Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Cromatografia HPLC
Cromatografia de lichide de nalt performan ( engl. HPLC - High
Performance Liquid Chromatography ) cunoscut n literatur i sub denumirea
de cromatografie de nalt presiune (High Pressure Liquid Chromatography)
este metoda cromatografic cea mai performant care realizeaz separarea,
identificarea i cuantificarea componentelor dintr-un amestec de specii chimice
cu ajutorul unor etaloane. Spre deosebire de cromatografia de gaze unde
pot fi analizate numai substane volatile, cromatografia HPLC permite
analiza lichidelor nevolatile. Cromatografia HPLC este folosit n separri i
analize de substane imposibul de realizat prin alte metode. Pe de alt parte la
aceast tehnic pot fi fcute i multe greeli. Acesta este motivul pentru care
este nevoie de o experien practic bogat dar i de cunostiine stiinifice
fundamentale. Avnd n vedere c att n cromatografia de gaze (GC) ct i in
cromatografia de lichide HPLC starea de agregare iniial a probelor este cea
lichid trebuie luat decizia asupra metodei cromatografice folosite pentru acel
amestec. In acest scop trebuie avute n vedere urmtoarele:
- cromatografia de lichide permite analiza lichidelor care nu pot fi aduse n
stare gazoas din cauza descompunerii acestora la temperatur ridicat.
- n practic numai cca 20 % din speciile moleculare nu se descompun la
temperaturi ridicate i ca atare pot fi analizate prin cromatografia de gaze.
[LINDSAY
- la cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai mare i au limite
de detecie mai bune dect la cromatografia de lichide
- comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile au o comportare
cromatografic necorespunztoare n gazcromatografie ca urmare analiza
lor trebuie fcut in cromatografie lichid
- n cromatografia de gaze exist numai o singur faz staionar care
poate interaciona cu moleculele probei , faza solid sau faza lichid,
aceasta faz poate absorbi proba gazoas n orice raport
- n HPLC att faza staionar ct i cea mobil pot interaciona mai selectiv cu
proba dect cromatografia de gaze. Multitudinea acestor interaciuni
selective ofer cromatografiei HPLC un domeniu de aplicaie mai larg
dect cromatografiei de gaze cu ea putnt fi rezolvate probleme de separare
avansat deosebit de complexe.
- n situaiile n care ambele metode pot fi aplicate decizia este pentru
gazcromatografie aceste analize au sensibilitate mai mare i snt mai
rapide, iar dac este vorba de determinri curente la anumite clase de
compui trebuie avut in vdere c un gazcromatograf este sensibil mai ieftin
dect un cromatograf pentru HPLC.
- Capacitatea de separare a cromatografiei HPLC este de cca 100 ori mai
mare decit cromatografia de lichide cu coloan clasic de joas presiune
i umplutur de granulaie mare.
liber din vas cu heliu n felul acesta aerul dizolvat i cel liber este indeprtat
heriul nefiind absorbit de solveni .
Coloane cromatigrafice
Coloanele pentru cromatografia HPLC snt tuburi din oel inoxidabil , umplute cu
faz staionar, cu lungimi cuprinse ntre 10 i 30 cm i diametre interioare
cuprinse intre 3-10mm , ele prezint la cele dou capete piulie speciale care
permit att nchiderea etan a colanei ct i racordarea ei la sistemul de
asigurare a presiunii respectiv la detector , figura .
Fig.4. Spectrogram de absorbie clasic pentru dou substane x i y - (a), cromatograma celor
dou substane - (b) i spectrul de absorbie in trei dimensiuni
pentru cele dou substane - (c)
Reprezentarea este asemntoare cu cea care red prin curbe de nivel inlimi
de dealuri sau muni pe hari geografice. In cazul concret al aplicaiei
cromatografice acest tip de reprezentare este foarte sugestiv reuind s redea o
imagine sintetic in trei dimensiuni a legturilor dintre absorbie , lungime de
und i timp cu posibiliti largi de interpretare inclusiv privind identificarea de
impuriti care nu pot fi evideniate prin alte metode. In figura 4a este
reprezentat un spectru de absorbie clasic pentru doua substane x i y, in figura
4b cromatograma celor doua substane a i b , iar in figura 4c diagrama in
coordonate lungime de und - timp avnd curbe de contur care leag puncte ce
reprezint aceeai absorbie.
Detectoare de fluorescen. La iluminare cu lumin ultraviolret
unele
substane sint n msur s absoarb radiaie ultraviolet si ca urmare a
acestei absorbtii s emit lumin vizibil pe o lungime de und mai mare dect
cea absorbit. Dac emisia de lumin are loc imediat dup iradiere fenomenul
poart denumirea de fluorescen , iar dac emisia are loc cu ntrziere se
vorbete de fosforescen. Raportul intre energia luminii emise si energia
radiaiei absorbit este subunitar i pentru majoritatea substanelor este att de
mic nct nu poate fi valorificat instrumental. Abia pentru substanele la care
9
valoarea acestui raport se situeaz la valori intre 0,1 i 1 este posibil detecia
prin fluorescen. Exista substane care prezint n mod natural fluorescen.
Asemenea substane au o structur ciclic conjugat aa cum prezint de
exemplu hidrocarburile aromatice policiclice. Multe substane ce nu prezint n
mod natural fluorescen , tratate cu reactivi corespunztori pot fi transformte n
derivate fluorescente. n figura 5 este reprezentat schema de principiu a unui
detector de fluorescen.
10
11
12
Fig.9. Curba curent tensiune pentru trei specii moleculare X, Y, Z active electrochimic
Dac se pleac din poziia (O) de curent zero si se aplic o tensiune negative
cresctoare in poziia (E1) se instaleaz un curent la care specia (Z) este
13
14
fenomenului de polarizare intre cei doi electrozi pentru alimentarea lor este
folosit un curent alternativ cu frecvena cuprins ntre 1000 Hz i 5000 Hz.
Cromatogramele cu celule conductometrice au n ordonat conductivitatea
electrolitic si pe abscis timpul. Pot fi analizate pe aceast cale numai
substane care disociaz ionic.
Interpetarea cromatogramelor
15
t r t0
t0
16
L
H
L
N
Una din problemele de baz ale cromatografiei n general este aceea a lirii
benzii Peak-urilor ca urmare a cltoriei speciilor chimice prin coloana
cromatografic. In condiii ideale
o specie chimic ar trebui s se deplaseze
prin coloan fr ca banda ei s se leasc la baz. n realitate ns are loc o
lire destul de pronunat la traversarea coloanei cauzat de difuzie molecular
longitudinal, de curgeri neuniforme prin coloan, de variaii necontrolate ale
sorbiei i resorbiei. Eficiena unei coloane cromatografice este cu att mai
ridicat cu ct lirile W1 i W2 n condiii date ale timpilor de retenie tr1 i tr2 snt
mai mici, numrul de talere teoretice N fiind dat de relaia:
17
t
N 16 r
W
Din relaia de mai sus rezult c numrul de talere respectiv eficiena unei
coloane poate fi calculat din dou msurtori de timpi: tr i W.
O alt metod pentru determinarea eficienei, considerat de muli
cercettori de ncredere mai mare [Skoog] o reprezint determinare llimii
peak-ului la jumtatea nlimii lui , numrul de talere teoretice rezultate fiind :
tr
N 5,54
W1/2
Dintre cele dou mrimi ce indic eficiena coloanei este preferat exprimarea
prin numrul de talere
deoarece este adimensional i poate fi folosit n
comparaii directe ale diferitelor tipuri de coloane cu condiia ca eficiena s fi
fost stabilit cu aceeai faz mobil. Numrul de talere poate fi mrit foarte
simplu prin creterea lungimii coloanei.
k 2 t r2 t 0
k1 t r1 t 0
1
2
18
Rs
t r2 t r1
0,5(w 1 w 2 )
Dac cele dou peak- uri snt apropiate i au ariile egale , figura 3, ecuaia ()
devine
Rs
t r2 t r1
4
19
tr2 tr1 = 4
rezoluia Rs are valoarea egal cu unu ceea ce corespunde unei separri
avansatea a celor doi componeni de cca 98 %. Folosirea termenilor de statistic
matematic este justificat de asemnarea peak-urilor cromatografice cu curbe
de tip Gauss valoarea lirii W fiind egal cu 4 . Forma cea mai complet i
ecuaia cheie n cromatografie pentru definirea rezoluiei Rs , ecuaie ce ine
1 k
R s 0,25
1 k
20
, N, atfel:
dac se mrete
a)
are ca efect
b)
21
c)
d)
Lirea de band
Lirea de band a unei probe n cltoria ei prin
patru factori:
1. difuzia radial
2. difuzia longitudinal
3. efectele transportului de mas
4. efectele exterioare
23
Fig. Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band . i- la curgere a
unui lichid printr-o conduct viteza liniar se schimb de-a lungul seciunii n sensul c
moleculele din centru se deplasez mai rapid dect cele din imediata vecintater a peretelui, iii difuzia multidirecional a probelor lichide duce la lirea de band
Analiza calitativ
Analiza cantitativ
Metoda normrii suprafeei (nlimii)
La analiza cantitativ se are n vedere faptul c suprafaa respectiv
inlimea unui peak este proportional cu concentraia componentului
reprezentat de acel peak. Pentru a exprima concentraia procentual a unui
component trebuie avut n vedere nlimea total sau suprafaa total a
tuturor componentelor din amestec care este considerat ca avnd o compoziie
de 100% . Concentraia fiecrui component din amestec se determin pe urm
prin regula de trei simple. La acest mod de abordare a analizei cantitative se
accept urmtoarele:
1. se presupune c pe cromatogram snt evideniate toate componentele
i c fiecare component apare sub forma unui peak individual bine
definit. Aceast presupunere nu ine cont de faptul c dou sau mai multe
componente pot parsi n acelai timp coloana fiind identificate ca o
singur specie, sau unele specii pot fi reinute total pe coloan i iar altele
eventual nici nu snt detectate
2. se presupune c sensibilitatea detectorului este aceeai pentru toate
componentele amestecului ceea ce n cele mai multe cazuri nu se
adeverete
24
Ai
h
Ai
S
calibrarea
multipl
cu
concentraii
cresctoare a componentului urmrit
urmrit oarecare
25
S
Ss
factor care se poate exprima , atunci cnd se ine cont de corespondena dintre
suprafaa S a peak-ului i concentraia c , ca fiind [LINDSAY]:
r
c u Su
c s Ss
Su
27
B+R- + A B+
Ionii din soluie nlocuiesc totdeauna ioni cu acelai semn din schimbtorul de
ioni. Un amestec ionic poate fi separat numai atunci cnd ntre ionii probei fazei
lichide mobile analizate i gruprile de schimb ionic ale fazei solide exist o
interferen de un anumit nivel care este dat de modul cum se modific
schimbul ionic n funcie de pH. Dup fixarea ionilor din amestec pe
schimbtorul de ioni urmeaz eluia acestora
cu un eluent care conine
acelai ion ca i ionii fixai pe schimbtor ( de exemplu ionii fixai pe o rin ca
ioni H+ se vor elua cu un eluent ce conine tot ioni H + , trebuie ns specificat c
c pentru eluarea componenilor de pe rin , concentraia ionilor care-i
schimb trebuie s fie mai mare dect cea a ionilor schimbai [ Liteanu C, s.a.
Cromatografia de lichide , Ed. St.Buc.1974]
Cromatografie de excludere cromatografie prin gel
Reprezint o tehnic avansat n cadrul cromatografiei de lichide folosit
n principal pentru separarea compuilor cu un numr mare de molecule .
Umplutura coloanelor este format
din granule mici de silicagel sau din
polimeri cu diametrul de cca 10 m ce au o
reea
de pori uniformi
la
suprafa , figura . In acesti pori pot difuza att moleculele solventului ct i
moleculele de dimensiuni mai mici ale speciilor analizate, popri n care snt
reinute un anumit timp i astfel extrase din fluxul fazei mobile find ntrziate
29
Fig. Mecanismul reinerii fazei mobile de ctre umplutura poroas la cromatografia cu gel
30
31
32
Electroforeza
Electroforeza reprezint o metot cromatografic de separarea dintr-un
amestec a particulelor ncrcate electric (ioni) sub aciunea unui cmp electric
continuu . Cimpul electric aplicat pin intermediul a doi electrozi provoac
migrarea electroforetic cu viteze diferite a particulelor plasate fie ntr-un mediu
electrolitic liber fie ntr-un mediu electrolitic pe un material suport sau ntr-un
mediu electrolitic n interiorul unei capilare. Viteza de migraie a ionilor este
proporional cu intensitatea
cmpului electric i ncrcrcarea electric a
particulei i invers proporional cu raza particulei i vscozitatea substanei de
analizat .
Electroforeza este folosit ca metod de analiz calitativ i cantitativ mai
ales n medicin, biologie , chimie alimentar. De asemenea electroforeza este
folosit n analiza genetic (DNA) pentru separarea genelor .
Descoperitorul electroforezei este cercettorul suedez Arne Tiselius (19021971). El a folosit pentru prima dat aceast tehnic analitic i a fost
rspltit cu premiul Nobel n anul 1948. La electroforeza clasic introdus
de Tiselius este folosit fie un mediu de migraie liber fie un mediu de
migraie stabilizant format din fii de hrtie poroas sau din geluri speciale
de puse pe plci de sticl sau plci sintetice. La ora actual bazat pe
tehnicile cromatografiei de lichide de nalt rezoluie (HPLC) i tehnicile
cromatografiei cu gaze (GC) s-a pus la punct electroforeza capilar cu o
rezoluie de separare mare .
Teoria electroforezei. ntr -un cmp electric ionii se deplaseaz cu o
vitez constant. Creterea intensitii cmpului electric (E), prin creterea
tensiunii , duce la creterea corespunztor i a vitezei (v) de migrare a ionilor:
v= e E
unde: (e) reprezint mobilitatea electroosmotic.
Hotrtor pentru separarea electroforetic snt vitezele diferite de migrare a
ionilor n cmp electric. De aici se trage concluzia c ionii se deosebesc prin
mobilitatea lor rezultnd de aici diferite viteze de migrare. Mobilitatea
electroforetic este o constant de material, specific pentru fiecare ion i este
definit pentru un anumit mediu de o valoare precis a pH-ului. Mobilitatea
electroforetic poate fi bine descris de forele ce acioneaz asupra substanei
33
ionice de analizat care snt pe de-o parte fore acceleratoare pe de alt parte
fore de frnare
Fora acceleratoare (Fe) este de natur electric i este dat de produsul
dintre sarcina ionic efectiv (z), constanta lui Faraday (F) i intensitatea
cmpului electric (E):
Fe= z F E
Sarcina ionic efectiv descrie sarcina ionic absolut minus componenta
sarcinii moleculelor ncrcate de semn contrar din mediu.
Fora de frnare (Ff) este dat de frecare i se poate descrie prin legea
lui Stokes:
Ff= 6rv
unde: - vscozitatea substanei de analizat,
r raza ionului
deoarece aceste dou fore cea electric de accelerare i cea de frnare snt n
echilibru , raportul lor este proporional cu viteza de migrare i cu mobilitatea ,
de unde rezult urmtoarea ecuaie:
e=z F/6r
Din relaia de mai sus se poate concluziona c molecule mici au o vitez de
migrare mai mare dect molecule mari
Clasificarea electroforezei
Electroforez n mediu liber
- Electroforez cu gradient de densitate
Electroforez n mediu stabilizant
Electroforeza cu hrtie
Electroforez cu gel
Electroforez discontinu
Electroforez capilar
Electroforez cu gradient
Electroforez n cmp pulsator
Electroforez cu focalizare electric
34
curentul electric dar sufer i ele deplasri din cauza fluxului de curgere.
Electroforeza clasic cu gel sau cu hrtie are dou dezavantaje majore:
- Interpretarea cantitativ este dificil. De exemplu proteinele pot fi
examinate numai dup colorare i msurri de reemisie (vezi i
electroforeza cu gel), ca atate msurtorile snt grevate de erori i de
timpi mari.
- Evaporarea prin efect Joule a soluiei din hrtie poate duce la uscarea lor
i la ntreruperea migrrii. Creterea de cldur depinde ptratic de
tensiunea aplicat pe electrozi din acest motiv tensiuni mici duc la timpi
de analiz foarte mari , astfel pentru separarea electroforetic complet,
n condiii de tensiune mici, pe un strat de hrtie de cca 20 cm lungime
se poate ajunge la timpi de ordinul orelor. In figra este redat principul
constructiv al unei celule electroforetice orizontale cu band de hrtie.
Fig.II137
P133
A.I.
36
Fig.II.139
Pa. 134
A.I.
Electroforeza cu gel
Electroforeza cu gel este o metod analitic a chimiei i biologiei
moleculare i servete separrii moleculelor purttoare de sarcin electric din
amestecuri moleculare. Un amestec de molecule migrez sub gradient de cmp
electric printr-un gel ce se gsete intr-o soluie tampon ionic. Dup dimensiune
i ncrcare moleculele se misc cu viteze diferite prin sit molecular format
de gel. Cel mai rapid se deplaseaz molecule mici ncrcate negativ (anionii)
spre anod urmeaz moleculele ncrcate pozitiv (cationii) care se ndreapt spe
electrodul negativ catodul. Dezavantajele electroforezei cu gel snt aceleai ca
ale electroforezei cu hrtie.
37
38
Electroforez Capilar
40
41
42
43