Cromatografie de lichide de inalta performanta (HPLC)

Cursul II IPA

Cromatografie de lichide de inalta performanta (HPLC)

HPLC utilizeaza o faza mobila lichida si faze stationare cu particule de mici dimensiuni. Pentru a obtine debite satisfacatoare, lichidele trebuie introduse in coloana sub presiune. HPLC s-a pus la punct in anii 60, din punct de vedere al: 1. Fazelor stationare cu particule care si-au redus dimensiunile de la 150-200 micrometri la 5-10 micrometri. 2. Dimensiunile mici au condus la cresterea rezolutiei separarii si la reducerea dimensiunilor coloanelor.

Clase de separari prin LC

Cromatografie de lichide in faza normala (NP-LC) faza stationara este polara, faza mobila este formata dintr-un solvent nepolar Cromatografie de lichide in faza inversa (RP-LC) faza stationara este nepolara si hidrofoba, iar faza mobila este un solvent polar Cromatografie de lichide prin mecanism de schimb ionic faza stationara este un schimbator de ioni, faza mobila este faza apoasa cu pH controlat Cromatografie de lichide prin mecanism de excludere faza stationara este un gel cu porozitate controlata

Clasificarea separarilor in HPLC

In functie de natura fazei stationare si a procesului de separare avem: In cromatografia de repartitie faza stationara este un adsorbent (silicagel sau alta umplutura pe baza de silice) iar procesul de separare se bazeaza pe adsorbtii si desorbtii repetate. In cromatografia de schimb ionic faza stationara contine sarcini ionice de suprafata de semn opus ionilor probei, tehnica aplicandu-se probelor ionice sau ionizabile, iar timpul de elutie fiind functie de taria schimbului ionic. Faza mobila este o solutie tampon apoasa, unde atat pH-ul cat si taria ionica sunt utilizate in controlul timpului de elutie. In cromatografia de excludere sterica coloana este umpluta cu un material cu dimensiuni de pori controlate, componentii probei find separati in functie de dimensiunile moleculare.Aceasta tehnica se mai numeste filtrare in gel sau cromatografie de filtrare in gel, desi astazi faza stationara nu mai este redusa numai la geluri.

Lichid-Solid opereaza pe principiul polaritatii. Compusii care poseda grupari functionale capabile sa dea legaturi puternice de hidrogen vor adera mai puternic la faza stationara in comparatie cu compusii mai putin polari. Astfel, compusii mai putin polari vor fi eluati din coloana mai rapid decat cei puternic polari. Lichid-Lichid opereaza pe acelasi principiu ca si in lichid-solid, aceasta tehnica fiind mai mult utilizata pentru probe de polaritate medie solubile in solventi de polaritate medie. Separarea ne-electrolitilor se realizeaza prin polaritati apropiate ale probei si fazei stationare si utilizarea de faze mobile cu polaritati mult diferite. Excluderea sterica opereaza pe principiul dimensiunilor moleculelor componentilor probei. Faza stationara este poroasa. Coloana poate contine umpluturi pe baza de silice sau alte tipuri de umpluturi.

In cromatografia de adsorbtie, in functie de polaritatea relativa a celor doua faze avem: cromatografie normala si cromatografie cu faza inversa:
In cromatografia in faza normala, faza stationara este puternic polara (e.g., silica gel), iar faza mobila este nepolara (n-hexan sau tetrahidrofuran). Probele polare sunt retinute pe suprafata polara a fazei mai mult decat cele nepolare sau mai putin polare. In cromatografia in faza inversa faza stationara este nepolara (hidrofobica) , in timp ce faza mobila este un lichid polar, e.g. amestecuri de apa si metanol sau acetonitril. Cu cat materialul este mai nepolar cu atat va fi mai mult retinut pe coloana. Cele doua tipuri de cromatografii acopera 90% din aplicatiile cromatografice. Polaritatea eluentului joaca un rol important in HPLC. Sunt doua tipuri de elutie: izocratica si cu gradient. In primul tip eluentul de compozitie constanta este pompat prin coloana in timpul analizei. In cel de-al doilea tip, compozitia eluentului si taria ionica se modifica in timpul analizei.

Instrumentatie

Componentele HPLC
Probele lichide sunt injectate in coloana cu o siringa printr-o valva de injectie. Proba este purtata de-a lugul coloanei cromatografice de faza mobila, iar separarea cromatografica are loc pe masura ce amestecul traverseaza coloana. Detectorii in HPLC detecteaza componentul eluat la capatul coloanei pe baza unor proprietati fizice ca: absorbtia de lumina UV, fluorescenta, sau diferentele de indice de refractie intre analit si faza mobila. Schema unui sistem HPLC este prezentata mai jos:

Faza mobila
Pompa

Rezervor

Injector

Pre-Coloana

Coloana

Detector
Achizitie Date

Faze mobile in HPLC.

Solvent UV cut-off (nm) 197 190 Refractive Index 1.389 1.372 Boiling Point (C) 99 69 Viscosity (cP, 25 C) 0.47 0.30 Solvent Polarity Parameter(P) 0.1 0.1 Selectivity Group -

Isooctane N-Hexane

Methyl t-butyl ether

Benzene Methylene chloride n-Propanol Tetrahydrofuran Ethyl acetate Chloroform Dioxane Acetone Ethanol Acetic acid Acetonitrile Methanol Water

210
278 233 240 212 256 245 215 330 210

1.369
1.501 1.421 1.385 1.405 1.370 1.443 1.420 1.356 1.359 1.370

56
81 40 97 66 77 61 101 56 78 118 82 65 100

0.27
0.65 0.41 1.9 0.46 0.43 0.53 1.2 0.3 1.08 1.1 0.34 0.54 0.89

2.5
2.7 3.1 4.0 4.0 4.4 4.1 4.8 5.1 4.3 6.0 5.8 5.1 10.2

a a a a

190 205

1.341 1.326 1.333

Faze stationara
Faza stationara in HPLC se refera la suportul solid din coloana peste care trece continuu faza mobila. Solutia probei se injecteaza in faza mobila prin portul de injectie. Componentii amestecului vor migra in functie de interactiunile ne-covalente ale acestora cu faza stationara. Interactiile chimice ale fazei stationare si ale probei cu faza mobila determina gradul de migrare si de separare al componentilor probei. Coloane continand diferite tipuri de faze stationare comerciale sunt cele in care apar mecanismele de sorbtie : LichidLichid (Repartitie) in faza normala si in faza inversa, Lichid-Solid (Adsorbtie), Excludere sterica, Schimb Ionic, si Afinitate.

Adsorbenti Separarile prin HPLC au la baza interactiuni la suprafata si depind de natura centrilor de adsorbtie (chimia suprafetei). Adsorbentii noi sunt particule mici, rigide cu suprafete mari. Parametrii adsorbentilor sunt: Dimensiunea particulelor: 3-10 m Distributia dimensiunii particulelor: cat mai ingusta posibil, < 10% din medie; Dimensiunea porilor: 70-300 m Aria suprafetei: 50-250 m2/g Densitatea de legare (numarul de centri de adsorbtie/unitate de suprafata: 1-5/1 nm2

Depinzand de tipul de ligand atasat la suprafata, adsorbentul poate fi faza normala (-OH, -NH2) sau faza inversa(C8, C18, Phenyl), sau schimbatori de ioni (NH4+), (-COO-).

Faza normala opereaza pe baza hidrofilicitatii si lipofilicitatii prin utilizarea de de faze stationare polare si faze mobile mai putin polare. Astfel compusii hidrofobici sunt eluati mai rapid decat cei hidrofilici. Faza inversa opereaza pe baza hidrofilicitatii si lipofilicitatii. Faza stationara consta in umplutura pe baza de silice cu lanturi n-alchilice covalent legate. C-8 semnifica un lant octil si C-18 un ligand octadecil in matrice. Cu cat este mai hidrofobica matricea, cu atat creste tendinta coloanei de a retine entitati hidrofobice, iar compusii hidrofilici sunt mai rapid eluati in comparatie cu cei hidrofobici.

Cromatografie in faza normala Faze stationare polare Solventii mai polari au puteri mai mari de elutie

Cromatografie in faza inversa Faze stationare nepolare Solventii mai putin polari au puteri mai mici de elutie

Clasificarea coloanelor in HPLC Sunt si alte tipuri de coloane decat cele de separare propriu-zise care contin faza stationara: de protectie, de derivatizare, capilare, rapide, si preparative. Coloanele de protectie sunt plasate inaintea coloanei de separare fiind utilizate la protejarea acesteia in scopul filtrarii sau separarii: 1) particulelor care pot infunda coloana; 2) compusilor care conduc la variatii ale liniei de baza "baseline drift", la rezolutii si sensibilitati scazute si la aparitia picurilor false; 3) compusilor care pot provoca precipitarea la contactul cu faza stationara sau faza mobila; 4) compusilor care pot fi co-eluati si produc picuri suplimentare interferand in detectie si in analiza cantitativa. Aceste coloane trebuie schimbate regulat pentru a-si pastra calitatile de protectie.

Coloane de derivatizare- Derivatizarea pre- sau post- coloana derivatization reprezinta un aspect important al analizei cromatografice. Reducand sau alterand compusul initial la molecule chimice inrudite la la fragmente moleculare se pot obtine date complementare datelor analizei. In putine cazuri, etapa de derivatizatizare poate conduce la date nesigure sau neconcludente, acest aspect conferind avantaje HPLC in comparatie cu GC. Deoarece GC necesita analiti volatili, termic stabili sau analiti nepolari, derivatizarea este necesara si in acele probe care nu au aceste proprietati. Acetilarea, sililarea, sau hidroliza acida reprezinta exemple de tehnici de derivatizare. Coloane capilare- Progresele in HPLC au condus la coloane analitice de mici dimensiuni, cunoscute ca microcoloane, coloanele capilare au diametre submilimetrice si sunt de trei tipuri: tubulare deschise, cu umplere partiala si umplute. Acestea permit lucrul cu probe de ordinul nanolitrilor, lucrul cu debite mici si volume mici de solvent. In aceste conditii insa toata instrumentatia trebuie miniaturizata debitele sunt dificil de reprodus, lucrul cu gradienti de elutie nu este eficient si injectarea probelor trebuie facuta cu grija.

Microcoloanele cu umplutura sunt utilizate pentru volume mici, diametrul lor fiind de 1-2 mm. Ca si coloanele capilare, instrumentele trebuie adaptate la folosirea unor coloane de acest tip (de ex. debite mici in coloana). Pe langa avantajele volumelor mici de proba si de faza mobila se remarca o crestere sensibilitatii fara a se pierde din rezolutie. ---Electroforeza capilara Coloane rapide- Argumentul in utilizarea acestor coloane este obtinerea unor probe superioare (cantitate de component in unitate de timp). Pentru multe coloane, cresterea debitului sau vitezei de migrare prin coloana afecteaza negativ rezolutia si separarea in general. Din acest motiv, coloanele rapide sunt utilizate in scopul reducerii timpului de analiza fara deviatii semnificative ale rezultatelor. Aceste coloane au acelasi diametru intern, dar lungimi mult mai mici fiind umplute cu particule cu diametrul de aprox. 3 m. Avantajele includ sensibilitate marita, timpi de analiza redusi, utilizarea unor volume mai mici de faza mobila si reproductibilitate marita.

Coloane preparative- Aceste coloane sunt utilizate pentru probe de ordinul miligramelor in scopuri preparative. O coloana preparativa are diametre mari pentru a facilita volume de injectie mari in sistemul HPLC. Accesoriile importante sunt regulatorul de presiune si colectorul de fractii. Primul este plasat imediat dupa detector, in scopul asigurarii unei presiuni constante la iesirea din detector pentru a preveni introducerea bulelor de aer in sistem si a imbunatati stabilitatea liniei de baza. Colectorul de fractii colecteaza uniform fractiuni la iesirea din coloana, fiolele fiind plasate intr-un carusel programat in ceea ce priveste intervalele de colectare. Fiecare fiola contine faza mobila si fractiunea din proba la timpul de elutie corespunzator. Umplutura coloanelor are diferite dimensiuni de particule, diametre, dimensiuni de pori sau suprafete modificate(in cromatografia de afinitate). (Brown, 1990).