Sunteți pe pagina 1din 43

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE

Cromatografia HPLC
Cromatografia de lichide de nalt performan ( engl. HPLC - High
Performance Liquid Chromatography ) cunoscut n literatur i sub denumirea
de cromatografie de nalt presiune (High Pressure Liquid Chromatography)
este metoda cromatografic cea mai performant care realizeaz separarea,
identificarea i cuantificarea componentelor dintr-un amestec de specii chimice
cu ajutorul unor etaloane. Spre deosebire de cromatografia de gaze unde
pot fi analizate numai substane volatile, cromatografia HPLC permite
analiza lichidelor nevolatile. Cromatografia HPLC este folosit n separri i
analize de substane imposibul de realizat prin alte metode. Pe de alt parte la
aceast tehnic pot fi fcute i multe greeli. Acesta este motivul pentru care
este nevoie de o experien practic bogat dar i de cunostiine stiinifice
fundamentale. Avnd n vedere c att n cromatografia de gaze (GC) ct i in
cromatografia de lichide HPLC starea de agregare iniial a probelor este cea
lichid trebuie luat decizia asupra metodei cromatografice folosite pentru acel
amestec. In acest scop trebuie avute n vedere urmtoarele:
- cromatografia de lichide permite analiza lichidelor care nu pot fi aduse n
stare gazoas din cauza descompunerii acestora la temperatur ridicat.
- n practic numai cca 20 % din speciile moleculare nu se descompun la
temperaturi ridicate i ca atare pot fi analizate prin cromatografia de gaze.
[LINDSAY
- la cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai mare i au limite
de detecie mai bune dect la cromatografia de lichide
- comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile au o comportare
cromatografic necorespunztoare n gazcromatografie ca urmare analiza
lor trebuie fcut in cromatografie lichid
- n cromatografia de gaze exist numai o singur faz staionar care
poate interaciona cu moleculele probei , faza solid sau faza lichid,
aceasta faz poate absorbi proba gazoas n orice raport
- n HPLC att faza staionar ct i cea mobil pot interaciona mai selectiv cu
proba dect cromatografia de gaze. Multitudinea acestor interaciuni
selective ofer cromatografiei HPLC un domeniu de aplicaie mai larg
dect cromatografiei de gaze cu ea putnt fi rezolvate probleme de separare
avansat deosebit de complexe.
- n situaiile n care ambele metode pot fi aplicate decizia este pentru
gazcromatografie aceste analize au sensibilitate mai mare i snt mai
rapide, iar dac este vorba de determinri curente la anumite clase de
compui trebuie avut in vdere c un gazcromatograf este sensibil mai ieftin
dect un cromatograf pentru HPLC.
- Capacitatea de separare a cromatografiei HPLC este de cca 100 ori mai
mare decit cromatografia de lichide cu coloan clasic de joas presiune
i umplutur de granulaie mare.

La cromatografia HPLC faza mobil purttoare denumit "Eluent"


mpreun cu substanele lichide de analizat este pompat cu ajutorul unei
pompe de nalt presiune printr-o coloan cromatografic de separare ce
conine faza staionar sub form de umplutur pulverulent cu dimensiuni de
ordin micronic. n mod obinuit naintea coloanei de separare propriu zise se
cupleaz o pre - coloan de separare pentru reinerea impuritilor, coloan
care este sensibil mai ieftin dect coloana de baz. O coloan de separare ntrun cromatograf HPLC are lungimea cuprins ntre 5 i 30 cm, diametrul interior
cuprins ntre 2- 4,6 mm iar debitul de faz mobil este cuprins ntre 1-5 ml/min.
Cromatografia HPLC este folosit i n scop preparativ pentru purifcarea
unor substane, situaie n care se lucreaz cu aparate cu debite i dimensiuni
ale coloanelor mai mari .
Ca i la celelalte metode cromatograficed dac o specie chimic a
amestecului de substane supus cromatografiei HPLC interacioneaz mai
puternic cu faza staionar ea este reinut un timp mai indelungat n coloan
dect o specie ce interacioneaz mai slab sau deloc . In funcie de intensitatea
acestei interaciuni
speciile chimice componente ale amestecului analizat
sosesc pe rnd , la timpi diferii (timpi de retenie) la captul coloanei
cromatografice unde este poziionat detectorul .

La ora actual exist urmtoarele metode de cromatografie de lichide :


cromatografie prin absorbie
cromatografie prin repartiie
cromatografie prin schimb ionic
cromatografie de excludere cromatografie prin gel

La cromatografia schimbtoare de ioni faza stationar este este o rin


schimbtoare de ioni
iar gradul de separare este dat de intensitatea
interaciunilor intre ionii probei i grupele schimbtoare de ioni din rin . In
cromatografia de excludere ca faz staionar este folosit un gel cu pori mari
care poate separa moleculele dup mrime i form , la acest tip de
cromatografie moleculele mari traverseaz cel mai rapid sistemul cromatografic.
Cromatografia cu lichide supracritice

Dac n timpul separarii cromatografice compoziia substanei de analizat


rmne constant tehnica de cromatografic este denumit eluie izocratic.
Dac compoziia fazei analizate este schimbat n timpul procesului de
separare dup o modalitate prestabilit, tehnica poart denumirea de eluie de
gradient .Cea din urm tehnic este folosit atunci cnd domeniul timpilor de
retenie a moleculelor din prob este att de mare nct acestea nu pot fi eluate
ntr-un timp rezonabil cu un solvent pur sau cu un amestec de solveni.
Detectorii folosii n HPLC lnt detectori selectivi, ceea ce nseamn c ei
nu rspund la toate moleculele existente nt-un amestec ci numai la anumite
molecule sau clase de compui. In cromatografia de lichide nc nu exist un
detector universal i de inalt sensibilitate aa cum este de exemplu detectorul
de ionizare cu flacr FID din cadrul cromatografiei de lichide, n schimb
detectoarele din cromatografia de lichide acoper un numr mult mai mare de
substane dect cele din cromatografia de gaze. Unele molecule de probe snt
greu de detectat n HPLC i trebuiesc aduse dup prsirea coloanei
cromatografice ntr-o form detectabil tehnic denumit derivatizare dup
coloan. Ca i la alte cromatografii n condiii tehnice date pentru analiza
calitativ este definitoriu timpul necesar unei molecule din prob pentru a
traversa sistemul cromatografic i a ajunge la detector, timp denumit timp de
retenie. Dat fiind numrul extrem de mare de substane organice unele
substane au timpi de retenie identici situaie n care peak-urile se suprapun
putnd da natere la erori importante de interpretare. Pentru nlturarea acestui
neajuns se apeleaz la spectrometre care snt de altfel cele mai importante
detectoare pentru HPLC. Pentru identificri avansate tot mai des ieirile din
coloanele cromatografice se cupleaz la spectrometre de mas (MS) situaia
clasic fiind cea LC-MS sau LC-MS-MS. Aceste combinaii de aparate au
sisteme de performante de prelucrarea datelor ce permit identificarea automat
prin compararea electronic a spectrului oricrei specii moleculare, n
momentul sosirii ei din coloana cromatografic la spectrometru, cu spectrele
etalon din bibliotec electronic de spectre.

Aparatura folosit n cromatografia HPLC


Cromatografele de lichide de nalt performan snt formate dint-un sistem de
vase cu solveni (1) , o pomp de nalt presiune (3), o coloan cromatografic
(6), unul sau mai muli detectori (8), i un sistem de prelucrare a datelor (9), ele
mai snt completate cu elemente de reglare automat a debitului , a presiunii i a
temperaturii. In figura 1 este reprezentat schema de principiu a unui
cromatograf de lichide.

Fig. 1 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide.1-recipiente de


solvent, 2-filtru, 3-pomp cu sistem de gradient, 4-sistem de msurare a
presiunii i a debitului, 5-sistem de introducere prob, 6-coloan cromatografic,
7- incint de termostatare a coloanei, 8-detector, 9-sistem de achiziie i prelucrare
date, 10-cromatogram.

Trebuie avut n vedere c n HPLC se folosesc solveni organici puternici sau


soluii tampon care pot ataca chimic orice component ce se gsete n traseul
lor de la recipientele de stocare pin la detector , ca atare toate materialele
folosite pe acest traseu trebuie s prezinte o rezisten chimic corespunztoare.
O alt recomandare este aceea ca volumul mort , denumit i volum
extracolumnar, ntre introducerea probei i traversarea detectorului s fie
meninut ct mai mic posibil prin aceasta evitndu-se o lire de band (vezi i
cap). Reducerea volumului mort se realizeaz n primul rnd prin msuri
constructive ale furnizorului de cromatograf i prin de alegerea corespunztoare
a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rnd elementele
componente ale unui cromatograf de tip HPLC

Recipientele pentru solveni


Solvenii pentru HPLC snt pstrai n vase sticl speciale ntunecate cu volumul
uzual de 1 litru cu dop perforat pentru introducerea furtunului de absorbie i
dup caz i a furtunului de purjare cu gaz rar heliu. Trebuie avut n vedere c
substana lichid care ajunge n pomp nu trebuie s conin praf sau alt
substan n suspensie acestea putnd duce la deteriorarea pompei sau la
nfundarea iremediabil a coloanei. In acest scop solventul se filtreaz cu un
filtru intercalat n circuitul de absorbie i cel mai adesea se folosete o
precoloan care este mult mai ieftin avind att rol cromatografic de separare ct
i rol de filtrare i reine . Este important ca i aerul dizolvat n soluie s fie
ndeprtat deoarece acesta se poate aduna in pomp sau n detector i poate
provoca erori sensibile de msurare , n acest scop se practic fie o degazare
prin uoar nclzire cuplat dup caz cu realiyarea unui vacuum uor deasupra
solventului i tot dup caz i ultrasonarea concomitent a solventului . Metoda
cea mai uzual de degazare folosit este cea de inundarea continu a spaiului

liber din vas cu heliu n felul acesta aerul dizolvat i cel liber este indeprtat
heriul nefiind absorbit de solveni .

Pompe de inalt presiune

Coloane cromatigrafice
Coloanele pentru cromatografia HPLC snt tuburi din oel inoxidabil , umplute cu
faz staionar, cu lungimi cuprinse ntre 10 i 30 cm i diametre interioare
cuprinse intre 3-10mm , ele prezint la cele dou capete piulie speciale care
permit att nchiderea etan a colanei ct i racordarea ei la sistemul de
asigurare a presiunii respectiv la detector , figura .

Fig. seciune printr-o coloan cromatografic de tip HPLC


Faza staionar din coloane este format din particule solide cu diametrul de 3,5
sau 10 m. coloanele cel mai des utilizate au lungimea de 25 cm, diametrul
interior de 5 mm i diametrul particulelor fazei staionare solide de 5 m, avnd
.
numrul de talere cuprins inre 40.000 60.000 m-1 Mai nou snt folosite coloane
cu lungimi mai mici cuprinse ntre 3 i 7,5 cm diametre interioare cuprinse ntre
1-4,6 mm i diametrul umpluturii de 3 i 5 m [Skoog] sau chiar diametre
submilimetrice n cazul coloanelor microbore [Lindsay] avantajul ultimelor
const n timpi mai mici de separare dar mai ales n consum mai redus de
solvent ultrapur scump. Pentru coloanele cromatografice clasice faza solid
staionar este poroase i este format din particule sferice sau particule
neregulate de gel de silice, oxid de aluminiu sau rin schimbtoare de ioni cu
diametre cuprinse ntre 3 - I0 m. Gelul de silice are grupe silanol ( Si-OH) care
pot fi modificate chimic n mod avansat astfel nct s poat lega chimic faze
lichide staionare folosite n cadrul cromatografiei de repartiie normale i inverse
( vezi i cap) . Clasa granulometric n cadrul unui anumite umpluturi de coloan
trebuie s fie foarte strns pentru asigurarea unei caliti nalte a separrii
cromatografice. La valori de pH mari gelul de silice nu rezist pentru aceste
domenii snt folosite materiale de umplutur pe baz de oxid de aluminiu ,
carbon fluorocarbon, rini polimerice. Durata de via a coloanelor
cromatografice este influenat de apariia de fisuri, acumulri de particule de
eroziune din pomp, particule din suspensii nefiltrate necorespunztor, tasri de
material cu apariia de volume moarte precum i absorbii ireversibile de
molecule din prob. Pentru mrirea duratei de via a coloanei de separare
cromatografic prin reinerea particulelor solide din faza mobil, snt folosite aa
zise precoloane . Din punct de vedere al compoziiei umpluturii precoloanelor
aceasta trebuie s fie asemntoare cu cea a coloanei cromatografice singura
deosebire fiind dimensiunea particulelor care este de regul mai mare dect cea

a coloanelor pentru a nu produce cderi de prensiune ridicate. Umplutura


precoloanelor cromatografice este format din bile de sticl sau de plastic cu un
diametru de 30 - 40 m pe suprafaa acestor bile se depune un strat subire de
gel de silice, de oxid de aluminiu sau dup caz de rin schimbtoare de ioni.
Pentru cromatografia de repartiie pe acest strat se absoarbe suplimentar o faz
staionar sub forma unui film lichid legat prin fore fizice sau chimice.

Detectoare folosite in cromatografia de lichide de tip HPLC


In cromatografia de lichide sint folosite urmatoarele tipuri de detectoare:
- de absorbie n ultraviolet
- ir de fotodiode (diode - Array)
- de fluorescen
- electrochimic
- refractometrici
Detectoare de absorbie n ultraviolet. Aceste detectoare sint de natur
semiconductoare i snt cei mai folosii senzori in cromatografia de lichide
datorit faptului c foarte multe molecule organice absorb in ultraviolet iar
detectorul este fiabil i ieftin. Sensibilitatea maxima a acestor detectoare este
situat n domeniul radiatiei ultraviolete
200-300 nm. In figura 1 este
reprezentat o asemenea caracteristic.
LINSAY

Fig. Caracteristica de sensibilitate a unui detector de absorbie n ultraviolet

Faza mobil ce iese din coloana cromatografic este trecut printr-o


celula de masurare etana , figura 2,
prin care trece fasciculul ultraviolet .
6

Lungimea drumului optic prin asemenea celule este de 10 mm iar diametrul


interior al tubului este de 1 mm. Selectivitatea acestui detector este dat de faptul
ca pot fi detectate calitativ si analizate cantitativ numai molecule ce absorb in
domeniul ultraviolet. Asemenea substane snt alchene, hidrocarburi aromatice,
sau compusi cu legturi multiple intre C, O, sau S. Faza mobila nu trebuie s
prezinte absorbie in ultraviolet.

Fig.1. Schema de principiu a unei cuve de absorbie dintr-un detector cu ultraviolete

Absorbia radiatiei ultraviolete de ctre moleculele probei de analizat este dat


de legea Lambert - Beer i este o funcie de concentraie a acestora .
Detectoare ir de fotodiode (Diode - Array) . Radiaia policromatica,
trimisa printr-o celula speciala ermetica prin care circula faza mobila ce iese
din coloana cromatografic , figura 3, cade pe o oglinda de reflecie totala si
de aici pe o reea de difracie unde este descompus dup componentele
spectrale acestea fiind reflectate pe detectorul sir de fotodiode.
( vezi i cap.)

Fig. 3. Schema de principiu a detectorului cromatografic tip ir de fotodiode

n situaia clasic se lucreaz cu o singura fotodioda sau cu un fotomultiplicator


ca detector, diferitele lungimi de und fiind aduse in dreptul fantei detectorului
prin rotaia automata a reelei de difracie. Marele avantaj al detectorului cu ir de
fotodiode const in faptul ca spectrul este obinut instantaneu i in mod continuu
neexistnd pericolul ca unii compusi de concentraie mic s nu fie surprini de
detector. In cazul clasic al scanarii lungimilor de und cu un monocromator si a
folosirii unui detector cu un singur canal acest pericol exist deoarece in
momentul ieirii din coloana cromatografic scanarea lungimilor de und se
poate gsi la alte lungimi de und dect cele unde absorbia este maxim pentru
acea specie molecular ea nefiind sesizat n amestecul substanei de analizat.
Alt avantaj al folosirii detectorului ir de fotodiode const in faptul c pentru
fiecare peak cromatografic se poate inregistra si reda ulterior spectrul fiind
posibil compararea cu alte spectre. Este posibil o identificare mai avansat a
peak-urilor precum i gsirea lungimii de und optime pentru detecia lungimilor
de und individuale., gsirea peak-urilor de sensibilitate maxim sau gsirea
peak-urilor ce deranjeaz. Rezultatele masurtorilor cu detector ir de fotodiode
pot fi redate prin curbe de contur, figura , care reprezint seciuni n peak-uri la
diferite absorbii, figura 4.

Fig.4. Spectrogram de absorbie clasic pentru dou substane x i y - (a), cromatograma celor
dou substane - (b) i spectrul de absorbie in trei dimensiuni
pentru cele dou substane - (c)

avnd curbe de contur

Reprezentarea este asemntoare cu cea care red prin curbe de nivel inlimi
de dealuri sau muni pe hari geografice. In cazul concret al aplicaiei
cromatografice acest tip de reprezentare este foarte sugestiv reuind s redea o
imagine sintetic in trei dimensiuni a legturilor dintre absorbie , lungime de
und i timp cu posibiliti largi de interpretare inclusiv privind identificarea de
impuriti care nu pot fi evideniate prin alte metode. In figura 4a este
reprezentat un spectru de absorbie clasic pentru doua substane x i y, in figura
4b cromatograma celor doua substane a i b , iar in figura 4c diagrama in
coordonate lungime de und - timp avnd curbe de contur care leag puncte ce
reprezint aceeai absorbie.
Detectoare de fluorescen. La iluminare cu lumin ultraviolret
unele
substane sint n msur s absoarb radiaie ultraviolet si ca urmare a
acestei absorbtii s emit lumin vizibil pe o lungime de und mai mare dect
cea absorbit. Dac emisia de lumin are loc imediat dup iradiere fenomenul
poart denumirea de fluorescen , iar dac emisia are loc cu ntrziere se
vorbete de fosforescen. Raportul intre energia luminii emise si energia
radiaiei absorbit este subunitar i pentru majoritatea substanelor este att de
mic nct nu poate fi valorificat instrumental. Abia pentru substanele la care
9

valoarea acestui raport se situeaz la valori intre 0,1 i 1 este posibil detecia
prin fluorescen. Exista substane care prezint n mod natural fluorescen.
Asemenea substane au o structur ciclic conjugat aa cum prezint de
exemplu hidrocarburile aromatice policiclice. Multe substane ce nu prezint n
mod natural fluorescen , tratate cu reactivi corespunztori pot fi transformte n
derivate fluorescente. n figura 5 este reprezentat schema de principiu a unui
detector de fluorescen.

Fig. 5. Schema de principiu a unui detector cromatografic de tip de fluorescen


1- surs de radiaie, 2- fant, 3- lentil , 4- filtru, 5- celul cu soluie de analizat, 6- lentil, 7fant, 8-filtru, 9-detector de radiaie,

Radiaia emis de o surs de radiaie de deuteriu (1) este trecut printr-un


filtru (4) i cade pe celula cromatografic special cu soluia de analizat unde
genereaz radiaie de fluorescen pe toate direciile, msurarea acesteia se
face ns la 90 0 fa de radiaia incident ea fiind trecut printr-un filtru (8)
nainte de a cdea pe detectorul (9). Avnd n vedere c msurarea fluorescenei
are loc la 90 0 fa de radiaia incident unele aparate permit msurarea
concomitent i a absorbiei cea din urm fiind msurat pe direcia radiaiei
incidente ( Fig. -linie punctata cu sgeat) dup ce aceasta a traversat celula
de msurare cromatografic (5). Avantajul mare al detectoarelor de fluorescen
fa de alte detectoare este sensibilitatea lor deosebit. Edificatoare n acest
sens este figura 5 unde [Linsay ] este prezentat cromatograma

10

Fig.6. Cromatograme pentru substae aromatice policiclice efectuate in ultraviolet (a) i n


fluorescen (b)

unor substane aromatice policiclice, prezente ca toxine n aer in cantiti mici ,


efectuat n UV (a) i cromatograma pentru aceleai substane efectuat n
fluorescen (b). De asemenea detectoarelor de fluorescen au i o selectivitate
foarte mare, deosebit de util n analiza urmelor, dat de faptul prin filtre
adecvate poate fi variat att lungimea de und incident ct i lungimea de und
detectat dup generarea fluorescenei. n condiiile n care cantitatea de
radiaie absorbit de prob nu depete 10% rspunsul detectorului d un
rspuns liniar pe plaja 103-104 [ Lindsay]

Detectoare refractometrice. Acest tip de detector se bazeaz msurarea


indicelui de refracie a eluentului ce sosete din coloana ca reprezentnd
diferena ntre indicele de refracie a substanei analizate i indicele de refracie
a fazei mobile pure. Detectoarele refractometrice au marele avantaj de a putea fi
folosite la aproape toate substanele snt fiabile iar indicaiile lor nu depind de
viteza de curgere n schimb indicaia este influenat de variaii de temperatur.
Detectoarele refractometrice au o sensibilitate mai mic dect detectoarele de
ultraviolete. Cele mai sczute nivele de zgomot care se pot obine se situeaz
la 10-7 unitati de refracie ceea ce corespunde pentru majoritatea compuilor
unei concentraii echivalente de 10-6 g/ml [ Lindsay]. In ce privete liniaritatea
aceasta se situeaz in jurul valorii de 104. Dac se dorete o sensibilitate inalta
este necesara termostatarea aparatului i un control foarte bun al compoziiei
fazei mobile. In figura 7 este prezentata schema de principiu a unui detector
refractometric.

11

Fig.7. Schema de principiu a unui detector cromatografic de tip refractometric


Radiaia luminoas trece printr-o celul paralelepipedic special (1) cu dou
compartimente desprite de un geam de sticl (2). Unul din compartimente
este pentru proba de analizat i unul pentru soluia etalon. Dup traversarea
celulei radiaia luminoas cade pe o oglind semitransparent (3) i este
desprit in dou fascicule, unul cade pe fotocelula (4) iar cellalt pe fotocelula
(5). Atunci cnd indicele de refracie se modific se modific unghiul de inciden
al radiaiei ce cade pe oglinda (3) i ca atare se modific i cantitile de radiaie
ce cad pe cele dou fotocelule (4) i (5), i proporional i fotocurenii celor dou
celule. Fotocurenii snt trecui ntr-un amplificator diferenial (6) ce d un semnal
de eroare ( ) proporional cu modificarea indicelui de refracie. Semnalul de
eroare comand un servomotor (7) care rotete oglinda semitransparent (3)
pn cnd semnalul de eroare are valoarea zero.Oglinda semitransparent este
legat de un ac inregistrator astfel nct deplasarea acesteia este inregistrat n
timp sub forma unei cromatograme ce are pe ordonat indicele de refracie iar
pe abscis timpul.
Detectoare electrochimice. Aceste detectoare exist ntr-o varietate mare
i se bazeaz pe principii electroanalitice diferite precum:
- amperometrie
- coulometrie
- conductometrie
Detectoarele electrochimice snt simple, au limite de detecie sczute i
aplicabilitate la un numr extrem de mare de substane. Pentru a putea fi
detectabile prin amperometrie i coulometrie substanele trebuie s fie uor
oxidabile respectiv uor reductibile. Pentru a putea fi detectate pe cale
conductometric substanele trebuie s existe sub form ionic.
La metodele electrocimice de tip amperometric sau conductometric
cromatogramele au pe ordonat curentul i pe abscis timpul. Din punct de
vedere constructiv detectoarele amperometrice sau coulometrice sint relativ
simple, in figura 8 este reprezentat o asemenea celul. Aa cum se observ
detectorul nu este altceva dect o celul electrochimic clasic cu trei electrozi
adaptat pentru condiii de masurare sub presiune. Folosirea deteciei

12

Fig.8 Detector cromatografic de tip amperometric


1 - corpul celulei, 2-electrod de lucru, 3- electrod auxiliar, 4 - electrod de referin,

amperometrice sau coulometrice presupune cunoastera exact a potenialului


unde specia respectiv are activitate maxim. n acest sens de un real folos snt
curbele curent -tensiune care se pot trasa pentru diferitele specii ionice cu celule
electrochimice cu trei electrozi. Dac se se aplic unei asemenea celule tensiuni
progresiv cresctoare atunci prin nregistrarea parametrilor curent- tensiune intre
electrodul de lucru (2) i electrodul de referin se obine o curb specific ce d
infomaii valoroase despre activitatea electrochimic a speciei respective. In
figura 9 este reprezentat o asemenea curb pentru trei substane diferite X,Y,
Z:

Fig.9. Curba curent tensiune pentru trei specii moleculare X, Y, Z active electrochimic

Dac se pleac din poziia (O) de curent zero si se aplic o tensiune negative
cresctoare in poziia (E1) se instaleaz un curent la care specia (Z) este

13

redus. Din palierul cresctor al curbei electrocinetice se observ creteri mari


mari de curent la creteri mici de potenial. Acest lucru se manifest pn n
zona curentului limit -corespunztor tensiunii (E 2). Dup aceast tensiune la
creteri relativ mari de potenial cresterea de curent este nesemnificativ.
Situaia se schimb dup depirea potenialului (E 3) cnd din nou la variaii
mici de potential corespund creteri mari de intensitate, in acest caz este vorba
ns de descrcarea (reducerea) altei substane respectiv solventul. Acelai
raionament se face pentru substanele (X) i (Y) care snt oxidate atunci cnd
potenialul se deplaseaz din punctul (O) spre dreapta ceea ce corespunde unui
potenial pozitiv. Substana (X) este oxidat mai uor ( oxidarea ncepe la E 4)
dect substana (Y) (oxidarea ncepe la E 5), oxidarea solventului necesit
potenilaul cel mai ridicat i ncepe la (E 6). Importana interpretrii acestei curbe
const n posibilitatea alegerii potenialului de descrcare care d sensibilitatea
cea mai ridicat pentru o anumit specie ionic molecular prezent ntr-un
amestec. Aa cum se observ din figur dac potenialul celulei cromatografice
ar fi cel corespunztor poziiei (O) nu ar putea fi identificata nici una din cele trei
substante deoarece peak-ul de pe cromatogram ar avea valoarea zero. La
stnga sau la dreapta acestui punct cele trei substane pot fi identificate cu
sensibiliti diferite n funcie de valoarea potenialului aplicat celulei. Situaia
alegerii potenialului de descrcare pentru obinerea unei sensibilitati maxime
este analoga cu modificarea lungimii de und n romatografia cu detectoare UV
pentru obinerea sensibilitii maxime pentru o anumit specie. Linia punctat din
figura de mai sus reprezint
curba curent- tensiune
rezidual
corespunztoare solventului atunci cnd ar lipsi cele trei substane (X),(Y) i (Z)
La metoda electrochimic conductometric este folosit o celul cromatografic
relativ simpl, figura 10. Pentru evitarea apariiei transportului ionic i a

14

Fig.11. Detector cromatografic de tip conductometric


1 celula conductometric, 2,3- electrozi de platina, 4- generator de frecvent, 5- amplificator , 6inregistator

fenomenului de polarizare intre cei doi electrozi pentru alimentarea lor este
folosit un curent alternativ cu frecvena cuprins ntre 1000 Hz i 5000 Hz.
Cromatogramele cu celule conductometrice au n ordonat conductivitatea
electrolitic si pe abscis timpul. Pot fi analizate pe aceast cale numai
substane care disociaz ionic.

Interpetarea cromatogramelor

Factorul de capacitate (k)


In figura 1 este reprezentat principiul cromatografiei lichide cu coloan indiferent
dac aceasta este de tip cu coloan deschis sau sau de tip HPLC . Aa cum se
observ amestecul de substane este injectat la intrarea n coloan , prin
mecanisme diverse de natur fizico chimic are loc separarea specific a
speciilor chimice n timp acestea sosind pe rnd la cellalt capt al coloanei
unde sunt detectate obinndu-se o cromatogram de tipul celei din figur.

15

Fig. Principiul separrii cromatografice pe coloan i cromatograma obinut pentru un amestec


de trei specii chimice ntr-un solvent

Pe cromatogram pot fi identificate trei Peak-uri:


- primul peak, de nlime mic, este cel al unei specii chimice nereinute
(neretardate) de umplutura coloanei , aceast specie traverseaz coloana cu
viteza fazei mobile, timpul scurs de la injecie pn la traversarea coloanei de
ctre aceast specie se noteaz cu t0
- al doilea Peak este cel al unei specii chimice cu viteza de traversare medie
timpul de reinere fiind notat cu tr1
- al treilea Peak este cel al unei specii chimice cu viteza mic de traversare
aceast specie avnd timpul de reinere tr2
Timpul de retenie i factorul de capacitate
Din cromatogram se observ c natura speciilor chimice poate fi interpretat
prin prisma timpului de retenie t acest timp depinde ns pe lng natura
specieiei i de ali factori precum : lungimea coloanei, natura i granulaia
umpluturii, etc, ca atare timpul de reinere poate fi considerat specific naturii
speciilor chimice numai n condiii precis definite neavnd un caracter universal.
Acesta este motivul pentru care pentru identificare calitativ este folosit factorul
de capacitate k :
k

t r t0
t0

16

un factor de kapacitate de valoare mic indic o rezoluie de identificare sczut


iar un factor de capacitate de valoare mare indic un timp de separare i de
analiz mare cu efect negativ asupra producivitii. Din punct de vedere al
ordinului de mrime factorul de capacitate trebuie s se situeze intre 1 i 10.
Eficiena unei coloane cromatografice
Ca msur a eficenei unei coloane cromatografice de lungime L este folosit fie
numrul N de talere teoretice necesare separrii fie nlimea teoretic H a
talerului. Teoria talerelor se bazeaz pe conceptul c o coloan cromatografic
poate fi asimilat cu o mulime de minicoloane (talere) lipite unul de altul , pe
fiecare din aceste talere realizndu-se echilibrul ntre faza mobil i cea
staionar . n acest concept se ia in considerare situaia n care un taler
realizeaz singur separarea cromatografic a componentelor, este evident c
pentru aceasta viteza fazei mobile ar trebui s fie infinit de mic iar timpul de
efectuare a unei cromatograme extrem de mare. ntr-o coloan cromatografic
cu umplutur pentru lichide un taler este asimilat cu o particulele de umplere a
coloanei , astfel colanele comerciale conin cca 50.000 talere pe metru dac
este vorba de particule cu diametrul de 5 m sau cca 25.000 talere pe metru
liniar dac este vorba de particule de umplere cu diametrul de 10 m. In general
eficiena unei coloane cromatografice de separare crete atunci cnd
dimensiunea particulelor de umplere scade. Numrul teoretic de talere necesar
ntr-o coloan cromatografic de lungime L este dat de relaia:

L
H

de unde rezult nlimea talerului ca fiind :


H

L
N

Una din problemele de baz ale cromatografiei n general este aceea a lirii
benzii Peak-urilor ca urmare a cltoriei speciilor chimice prin coloana
cromatografic. In condiii ideale
o specie chimic ar trebui s se deplaseze
prin coloan fr ca banda ei s se leasc la baz. n realitate ns are loc o
lire destul de pronunat la traversarea coloanei cauzat de difuzie molecular
longitudinal, de curgeri neuniforme prin coloan, de variaii necontrolate ale
sorbiei i resorbiei. Eficiena unei coloane cromatografice este cu att mai
ridicat cu ct lirile W1 i W2 n condiii date ale timpilor de retenie tr1 i tr2 snt
mai mici, numrul de talere teoretice N fiind dat de relaia:

17

t
N 16 r
W

Din relaia de mai sus rezult c numrul de talere respectiv eficiena unei
coloane poate fi calculat din dou msurtori de timpi: tr i W.
O alt metod pentru determinarea eficienei, considerat de muli
cercettori de ncredere mai mare [Skoog] o reprezint determinare llimii
peak-ului la jumtatea nlimii lui , numrul de talere teoretice rezultate fiind :

tr
N 5,54
W1/2

Dintre cele dou mrimi ce indic eficiena coloanei este preferat exprimarea
prin numrul de talere
deoarece este adimensional i poate fi folosit n
comparaii directe ale diferitelor tipuri de coloane cu condiia ca eficiena s fi
fost stabilit cu aceeai faz mobil. Numrul de talere poate fi mrit foarte
simplu prin creterea lungimii coloanei.

Gradul de separare, selectivitatea i rezoluia de separare


Gradul de separare a dou peak-uri

este dat de factorul de separare :

k 2 t r2 t 0

k1 t r1 t 0

Selectivitatea de separare a doi componeni este dat de raportul factorilor


lor de separare :

1
2

Msura separrii unei componente de alta este dat de rezoluia de separare


Rs :

18

Rs

t r2 t r1
0,5(w 1 w 2 )

unde : w1, w2 reprezint limea bazei picurillor celor dou componente.


Exprimarea pentru t i w poate fi n uniti de timp, de volum, sau de lungime.
Atta timp ct pentru cele dou mrimi se folosesc aceleai uniti se consider
c dou peak-uri snt complet separate la baz dac Rs = 1,5. In figura 2 snt
prezentate dou Peak-uri neseparate complet.

Fig.2. Situaia unei separri incomplete a Peak-urilor

Dac cele dou peak- uri snt apropiate i au ariile egale , figura 3, ecuaia ()
devine
Rs

t r2 t r1
4

Fig.3 Exemplificare pentru situaia cu dou picuri apropiate de arii egale

ecuaie ce arat influena termodinamic a sistemului cromatografic asupra


rezoluieiei prin termenul de la numrtor i a eficienei de separare prin
abaterea standard . In situaia in care:

19

tr2 tr1 = 4
rezoluia Rs are valoarea egal cu unu ceea ce corespunde unei separri
avansatea a celor doi componeni de cca 98 %. Folosirea termenilor de statistic
matematic este justificat de asemnarea peak-urilor cromatografice cu curbe
de tip Gauss valoarea lirii W fiind egal cu 4 . Forma cea mai complet i
ecuaia cheie n cromatografie pentru definirea rezoluiei Rs , ecuaie ce ine

cont de factorul mediu de capacitate k , de factorul de separare i de

numrul mediu de talere N este:

1 k
R s 0,25

1 k

Aceast ecuaie presupune ndeplinirea a trei condiii pentru obinerea unei


rezoluii dorite i anume :
- peak-urile trebuie s fie separate ntre ele ( >1)
- substanele trebuie s fie reinute pe coloan (k >1)
- coloana trebuie s conin un anumit numr de talere (N)

Influena fiecrui factor (, k , N) , asupra rezoluiei poate fi discutat


independent de ceilalali doi , rezultnd situaiile din tabelul de mai jos:

Dac se pleac de la o selectivitate constant ( factorul de


separare constant) i un numr constant de talere, zoluia R s

k /(1 k ) n figura din dreapta este

reprezentat dependena dintre factorul de capacitate mediu k

i termenul: k /(1 k ) . Valoarea limit a termenului din urm

este proportional cu:

este 1. Dac se mrete

n prima faz se mrete puternic

rezoluia ca ulterior la valori mai mari ale lui k acest efect s


scad puternic. Aa cum se observ din figura alturat valorile

optime ale lui k se situeaz ntre 1 - i 10, este adevrat c se


poate cstiga o rezoluie mai bun i la valori mai mari de 10
ns aceast cretere este legat invariabil de creteri ale
timpului de analiz.
Dac factorul de separare >1 valoarea limit pentru termenul
( 1)/ este tot 1, iar valoarea acestui termen crete ncet cu
creterea lui , atunci cnd =2 , ceea ce n practic

20

echivaleaz cu o selectivitate ridicat, abia se atinge 50% din


valoarea limit, figura din dreapta . Cea mai sensibil rezoluie
se obine atunci cnd valoarea acesteia este n jurul valorii 1, (
Rs 1

) ns i la valori mai ridicate ale Rs


o cretere a
factorului de separare este favorabil
creterii rezoluiei.
Factorul de separare poate fi influenat hotrtor fie prin
natura fazei staionare fie prin natura compoziiei fazei mobile.
Dependena rezoluiei de numrul de talere urmrete o o
funcie radicalic care pleac la nceput destul de abrupt din
zero dar care ulterior la valori mai mari ale numrului de talere
N nu mai crete aa de rapid, vezi figura din dreapta. Pentru a
dubla rezoluia N trebuie crescut cu factorul 4 , lucru foarte
greu de realizat n practic. Numrul de talere poate fi variat prin
modificarea lungimii coloanei, a diametrului particulelor, sau a
curgerii . Dac se mrete N prin creterea pur i simplu a
lungimii coloanei se ajunge la timpi de analiz mai mari precum
i la o cdere de tensiune mai ridicat pe coloan. Cu tot rolul
important pe care-l joac coloana cromatografic este cel mai
puin indicat mrirea numrului de talere N pentru a crete
rezoluia.

In figurile alturate este prezentat evoluia


unei cromatograme cu dou peak-uri
neseparate a) atunci cnd se variaz cei trei
factori ,

, N, atfel:

dac se mrete

a)

numrul de talere N i se menin constani


ceilali factori cei doi componeni 1 i 2 apar
n acelai loc pe cromatogram , se
mbunteste n schimb rezoluia Rs deoarece
limea peak-ului scade, figura b). O cretere a
factorului de capacitate mediu

are ca efect

b)

21

ndeprtarea celor dou peak-uri unul de


cellalt ceea ce nseamn de fapt o rezoluie
mai bun , totodat se nrutete
productivitatea deoarece substanele rmn un
timp mai ndelungat n faza staionar i
traversarea coloanei dureaz mai mult, peakurile nu se mai regsesc n acelai loc pe
cromatogram, figura c. O mrire a factorului
de separare duce automat la ndeprtarea
celor dou peak-uri unul fa de cellalt ceea
ce nseamn tot o rezoluie mai ridicat, d).

c)

d)

Lirea de band
Lirea de band a unei probe n cltoria ei prin
patru factori:
1. difuzia radial
2. difuzia longitudinal
3. efectele transportului de mas
4. efectele exterioare

coloan este influenat de

Difuzia radial se bazeaz pe faptul c o prob datorit drumului de curgere


distribuit radial parcurge ntr-o coloan lungimi diferite fcnd ca ea s
soseasc pe un interval mai mare de timp (band lit). Diferenele de lungime
iau natere ca urmare a diferitelor forme i dimensiuni ale umpluturii coloanei
precum i datorit golurilor neuniforme din umplutur, reprezentarea schematic
este dat n figura

. Pentru ca o coloan s prezinte o lire de band mic este nevoie ca ea s


aibe o umplutur de dimensiune ct mai mic i de diametru ct mai uniform.
Difuzia radial este cu atit mai ridicat cu ct proba traverseaz mai ncet
coloana.
Difuzia longitudinal se datoreaz pe diferenierea axial a vitezei de
curgere ca urmare a difuziei axiale. Acest efect este mai pronunat pe msura
22

creterii timpului de staionare a probei n coloan. Spre deosebire de difuzia


radial la cea axial se poate reduce efectul asupra lirii de band prin mrirea
vitezei fazei mobile. Din cauza coeficientului de difuzie mai mic cu cca 10 3-104
la
lichide dect la gaze difuzia longitudinal este totui minor n cadrul
cromatografiei de lichide n schimb la cromatografia de gaze ea joac un rol
hotrtor.
Efectele transportului de mas se manifest asupra lirii de band datorit
faptului c cinetica de absorbie- desorbie a moleculelor probei ntre faza
staionar i cea mobil este mai lent dect viteza moleculelor n faza mobil.
Atunci cnd o molecul a fazei mobile intr n interaciune cu faza staionar
petrece pe i n aceasta un un anumit timp pn cnd intr din nou n fluxul de
curgere i este ransportat mai departe de faza mobil. In tot acest timp
molecula pierde timp fa de moleculele care nu au interacionat cu faza
staionar. Un rol important la retenia moleculelor o joac i structura poroas a
fazei staionare. Fenomenele de transport de mas devin cu att mai pronunate
cu ct viteza de curgere liniar este mai mare, ca atare lirea de band datorit
efectului de transport de mas poate fi redus prin scderea vitezei de curgere a
fazei mobile . De asemenea ea poate fi redus prin folosirea unor particule cu
diametru ct mai mic i neporoase pentru umplutur, precum i folosirea de
solveni de vscozitate mic.
Efectele exterioare ale lirii de band se manifest n exteriorul coloanei i
snt cauzate de volume moarte n injector , n detector, precum i n conductele
de transport. Suma efectelor
enunate mai sus se numesc Efecte
extracolumnare un experiment [1] simplu poate demonstra efectul diferitelor
volume moarte intercalate n circuitul de lichid iar n figura este reprezentat

23

Fig. Lairea de band: i - la o cromatogram normal, ii- la o cromatogram care se obine


prin intercalarea intre detector i ieirea coloanei a unui tub cu lungimea de 15 cm i diametrul
interior de 0,8 mm, iii- la o cromatogram care se obine prin intercalarea intre detector i ieirea
coloanei a unui tub cu lungimea de 12,5 cm i un diametru interior de 4,6 mm

Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band

Fig. Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band . i- la curgere a
unui lichid printr-o conduct viteza liniar se schimb de-a lungul seciunii n sensul c
moleculele din centru se deplasez mai rapid dect cele din imediata vecintater a peretelui, iii difuzia multidirecional a probelor lichide duce la lirea de band

Analiza calitativ

Analiza cantitativ
Metoda normrii suprafeei (nlimii)
La analiza cantitativ se are n vedere faptul c suprafaa respectiv
inlimea unui peak este proportional cu concentraia componentului
reprezentat de acel peak. Pentru a exprima concentraia procentual a unui
component trebuie avut n vedere nlimea total sau suprafaa total a
tuturor componentelor din amestec care este considerat ca avnd o compoziie
de 100% . Concentraia fiecrui component din amestec se determin pe urm
prin regula de trei simple. La acest mod de abordare a analizei cantitative se
accept urmtoarele:
1. se presupune c pe cromatogram snt evideniate toate componentele
i c fiecare component apare sub forma unui peak individual bine
definit. Aceast presupunere nu ine cont de faptul c dou sau mai multe
componente pot parsi n acelai timp coloana fiind identificate ca o
singur specie, sau unele specii pot fi reinute total pe coloan i iar altele
eventual nici nu snt detectate
2. se presupune c sensibilitatea detectorului este aceeai pentru toate
componentele amestecului ceea ce n cele mai multe cazuri nu se
adeverete
24

bazat pe aceste presupuneri i efectele generate de ele se procedeaz la


calibrarea sensibilitii detectorului prin diferite metode care vor fi descrise n
continuare.
Metoda standardului extern
La folosirea acestei metode se prepar un standard extern care conine
specia (speciile) urmrit , dac se bnuiete ordinul de mrime al concentraiei
componentei (componentelor) urmrite este bine ca la standardul extern
concentraia s fie n acelai domeniu. Faza mobil astfel preparat se trimite
prin cromatograf i se traseaz o cromatogram , operaia se repet pentru
proba de analizat. Din cromatograma standard se determin pentru peak-ul
urmrit, figura, un factor de rspuns r ca fiind raportul dintre concentraia
componentei [Ai] urmrite i nlimea h sau suprafaa S a peak-ului, :
r

Ai
h

Ai
S

Fig. Mrimi caracteristice ale peak-ului luate n calcul la


determinarea concentraiei prin metoda standardului extern

n continuare concentraia oricrei componente din prob se determin prin


nmulirea factorului de rspuns r cu nlimea h sau cu suprafaa S peak-ului.
De fapt prin calcularea acestui factor de rspuns r se simplific determinarea
concentraiei prin regula de trei simple, factorul de rspuns regsindu-se de
fiecare dat n aceast regul sub forma unei constante,
la calcularea
concentraiei diferitelor componente din amestec. Acest mod de determinare a
concentraiei unei componente presupune o dependen liniar ntre nlimea
respectiv suprafaa peak-ului i concentraie. Atunci cnd aceast dependen
este cunoscut sau bnuit ca fiind neliniar se efectueaz mai multe
cromatograme etalon cu concentraii cunoscute care includ n domeniu valoarea
concentratiei necunoscute , figura i cu valorile obinute se traseaz o curb de

Fig. nlimea i forma peak-urilor la

Fig. Curba de etalonare a componentului

calibrarea
multipl
cu
concentraii
cresctoare a componentului urmrit

urmrit oarecare

25

etalonare n coordonate h(S) i concentraie. Pe aceast curb de etalonare se


extrapoleaz valorile nlimii sau suprafeei peak-ului urmrit pentru detrminarea
concentraiei speciei pe care o reprezint acesta. Imprecizia acestei metode este
legat de erorile de dozare ale probei de analizat avnd n vedere i volumele
mici ce se dozeaz.
Metoda standardului intern
La folosirea acestei metode se obin cele mai mari precizii deoarece snt
evitate erorile datorate impreciziei de dozare a probei la injecie. Tehnica se
bazeaz pe adugarea atit la proba standard ct i la proba urmrit o cantitate
bine stabilit dintr-un standard intern. Raportul dintre suprafeele peak-urilor sau
a nlimii probei i suprafaa peak-ului standardului intern reprezint parametrul
analitic urmrit respectiv factorul de rspuns r :
r

S
Ss

factor care se poate exprima , atunci cnd se ine cont de corespondena dintre
suprafaa S a peak-ului i concentraia c , ca fiind [LINDSAY]:
r

c u Su
c s Ss

unde: c - concentraia componentei care intereseaz


S - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului
cs - concentraia standardului intern
Ss - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului standardukui intern
In aceste condiii concentraia componentei urmrite cu are expresia:
cu r

Su

unde: cu - concentraia componentei care intereseaz


Su - suprafaa (respectiv nlimea) peak-ului
cs - concentraia standardului intern
Ss - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului standardului intern
Cromatografia de repartiie , este cea mai folosit metod
cromatografic i const n absorbtii si desorbii repetate ntre un faza lichid
mobil si o faz lichid staionara , ultima fiind absorbit sau legat chimic de
umplutura solid a coloanei cromatografice. Cromatografia de repartiie era
folosit nainte numai pentru analiza substanelor cu legturi polare neionice
la substane cu molecule de dimensiuni mici pn la dimensiuni medii (< 3.000g .
26

mol-1) , astzi prin metode de derivatizare i metode de formare de perechi


ionice [ Skoog] metoda permite i analiza compuilor ionici.
Cromatografia de repartiie poate fi clasificat n cromatografie lichidlichid i cromatografie cu faze legate chimic . La cromatografia lichid - lichid
faza lichid este reinut prin fore de natur fizic pe suprafaa fazei solide
staionare. La cromatografia cu faza legat chimic faza mobil este fixat prin
fore de natur chimic pe suprafaa fazei staionare solide. Cromatografia de
tip lichid- lichid este folosit mai puin din cauza solvirii fazei lichide staionare de
ctre faza mobil i antrenarea acesteia spre captul coloanei fapt ce necesit
refacerea periodic a peliculei fazei staionare, din acelai motiv acest tip de
separare nu poate fi folosit
la cromatografia cu gradient de eluie. Alte
avantaje ale cromatografiei cu faze legate chimic fa de cromatografia lichidlichid constau n simplitate, rapiditate , aplicabilitate universal i o mai bun
reproductibilitate a datelor experimentale.
n cadrul cromatografiei cu faze legate chimic se folosesc dou metode:
- cu faz normal
- cu faz invers
Metoda cu faz normal folosete o faz staionar polar (ex silicagel) i o
faz mobil nepolar . Metoda cu faz invers folosete o faz staionar
nepolar (ex hidrocarburi ) i o faz mobil polar cu solvent ap, metanol
sau acetonitril. Metoda cu faz invers este folosit la scara cea mai larg n
practic, cca 70% din separrile analitice snt separri cu faz invers. La
cromatografia cu faz normal prima dat este eluat (ajunge prima la
captul sistemului cromatografic) componenta cu polaritatea cea mai mic

27

Fig. Legtura ntre timpul de eluie i polaritate la cromatografia


cu faz normal i la cromatografia cu faz invers

iar la cromatografia cu faz invers este eluat prima componenta


cu
polaritatea cea mai mare. O ilustraie grafic n acest sens este dat n figura
. O aplicaie deosebit pentru metoda cu faz invers o reprezint
separarea de substane care prin metoda cu faz normal au timpi de
retenie foarte mari. Aplicaii specifice pentru analitica alimentar snt
separarea , identificarea i dozarea : indulcitorilor , aditivilor, antioxidani,
aflatoxine
Cromatografia de absorbie , denumit i cromatografia lichid-solid
reprezint cromatografia clasic de lichide la care o substan din faza lichid
mobil care interacioneaz puternic cu faza staionar solid rmne un timp
mai ndelungat n coloan dect o substan care interacioneaz mai slab cu
faza staionar. Corespunztor substanele din amestec ce au o comportare
absorbant difereniat fa de faza staionar prezint timpi de retenie diferii
i ajung pe rnd la captul coloanei de separare locul unde se gsete detectorul.
Acest tip de cromatografie de lichide poart denumirea de cromatografie de
absorbie sau cromatografie lichid- solid (LSC - Liquid Solid Chromatographie).
La acest tip de cromatografie ca umplutur pentru coloane este folosit silicagelul
i oxidul de aluminiu iar singura variabil accesibil pentru optimizarea lui k i
28

o reprezint compoziia fazei mobile care poate fi modificat din fericire n


mod hotrtor prin alegerea solventului sub aspectul naturii i a concentraiei lui.
Cromatografia de absobie este recomandat pentru substane cu masa
.
molecular mai mic de 5000g mol-1 solubile n solveni nepolari. Avantajul cel
mai mare al cromatografiei de absorbie l reprezint capacitatea acesteia de a
permite diferenierea i identificarea componentelor unui amestec izomeric,
capacitate care nu o are nici o alt metod cromatografic.
Cromatografia ionic constituie un domeniu important i deosebit de
dinamic al cromatografiei de lichide. Aciunea conjugat i interesat a
productorilor de aparatur cromatografic a fcut ca mult timp acest tip de
cromatografie s fie considerat ca un domeniu distinct care ar necesita o
aparatur proprie. n realitate nu este aa , separarea prin schimb ionic a
lichidelor ionizate sau ionizabile se face pe aceeai aparatur ca i a celorlalte
lichide specific fiind numai umplutura coloanei i detectorul care este de regul
unul de tip conductometric, mai nou fiind folosite i detectoare amperometrice.
La cromatografia ionic umplutura coloanei cromatografice este o rin
schimbtoare de ioni A+R+ depus pe o rin sintetic cu grad mare de
polimerizare , ce se prezint sub form granular, care fixeaz ionul B + n raport
stoechiometric :
A+R- + B+

B+R- + A B+

Ionii din soluie nlocuiesc totdeauna ioni cu acelai semn din schimbtorul de
ioni. Un amestec ionic poate fi separat numai atunci cnd ntre ionii probei fazei
lichide mobile analizate i gruprile de schimb ionic ale fazei solide exist o
interferen de un anumit nivel care este dat de modul cum se modific
schimbul ionic n funcie de pH. Dup fixarea ionilor din amestec pe
schimbtorul de ioni urmeaz eluia acestora
cu un eluent care conine
acelai ion ca i ionii fixai pe schimbtor ( de exemplu ionii fixai pe o rin ca
ioni H+ se vor elua cu un eluent ce conine tot ioni H + , trebuie ns specificat c
c pentru eluarea componenilor de pe rin , concentraia ionilor care-i
schimb trebuie s fie mai mare dect cea a ionilor schimbai [ Liteanu C, s.a.
Cromatografia de lichide , Ed. St.Buc.1974]
Cromatografie de excludere cromatografie prin gel
Reprezint o tehnic avansat n cadrul cromatografiei de lichide folosit
n principal pentru separarea compuilor cu un numr mare de molecule .
Umplutura coloanelor este format
din granule mici de silicagel sau din
polimeri cu diametrul de cca 10 m ce au o
reea
de pori uniformi
la
suprafa , figura . In acesti pori pot difuza att moleculele solventului ct i
moleculele de dimensiuni mai mici ale speciilor analizate, popri n care snt
reinute un anumit timp i astfel extrase din fluxul fazei mobile find ntrziate

29

la traversarea coloanei fa de moleculele de dimensiuni mari care traverseaz


primele coloana

Fig. Mecanismul reinerii fazei mobile de ctre umplutura poroas la cromatografia cu gel

30

Cromatografia cu fluide supracritice


Cromatografia cu fluide supracritice
(SFC- Supercritical Fluid
Cromatography) reprezint o tehnic cromatografic relativ nou de nalt
performan care poate fi explicat simplist ca fiind
o tehnic hibrid ntre
cromatografia de gaze i cromatografia de lichide cu folosirea avantajelor
ambelor metode cromatografice. Cel mai mare avantaj a acestei tehnici este
ns acela c reuete s separe i s identifice compui care nu pot fi
separai prin cele dou tehnici clasice de cromatografie respectiv cea de gaze i
cea de lichide. Asemenea compui prezint urmtoarele caracteristici :
- fie nu snt volatili fie se descompun la temperaturi mai ridicate astfel nct
cromatografia de lichide nu poate fi aplicat.
- Nu au grupri funcionale care s permit identificarea lor prin metode
spectrometrice, electrochimice sau refractometrice specifice deteciei n
cromatografia de lichide
Se apreciaz [Linsay] , [ Chester T.L. , Journal Cromatogr.Sci.1986, 24, p226],
c cca 25 % din problemele de separare cromatografic a amestecurilor snt
cauzate de acest tip de compui. Alte avantaje sunt legate de viteya mai mare
fa de cromatografia HPLC clasic,
Un fluid supracritic este o stare de agregare a unui compus care-l
plaseaz din punct de vedere al temperaturii i al presiunii foarte puin peste
valoarea temperaturii la care acea substan nu mai poate exista n faz lichid
indiferent de presiunea aplicat, temperatura acestei stri este denumit
temperatura critic,
iar presiunea corespunztoare poart denumirea de
presiune critic. Perechea de valori ale temperatuii critice i ale presiunii critice
ale unui anumit compus poart denumirea generic de punct critic al compusului
respectiv. Expresile valorice ale unor proprieti fizice sau fizico-chimice
precum :densitate, viscozitate, tensiune superficial etc.
ale fluidelor
supracritice se situeaz ntre cele ale compusului respectiv n stare lichid i
cele ale compusului n stare gazoas. De fapt pe densitatea relativ mare a
fluidelor supracritice se bazeaz capacitatea acestora de solvi lanuri moleculare
cu muli atomi de carbon fcnd ulterior posibil separarea lor cromatografic.
Din gama relativ mare a fluidelor supracritice folosite n cromatografie se
remarc bioxidul de carbon care n stare supracritic ( Teperatura critic
31,30C , presiune critic 72,9 bar, densitate la punctul critic 0,47 g/cm 3) este un
excelent solvent pentru hidrocarburi cu muli atomi de carbon, afar de asta este
ieftin, permeabil la radiaie UV, nu are miros i este netoxic. Separarea cu fluide
supracritice este folosit si ca tehnic industrial , astfel cu CO 2 supracritic se
extrage cofeina din cafea n vederea obinerii cafelei decofeinizate sau nicotina
din tabac n vederea obinerii igrilor uoare
Aparatura folosit la cromatografia cu fluide supracritice
Trebuie remarcat faptul c att temperaturile ct i presiunile folosite la fluide
supracritice se situeaz perfect n domeniul acoperit de HPLC pentru aceti doi

31

parametrii. Cu toate acestea un cromatograf pentru fluide supracritice are o


serie de particulariti fa de un cromatograf clasic de tip HPLC , astfel:
- trebuie s dispun de un sistem de termostatare avansat a coloanei
cromatografice asemntor cu un cromatograf de gaze.
- Trebuie s dispun de un reductor de presiune reglabil cu ajutorul crui a
presiunea n coloan s poat fi redus i meninut la valoarea dorit
pentru a transforma fluidul supracritic n gaz inainte de a ajunge la
detector
- S dispun de bucle de reglare automat a temperaturii i a presiunii
gestionate de microprocesoare specializate
- S dispun pe lng detectoare specifice HPLC precum detector UV, IR,
de fluorescen, flamfotometric i de detector de ionizare cu flacr (FID)
specific gazcromatografiei precum i de detector spectrometru de mas
In figura
este prezentat schema de principiu a unui cromatograf cu fluide
supracritice

Fig. schema de principiu a unui cromatograf cu fluide supracritice

Coloanele cromatografice folosite sint atit de tip tubular fr umlplutur ct


i de tip tubular cu umplutur , fiind preferate totui primele care se prezint sub
forma unor coloane lungi de ordinul metrilor fiind uzuale i lungimi de 25-30 m,
diametrul interior variind ntre 0,05-0,1 mm iar grosimea filmului de siloxani
legai chimici variaz ntre 0,05-1m [Lindsay] .La coloane cu umplutur
diametrul maxim interior este de 4,6 mm iar natura i dimensiunile umpluturii
asemntoare la coloanele HPLC clasice folosite la cromatografia de repartiie.
In cromatografia de gaze Faza mobil are numai rol de transport , n
cromatografia de lichide pe ling transport faza mobil joac i rol de mediu de
interferen
cu speciile analizate i influeneaz prin aceasta factorul de

32

selectivitate (). Dac o molecul se gsete ntr-un fluid supracritic atunci


aceast stare poate fi asimilat cu o evaporare la temperaturi mult mai mici dect
cele la care ar avea loc n mod obinuit evaporarea acelor specii i eluarea lor
pe coloan evitndu-se pericolul ruperii lanului molecular n segmente mai
scurte i prin aceasta identificri greite .

Electroforeza
Electroforeza reprezint o metot cromatografic de separarea dintr-un
amestec a particulelor ncrcate electric (ioni) sub aciunea unui cmp electric
continuu . Cimpul electric aplicat pin intermediul a doi electrozi provoac
migrarea electroforetic cu viteze diferite a particulelor plasate fie ntr-un mediu
electrolitic liber fie ntr-un mediu electrolitic pe un material suport sau ntr-un
mediu electrolitic n interiorul unei capilare. Viteza de migraie a ionilor este
proporional cu intensitatea
cmpului electric i ncrcrcarea electric a
particulei i invers proporional cu raza particulei i vscozitatea substanei de
analizat .
Electroforeza este folosit ca metod de analiz calitativ i cantitativ mai
ales n medicin, biologie , chimie alimentar. De asemenea electroforeza este
folosit n analiza genetic (DNA) pentru separarea genelor .
Descoperitorul electroforezei este cercettorul suedez Arne Tiselius (19021971). El a folosit pentru prima dat aceast tehnic analitic i a fost
rspltit cu premiul Nobel n anul 1948. La electroforeza clasic introdus
de Tiselius este folosit fie un mediu de migraie liber fie un mediu de
migraie stabilizant format din fii de hrtie poroas sau din geluri speciale
de puse pe plci de sticl sau plci sintetice. La ora actual bazat pe
tehnicile cromatografiei de lichide de nalt rezoluie (HPLC) i tehnicile
cromatografiei cu gaze (GC) s-a pus la punct electroforeza capilar cu o
rezoluie de separare mare .
Teoria electroforezei. ntr -un cmp electric ionii se deplaseaz cu o
vitez constant. Creterea intensitii cmpului electric (E), prin creterea
tensiunii , duce la creterea corespunztor i a vitezei (v) de migrare a ionilor:
v= e E
unde: (e) reprezint mobilitatea electroosmotic.
Hotrtor pentru separarea electroforetic snt vitezele diferite de migrare a
ionilor n cmp electric. De aici se trage concluzia c ionii se deosebesc prin
mobilitatea lor rezultnd de aici diferite viteze de migrare. Mobilitatea
electroforetic este o constant de material, specific pentru fiecare ion i este
definit pentru un anumit mediu de o valoare precis a pH-ului. Mobilitatea
electroforetic poate fi bine descris de forele ce acioneaz asupra substanei

33

ionice de analizat care snt pe de-o parte fore acceleratoare pe de alt parte
fore de frnare
Fora acceleratoare (Fe) este de natur electric i este dat de produsul
dintre sarcina ionic efectiv (z), constanta lui Faraday (F) i intensitatea
cmpului electric (E):
Fe= z F E
Sarcina ionic efectiv descrie sarcina ionic absolut minus componenta
sarcinii moleculelor ncrcate de semn contrar din mediu.
Fora de frnare (Ff) este dat de frecare i se poate descrie prin legea
lui Stokes:
Ff= 6rv
unde: - vscozitatea substanei de analizat,
r raza ionului
deoarece aceste dou fore cea electric de accelerare i cea de frnare snt n
echilibru , raportul lor este proporional cu viteza de migrare i cu mobilitatea ,
de unde rezult urmtoarea ecuaie:
e=z F/6r
Din relaia de mai sus se poate concluziona c molecule mici au o vitez de
migrare mai mare dect molecule mari

Clasificarea electroforezei
Electroforez n mediu liber
- Electroforez cu gradient de densitate
Electroforez n mediu stabilizant
Electroforeza cu hrtie
Electroforez cu gel
Electroforez discontinu
Electroforez capilar
Electroforez cu gradient
Electroforez n cmp pulsator
Electroforez cu focalizare electric

Electroforeza n mediu liber

34

Electroforeza n mediu liber reprezint un procedeu electroforetic fr


faz suport staionar solid. Acest tip de electroforez a fost descris pentru
prima dat de ctre Tiselius n anul 1937. Avantajul const n simplitatea
constructiv a instalaiei de separare format dintr-un tub sub form de U n
care se gsete soluia de analizat n soluie de electrolit iar n cele dou phare
de la captul tubului soluii tampon i cei doi electrozi , anodul i catodul. In
figura este reprezentat schema de principiu a electroforezei cu gradient de
densitate

Fig.II 136, p.132, AI

Fig. schema de principiu a electroforezei cu gradient


de densitate la separarea unui amestec tricomponent A+B+C

Dup cuplarea curentuluielectric se realizeaz separarea bspaiilor A, A+B,


A+B+C, B+C, C de ctre fronturi. Mobilitile ionice ale speciilor descresc n
ordinea A> B >C. La analiza unui amestec din specii anionice diferite
compartimentul anodic trebuie s conin un electrolit care s aib n
compunere o speciae anionic cu o mobilitate superioar celei corespunztoare
componentelor. Dezavantajul principal al electroforezei libere este formarea de
miscare termic convectiv, ca urmare a nclzirii inevitabile a electrolitului prin
efect Joule, miscare care poate rupe molecule mari n frecare cu pereii tubului
n special la electroforeza proteinelor.

Electroforeza n medii stabilizante


Electroforeza cu hrtie
Prin aplicarea unui curent electric la extremitile unor fii de hrtie
impregnate cu un electrolit purttor n amestec cu amestecul electrolitic al
substanelor de analizat are loc separarea substanelor ce au sarcin electric
pe baz de migrare capilar a ionilor spre cei doi electrozi de semn contrar, adic
anionii spre anod i cationii spre catod. Substanele neutre nu snt antrenate de
35

curentul electric dar sufer i ele deplasri din cauza fluxului de curgere.
Electroforeza clasic cu gel sau cu hrtie are dou dezavantaje majore:
- Interpretarea cantitativ este dificil. De exemplu proteinele pot fi
examinate numai dup colorare i msurri de reemisie (vezi i
electroforeza cu gel), ca atate msurtorile snt grevate de erori i de
timpi mari.
- Evaporarea prin efect Joule a soluiei din hrtie poate duce la uscarea lor
i la ntreruperea migrrii. Creterea de cldur depinde ptratic de
tensiunea aplicat pe electrozi din acest motiv tensiuni mici duc la timpi
de analiz foarte mari , astfel pentru separarea electroforetic complet,
n condiii de tensiune mici, pe un strat de hrtie de cca 20 cm lungime
se poate ajunge la timpi de ordinul orelor. In figra este redat principul
constructiv al unei celule electroforetice orizontale cu band de hrtie.

Fig.II137
P133
A.I.

Fig. celul electroforetic orizontal cu band de hrtie


1- vas paralelepipedic, 2-anod, 3- catod, 4-electrolit, 5- hrtie electroforetic,
6- suport pentru hrtie, 7- perete separator, 8- surs de alimentare cu curent continuu

Celula este format dintr-un vas paralelepipedic (1) ce conine un compartiment


anodic (a) i un compartiment catodic (c) n care se gsesc cei doi electrozi
anodul (2) i catodul (3). Tot n aceste compartimente se toarn n pri egale
electrolitul (4). Banda de hrtie electroforetic (5) umectat uniform cu o soluie
tampon i aezat pe suportul plan (6) are ambele capete introduse n cele dou
comparimente ale celulei electroforetice. Pentru reducerea la minim a efectului
produselor de electroliz care se formeaz asupra componentelor examinate
(electroliza produselor nu este dorit dar nu poate fi evitat n totalitate) cele
dou compartimente, anodic i catodic, snt separate fiecare n parte de de ctre
un perete (7) a crui parte superioar se situeaz sub nivelul lichidului din
compartiment , astfel nct s se poat realiza comunicarea ntre compartimente.

36

Alimentarea celulei se face de la o surs de curent continuu de nalt tensiune


(8). Pentru evitarea evaporrii electrolitului celula electroforetic este acoperit
cu un capac de sticl sau de plastic transparent. Soluia cu amestecul de
analizat se pipeteaz de obicei n centrul hrtiei , se acoper celula i se pornete
sursa de curent. Separarea speciilor ionice n timp pe fia de hrtie este
repreezentat schematic n figura pentru trei specii cationice A,B,C, i a unei
specii anionice D din electrolitul purttor.

Fig.II.139
Pa. 134
A.I.

Fig. principiul separrii electroforetice a speciilor ionice


n timp pentru electroforeza cu hrtie.
a) situaia dinaintea electroforezei, b) situaia dup electroforez

pe fia de hrtie este repreezentat schematic n figura pentru trei specii


cationice A,B,C, i a unei specii anionice D din electrolitul purttor. Dup
electroforez banda de hrtie este scoas din celul, uscat , colorat i
msurat densitometric (vezi i electroforeza cu gel).

Electroforeza cu gel
Electroforeza cu gel este o metod analitic a chimiei i biologiei
moleculare i servete separrii moleculelor purttoare de sarcin electric din
amestecuri moleculare. Un amestec de molecule migrez sub gradient de cmp
electric printr-un gel ce se gsete intr-o soluie tampon ionic. Dup dimensiune
i ncrcare moleculele se misc cu viteze diferite prin sit molecular format
de gel. Cel mai rapid se deplaseaz molecule mici ncrcate negativ (anionii)
spre anod urmeaz moleculele ncrcate pozitiv (cationii) care se ndreapt spe
electrodul negativ catodul. Dezavantajele electroforezei cu gel snt aceleai ca
ale electroforezei cu hrtie.

37

La electroforeza cu gel un rol important joac i raportul dintre diametrul


particulelor i dimensiunea porilor gelului folosit ca material suport ce
acioneaz ca sit molecular. O dimensiune de particul mai mare are
un rol de frnare a vitezei de deplasare mai puternic dect ar fi de asteptat
numai prin aciunea vscozitii gelului. Prin ncrcarea ionic diferit
precum i prin diametrul diferit al particulelor diferitele substane se
deplaseaz cu viteze diferite prin materialul suport formnd benzi vizibile.
Prin aceaste electroforeza se potrivete foarte bine pentru separarea
amestecurilor de substane n special amestecuri moleculare. Ca
material suport
pot fi folosite soluii, geluri ( electroforez cu gel
( poliacrilamid, agaroz)) sau materiale solide. O subspecie important
a electroforezei cu gel este electroforeza SDS-PAGE (electroforeza
dodecylsulfat de sodiu - poliacrilamid). Prin adugare de SDS se
compenseaz diferena de sarcin a ionilor , ei fiind separai astfel numai
dup diametrul lor. Acelai efect se obine materiale suport speciale a
cror pori se indesesc pornind de la un capt la cellalt.
Matricea de gel. Componentele gelului , de exemplu agaroz sau acrilamid
polimerizat, formeaz o reea deas tip sit care frneaz difereniat, dup
mrime, deplasarea moleculelor ce urmeaz a fi separate. Geluri de agaroz au
porii de dimensiuni relativ mari (150 nm la geluri de 1%, 500 nm la geluri de
0,16% ) i se folosesc pentru separarea ADN precum i pentru separarea
proteinelor cu molecule mari. Gelurile de poliacrilamid au pori sensibili de
dimensiuni sensibil mai mici (3-6 nm), dimensiunea depinznd de concentraia
acrilamidei precum i de gradul de mpletire. n funcie de destinaie gelului i se
adaug diferite materiale de adaus, de exemplu SDS la electroforeza cu
poliacrilamid (SDS-PAGE) sau amfolii la electroforeza cu focalizarea
izoelectric (EF).
Gelurile necesare velectroforezelor pot fi preparate n
laborator. De asemenea pot fi procurate comercial geluri gata preparate
mpreun cu soluiile tampon corespunztoare
Efectuarea electroforezei. Electroforeza clasic cu gel se efectueaz ca
electroforez zonal. O metod pentru obinerea unei nalte rezoluii mai ridicate
este electroforeza discontinu. La electroforeza cu gel ia natere cldur care
trebuie ndeprtat pentru asigurarea condiiilor optime . Din motive de
reproductibilitate a rezultatelor este recomandat ca electroforeza cu gel s se
execut cu aparate cu posibilitate de rcire i meninere constant a
temperaturii. n cazul ideal o electroforez se consider ncheiat atunci cnd
cele mai mici molecule ( cele mai mobile) au atins captul plcii cu gel. n
aceast situaie s-a atins capacitatea maxim de separare.
Interpretarea . n vederea interpretrii gelurilor dup separare se pot
folosi tehnici care marcheaz substana de analizat nainte de separarea
moleculelorsau dup separarea lor. Astfel substana se poat marca radioaktiv
inainte de separare i ulterior autoradiografia sau substana se poate marca cu
colorani dup separare (de exemplu cu Etiudibromur) i analiza pe urm su
lumin ultraviolet. Molecule identice se deplaseaz prin gel sub forma unor
zone discrete prin gel denumite uzual , datorit formei lor, benzi. Probe diferite se
pot deplasa paralel , n acelai timp, unele fa de celelalte n acelai gel. Dac

38

mrimea unor molecule este cunoscut atunci prin compararea benzilor


acestora cu benzile moleculelor necunoscute se poate aprecia mrimea
celorlalte molecule. Standarde de greutate molecular , cu benzi de migraie
cunoscute, pot fi achiziionate i comercial. Determinarea cantitii de substan
dintr-o band
se face prin colorarea gelului i ulterior prin msurare
densitometric.
Msurarea densitometric este o msurare cantitativ a densitii de
culoare (D), adic a cantitii de culoare pe unitatea de suprafa. Cu aceast
ocazie se determin diferite valori de tonalitate ns nu tonaliti de culoare.
Densitometria se bazeaz pe liniaritatea dintre cantitatea de culoare i
densitate optic, principiul de msurare este: cu ct mai mult culoare exist cu
att mai puin lumin se reflect. n practic se folosete o surs de lumin
monocromatic ce trimite radiaia prin gel spre substrat. Radiaia trece prin gelul
colorat i este filtrat corespunztor . Anumite lungimi de und snt ndeprtate
complet altora li se reduce intensitatea. Lumina ce ajunge pe substrat ( de regul
de culoare alb) este reflectat de acesta i trece din nou prin gelul colorat
putnd fi determinat att cantiatatea ct i natura (lungimea de und) a luminii pe
cale fotoelectric i cu ajutorul unui monocromator. Valoarea coeficientului de
reemisie (R) se determin prin relaia :

Electroforeza discontinu cu gel


Elecroforeza discontinu cu gel reclam o rezoluie mare a benzii
electroforetice . Discontinuitatea rezult din pH-ul diferit ntre soluiile tampon
(att a soluiei tampon a gelului ct i a soluiei tampon a electrozilor) precum i
asupra dimensiunii diferite a porilor gelului de separare i a gelului de
colectare. Gelul de colectare cu pori mari are o valoare a pH-ului de 6,8
iar gelul de separare o valoare a pH-ului de 8,8. Din cauza matricei mari
n gelul de colectare n prima faz mobilitatea proteinelor este
dependent numai de sarcina electric . n zona de grani spre gelul cu
pori mici proteinele sufer o rezisten mare la frecare rezultnd o barier
care duce la o ascuire zonal a separrii . n acesat zon mobilitatea
este dependent att de sarcin c i de mrimea moleculei. Prin
valoarea mai ridicat a pH-ului moleculele dobndesc
i o ncrcare
electric mai mare. Pentru evitarea difuzrii moleculelor gelului de
colectare cu cele ale gelului de separare este recomandat ca cele dou
geluri s se toarne unul asupra celuilalt scurt nainte de electroforez.
Efectul conjugat pozitiv al acestui procedeu electroforetic este acela c
se obiene o rezoluie la separare mai bun fa de electroforeza clasic
cu gel.

Electroforeza cu gradient de densitate


39

Electroforeza cu gradient de densitate, este tot un procedeu de


electroforez liber la care nu se folosete o faz suport staionar solid. La
electroforeza cu gradient de densitate este evitat convecia termic prin
intermediul unui gradient de densitate creat artificial. Prin aceasta electroforeza
devine una deosebit de menajant fcnd posibil separare unor proteine cu
mas molecular foarte mare ntruct moleculele nu snt forate s intre n
interaciune cu o faz solid staionar pstrndu-i integritatea. La electroforeza
de gradient de densitate, n comparaie cu electroforeza cu gel , molecule mari
nu migreaz mai ncet deoarece nu este prezent o sit molecular. Un alt
avantaj fa de electroforeza cu gel este acela c la acest tip de electroforez
este acela c la sfritul procesului de separaie proteinele se gsesc deja n
stare solvit. Dezavantajul acestui tip de electroforez n comparaie cu alte
procedee const n durata mai mare a electroforezei i rezoluia mai slab la
separare. O rezoluie mai bun se poate obine atunci cnd n loc s se introduc
substana de analizat la fundul tubului sub form de U aceasta se introduce n
cantitate redus n imediata vecintate a prii de sus a tubului sub un gradient
de densitate. Pentru creterea densitii n vederea creerii gradientului de
densitate intr n discuie saharoza, glicerina, apa grea. Zaharoza i glicerina mai
au avantajul de a avea o aciune stabilizant asupra proteinelor. Ele se folosesc
n concentraii cuprinse intre 2-70%. La concentraii mai mari este afectat prea
puternic conductivitatea. n curbura de jos a tubului sub form de U se
introduce o pern de densitate prin folosirea concentraiei celei mai ridicate .
Concentaiile de electrolit folosite trebuie s se situeze ntre 0,02 und 0,05 M , la
concentraii mai mari apare o conductivitate prea ridicatU. La rndul ei
creterea nclzirii, prin convecia ce o nsoete, duce la distrugerea
gradientului de concentraie. Pentru evitarea acestui fenomen nedorit se
realizeaz termostatarea tubului . Termometrul de control al temperaturii este
situat n punctul cel mai sczut al tubului U. n acest loc diferena de
temperatur ntre pern de densitate i temperatura apei din cmaa de rcire
nu trebuie s depesc dou grade Celsius. Spre deosebire de substanele
formatoare de gradient de densitate , concentraia electrolitului n ntregul sistem
este constant.
Ca electrolii deosebit de favorabile snt soluii tampon formate din sruri
rezultate din baze slabe cu acizi slabi deorece prin descompunere la cei doi
electrozi ei nu provoac valori de pH extreme. Electrozii folosii snt din platin
sau grafit. Prin alegerea valorii pH - ului soluiei tampon i prin poziia
electrodului negativ i pozitiv se poate influena dupdorin viteza de migrare a
proteinelor. Suplimentar, prin folosirea de substane ce mresc gradientul de
densitate, este posibil s se introduc amestecul de proteine cercetat n locul
gradientului de densitate dorit.

Electroforez Capilar
40

Electroforeza capilar este o technic de separare a sustanelor lichide


sub gradient de cmp electric , amestecul sustanelor de analizat deplasndu-se
ntr-un tub capilar a crui capete snt scufundate n dou cuve n care se
gsete electrolitul purttor precum i cei doi electrozi , anodul i catodul.
Principial tehnica electroforezei capilare se deosebete de cromatografia de
lichide HPLC i de cromatografia de gaze numai prin faptul c la ultimele dou
deplasarea amestecului de substane prin tuburile capilare se realizeaz sub
gradient de presiune, iar la prima prin gradient de potenial electric.
Primele cercetri n vederea introducerii electroforezei capilare ca
tehnic avansat de separare s-au fcut n scopul nlturrii a dou
dezavantaje majore a electroforezei cu gel i cu hrtie i anume calitatea redus
a deteciei i nclzirea probei prin efect Joule ca urmare a trecerii curentului
electric prin ea. Adevratul succes l-a cunoscut electroforeza capilar ns numai
atunci cnd s-a trecut la capilare cu diametre interioare cuprinse ntre 50 i 200
m cu o eficien a separrii foarte mare. La ora actual electroforeza capilar a
evoluat foarte mult, ea fiind rapid , de nalt rezoluie, uor adaptabil condiiilor
concrete de separare i complet automatizabil.
Deoarece ncrcarea electric la suprafaa peretelui interior al capilarei este
puternic dependent de pH, fluxul electroforetic se schimb cu valoarea pHului. La valoare redus a pH-ului el scade iar la valoare ridicat devine mai
mare. Intensitatea fluxului este dependent i de temperatur i de concentraia
electrolitului. Dac crete concentraia electrolitului scade intensitatea fluxului
electroforetic i invers. i prin adusul de solveni organici precum metanol,
intensitatea fluxului electroforetic scade. La HPLC prin presiunea aplicat apare
un profil de curgere hidrodinamic sau un profil laminar destul de pronunat.
Profilul de curgere ce rezult n schimb n urma fluxului electroforetic este
destul de plat. Acest lucru are avantajul unei liri mici a benzi i prin aceasta
determin o rezoluie mai ridicat a Peak-ului.
Aparatura folosit la electroforeza capilar. Aparatul de electroforez
capilar este relativ simplu. Elementul principal l constituie o capilar de silice
(capilar fused silica) cu diametru de 50- 250 m i lungimea de 30 i 100 cm,
protejat pentru mrirea rezistenei mecanice de un inveli subire poliamidic,
scufundat cu ambele capete n dou vase umplute cu electrolit purttor.
Capilar la rndul ei este umplut cu faza mobil constituit din electrolit purttor
i din amestecul electrolitic al sustanelor de analizat . Pentru umplerea capilarei
se introduce un capt al capilarei ntr-un vas ce conie electriolit purttor n care
se gseste solvit amestecul de substane de analizat i prin technici de presiune
sau de vacuum se umple capilara ale crei capete se introduc ulterior n cuvele
ce conin numai electrolit purttor precum i pe cei doi electrozi, anodul i
catodul. Celor doi electrozi din cuve li se pot aplica tensiuni continue de pn la
30 kV n vederea creerii gradientului de potenial sub aciunea cruia migreaz
att speciile cercetate ct i ionii electrolitului purttor . n figura este prezentat
schema de principiu a electroforezei capilare

41

Fig. Schema de principiu a electroforezei capilare

n urma separrii componentelor se obine o cromatogram care ereprezint o


distribuie n timp a picurilor ce apar atunci cnd un anumit component trece prin
drepul fotobarierei ( analiza calitativ parial). nlimea picurilor, mai precis
suprafaa de sub Peak-uri este proporional cu concentraia componentului din
electrolit (analiz cantitativ)
Prin folosirea de capilare de cuar este posibil detecia fotometric n
domeniul ultraviolet. n acest caz n dreptul ferestrei de detecie trebuie nlturat
nveliul poliamidic deorece frneaz trecerea radiaiei ultraviolete. Pe lng
detectoarele de ultraviolete pot fi folosite i alte detectoare precum cele de:
fluorescen, conductivitate, electrochimice, radioactive. Alte posibiliti de
detecie snt
legate de combinaia
electroforezei capilare (EC) cu un
spectrometru de mas (MS).
Tehnici folosite n electroforeza capilar.
n electroforeza capilar snt
folosite diferite tehnici precum:
- Electroforeza capilar zonal. Aplicarea probei se face pe o band
subire. Dup aplicarea cmpului electric fiecare component se mic pe
baza mobilitii ei , astfel nct n caz ideal se formeaz o zon curat cu o
singur component . separarea are loc pe baza sarcinii i a mobilitii.
- Electroforezei micelar electrocinetic.
La n electroforeza
capilar
moleculele neutre, cu toat c nu snt purttoare de sarcin electric, snt
antrenate i ele spre catod datorit fluxului electroosmotic dar nu snt
separate ntre ele pe componente. Prin introducerii electroforezei micelare
electrocinetice pot fi separate i molecule neutre. n cazul acestei
cromatografii miceliile snt transformate cu ajutorul unor detergeni n
electrolii, dup care n mod clasic are loc separarea moleculelor neutre
ntre micelii.
- Electroforeza capilar cu gel folosete o capilar umplut cu gel polimeric
, de ex. Poliacrilamid. La acest tip de electroforez n scopul unei
separari i mai avansate se folosete pe lng efectul electroosmotic i

42

efectul de sit molecular capilar


format prin prezena gelului n
capilar.
La electroforez cu focalizare izoelectric componente amfotere ale
probei se separ de-a lungul unui gradient de pH. Se ajunge la o separare
, aa de exemplu aminoacizii se deplasez sub form de legturi
amfoterice numai pn cnd este atins punctul lor izoelectric, deci punctul
n care ele se manifest spre exterior neutru.
Electroforeza izotachic (ITP) folosete un sistem tampon discontinuu
format din electrolitul de conducie i electrolitul final. Dat fiind faptul c
mobilitatea electrolitului conductor (cea mai nalt mobilitate) i
mobilitatea electrolitului final ( cea mai sczut mobilitate) la aplicarea
unui curent constant i respectarea legii lui Ohm se formeaz un gradient
de potenial care duce la separare avansat.

43