conductivitate, de refracţie, detectoare polarografice,
detectoare radiometrice, etc. În anumite cazuri de separări cromatografice în LC utilizarea
unui detector corespunzător elimină necesitatea unei separări complete.

 Un mare avantaj al LC faţă de GC este faptul că după separarea cromatografică

substanţele pot fi uşor recuperate în eprubete separate, cu ajutorul colectoarelor de
fracţiuni. Trecerea de la LC analitică la cea preparativă se face relativ uşor, recuperarea
componentelor separate fiind cantitativă. Există posibilitatea de recuperare a
componentelor şi în GC, dar procedeul este mult mai complicat şi cel mai adesea
necantitativ.

 În ciuda avantajelor menţionate ale LC faţă de GC, aceasta din urmă este aplicată cu
prioritate dacă nu sunt de aşteptat probleme speciale în ceea ce priveşte separarea
componentelor amestecului de analizat. Separările prin GC sunt în general mai rapide şi
mai sensibile şi, cel mai adesea, mai puţin costisitoare.

1.2. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE MODERNĂ COMPARATĂ CU CEA TRADIŢIONALĂ

Să considerăm acum diferenţele dintre sistemul cromatografic tradiţional şi cel

modern:

În LC clasică, o coloană este, în general, utilizată o dată (în cel mai bun caz de câteva
zeci de ori) după care este golită şi reumplută (eventual materialul de umplere este regenerat).
Aceasta reprezintă o mare cheltuială atât de manoperă cât şi de material. Aplicarea probei,
pentru a se face corect, necesită o mare pricepere din partea operatorului. Curgerea
solventului (eluentului) prin coloană se realizează prin cădere liberă (pe baza acceleraţiei
gravitaţionale), sau cu ajutorul unor pompe peristaltice. Separările cromatografice durează, în
varianta clasică, câteva ore (uneori câteva zile), fiind prin urmare procedee mari
consumatoare de timp şi de efort uman.

Variantele LC pe hârtie (paper chromatography = PC), apărută prin ani ‘40 şi a

cromatografiei în strat subţire (thin-layer chromatography = TLC) din anii ‘50 a simplificat
într-o oarecare măsură multe din operaţiile necesare executării cromatografiei. Astfel,
realizarea stratului (patului) cromatografic în TLC sau PC s-a simplificat mult şi a devenit
mult mai ieftină. Hârtia cromatografică sau plăcile gata turnate pentru TLC pot fi astăzi

6
cumpărate la preţuri acceptabile. Aplicarea probelor în aceste tehnici este mai puţin
pretenţioasă, existând de altfel şi dispozitive care ajută la realizarea acestei operaţii. Curgerea
solventului se realizează, cel mai adesea prin capilaritate, hârtia sau placa cromatografică
fiind introdusă într-un tanc cromatografic închis, ce conţine o mică cantitate din solventul
eluant. În acest fel, singura intervenţie a operatorului constă în urmărirea frontului de solvent
pentru a opri procesul cromatografic la timpul dorit. Detectarea şi cuantificarea substanţelor
separate se realizează prin stropirea hârtiei sau plăcii uscate cu reactivi cromogenici
corespunzători, pentru a se crea spoturi colorate pentru fiecare component separat.

Tehnica PC şi TLC a simplificat mult procesul cromatografic şi a redus timpul de

separare, care, în special în cazul TLC este de ordinul minutelor (30-60 min.). Totuşi, anumite
limitări, caracteristice metodelor cromatografice "pat-deschis" (open-bed) s-au păstrat şi la
aceste tehnici:

 reproductibilitate redusă;

 dificultate în realizarea determinărilor cantitative;

 timpi de separare mai lungi şi rezoluţii mai scăzute decât în cazul GC;

 capacitate limitată de realizare a separărilor preparative (de ordinul miligramelor);

 automatizare dificilă.
Cromatografia de lichide modernă utilizează coloane închise, care pot fi refolosite de
sute sau chiar de mii de ori, fără a periclita performanţele separărilor. Cu toate că aceste
coloane sunt foarte scumpe (de la 400 DM în sus), ţinând cont de faptul că perioada de viaţă
este foarte lungă, practic utilizarea lor este mai economică decât cea a coloanelor deschise
(open-bed column). Cu toate că şi coloanele HPLC se pot încărca individual de fiecare
operator, cel mai adesea, acestea se cumpără gata umplute, astfel că se poate elimina această
operaţie mare consumatoare de timp şi care necesită o mare pricepere din partea operatorului.
Injectarea probelor se realizează cu ajutorul unor dispozitive speciale -valve de injecţie, bucle
de injecţie - care fac ca operaţia să fie rapidă şi foarte uşor de executat. Curgerea solvenului
prin coloană se realizează cu ajutorul unor pompe de mare presiune, motiv pentru care tehnica
se mai numeşte cromatografie de mare presiune (High Presure Liquid Chromatography =
HPLC). În funcţie de presiunea cu care este împinsă faza mobilă în coloană, metodele
cromatografice pot fi clasificate în cromatografie la presiune redusă (sub 5 bari), la presiune
moderată sau medie (5-50 bari) şi la presiune înaltă (peste 50 bari). Curgerea solventului sub
presiune are o serie de avantaje: viteza de curgere este rapidă şi (aproape) perfect controlată,

7
ceea ce duce la reducerea dispersiei moleculare şi la o (aproape) perfectă reproductibilitate a
separărilor cromatografice.

Detectarea şi cuantificarea substanţelor separate se realizează în mod continuu cu

ajutorul detectoarelor de diferite tipuri şi a integratoarelor-înregistratoare ce fac parte
componentă din sistemele cromatografice HPLC. Aceste sisteme sunt (sau pot fi) complet
automatizate: probele pot fi injectate automat cu ajutorul injectoarelor automate, operaţiile
executate de sistemul de pompe, detectoare şi integratoare pot fi de asemenea controlate de
către un calculator, iar regăsirea substanţelor separate se poate realiza cantitativ cu ajutorul
colectoarelor de fracţiuni. Intervenţia manuală a operatorului este minimă, în cel mai rău caz,
reducându-se la efectuarea injectării probei în coloană, el putând face alte operaţii în timp ce
sistemul cromatografic lucrează. Operaţiile fiind automatizate, performanţele cromatografice
sunt excepţional de ridicate, dacă le comparăm cu metodele de CL clasice, motiv pentru care
metoda se mai numeşte cromatografie de înaltă performanţă (High Performance Liquid
Chromatography = HPLC). În plus, ridicarea la scară, adică trecerea de la cromatografia
analitică la cea semi-preparativă şi preparativă se realizează foarte uşor. Datorită curgerii
solventului sub presiune, cu viteză mare, prin stratul cromatografic, timpul de cromatografie-
re a fost mult redus, marea majoritate a separărilor realizându-se în mai puţin de 20 minute.
Pentru realizarea diferitelor separări cromatografice, există o multitudine de suporturi
cromatografice, care fac posibile separări de mare fineţe - cum ar fi izomerii optici. Marele
"dezavantaj" al LC moderne (pe care de acum încolo o vom numi simplu HPLC) constă în
preţurile foarte ridicate ale aparaturii care trebuie să fie de cea mai mare precizie, al
materialului cromatografic care trebuie să fie de cea mai bună calitate, al solvenţilor de eluţie
care trebuie să fie ce cea mai mare puritate, motiv pentru care iniţialele HPLC pot să însemne
şi High Price Liquid Chromatography.

Iată rezumativ câteva caracteristici tipice ale cromatografiei clasice (de joasă presiune) şi
ale cromatografiei moderne (HPLC)

Tabel 1. Caracteristici generale ale cromatografiei de lichide clasică şi ale HPLC

Caracteristici LC clasică HPLC

8
 Dimensiunea particulelor 100-300 µm 3-10 µm

Viteza de curgere 10-30 ml cm-2 h-1 100-300 ml cm-2 h-1

Presiunea de operare <5 bar >50 bar

Timpul de separare 24 h, sau chiar mai mult 0.1-3 h

Volumul probei Variabil (ml-litri) Mic (µl-ml)

Rezoluţia Bună Poate fi excelentă

Neajunsuri Timp de procesare lung Cost ridicat al aparaturii

1.3. ECHIPAMENTUL FOLOSIT ÎN CROMATOGRAFIA DE LICHIDE

Echipamentul necesar pentru LC poate fi asamblat din componente care pot proveni de
la diferiţi fabricanţi sau (cel mai bine) poate fi un sistem cromatografic complet asamblat
provenit de la un singur producător. Există enorm de multe firme producătoare de sisteme
cromatografice. Se poate pune întrebarea: Care este cel mai bun sistem cromatografic ?
Răspunsul, fără a fi evaziv, este că nu există un echipament "cel mai bun" deoarece cerinţele
pentru un anume aparat depind de problemele specifice pe care acesta este chemat să le
rezolve. Tabelul 7.2. prezintă sumar unele dintre acestea.

Tabelul 2. Criterii pentru echipamentele HPLC

Performanţe Caracteristici ale sistemului Cerinţe ale echipamentului

Cerinţe

Adaptabilitat Utilizabil pentru probe din di- Materiale cu mare rezistenţă chimică
e ferite clase şi tipuri de subs-
Diferite tipuri de detectoare
tanţe

9
 Performanţe Caracteristici ale sistemului Cerinţe ale echipamentului

Cerinţe

Viteză Coloane selective, cu eficienţă Pompe de mare presiune

mare
Viteză volumetrică sporită a
fazei mobile
Viteză mare de ieşire a datelor
Detectoare şi tuburi de conectare cu
volume moarte foarte reduse
Înregistratoare şi sisteme rapide de
prelucrare a datelor

Reproductibil Controlul operaţional al para- Controlul precis al:

itate metrilor
- temperaturii coloanei

- temperaturii detectorului

- compoziţiei fazei mobile (gradient)

- vitezei fazei mobile

- răspunsului detectorului

Senzitivitate Detectoare cu răspuns foarte Design atent al detectorului

rapid
Raport semnal/zgomot redus
Benzi înguste
Coloane eficiente

În figura 2. se prezintă schematic un sistem LC, cu componentele sale de bază. La

configuraţia de bază se pot adăuga diferite alte componente, utile pentru anumite analize
speciale sau deosebite.

Aşa cum s-a mai menţionat, iniţiale HPLC pot să semnifice şi high price liquid
chromatography deoarece echimapentele HPLC sunt foarte scumpe. Un sistem cu
configuraţie de bază, ca cel din fig. .2.. costă în jur de 20000 DM, coloanele costă de la 400
DM în sus şi exemplele ar putea continua. Deoarece în acest caz preţul este un factor
limitativ, este important de ştiut care sunt cerinţele unui bun sistem HPLC, căci deşi este

10
recomandabilă achiziţionarea unui sistem HPLC integrat, rezultate similare se pot obţine şi
prin asamblarea de componente provenind de la firme diferite şi care ar putea fi mai ieftine.

Urmărind fig. 7.2.. se constată că principial sistemul HPLC nu diferă de un sistem

cromatografic de joasă sau medie presiune, toate având practic aceeaşi diagramă de curgere a

Fig. 2. Schema generală

a unui sistem LC: 1 - re-
zervor de fază mobilă; 2-
element de încălzire; 3 -
agitator magnetic; 4 -
pompe; 5- filtru; 6 -
restrictor de pulsuri de
presiune; 7 - pre-coloa-
nă (opţional); 8 -
coloana analitică; 9 -
sistem de injectare a
probei; 10 - termostat
(opţional); 11 - detector;
12 - integra-
tor/înregistrator sau
sistem de prelucrare a
datelor
fazei mobile şi componentelor probei: rezervorul de fază mobilă → (sistemul de creare a
gradientului) → pompa → (monitorul de presiune) → injectorul → coloana → detectorul
→ colectorul (sistemul de creare a gradientului şi monitorul de presiune au fost puse în
paranteză deoarece acestea pot fi încorporate în pompă).

1.4. DIFERITELE VARIANTE ALE CROMATOGRAFIEI DE LICHIDE

Retenţia moleculelor probei de către faza staţionară se poate realiza prin patru
mecanisme sau procese diferite. Bazate pe acestea există patru tipuri de LC: lichid-lichid,
lichid-solid, schimb ionic şi gel-cromatografie.

(1) Cromatografia lichid-lichid (sau cromatografia de partiţie) implică existenţa unei faze
staţionare lichide a cărei compoziţie este diferită de cea a fazei staţionare mobile.
Moleculele probei se distribuie între faza staţionară (lichidă) şi faza mobilă (bineînţeles,
lichidă şi ea) în funcţie de coeficientul de partiţie al probei respective faţă de cele două
lichide. Faza staţionară şi cea mobilă pot fi două lichide nemiscibile, sau faza staţionară poate
fi legată chimic pe particulele de gel ce formează suportul cromatografic.

11
(2) Cromatografia lichid-solid (sau cromatografia de adsorbţie) implică umplerea coloanei
cu particule ce au o mare suprafaţă. Moleculele probei vor fi reţinute prin atracţia reciprocă cu
situsuri active de pe suprafaţa particulelor de gel.

(3) În cromatografia de schimb ionic coloana se umple cu particule de gel ce prezintă fixate
pe suprafaţa lor grupări ionice (pozitive sau negative) împreună cu contraionii de sarcină
opusă. De exemplu, particulele de gel pot avea fixate pe ele grupări –SO3–, contraionul fiind
Na+. Contraionul este, de asemenea, prezent şi în faza mobilă (sub formă de sare NaCl).
Moleculele probei, care la rândul lor prezintă o anumită sarcină globală pozitivă sau negativă
(fie în exemplu nostru P+), vor face schimb ionic cu contraionii de pe faza staţionară: P+ +
SO3–Na+ → Na+ + SO3–P+. Deci ionii de sodiu vor fi înlocuiţi cu moleculele ionice ale
probei. Cu cât sarcina globală a acestora este mai mare, cu atât retenţia va fi mai puternică şi
deci timpul de retenţie mai lung. Moleculele probei care au aceeaşi sarcină globală cu cea a
sarcinilor fixate pe particulele de gel (minus în cazul de faţă) nu vor fi reţinute de loc de
materialul de umplere al coloanei şi vor migra odată cu faza mobilă.

(4) În gel-cromatografie (sau cromatografie de excludere moleculară, cromatografie de

gel-filtrare) perlele de gel ce umplu coloana prezintă pori de diferite dimensiuni. Moleculele
probei ce prezintă dimensiuni mai mari decât porii nu vor putea intra în aceştia şi vor migra
odată cu faza mobilă. Moleculele mai mici decât porii, vor pătrunde în aceştia, vor parcurge
un drum mai lung (intrare şi ieşire din pori), motiv pentru care vor fi eluate mai târziu decât
moleculele mari. În mod normal, se caută ca între moleculele probei şi cele două faze să nu
existe nici un fel de interacţii, singurul criteriu al separării fiind dimensiunea moleculară.

1.5. CROMATOGRAFIA LICHID-LICHID ÎN FAZĂ INVERSATĂ

Dintre toate tehnicile HPLC, RP-HPLC este cea mai utilizată. Cel puţin 60% din
separările analitice se realizează prin această tehnică. Termenul de fază inversată a fost
utilizat prima dată de Howard şi Martin [71] care au realizat o LLC (Liquid liquid
chromatography) folosind ca fază staţionară uleiul de parafină şi n-octanul cu eluenţi apoşi.
Într-un astfel de sistem de partiţie, metodologia convenţională, care utiliza o fază staţionară,
polară şi o fază mobilă, mai puţin polară a fost inversată, faza mobilă devenind mai polară
decât cea staţionară.

RPC (Reversed phase chromatography) diferă de majoritatea celorlalte tehnici cromatografice

în care forţele atractive dintre faza staţionară şi faza mobilă sunt dominante. În RPC, faza

12
staţionară este, în general, de natură hidrocarbonată, inertă, şi singurele interacţii cu solutul
sunt cele hidrofobe, selectivitatea fiind dominată de efectele solventului. Faza mobilă, în
RPC, este formată fie din apă (singură), fie din apă plus un modificator organic, fie dintr-un
solvent neapos. Aceste faze mobile diferite au dus la utilizarea de diferite acronime pentru
variantele RPC: PARP = plain aqueous reverse phase; MARP = mixed aqueous RP; NARP =
non-aqueous RP.

În RPC, faza staţionară este, în mod uzual, formată dintr-o matrice din particule sferice
de silicagel pe care s-au imobilizat covalent liganzi n-octadecil. Alţi liganzi mult utilizaţi sunt
n-octil şi fenil. Pentru separări analitice, diametrul sferelor de silicagel este mai mic de 25
µm. Fazele staţionare sunt, de obicei, împachetate în coloane de oţel inoxidabil, cu diametrul
de 4-5 mm şi lungimea de 50-300 mm. Tendinţa actuală este de a se folosi coloane cu
diametre mai mici de 4 mm (4 - 1 mm)(norow bore column) împachetate cu sfere cu diametre
mai mici de 5 µm. Cele mai utilizate faze mobile sunt soluţiile apoase (tamponate) în amestec
cu diferite procente de metanol şi/sau acetonitril. Fazele mobile sunt pompate la viteze
volumetrice între 0,5 şi 2 mL·min–1.

Popularitatea RPC este de înţeles având în vedere numeroasele avantaje şi marele său
potenţial. Cel mai mare avantaj al RPC este stabilitatea şi inerţia fazei staţionare, care permite
utilizarea unei game largi de solvenţi: adăugarea de săruri, modificarea pH-ului şi a
temperaturii, etc.

1.5.1. FAZELE STAŢIONARE UTILIZATE ÎN CROMATOGRAFIA ÎN FAZĂ

INVERSATĂ

Cele mai comune faze staţionare utilizate în RPC sunt cele ce conţin grupări octadecil-
silan (ODS sau C18) legate covalent de matricea de silicagel. Aşa cum s-a amintit deja,
destul de utilizate sunt şi suporturile ce prezintă liganzi octil sau fenil. Ca matrice, pe lângă
silicagel se mai utilizează kieselguhr-ul, alcoolul polivinilic (PVA), sticla, oxizi metalici, etc.
Diametrul perlelor utilizate ca matrice variază între 3 şi 10 µm.

Modificarea gelurilor de silice se realizează prin fixarea pe suprafaţa lor a unor grupări
cu caracter hidrofob. Ca o regulă generală, gruparea hidrofobă se leagă de silicagel printr-o
legătură siloxan stabilă. Ea este formată în reacţia dintre alchil (aril) clorosilan (agentul
modificator) cu grupările silanol de pe suprafaţa silica-gelului. Grupările hidrofobe ataşate
matricei de silicagel pot fi de tipul etil (C2H5), octyl (C8H17), octadecil (C18H37) şi fenil

13
(C6H5). În loc de monoclorsilani se pot utiliza pentru modificarea silica-gelului şi di- şi
triclorsilani, ultimul fiind cel mai eficient.

Împiedicările sterice fac ca modificarea suprafeţei matricei, prin reacţiile cu clor-silani

să nu depăşească 40% din aria sa. În general, densitatea grupărilor hidrofobe este în jur de 2,9
–2
- 3,4 µmoli·m–2, în timp ce densitatea grupărilor silanol iniţial prezente este de 8-9 µmoli·m .

Grupările silanol neprotejate pot duce la adsorbţii necontrolabile ale proteinelor sau ale
unor molecule mici (în aşa numita cromatografie "perechi ionice" - ion-pair chromatogrphy -
ionii pot fi adsorbiţi) ducând la o descreştere a puterii de rezoluţie şi la nereproductibilitatea
procesului cromatografic. Pentru a evita aceste fenomene negative, silica gelul este tratat cu
modificatori hidrofobi cu masă moleculară mică, cum ar fi trimetil-clor-silanul.

Grupările ionice ale solutului, cum ar fi cele prezente pe suprafaţa proteinelor, sunt
puternic hidratate şi interferă cu liganzii hidrofobi. Prin alegerea convenabilă a pH-ului aceste
grupări ionizate pot fi aduse într-o formă neionică, astfel încât interacţiile hidrofobe să
crească. La modificările pH-ului mediului, trebuie ţinut cont de faptul că matricea de silicagel
este stabilă pe domeniul de pH 2 - 7,5 şi se solubilizează treptat la valori alcaline ale pH-ului.

1.5.2. PARAMETRI CE AFECTEAZĂ RETENŢIA CROMATOGRAFICĂ

Modificatorii organici. Eluţia in RP-HPLC este efectuată datorită prezenţei sau creşterii
gradate a concentraţiei unui solvent organic în eluent. Solventul se numeşte, în acest caz,
modificator organic. Importanţa teoriei solvofobice constă în faptul că permite prezicerea
caracteristicilor de retenţie a soluţilor. Aceasta poate fi clar demonstrată prin efectele
modificatorilor organici introduşi în faza mobilă asupra retenţiei soluţilor.

Temperatura. Odată cu creşterea temperaturii scad timpii de retenţie şi deci se măreşte viteza
de cromatografiere. Ca regulă generală, o creştere cu 10ºC duce la o reducere a factorului de
capacitate de două ori. Prin creşterea temperaturii se scade viscozitatea solvenţilor organici şi
deci se poate mări viteza de eluare.

Adăugarea de săruri în faza mobilă duce la modificarea factorului de capacitate. Pentru un

solut neutru, logaritmul factorului de capacitate va creşte linear cu concentraţia sărurilor.
Aceasta este o consecinţă a creşterii lineare a tensiuni de suprafaţă.

14
pH-ul. Pentru compuşii care ionizează când pH-ul fazei mobile se apropie de pKa-ul solutului

se observă schimbări majore în ce priveşte factorul de capacitate şi selectivitatea.

Tampoanele. Aşa cum s-a amintit deja, supresia ionică este o tehnică utilă pentru creşterea
factorilor de capacitate a soluţilor. Gradul de ionizare al soluţilor poate varia cu concentraţia
solutului în absenţa unui tampon, pe măsură ce un solut eluează din coloană, concentraţia sa
în bandă variază şi la fel şi gradul de ionizare. Astfel de schimbări în ionizare pot duce la
apariţia cozilor sau a eluţiilor întârziate (cozi inversate). Astfel de probleme pot fi corectate
prin tamponarea corectă a fazelor mobile.

Pe lângă faptul că menţine constat pH-ul fazei mobile, tamponul mai trebuie să îndeplinească
anumite cerinţe cromatografice:

 Să fie transparent optic, pentru a permite utilizarea detectoarelor UV-VIS. De exemplu,

acetatul, în comun cu alţi acizi carboxilici, nu poate fi folosit sub 235 nm, unde începe să
devină opac optic;

 Componentele tamponului nu trebuie să precipite în prezenţa modificatorilor organici;

Lungimea lanţurilor liganzilor hidrofobi. Cu toate că există suporturi cromatografice cu
liganzi hidrocarbonaţi imobilizaţi a căror lungime variază de la 2 la 18 atomi de carbon, totuşi
cel mai comod este a se modifica compoziţia fazei mobile, care de altfel constituie şi factorul
dominant în determinarea rezoluţiei. În ce priveşte efectul lungimii lanţului hidrocarbonat
utilizat ca ligand hidrofob, pe măsură ce numărul atomilor de carbon creşte şi retenţia
soluţilor. Retenţia depinde şi de densitatea acestor liganzi, astfel că putem spune că retenţia
soluţilor pe astfel de suporturi cromatografice creşte odată cu conţinutul de carbon al fazei
staţionare.

2. Etapele analizei cromatografice

Analiza HPLC este un proces complicat, cu multe etape, rezultatul cărei depinde de
designarea optimă şi scrupulozitatea efectuării fiecărei etape în parte. Se pot evidenţia 3 etape
de bază ale acestui proces:

Prepararea probelor – toate operaţiile de preparare a mostrelor de analizat, care se

finisează cu obţinerea probelor, injectate direct în coloana cromatografică, inclusiv şi
derivatizarea precoloană, în caz de utilizare.

15
 Analiza cromatografică propriu zisă – din momentul injectării probei până la înregistrarea
semnalului electric la ieşirea din detector, inclusiv şi derivatizarea pe coloană sau
postcoloană, unde ea-i prezentă.

Prelucrarea informaţiei cromatografice primare, rezultatul căreia constă în obţinerea

mărimilor ce caracterizează componenţa calitativă şi cantitativă a probelor de analizat.

3. Sisteme de introducere a probe

În cazul HPLC injecţia probei trebuie făcută într-un timp cât mai scurt, pentru a nu
deranja regimul dinamic al eluentului prin coloană şi detector. Dificultatea provine de la
presiunea ridicată la care lucrează coloana (20mii kPa). Sistemul cel mai utilizat în
cromatografele de lichide este ventilul cu 6 căi, numit şi ventil de introducere a probei,
prevăzut cu bucle interschimbabile (fig. 3).

Deoarece eluentul aderă la pereţi, pentru completa îndepărtare a sa în momentul

alimentării buclei cu probă, este necesară injectarea prin buclă a unui volum de cel puţin de
trei ori volumul acesteia, înainte de comutarea pe analiză. Bucla lucrează în două etape.

Etapa A (fig. 3-A) în care bucla este umplută cu probă cu ajutorul unei seringi sau în
alt mod. Apoi are loc comutarea pe analiză (fig. 3-B) când prin rotire cu 60°, în direcţia acelor
de ceasornic, manual sau automat, bucla este parcursă de eluentul de la pompă şi conţinutul
acesteia este antrenat în coloană. Volumul probelor pentru coloane obişnuite (25cmx4.6mm)
este de 10-50µl.

Evident aceste ventile sunt confecţionate din materiale rezistente la coroziune şi la

solvenţi (oţel inoxidabil, tantal, teflon etc).

16
4. HPLC – metoda utilizata pentru determinarea îndulcitorilor artificiali din băuturile
răcoritoare

Lucrarea de faţă descrie dezvoltarea şi validarea unor metode de determinare a

îndulcitorilor printr-o metodă HPLC combinată cu un detector evaporativ cu
împrăştierea luminii şi prin cromatografie ionică, care îndeplinesc cerinţele pentru a controla
limitele legale ale îndulcitorilor sintetici şi semi-sintetici prevăzute în legislaţia actuală a UE.

Partea experimentală:

Substanţe chimice, reactivi şi soluţii standard

Reactivii analitici, acid formic şi trietilamina, au fost obţinuţi din Fluka (Germania),
iar metanolul şi acetonea din Merck (Germania). Apa ultrapura cu o rezistivitate > 18MΩ şi
cu carbon organic total <5ngg-1 au fost obţinute de la un sistem MilliQ Plus 185.

Standardele individuale pentru fiecare îndulcitor au fost obţinute din diferite surse.

Au mai fost utilizate şi următoarele substanţe: benzoat de sodiu, cafeină, acid sorbic,
acid glutamic, acid fosforic, acid ascorbic, D (o)-sorbitol, acid malic, taurina, d (+)-
glucurono-lactona, chinina, hemi-sulfat de sare, acid citric monohidrat, zaharoza, fructoza,
glucoza şi lactoză.

17
 O soluţie tampon cu pH 4,5 a fost pregătită prin dizolvarea a 4 ml de acid formic în 5 l
apă şi ajustată la pH 4,5 cu cca. 12,5 ml trietilamina. Faza mobila A a HPLC a fost pregătită
prin amestecarea de 690 ml metanol cu 240 ml soluţie tampon şi 70 ml acetona, iar faza
mobila B s-a obţinut prin amestecarea a 110 ml metanol cu 820 ml soluţie tampon şi 70 ml
acetona.

Probele pentru testare

Probe de băuturi energizante (îndulcite cu zahăr), băuturi răcoritoare cu acid (îndulcite

cu zahăr), băuturi răcoritoare fără acid (îndulcite cu zahăr), conserve din fructe (cocktailuri de
fructe şi de pere îndulcite cu zahăr) şi iaurturi naturale achiziţionate de la magazine de
vânzare cu amănuntul. Înainte de utilizare, pentru fiecare probă a fost verificată absenta
compuşilor interesaţi pentru a fi folosite ca probe martor, pentru prepararea soluţiilor de
calibrare şi pentru pregătirea de materiale de testare fortificate.

Prepararea şi calibrarea soluţiilor:

Standarde de calibrare în soluţie tampon

Pentru cuantificarea în timpul procesului de dezvoltare şi optimizare a metodei a fost

pregătită o soluţie standard care conţine toţi cei nouă îndulcitori în soluţia tampon.
Concentraţia fiecărui îndulcitor a fost de 500 µg ml-1, cu excepţia DUL şi NHDC care au avut
o concentraţie de 100 µg ml-1. O serie de 8 soluţii de calibrare au fost preparate prin diluţia
soluţiei standard cu soluţie tampon rezultând concentraţii între 4-500 µg ml-1 şi de 0,8-100 µg
ml-1 pentru DUL şi NHDC.

Pentru cunatificare, la finalul etapei de validare, a fost preparată o soluţie standard

care conţine toţi cei 9 îndulcitori, respectând limita admisă de 125 % din MUD. Pentru
îndulcitorii neautorizaţi (ALI, DUL şi NEO) au fost preluate MUD fictive de la cca. 150 µg
ml-1. O serie de 8 soluţii de calibrare au fost pregătite prin diluţia soluţiei standard cu o soluţie
tampon care rezultă în intervale de concentraţii potrivite cu limitele date.

Soluţia de calibrare a matricei

Soluţia matrice standard a fost preparată folosind o băutură energizantă, un compot de

fructe şi un iaurt natural. Înainte de utilizare băutură energizantă a fost tratată cu ultrasunete,
fructele din compot şi iaurtul au fost omogenizate. O soluţie stoc compusă din cei 9
îndulcitori a fost preparată prin cântărirea standardelor pure într-un flacon de 100 ml,

18
adăugându-se cca. 50g de probă omogenizata, conţinutul obţinut amestecându-se timp de 6
ore. O serie de 8 soluţii de calibrare au fost preparate prin diluţia soluţiei matrice standard cu
probele de analizat, rezultând concentraţii de 12,5-2000 µg g-1.

Pregătirea materialelor de testare:

Omogenizarea materialelor de testare

Toate băuturile au fost tratate într-o baie cu ultrasunete timp de 15 min, unde fructele
şi iaurturile au fost omogenizate folosind un blender alimentar şi un Ultraturrax.

Fortificarea materialelor de testare

Pentru a compara fiecare tip de calibrare de la fiecare material testat s-au pregătit
soluţii cu concentraţii de cca. 2000, 400 şi 80 µg g-1. Testul de stabilitate a fost efectuat
folosind un material test cu o concentraţie de cca. 250 µg g-1. Toate acestea au fost pregătite
în acelaşi mod ca la Secţiunea 1.3.2.

Instrumente:

Îndulcitorii au fost separaţi folosind coloane analitice. Măsurătorile cromatografice au

fost efectuate folosind un sistem HPLC format dintr-o pompă cuaternara, un autosampler şi o
coloană termostatata compartimentată. Extracţiile pe fază solidă au fost efectuate sub vid.

Metoda:

Pregătirea probelor

Fiecare material de testat a fost tratat astfel: 5g de material de testat omogenizat a fost
cântărit într-un balon cotat de 50 ml şi apoi se completează până la semn cu soluţie tampon.
Se agită energic 5 minute, iar apoi conţinutul balonului este transferat într-un tub de 50 ml şi
se centrifughează la 4000 rpm timp de 10 min. Coloanele SPE vidate au fost condiţionate cu 3
ml metanol, apoi 3 porţiuni a câte 2 ml soluţie tampon şi 2 porţiuni a câte 5 ml supernatant. Pe
parcursul întregului proces s-a utilizat un debit de 1-2 ml/min. După spălarea coloanei SPE cu
3 ml soluţie tampon, îndulcitorii au fost colectaţi prin eluţie cu 2 ml etanol, într-o eprubetă de
5 ml. Metanolul colectat a fost evaporat la cca. 3,5 ml la temperatura ambientală folosind un

19
curent de azot şi apoi se aduce la semn cu soluţie tampon înainte de a se trece la analiza
HPLC-ELSD.

Analiza HPLC-ELSD

Separarea HPLC a îndulcitorilor a fost realizată cu ajutorul gradientului de profil cu un

debit de 0,5 ml/min al fazei mobile. Volumul de injectare a fost de 8 µl, temperatura tubului a
fost de 85°C, iar debitul de azot reglat la 2,5 l/min.

Identificarea şi cuantificarea îndulcitorilor

Identificarea fiecărui îndulcitor din materialele test a fost făcută prin comparaţia
timpilor de retenţie a îndulcitorilor observaţi în timpul analizei soluţiilor standard analizate
din acelaşi lot de probe, cu timpii de retenţie a compuşilor eluati în timpul analizei
materialelor de testare.

Cuantificarea celor nouă îndulcitori a fost realizată prin analiza celor opt soluţii de
calibrare standard, folosind condiţiile HPLC identice cu cele utilizate pentru materialele de
testare. Determinarea cantitativă a îndulcitorilor i din extractul din SPE (C 1i) a fost efectuat
prin conversie în zona de vârf I (Ri) obţinut prin analiza extractului injectat în coloana SPE,
utilizând rezultatul funcţiei de calibrare. Fracţia de masă a îndulcitorilor i din materialul de
testare a fost calculată în conformitate cu ecuaţia (1.).

Unde: C1i= fracţia de masă a îndulcitorilor i din extractul SPE µg g-1 determinat folosind
ecuaţia de calibrare stabilită.

C2i= fracţia de masă a îndulcitorilor i din materialul test µg g-1

M1= masa materialului test luată pentru extracţie, 5g

V1= volumul total al probei, 50 ml

V2= volumul de soluţie de probă încărcat pe cartuşul SPE, 10 ml

V3= volumul final al extractului SPE, 4 ml.

Experimentele sunt împărţite în două părţi: optimizarea şi validarea metodei.

20
 Optimizarea:

. Separarea HPLC

Selectarea unei coloane analitice a fost prima etapă în dezvoltarea noii metode. În
studiul de faţă a fost selectată o coloană complet închisă la capate, oferind o separare în 25 de
minute a celor nouă îndulcitori aleşi: ACS-K, ASP, CYC, NHDC, SAC, ŞCL, ALI, NEO şi
DUL (Fig.4).

Fig. 4- Separarea HPLC-ELSD a unei mixturi cu 11 îndulcitori folosind Nucleodur C18

Pyramid column.

În plus a fost posibil să se separe alţi doi îndulcitori neautorizaţi, de exemplu,

stevioside şi rebaudioside A. Cu toate acestea, din cauza probelor limitate, aceşti doi compuşi
au fost excluşi din experimente. Aşa cum arată Fig.5, prin aplicarea aceloraşi condiţii
cromatografice, separarea îndulcitorilor a fost eficientă indiferent de brand-ul coloanei.

21
Fig. 5- Separarea HPLC-ELSD a unei mixturi cu 9 îndulcitori folosind coloane diferite: (a)
Zorbax Extend-C18; (b) Nucleodur C18 Pyramid; (c) Nucleodur C8 Gravity; (d) Purospher
Star RP-18

În ceea ce priveşte faza mobilă şi parametrii gradientului, trebuie luate în

considerare mai multe aspecte. Înainte de toate, ELSD este limitată pentru utilizarea sa în
fazele mobile volatile.

ELSD se bazează pe diferenţele de volatilitate dintre solvent şi probă. Principalul

avantaj al ELSD este că se poate detecta orice analit fără a fi nevoie de cromofori sau
fluorofori. Singura condiţie este ca analitul să fie mai puţin volatil că faza mobila. În al doilea
rând, pentru a obţine timpi de retenţie stabili, este aleasă o fază mobila tamponata, deoarece
îndulcitorii formează molecule polare în faza mobilă, frecvent utilizate în cromatografia
lichidă de faza inversă, şi gradul de ionizare al unei molecule afectează interacţiunile sale cu
faza de staţionare. În cele din urmă, cea mai bună metodă de separare a tuturor celor 9
îndulcitori a fost cea care foloseşte o soluţie tampon apoasa compusă din acid formic şi
trietilamina (pH=4,5) şi o fază mobila formată dintr-un amestec de metanol şi acetona.
22
 Detecţia ELSD

Un rezultat bun a fost obţinut prin utilizarea unei temperaturi de 85°C şi un debit de
azot de 2,5 l/min.

Prepararea probei prin extracţie pe fază solidă

Prepararea probelor cu succes, de exemplu, matricea de simplificare, au fost realizate

prin adsorbţia îndulcitorilor pe cartuşe SPE, iar desorbţia posibilelor interferenţe ale matricei a
fost posibilă prin spălarea cu soluţie tampon şi prin impregnarea îndulcitorilor cu metanol.
Tipul cartuşelor SPE a fost ales pentru a se potrivi cu faza staţionară a coloanelelor de
separare HPLC. Pentru a determina un amestec de 3 îndulcitori cu un timp de retenţie foarte
scurt, se dizolvă amestecul în apă acidificată cu acid formic 0,1% sau în soluţie tampon şi
apoi se foloseşte vid într-un cartuş SPE condiţionat. Fiecare porţiune de 5ml din cartuş au fost
colectate şi analizate prin HPLC. Cel mai mare volum de 30 ml a fost obţinut pentru a fi
folosit ca solvent de spălare. În cele din urmă, cele mai bune rezultate au fost obţinute prin
limitarea volumului probei din cartuş la 10 ml şi volumul solventului de spălare la 3 ml.

. Calibrarea

În scopul alegerii tipului potrivit de calibrare, au fost efectuate mai multe experimente
pentru a respecta limitele legale din actuala legislaţie a UE.

Ca un exemplu, funcţia de calibrare a ŞCL este dată în Fig. 6a.

Prin urmare, cuantificarea a fost efectuată cu ajutorul conversiei logaritmice în baza10

atât pentru concentraţie cât şi pentru aria peak-urilor. Deşi aceasta este o metodă comună de

23
liniarizare, s-a constatat că pentru majoritatea îndulcitorilor răspunsul de transformare nu a
fost complet linear pe un interval de lucru de 12,5-2000 µg g-1 (Fig. 6b).

Chiar dacă coeficienţii de corelaţie liniara R au fost în cea mai mare parte > 0,98,
distribuirea reziduurilor (Fig. 6c), a indicat că modelul nu este adecvat.

Răspunsul primit de ELSD a fost cel mai bine descris printr-o ecuaţie polinomială de
gradul 3 (Fig. 6d).

24
 Următorul pas a fost de a compara rezultatele obţinute de trei materialele test
fortificate cu niveluri diferite de îndulcitori, cuantificate prin utilizarea matricei de calibrare
sau etalonare obţinută prin standardele dizolvate în soluţie tampon. În cele mai multe cazuri,
rezultatele obţinute pe baza soluţiilor tampon de calibrare au fost mai aproape de valoarea
reală decât cele calculate cu ajutorul curbelor de calibrare. Numai în cazul NHDC din iaurt,
matricea de calibrare a dat rezultate relative mai bune, care ar putea fi din cauza degradării
mai rapide a îndulcitorului în iaurt.

Scopul final al studiului a fost de a oferi metodologie adecvată pentru a fi utilizată de

către laboratoarele particulare sau de agenţii pentru a pune în aplicare limitele legislative. Prin
urmare, întreaga abordare a fost în cele din urmă adaptată pentru a se potrivi cu limitele legale
prevăzute. Nivelul superior al gamei de lucru a fost limitat la cca. 125 % din MUD pentru
îndulcitorii autorizaţi. Niveluri de concentraţie mai mică au fost stabilite cu ajutorul LOQ
determinate. O comparaţie a abaterilor standard ale reziduurilor obţinute prin ecuaţii
polinomiale şi liniare nu au arătat diferenţe semnificative între cele două modele de calibrare
pentru toţi cei 9 îndulcitori.

Validarea metodei

Metoda de validare este una dintre măsurile universal recunoscute ca fiind o parte
necesară a unui sistem global de asigurare a calităţii în chimia analitică. Validarea metodei de
analiza poate fi considerată ca fiind un proces sistematic de verificare dacă o metodă de
analiză este acceptată pentru scopul destinat. Validarea prezentată examinează parametrii de
selectivitate, limita de detecţie, limita de cuantificare, precizia şi exactitatea metodei folosite
pentru cei nouă îndulcitori.

Selectivitatea

Selectivitatea reprezintă capacitatea metodei de a determina cu exactitate analitul de

interes, în prezenţa altor componente care pot fi prezente în aceeaşi probă. S-a stabilit prin
compararea rezultatelor obţinute pe o soluţie standard de îndulcitori care conţinea 16
substanţe diferite întâlnite în produse alimentare. Au fost testate următoarele substanţe:
benzoat de sodiu, acid sorbic, acid citric, acid fosforic, acid malic, acid ascorbic, acid
glutamic, zaharoza, glucoză, fructoza, lactoză, cafeină, chinina, taurina, D (+)-glucurono-
lactona şi sorbitol. Singura pereche de compuşi care a întâmpinat probleme a fost ALI-CHI.
Mai mult, selectivitatea metodei a fost investigată prin analizarea tuturor probelor martor,

25
materialelor test cum ar fi: băuturi energizante, băuturi carbogazoase, băuturi răcoritoare fără
acid, conserve din fructe şi iaurturi natural. Niciunul din materialele test nu a prezentat alte
component care ar fi putut interfera cu analitii de interes.

Domeniul de lucru

Întreaga abordare a fost efectuată într-un interval de lucru de 25 µg g-1 la 125% din
MUD-uri pentru îndulcitorii autorizaţi şi 125% din 150 µg g-1 pentru îndulcitorii neautorizaţi.

Limită de detecţie şi de cuantificare

Probele martor au fost utilizate pentru a determina nivelul mediu al timpului de

retenţie a analitilor de interes şi matricea potrivită pentru soluţiile de calibrare pentru a estima
limita de detecţie (LOD) şi limita de cuantificare (LOQ).

LOD au fost determinate de reducerea succesivă a volumului de soluţii de calibrare

injectate ce conţin cele mai mici concentraţii de îndulcitori. Volumul de injectare care a dat un
semnal zgomotos de trei ori a fost utilizat pentru a estima LOD.

LOQ pentru fiecare îndulcitor a fost stabilită în funcţie de concentraţia care a dat
semnalul sonor. LOD şi LOQ sunt prezentate în Tabelul 3.

Precizia şi autenticitatea metodei

Pentru a se respecta autenticitatea metodei în ceea ce priveşte concentraţia,

repetabilitatea, exprimate prin deviaţia relativă standard a repetabilităţii, au fost efectuate
aceste etape pe 6 probe pentru trei mătrici alimentare diferite, fortificate cu toţi cei nouă
îndulcitori la 4 niveluri diferite de concentraţie.

5. HPLC – metoda utilizata in studiul coloranţilor din băuturi nealcoolice şi alcoolice

26
 Calitatea alimentelor este o entitate deosebit de complexă deoarece, spre deosebire
de cea a altor produse industriale, ea are un cuprins mult mai larg şi efecte mult mai profunde.
Trebuie evidenţiat faptul că alimentul, prin calitatea sa, are implicaţii deosebite asupra vieţii
deoarece alimentele reprezintă un factor esenţial al proceselor metabolice şi al echilibrului
organismului. Introducerea în produsele alimentare a unor cantităţi sporite de conservanţi,
poate avea ca efect, pe de o parte substituirea unui component de valoare superioară şi, deci,
fraudă de ordin economic şi calitativ pentru consumatori, iar pe de alta parte, în cazul în care
limitele normelor oficiale sunt depăşite, obţinerea de produse care devin periculoase pentru
sănătatea consumatorului. În toate cazurile de suspiciune, trebuie să se apeleze la analizele
fizico-chimice de laborator. Din cauza toxicităţii posibile a unor aditivi legislaţia sanitară
naţională şi internaţională,precum şi standardele prevăd denumirea aditivilor şi dozele maxim
permise. Aditivii trebuie să îndeplinească pe lângă condiţiile de calitate şi proprietăţi specifice
şi o serie de cerinţe de puritate în ceea ce priveşte conţinutul în metale grele şi metaloizi.

Culoarea este o însuşire a calităţii senzoriale a unui produs alimentar care, alături de
formă, mărime, structură şi aspectul general al acestuia, contribuie la percepţia vizuală a
consumatorului. Este bine-cunoscut faptul că aspectul unui produs alimentar sau al unei
băuturi depinde în mare măsură de faptul că acesta este sau nu colorat.

Culoarea unei băuturi este un parametru greu de evidenţiat în profunzime, dar foarte
important în clasificarea şi stabilirea calităţii acesteia. Pentru a satisface preferinţa
consumatorului pentru băuturi colorate, se recurge adesea la adaosuri de coloranţi sintetici
şi/sau naturali, care pot fi interzişi sau nu de lege. Posibilitatea de detectare a coloranţilor
utilizaţi la prepararea băuturilor nealcoolice (concentrate, răcoritoare, energizante) şi alcoolice
(lichioruri, whisky, băuturi preparate din vin – vermut, coniac etc.) este foarte importantă
pentru controlul calităţii acestor produse.

Coloranţii alimentari incluşi în lista E-urilor (E 100 – E 182) sunt intens folosiţi în
industria producerii băuturilor. Caracterizarea culorii băuturilor face subiectul a numeroase
cercetări în domeniu. Apariţia pe piaţă a unei game variate de băuturi colorate artificial, ridică
însă problema colorării artificiale şi impune un control riguros al calităţii şi cantităţii
coloranţilor folosiţi. Ca urmare, cercetări specifice de actualitate pentru determinarea
coloranţilor prezenţi în băuturi sunt absolut necesare.

27
 Autenticitatea băuturilor şi securitatea chimică a acestora sunt parametri deosebit
de importanţi care pot fi confirmaţi prin rezultatele analizelor efectuate şi care fac posibilă
delimitarea băuturilor originale de cele falsificate. În stadiul actual, problema autenticităţii, a
calităţii şi a siguranţei chimice a băuturilor de pe piaţa românească este stringentă deoarece
sistemul de control existent se manifestă doar în cazul apariţiei unor sesizări ale
consumatorului, este subdimensionat şi rezolvă doar o paletă restrânsă din problemele ridicate
de consumator. Numărul laboratoarelor de control al calităţii produselor alimentare este mic şi
nu posedă metode moderne de lucru standardizate. Importanţa comercială considerabilă a
băuturilor, împreună cu regulile stricte de control al calităţii necesită dezvoltarea unor metode
adecvate şi sigure pentru determinarea coloranţilor alimentari continuţi.

Metodele de analiză fizico-chimică a coloranţilor alimentari din băuturi au menirea

de a interveni în mecanismul de control al conformităţii etichetă-compoziţie, contribuind
astfel la diminuarea abuzurilor producătorilor. Pentru că în produsele alimentare coloranţii
sintetici se folosesc în cantităţi extrem de mici, care nu determină un gust sesizabil, iar preţul
de cost este deosebit de avantajos pentru producătorii, tentaţia utilizării lor pentru a imita
produsele naturale poate fi foarte mare. Identificarea utilizării coloranţilor alimentari în scopul
ilustrat mai sus reprezintă un alt obiectiv care justifică elaborarea metodelor de analiză
fizicochimică a coloranţilor alimentari din băuturi.

Există o gamă largă de metode de analiză, destructive şi nedestructive utilizate pentru

analiza băuturilor: metode spectrofoto-metrice: UV-Vis, spectroscopie IR (FTIR, NIR),
metode cromatografice: GC, GCMS,HPLC, HPTLC, TLC, HPLC-MS, metode
electrochimice, electroforeza capilară, spectrometrie de masă etc.

Metodele de analiză a coloranţilor alimentari fie că sunt metode electrochimice, fie

că sunt metode spectrofotometrice sau metode cromatografice, ele trebuie să întrunească
anumite criterii de performanţă, criterii care se referă la limita de detecţie şi de determinare; la
interferenţă şi nu în ultimul rând la siguranţa rezultatului dat şi a costurilor legate de analiză.
În baza datelor din literatură, se observă ca tehnicile cromatografice de analiză sunt foarte
permisive din punct de vedere al varietăţii compuşilor care pot fi analizaţi. Astfel datorită
performanţelor obţinute, tehnicile cromatografice s-au consacrat ca tehnici uzuale de analiză a
coloranţilor alimentari.

28
 Au fost efectuate cercetări de laborator preliminare privind determinarea unor
coloranţi sintetici (tartrazine, sunset yellow, carmoisine, quinoline yellow, carmine, Ponceau
4R,Burnt Sugar, Caramel Brown, Dark Chocolate, Brilliant Black, brilliant Blue) şi a
coloranţilor naturali (antociani, b-caroten, Enocolor - extract natural din coajă de strugure),
utilizând metode spectroscopice (FTIR, UV-Vis), metode cromatografice (HPLC - High
Performance Liquid Chromatography şi TLC - Thin Layer Chromatography).

Rezultatele obţinute arată că spectroscopia optică poate fi utilizată cu succes pentru

identificarea componentelor produselor comercializate ca şi coloranţi dar, având în vedere
sensibilitatea la adaosurile prezente în unii produşi, rezultatele obţinute prin această metodă
de analiză trebuie corelate cu cele obţinute prin alte metode de investigare. Menţionăm că
spectrele UV-Vis sunt utile pentru stabilirea lungimii de undă optimă pentru detecţia HPLC.

Analiza prin HPLC este o metodă de analiză performantă şi rapidă. Datorită rezoluţiei,
sensibilităţii şi preciziei aceasta a devenit în ultimii ani metoda preferată de mulţi analişti, în
special atunci când este necesară analiza compuşilor nevolatili.

Au fost realizate cercetări preliminare, obţinându-se o bună separare prin HPLC a şase
coloranţi de sinteză: tartrazină, sunset yellow, carmoizină, ponceau 4R, brilliant blue şi
brilliant black. Pentru studiul coloranţilor naturali, au analizate HPLC extracte naturale din
coajă de struguri roşii (antociani) şi sfeclă roşie (betaina) în comparaţie cu colorantul
comercial Enocolor.

A fost adaptată o metodă HPLC pentru determinarea a patru coloranţi alimentari

sintetici: tartrazină, ponceau 4R, allura red şi galben de chinolină si o metodă HPLC de
determinare simultană a unor coloranţi naturali din extracte de morcov, pătrunjel, ardei roşu,
pastă de roşii. Metodele HPLC prezentate sunt potrivite pentru studiul coloranţilor naturali şi
sintetici din diferite probe de băuturi nealcoolice şi alcoolice.

29
BIBLOGRAFIE:

1. Armstrong, D.W. Analytical Chemistry, 1987, Vol. 59, pp. 84-91.

2. Beckman Model 330 HPLC Manuel, Beckman Instruments, Fullerton, CA.

3. Bidlingmeyer, B.A. and Warren, F.V. Jr. Analytical Chemistry, 1984, Vol. 56, pp. 1583-96.

4. Bright, F.V. Analytical Chemistry, 1988, Vol. 60, pp. 1031-1039.

5. Brown, P.R. Analytical Chemistry, 1990, Vol. 62, pp. 995-1008.

6. DiCesare, J.L.; Dong, M.W.; Vandermark, F.L.; Am. Lab., 1981, No. 13, p. 52.

7. Dorschel, C.A.; Ekmanis, J.L.; Oberholtzer, J.E.; Warren, F.V. Jr.; Bidlingmeyer, B.A.
Analytical Chemistry, 1989, Vol. 61, pp. 951-968.

8. Ewing, A.G.; Wallingford, R.A.; Olefirowicz, T.M.; Analytical Chemistry, 1989, Vol. 61,
pp. 292-303.

9. Glajch, J.L. and Kirkland, J.J.; Analytical Chemistry, 1983, Vol. 55, pp. 319-32.

10. Green, R.B. Analytical Chemistry, 1983, Vol. 55, pp. 20-31.

11. Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals; Molecular
Probes Inc.; Eugene, OR, 1985.

12. Jones, D.G. Analytical Chemistry, 1985, Vol. 57, pp. 1057-1073.

13. Knox, J.H. and Kauer, B.; High Performance Liquid Chromatography; Brown. P.R. and
Hartwick, R.A. Eds.; Wiley Interscience: New York, 1989, Chapter 4.

14. Mant, C.T. and Hodges R.S. eds. High-Performance Liquid Chromatography of Peptides
and Proteins: Separations, Analysis, and Conformation, CRC Press: Boston, 1991.

15. McClure, W.F. Analytical Chemistry, 1994, Vol. 66, pp. 43-54.

16. Novotny, M. Analytical Chemistry, 1989, Vol. 60, pp. 500-10.

17. Regnier, F.E. Analytical Chemistry, 1983, Vol. 55, pp. 1298-1306.

30
18. Schoeff, M.S. and Williams, R.H. Principles of Laboratory Instruments, Mosby: St. Louis,
1993.

19. Simpson, R.C. and Brown, P.R.; J. Chromatogr., 1987, Vol. 400, p. 297.

20. Synder, L.R.; Stadalius, M.A.; Quarry, M.A. Analytical Chemistry, 1983, Vol. 55, pp.
1412-30.

21. Thomas, E.V. Analytical Chemistry, 1994, Vol. 66, pp. 795-804.

22. Thorne, A.P. Analytical Chemistry, 1991, Vol. 63, pp. 57-65.

23. Wellinder, B.S.; Kornfelt, T.; Sorensen, H.H.; Analytical Chemistry, 1995, Vol. 67, pp.
39-43.

24. Willard, H.; Merritt, L.; Dean, J.A.; Settle Jr., F.A. Instrumental Methods of Analysis , 7th
ed., Wadsworth Publishing Co., 1988.

25. S.Gocan, Cromatografia de înalta performanta, I. Cromatografia de gaze, Ed. Dacia, Cluj-
Napoca, 1998.

26. S.Gocan, Cromatografia de înalta performanta, II Cromatografia de lichide pe coloana,

Ed.Risoprint, Cluj-Napoca, 2002.

27. Yan Zhu, Yingying Guo, Mingli Ye, Frits S. James – Journal of Chromatography A, 1085,
pag. 143-146, 2005

31