Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
LICHIDE PE COLOANĂ
1
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE ÎNALTĂ
PERFORMANŢĂ (HPLC)
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ =
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Principiu
Mărimi caracteristice
Mod de lucru
2
PRINCIPIU
Faza staţionară
Solidă
Introdusă într-un tub metalic (coloană)
Faza mobilă – amestec de lichide miscibile
3
Faza mobilă este vehiculată sub presiune în coloana
cromatografică
HPLC clasică – presiunea în coloană – 400-450 bari
UPLC Upper Pressure Liquid Chromatography – presiunea în
coloană – până la 1000 de bari
Compuşii separaţi ies pe rând din coloana
cromatografică şi intră într-un modul numit detector care,
de regulă, măsoară o proprietate fizico-chimică
(absorbanţa, fluorescenţa, potenţialul electrochimic,
conductivitatea etc.)
În principiu un cromatograf de lichide este format din:
• pompă
• injector
• coloană cromatografică cu sau fără termostat
• detector
• sistem de achiziţie şi prelucrare a datelor (computer)
4
APARATURA ÎN HPLC
5
1.REZERVOARELE DE SOLVENT ŞI
DEGAZAREA SOLVENTULUI
REZERVOARELE:
- sunt confecţionate din sticlă
- au capacitatea de minim 500 mL
- conductele de alimentare cu solvent spre
pompe sunt prevăzute cu filtre pentru prevenirea
intrării impurităţilor mecanice
DEGAZAREA: este necesară pentru că oxigenul sau
azotul dizolvate în faza mobilă afectează separarea
cromatografică( se poate face prin menţinerea fazei
lichide în baie cu ultrasunete, sub vid sau există
dispozitive moderne de degazare intercalate între 6
solvent şi pompă).
2.POMPELE
Pompe Pompe
cu faza mobilă este împinsă cu tip În cazul pompelor tip
piston
ajutorul unui piston,
simultan cu închiderea şi seringă seringă, solventul este
introdus într-un rezervor
deschiderea valvelor de mare şi deplasat constant,
acces şi evacuare a ca în cazul utilizării unei
seringi, cu ajutorul unui
solvenţilor piston acţionat de un
motor . Prin presurizarea
rezervorului, faza mobilă
este deplasată cu un debit
predefinit spre coloană.
9
3.ELUŢIA ÎN HPLC
10
4.SISTEMUL DE INTRODUCERE A PROBEI
11
Indiferent de modul de injectare, introducerea probei în
coloana cromatografică presupune două etape, încărcarea
buclei de injectare şi apoi injectarea probei în sistem, etapă
în care faza mobilă preia proba din bucla de injectare
12
5.COLOANELE ŞI PRECOLOANELE CROMATOGRAFICE
14
CLASIFICAREA DETECTORILOR
• Detectorul refractometric
• Detectorul de conductivitate
• Detectorul dielcometric
15
7.SISTEMUL DE CONTROL, ACHIZIŢIE ŞI PRELUCRARE A DATELOR
16
8.FAZE STAŢIONARE ÎN HPLC
18
FAZE STAŢIONARE-CONTINUARE
b. Forma particulelor
Particule neregulate
Particule sferice – des utilizate
c. Mărimea particulelor:
normală – diametrul particulelor este cuprins între 3 şi 10 m
micro – diametrul particulelor 3 m
monolit – faza staţionară este formată dintr-un material în
bloc, poros, faza mobilă trecând prin canale cu diametre medii de 2 m
până la 12 nm de-a lungul coloanei
Fazele staţionare în HPLC pot fi obţinute din foarte multe
substanţe: silicagel, hidroxizi, alumina, polimeri organici, carbon
grafitic poros etc., fiind folosite ca atare sau, unele dintre ele, după
modificare chimică prin grefarea unor resturi organice: alchil,
amino, ciano, alcool, selectori chirali, etc.
Forme ale
particulelor
fazei staţionare:
a. sferice, b. 19
neregulate
9.FAZE MOBILE ÎN HPLC
Indicele de refracţie
20
FAZELE MOBILE-CONTINUARE
Lungimea de undă limită la care absorbanţa solventului măsurată în
cuva de 1 cm este 1, folosind ca referinţă cuva cu aer. Solvenţii cu
puritate redusă au această limită situată la valori mai mari, ceea ce
afectează măsurătorile spectrofotometrice în UV-VIS
Punctul de fierbere – un punct de fierbere scăzut este impropriu dacă
eluţia necesită temperaturi de lucru mari
Polaritatea – capacitatea solventului de a interacţiona prin legături
dipolare cu substanţele de separat din probă (mat bibliografic supl)
Aciditatea – capacitatea solventului de a funcţiona ca donor de protoni
în raport cu un solut bazic
Bazicitatea – capacitatea solventului de a funcţiona ca acceptor de
protoni în raport cu un solut acid
21
MODURI DE SEPARARE ÎN HPLC
22
MODURI DE SEPARARE ÎN HPLC
Metode CL
DE RETENŢIE DE NONRETENŢIE
CL de adsorbţie CL de excluziune
CL de repartiţie
CL de repartiţie lichid-lichid
CL de schimb ionic
23
CL de afinitate
MODURI DE SEPARARE ÎN HPLC-
CONTINUARE
24
HPLC
Cromatografie cu fază normală
Principiul separării: cu cât natura analitului va fi mai apropiată de cea a fazei staţionare, cu
atât interacţiunile lui cu aceasta vor fi mai puternice – VA ELUA MAI TÂRZIU, TIMP DE
RETENŢIE CRESCUT.
MODURI DE SEPARARE ÎN HPLC
CONTINUARE
26
MODURI DE SEPARARE ÎN HPLC-
CONTINUARE
27
HPLC
Faza mobila
• compatibila cu elementele instrumentului si cu faza
stationara
• puritate avansata
• compresibilitate si vascozitate scazute
• lipsita de gaze dizolvate (aer)
(1)-Benzen,(2)-Monoclorbenzen,(3)-
Ortodiclorobenzen,
(4)-1,2,3– triclorobenzen,(5)-1,3,5–
triclorobenzen,
(6)-1,2,3,4 – tetraclorobenzen, (7)-
Pentaclorobenzen,
(8)-Hexaclorobenzen
1.CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE
Principiul cromatografiei de adsorbţie stă la baza
cromatografiei de lichide clasice, în strat subţire şi pe coloană,
şi a cromatografiei de adsorbţie gaz-solid.
Adsorbţia corespunde fixării energice a unui gaz, lichid sau
solid pe o suprafaţă solidă, procesul este reversibil, iar forţele
responsabile de adsorbţie nu sunt specifice .
29
CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE-CONTINUARE
30
CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE-CONTINUARE
Substanţele adsorbante
Adsorbanţii se aleg în funcţie de puterea de separare raportată la
amestecurile de substanţe, de inerţia lor faţă de acestea şi de
solventul utilizat ca eluant.
Exemple de adsorbanţi: bentonite (silicaţi de aluminiu hidrataţi),
alumină (Al2O3 nH2O), silice (SiO2), oxidul de magneziu.
Solvenţii
Solvenţii trebuie să fie inerţi faţă de adsorbant şi substanţa adsorbită.
Se întâmplă foarte rar ca un singur solvent să fie utilizat atât pentru
adsorbţie cât şi pentru eluţie. În cromatografie se alege în general un
solvent de fixare şi unul de eluţie, în funcţie de natura substanţelor de
separat.
Când adsorbantul este polar, solventul de fixare trebuie să fie cât mai
puţin polar.
Eluţia se începe cu solvenţi puţin polari şi se continuă cu solvenţi din
ce în ce mai polari.
În cromatografia de adsorbţie puterea eluotropică a unui solvent este
definită prin parametrul o din ecuaţia Snyder. 31
CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE-CONTINUARE
Creşterea
Solvent o
polarităţii
hexan 0
eter de petrol 0,01
tetraclorură de carbon 0,14
benzen 0,25
cloroform 0,31
acetat de etil 0,48
piridină 0,55
metanol 0,73
sesseSemnal
Timps
33
CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE-CONTINUARE
Adsorbţia unei substanţe depinde de:
34
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE
Sub această denumire se reunesc cromatografia de repartiţie
lichid-lichid şi cromatografia cu faze legate, iar principiul de
separare se bazează pe echilibrul de repartiţie între două faze
(solubilitatea diferită)
Principiul cromatografiei de
repartiţie
35
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE-
CONTINUARE
36
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE CU FAZE LEGATE
Suporţii
Printre cele mai cunoscute substanţe utilizate ca suporţi în
cromatografia de repartiţie sunt:
celuloza
kiselgur
silicagel (silice)
polimeri sintetici
Fazele staţionare
Fazele staţionare sunt grefate adică sunt faze în care se stabilesc
legături chimice între faza staţionară şi suport. Cele mai utilizate
sunt lanţurile alifatice de lungime şi polaritate diferită grefate pe
suporturi solide de tip silicagel
37
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE CU FAZE LEGATE-
CONTINUARE
38
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE CU FAZE LEGATE-
CONTINUARE
Fazele mobile
Trebuie să fie caracterizate prin putere eluotropică şi inerţie
chimică faţă de probele de analizat.
Cel mai adesea fazele mobile sunt constituite din
amestecuri de solvenţi (frecvent sunt amestecuri de apă sau soluţii
tampon şi un solvent organic) a căror proporţie poate varia în
cursul procesului cromatografic. Pentru cromatografie, în general,
cel mai puternic mediu de eluţie a fost considerat apa, acest lucru
fiind adevărat numai în cazul proceselor de adsorbţie
În cromatografia de repartiţie în fază inversă apa nu poate
uda grupările alchil nepolare (hidrofobe) şi nu interacţionează cu
acestea. Din această cauză apa este cea mai slabă fază mobilă şi
dă vitezele de eluţie cele mai scăzute în cromatografia cu fază
inversată. Creşterea cantităţii de apă în faza mobilă creşte timpul
de retenţie.
39
CROMATOGRAFIA DE REPARTIŢIE CU FAZE LEGATE-
CONTINUARE
metanol
acetonitril
anol
Scăderea polarităţii
isopropanol
Creşterea puterii de eluţie
dimetilformamidã
n-propanol
dioxan
tetrahidrofuranet
40
CROMATOGRAFIA CU SCHIMBĂTORI DE IONI
Principiul cromatografiei cu
schimbători de ioni
41
CROMATOGRAFIA CU SCHIMBĂTORI DE IONI-
CONTINUARE
45
CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE STERICĂ
Principiu
Cromatografia prin excluziune sterică se bazează pe un proces
de repartiţie lichid-lichid în care moleculele componenţilor de separat
sunt reţinute în funcţie de forma şi mărimea lor.
Mecanismul prin care are loc separarea în cromatografia prin
excluziune sterică nu este suficient elucidat
Proteină cu
afinitate pt
ligand
Alte
proteine
49
ANALIZA CALITATIVĂ
50
A. DIN DATE CROMATOGRAFICE
Soluţie standard
Sem
nal
51
Soluţie probă
Timp
52
Soluţii probă cu
adaus standard
Soluţia probă
iniţială
Timp
53
tipurile de spectrometre: UV-VIS, IR cu transformată
Fourier, spectrometru de masă, spectrometru de rezonanţă
magnetică nucleară, etc. Prin aceste cuplaje se pot obţine
spectre caracteristice, pe baza cărora se poate face
identificarea.
ANALIZA CANTITATIVĂ
54