HPLC

Cromatografia de lichide de înaltă

performanță
Cromatografia de lichide de înaltă
presiune

2020
 DEFINIȚIE:
HPLC – metoda analitică utilizată în scopul separării,
identificării și dozării substanțelor organice și
anorganice aflate într-un amestec.

Aplicații practice:
 Separarea componenților;
 Identificarea;
 Dozarea;
 Puritatea substanței;
 Clasificarea HPLC:
• Cromatografia de adsorbtie :

 faza stationara - adsorbant de tip silicagel/ alte umpluturi pe baza de silice

 principiul separarii: etape repetate de adsorbtie-desorbtie

 Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

 Interactiuni polare (dipol-dipol) – faza normala

• Cromatografia de schimb ionic :

 suprafata fazei stationare este incarcata ionic, de semn contrar ionilor analitului

 specifica analitilor ionici/ionizabili

 Interactiuni ionice
• Cromatografia de excluziune sterică SEC (GPC) :

 umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

 proba este separata functie de marimea ionului solvatat

Clasificarea HPLC funcție de
polaritatea celor două faze
Cromatografie cu faza Cromatografie cu faza
normala inversa
faza stationară –
faza stationară –
puternic polară
nepolara, lanturi
(silicagel) hidrocarbonate hidrofobe
faza mobilă – nepolară legate de silice :
Structura aparatului HPLC
 Principalele componente ale
cromatografului de lichide sunt:
- sistemul de alimentare cu fază mobilă
- dispozitivul pentru introducerea probei
- una sau două pompe
- coloana
- detectorul
- sistemul de prelucrare a datelor
Dispozitivul pentru degazare
Este necesar pentru îndepărtarea din solvenți
a gazelor dizolvate, mai ales a oxigenului,
care în timpul trecerii prin coloana ar putea
reacționa cu faza stationară, sau ar putea
forma bule de gaz cu o influență
nefavorabilă atât asupra separării cât mai
ales a detecției, ținând cont de volumul
foarte mic al celulelor detectoarelor
moderne. 
 Dispozitivul pentru
alimentarea cu solvenți:
 poate fi foarte diferit ca complexitate, de la
un simplu rezervor de solvenți în cazul eluției
izocratice , până la un programator de eluent
pentru doi sau trei solventi: pentru eluțiile de
gradient.

Elutie izocratica, cu un singur eluent sau cu un amestec de

eluenți de compoziție constanta;

Elutie cu gradient, utilizând un amestec de doi solvenți a

cărui compoziție este modificataă continuu în timpul
eluției.
 Eluția componentelor
Eluția izocratică
Eluția izocratică este recomandată mai ales atunci când se urmarește
separarea unui component nepolar dintr-un amestec de componenți mai polari. În acest
caz se folosește un eluent cu polaritate apropiată de cea a componentei urmarite, care va
elua doar compusul respectiv, ceilalți compusi, mai polari, rămânând adsorbiți în partea
superioara a coloanei.

Eluarea cu gradient
Eluarea cu gradient este utilizată atunci când se urmărește schimbarea
compoziției eluentului într-o maniera constantă și uniformă. Acest tip de eluție se poate
realiza utilizând două rezervoare, unul conținând solventul mai polar iar celalalt pe cel
nepolar. Solventul mai polar trece, cu debitul F1, într-o camera de amestecare în care se
găsește solventul mai puțin polar. Din aceasta camera, are loc trecerea amestecului de
solvenți în coloană, cu debitul F2. Se pot genera diferiți gradienți prin variația celor doua
debite. Prin utilizare eluției cu gradient, se pot separa într-o singura analiza compuși cu
polarități mult diferite.
 Injectarea probei
Valvele de injecție permit introducerea reproductibilă a
probelor în coloanele cromatografice aflate sub presiune, fără
întreruperea curgerii fazei mobile. Proba este încarcată la
presiune atmosferică într-o bucla exterioară a valvei de
injecție si este apoi introdusă în faza mobilă printr-o simplă
rotire a valvei. Volumul de probă introdusă variază între 2μl și
mai mult de 100 μl și poate fi modificat prin schimbarea buclei
de injecție sau folosind valve speciale cu volum variabil de
probă.
 Injectarea probei
 Introducerea probelor poate fi realizată în două
moduri: prin injecție cu ajutorul unei seringi
sau prin folosirea unei valve (robinet) de
injecție cu mai multe canale.
Injectarea probei
 Injectarea probei
Pentru analize în serie se
recomandă folosirea unor
dispozitive de introducere automată
a probelor.
 Coloana cromatografică
Umpluturile folosite in cromatografia de lichide moderna au
dimensiuni mici, sunt rigide si uniforme. Ele pot fi clasificate în
urmatoarele categorii:
-         Particule polimerice pe baza de silicagel care sunt mai
eficiente si mai stabile mecanic.
-         Particule superficial poroase (peliculare), cu diametrul cuprins
între 30-55 μm, care constau dintr-un învelis subtire  (1-3 μm) de
silicagel, dispus pe un nucleu dintr-un material inert, de exemplu
granule sferice de sticla. Asemenea umpluturi peliculare se mai
folosesc în anumite aplicatii de cromatografie de schimb ionic, însa
utilizarea lor a înregistrat un puternic regres odata cu dezvoltarea
umputurilor total poroase.
-         Particule total poroase de silicagel, cu diametre mai mici
decât 10 μm care sunt cele mai folosite la ora actuala pentru
coloanele analitice HPLC. Comparativ cu umpluturile peliculare, ele
ofera o serie de avantaje în ce priveste eficienta coloanei,
capacitatea de încarcare cu proba si viteza analizei.
 Coloana cromatografica
Pentru creșterea duratei de utilizare a unei
coloane de analiza HPLC se recomanda
introducerea unei coloane de protecție
(pre-coloană, guard column). Aceasta este
o coloana mica ce se amplaseaza între
injector si coloana analitica și previne
pierderea eficientei coloanei analitice
datorită prezenței anumitor impurități
prezente în proba sau solvent, de exemplu
a celor care se adsorb foarte puternic.
Coloana cromatografica
 Detector:
Funcția detectorului este de a monitoriza
faza mobilă pe masură ce ea iese din
coloana. Detecția prezinta mai multe
probleme în cromatografia de lichide decât
în cea de gaze, neexistând detectoare
universale
Detector
 Detectorul cromatografic
ideal
• Raspuns independent de compoziţia fazei mobile, debit, temperatura
• Sensibilitate – panta curbei de calibrare mare → sensibilitate mare
• Selectivitatea
• Raspuns rapid
• Zgomot de fond scăzut
• Non-destructiv pentru proba
• Domeniu dinamic liniar mare
• Stabilitate într-un timp îndelungat de operare
 Detectoare cromatografice
RI UV/VIS Fluorescent MS
a
Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv
Sensibilitate 4 5 3 1
microgra nanogra picograme picogram
me me
Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la DA NU NU NU
temperatura
 Factorii care influențează
separarea cromatografică
• Coloana: dimensiuni (L,d), T
Dimensiunea Timpul de Presiunea
• Faza stationara: natura, particulelor retentie (bar)
(μm) (min)
diametrul particulelor
5 30 19
• Faza mobila: tipul de elutie,
3 18 87
debitul, solventii 1,5 9 700
• Analitul: polaritate, masa
moleculară, concentrație

Faza mobila
• compatibila cu elementele instrumentului si cu
faza staționară
• puritate avansată
• compresibilitate si vascozitate scazute
• lipsită de gaze dizolvate (aer) – rezultatul UV
si probleme de compresibilitate
 Principalele avantaje HPLC:
avantaje HPLC:

1. Capacitate înaltă de separare

2. Viteza optimă a separării

3. Posibilitatea monitorizarii continue a efluentului coloanei

4. Realizarea unor analize repetate și reproductibile utilizând

aceeași coloană

5. Automatizarea procedurii analitice și a prelucrării datelor.

 Aplicații practice:
farmaceutice
• clinice
• toxicologice
• de mediu
• industriale
• alimentare