Cromatografia de lichide de înaltă performanţă HPLC

Introducere
Cromatografia de lichide de înaltă performanță notată prescurtat HPLC ( high
performance liquid chromatography) este în prezent mult utilizată deoarece permite abaliza
substanțelor moleculare organice, organo-metalice și anorganice , inclusiv a compușilor cu masă
moleculară ridicată naturali sau sintetici.
Eficacitatea coloanelor in HPLC este mai mică decat cea din cromatografia de gaze. În
schimb, in cazul HPLC se poate modifica atat faza stationara cat si cea mobila ceea ce face
posibila separarea unor compusi imposibil de separat prin alte tehnici.

Această tehnică este cel mai mult aplicată dintre tehnicile cromatografice fiind folosită în
analiza chimică, biomedicală, farmaceutică , analiza alimentelor etc. HPLC este utilizată pentru
separarea şi detecţia unor compuşi biologic activi (hormoni, vitamine, proteine , lipide) , instabili
termic

Solventi

Pompe

Injector

Coloana

Detector

Calculator
pentru înregistrarea și prelucrarea semnalului

Figura 1.Schema bloc a unui cromatograf HPLC

Parţile componente ale unui cromatograf de înaltă performanţă sunt următoarele:
–rezervoare pentru lichide ( eluenţi);
-pompe pentru lichide (una sau două);
-sistem de introducere a probei (seringă de injecţie);
-coloana de separare;
-detector ;
- înregistrator.

Pompele preiau eluentul din rezervorul de solvenţi . Cu ajutorul sistemului de

introducere a probei, acesta este introdusă în coloana cromatografică. La ieşirea din coloana ,
eluentul cu componenţii separaţi din probă trece prin detectorul 5 .
În detector, sunt identificaţi componenţii probei datorită variaţiei unei proprietăţi , de
exemplu absorbţia în UV , VIS sau fluorescenţa.
Înregistratorul trasează cromatograma , care este proprietatea dată de detector în funcţie
de timp. De exemplu , în cazul de detectorului UV se traseaza absorbanţa în UV funcţie de timp.
Înregistratorul a fost înlocuit pentru aparatele HPLC moderne de calculatoare care preiau
semnalul și îl prelucrează.

Pompa pentru HPLC

Pompa este considerata una dintre cele mai importante componente ale HPLC deoarece
permite realizarea unui debit constant al eluentuluiprin întregul sistem al cromatografului de
lichide: injector, coloană, detector. Pompa permite creșterea apreciabilă a vitezei de separare prin
întregul aparat HPLC: injector, coloană, detectror . Cromatograful de lichide este dotat cu una
sau mai multe pompe. Fiecare din acestea furnizeaza o presiune de până la circa 20000
kPa(aproximativ 200 atm). Această presiune ridicată este necesară pentru a învinge rezistența la
curgere opusă de umplutura cu finețe mare. În absența presiunii aplicate , debitul efluentului ar
fi foarte mic, iar separarea cormatografică ar dura prea mult.
Pompele cu care sunt dotate cromatografele de lichide HPLC sunt de două tipuri:
 pompe cu presiune constantă ( având debitul variabil);
 pompe cu debit constant.
Pompele cu presiune constantă sunt simple , relativ ieftine și nu prezintă pulsații în
funcționare. Pulsațiile sunt nedorite deoarece împiedică obținerea unei linii de bază netede.
Dar, pompele cu presiune constantă au ca dezavantaj faptul că debitul trebuie modificat
frecvent pentru a se menține cât mai constant. În cazul separărilor de lungă durată apar probleme
deoarece în cursul funcționării cromatografuluio, are loc obturarea coloanelor ceea ce duce la
scăderea debitului. Orice modificare de debit, datorită vâscozității sau temperaturii eluentului și a
structurii umpluturii afectează timpul de retenție, și totodată semnalul detectorilor, care sunt în
majoritate sensibili la concentrație.
Pompele cu debit constant prezintă acest dezavantaj. Aceste pompe se fabrică în
următoarele variante constructive:
 pompe cu piston;

 pompe de tip seringă (cu deplasare pozitivă).

Pompele cu piston, numite și pompe alternativesunt cele mai utilizate. Mișcarea

oscilatorie ( du-te-vino) a pistoanelor și a supaelor permit o funcționare continuă, dar necesită
dotarea cu dispozitive cu rol de atenuare a pulsațiilor care să elimine variațiile de debit de mică
amploare numiteacumulatoarele hidraulice. Cu ajutorul acestor dispozitive se menține un debit și
o presiune constantă fiind alcătuite din mai multe rezistențe hidraulice, de exemplu tuburi subțiri
sau incinte cu pereți elastici.
Pompele cu presiune constantă sunt asemănătoare cu siringile, dar au capacitate mai
mare. Ele pompează continuu pe toată durata separării. Pistonul se deplasează ci o viteză liniară
constantă, dar după fiecare cursă este necesară oprirea debitului și reumplerea cu solvent a
corpului pompei.
Pompele utilizate în HPLC funcționează într-un mediu coroziv (vehiculează solvenți) la
presiuni ridicate. De aceea solvenții sunt degazați , iar pompele sunt construite din materiale
rezistente la coroziune (teflon sau aliaje speciale).

Sisteme de introducere a probei

Încromatografiade lichide de înaltăperformanțăinjecțiaprobeitrebuiefacutăfoarte rapid, pentru a

nuperturbaregimuldinamic al eluentuluiprincoloanăși detector avândînvederepresiunearidicată la
care se lucrează.Celmaiutilizatsistem de introducere a probeiesteventilul cu 6 căi, numitșiventilși
de introducere a probei, prevazut cu bucleinterschimbabile (fig. 3).
 Figura 3.
Ventilulpentruintroducereaprobei (cu 6 căi) lucreazăîndouăetape: 1 — alimentareabuclei cu
proba; 2 — după o rotire cu 60 ° însensulacelor de ceasornic, are locantrenareaprobei din
buclăîncoloană.

Ventilulcu 6căifuncționeazăîn 2 etape:

-etapa 1: introducereaprobeiînventil( maiprecisîntr-o buclă a ventilului);
-etape 2: comutareaventiluluipeanalizăcând are locrotirea cu 60 ° șiantrenareaprobei din
buclăîncoloană.
Eluentul aderă la pereți și de aceea , pentru completa îndepărtare a sa în momentul
alimentării buclei cu probă , este necesară injectarea prin buclă a unui volum de cel puțin 3 ori
volumul acesteia, înainte de comutarea pe analiză.
Volumul probelor pentru colonele obișnuite cu dimensiuni de 25 cm x4,6 mm ( lungime
x diametrul coloanei) este de 10-50 µL ( microlitri).
Pentru fabricarea ventilelor se utilizează materiale rezistente la coroziune și la solvenți
(oțel inoxidabil, tantal, teflon etc.).

Colonele cromatografice în cromatografia de lichide

Coloana cromatografică este spațiul în care are loc separarea componenților probei fiind
considerată cea mai importantă componentă a cromatografului de lichide. În funcție de calitatea
coloanei și a umpluturii se mărește sau se micșorează raportul semnal /zgomot.
Coloana cromatografică este formată din:
 corpul coloanei;
 umplutura coloanei.
Corpul coloanei este alcătuit dintr-un material care asigură rezistența mecanică necesară a
putea funcționa la presiunile ridicate la care se operează în HPLC (20 000 kPa) și rezistența la
coroziune având în vedere că faza mobilă este constituită din diferiți solvenți sau amestecuri ale
acestora.
Materialele utilizate pentru confecționarea colonelor în HPLC sunt următoarele:
-oțel inoxidabil lucios;
-materiale compozite formate din sticlă sau material plastic în interior și oțel inoxidabil sau
material plastic în exterior.
 Figura 4.
Coloane HPLC de diferite dimensiuni

(http://www.directindustry.it/prod/agilent-technologies-life-sciences-and-chemical/colonne-hplc-
32598-250400.html; http://www.chimicare.org/blog/metodi-e-approcci/che-cose-la-
cromatografia/)
 Umplutura unei coloane cromatografice (SiO2 avand grefate catene hidrocarbonate liniare cu
grupari fenil)

Coloanele în cromatografia de lichide sunt de formă cilindrică. Dimensiunile lor depind

de dimensiunea granuelolor și de porozitatea umpluturii. Diametrul coloanelor variază între 0,3-5
cm, iar lungimea este situată în domeniul 3-25 cm.
Pentru scopuri preparative, se utilizează diametre mai mari de 5 cm.
Cu cât umplutura este mai fină, cu atât se recomandă a se lucra cu o coloană mai scurtă.
Pentru a se reține eventualele impurități sau componenți care nu pot părăsi coloana deoarece sunt
reținuți ireversibil, se pot utiliza așa numitele “precoloane” care au același diametru ca și
coloanele, dar lungimi mai mici situate între 0, 4 și 1 cm. Precoloanele se pot înlocui mai des,
evitând astfel scoaterea din funcție a coloanei principale.
Coloana cromatografică este prevăzută la cele două capete cu două discuri metalice
poroase care au rolul de a reține fază staționară care ar putea fi antrenată de faza mobilă în zona
poroasă cu porii având diametrul de 0,5-10 µm.
De asemenea, pentru a nu se lărgi prea mult prin coloană zona cromatografică (datorită
diluării care are loc simultan), tot volumul mort al coloanei ( goluri în coloană, tuburi de
aducțiune de la injector, tubul de evacuare spre detector) trebuie redus la minimum.

Mecanisme de separare în cromatografia de lichide

Se cunosc mai multe mecanisme de separare care depind de faza mobilă și staționară din
coloana și de natura fenomenului fizico-chimic prin care are loc separarea cromatografică:
Pe baza mecanismului de separare, metodele cromatografice din cromatografia de lichide
se clasifică în:
-cromatografia de adsorbție;
-cromatografia de repartiție;
-cromatografia ionică;
-cromatografia de excluxiune sterică.
În funcție de compușii care urmează să fie separați prin CL, tipul de mecanism se alege
cu ajutorul schemei din figura 5.
 Cromatografia de repartiție se poate realiza în două variante de lucru:
a) cromatografia de repartiție directă ( sau cu faze normale, clasică);
b) cromatografia de repratiție cu faze inversate.
În cazul cromatografiei de repartiție directă, faza staționară este formată dintr-un lichid
polar, iar faza mobilă dintr-un solvent organic nepolar.
În cazul cromatografiei de repartiție cu fază inversată, situația se inversează: lichidul
impobil este nepolar, iar faza mobilă este un amestec de solvenți polari.
 Cromatografie
Substanță ionică (CI)

Solubilăînapă ionică
Cromatografie cu
perechi de ioni
Substanță
covalentă
M< 2000
Substanță Cromatografie
polară - cufazainversa;
Solubilăîn - cufazapolarălegată;
solvenți - lichid solid (CLS);
organici - deexcluziunesterică

Proba
CLS
Substanță
CI
nepolară
Cromatografie de
excluziune sterică

Solubilăînapă Cromatografie de
excluziune sterică
M> 2000

Solubilăînsolvenți Schimb ionic

organici
Interacțiuni
hidrofobe

Figura 5. Mecanisme de separare cunoscute pentru CL

Faza staționară
Silicagelul, SiO2, este cel mai mult utlizat material pentru faza staționară. Silicagelul s-a
obținut sub formă granulară neregulată, iar apoi prin perfecționarea procedeelor de obținere, în
formă sferică.
Obținerea silicagelului sferic se face plecând de la soluții care conțin silicat de sodiu pur
sau alți compuși ai siliciului care dau reacții de hidroliză: tetraclorura de siliciu, silicat de etil
etc. Compușii siliciuluianterior menționați sunt supuși reacției cu apa, urmată de pulverizare și
apoi de sinterizare (aglomerare a pulberilor) , iar in final se obțin granule cu aspect sferic (figura
6). Operațiileprin care se obține silicagelul sunt prezentate in figura 7. Granulatia silicagelului
treuie sa fie uniforma. Parte fina se elimina din produs. In acest fel curgerea eluentului este mult
imbunatatita.
Figura 6. Aspectul granulelor de silicagel sferic care se utilizează frecvent la umplerea
coloanelor in HPLC

Figura 7. Schema operatiilor prin care se obtine silicagelul pentru HPLC

 Figura. 17.12. Aspectul schematic al unei granule sferice cu fază stationara chimic legata de
suprafata suportului

Faze staţionare normală şi inverse în HPLC prin adsorbtie si repartitie

În funcţie de umplutura coloanelor se disting doua variante de lucru pentru separarea prin
HPLC:

Cu fază normală (HPLC-FN);

Cu faza inversă (HPLC-FI) , în engleză reverse phase.

Pentru umplutura coloanelor cu fază normală se folosesc următoarele substanţe:

 Silicagel;
 Alumină,
 Celuloză;
 Ca(OH)2;
 MgCO3

Pentru umplutura coloanelor cu fază inversă se folosesc următoarele substanţe cu

proprietăţi de adsorbţie:
Cărbune activ;
Silicagel modificat chimic prin legarea de octadecilsilan C18 sau octasilan C8.

Mecanismul pe baza căruia are loc separarea în cele două cazuri este diferit.
În cazul sistemelor HPLC –FN , separarea are loc datorită proceselor de adsorbţie, iar în
sistemele HPLC-FI , procesul de separare se bazează pe repartiţia componentelor între faza
staţionară nepolară şi eluentul poar.

Faze mobile în HPLC

Tipul fazei mobile (a eluentului) depinde de natura fazei staţionare. Astfel în sistemele HPLC-
FN , unde faza staţionară este polară, se folosesc eluenţi nepolari (eter de petrol, hexan puri sau
în amestec cu acetona 1-15%), iar când faza staţionară este nepolară (HPLC-FI) se folosesc
amestecuri de solvenţi nepolari cum sunt acetonitril, metanol, acetat de etil, etc.
În funcţie de tipul probei de analizat se va alege unul din aceste două sisteme:

 Daca probă este preponderent nepolară se recomandă utilizarea sistemului HPLC –FN
unde coloana conţine fază staţionară polară cu afinitate diferită

Detectia
Detectia in HPLC se realizeaza prin mai multe metode:

Detectia refractometrica:
Detectia bazata pe difuzia luminii;
Detectia conductometrica;
Detectia spectrofotometrica;
Detectia fluorimetrica.
Detectia electrochimica (amperometrica)
Detectia bazata pe spectrometria de masa.
In unele cazuri se adauga reactivi care permit detectia cu ajutorul unui anumit instrument , de
exemplu cu spectrofotometru sau fluorimetru. Acest procedeu se numeste derivatizare.