Interpetarea cromatogramelor

In figura 1 este reprezentat principiul cromatografiei lichide cu coloan indiferent dac

aceasta este de tip cu coloan deschis sau sau de tip HPLC . Aa cum se observ
amestecul de substane este injectat la intrarea n coloan , prin mecanisme diverse de
natur fizico chimic are loc separarea specific a speciilor chimice n timp acestea
sosind pe rnd la cellalt capt al coloanei unde sunt detectate obinndu-se o
cromatogram de tipul celei din figur.

Fig. 1. Principiul separrii cromatografice pe coloan i cromatograma obinut pentru un

amestec de trei specii chimice ntr-un solvent

Pe cromatogram pot fi identificate trei Peak-uri:

- primul peak, de nlime mic, este cel al unei specii chimice nereinute
(neretardate) de umplutura coloanei , aceast specie traverseaz coloana cu viteza
fazei mobile, timpul scurs de la injecie pn la traversarea coloanei de ctre aceast
specie se noteaz cu t0
- al doilea Peak este cel al unei specii chimice cu viteza de traversare medie timpul de
reinere fiind notat cu tr1
- al treilea Peak este cel al unei specii chimice cu viteza mic de traversare aceast
specie avnd timpul de reinere tr2

Mrimi specifice cromatografiei

1

Lungimea coloanei cromatografice (L)reprezint lungimea coloanei

msurat de la sistemul de injecie pn la detector
Viteza liniar de curgere (u) estedefin it prin viteza de curgere a fazei mobile
i este exprimat prin:
L
t0
Timpul de traversare (timpul mort) (t0 ) este timpul parcurs de o specie
chimic nereinut e (neretardate) de umplutura coloanei de la injecie pn la
traversarea coloanei, aceast specie traverseaz coloana cu viteza fazei mobile. Acest
timp espe msurat automat prin semnalul electric dat de sistemul de injecie i
semnalul dat de detector atunci cnd valoarea derivatei a I a a peak-ului cromatografic
atinge valoarea zero. Timpul t0 formeaz baza de plecare pentru determinarea
factorului de reinere
Timpul de reinere (tr)- reprezint timpul necesar ca o specie chimic s
traverseze coloana cromatografic din momentul injectiei pn la sosirea la detector .
Ca i la timpul mort i acest timp espe msurat automat prin semnalul electric dat de
sistemul de injecie i semnalul dat de detector atunci cnd valoarea derivatei a I a a
peak-ului cromatografic atinge valoarea zero.
Factorul de reinere ( factorul de capacitate ) (k). Din cromatogram din fig.
1 se observ c natura speciilor chimice poate fi interpretat prin prisma timpului de
retenie tr acest timp depinde ns pe lng natura specieiei i de ali factori precum :
lungimea coloanei, natura i granulaia umpluturii, etc, ca atare timpul de reinere poate
fi considerat specific naturii speciilor chimice numai n condiii precis definite neavnd un
caracter universal. Acesta este motivul pentru care pentru identificare calitativ este
folosit factorul de reinere (k) denumit in literatur i factor de capacitate:
u

t r t0
t0

un factor de kapacitate de valoare mic indic o rezoluie de identificare sczut iar un

factor de capacitate de valoare mare indic un timp de separare i de analiz mare cu
efect negativ asupra producivitii. Din punct de vedere al ordinului de mrime factorul
de capacitate trebuie s se situeze intre 1 i 10.
Gradul de separare a doi componeni () - exprim gradul de separare
cromatografic a dou substane i este definit ca :

k 2 t r2 t 0

k1 t r1 t 0

Eficiena unei coloane cromatografice . Ca msur a eficenei unei coloane

cromatografice de lungime L este folosit fie numrul N de talere teoretice necesare
separrii fie nlimea teoretic H a talerului. Teoria talerelor se bazeaz pe conceptul
c o coloan cromatografic poate fi asimilat cu o mulime de minicoloane (talere) lipite
unul de altul , pe fiecare din aceste talere realizndu-se echilibrul ntre faza mobil i
cea staionar . n acest concept se ia in considerare situaia n care un taler realizeaz
singur separarea cromatografic a componentelor, este evident c pentru aceasta

viteza fazei mobile ar trebui s fie infinit de mic iar timpul de efectuare a unei
cromatograme extrem de mare. ntr-o coloan cromatografic cu umplutur pentru
lichide un taler este asimilat cu o particulele de umplere a coloanei, astfel colanele
comerciale conin cca 50.000 talere pe metru dac este vorba de particule cu diametrul
de 5 m sau cca 25.000 talere pe metru liniar dac este vorba de particule de umplere
cu diametrul de 10 m. In general eficiena unei coloane cromatografice de separare
crete atunci cnd dimensiunea particulelor de umplere scade. Numrul teoretic de talere
necesar ntr-o coloan cromatografic de lungime L este dat de relaia:

L
H

de unde rezult nlimea talerului ca fiind :

H

L
N

Una din problemele de baz ale cromatografiei n general este aceea a lirii benzii
Peak-urilor ca urmare a cltoriei speciilor chimice prin coloana cromatografic. In
condiii ideale o specie chimic ar trebui s se deplaseze prin coloan fr ca banda
ei s se leasc la baz. n realitate ns are loc o lire destul de pronunat la
traversarea coloanei cauzat de
difuzie molecular longitudinal,
de curgeri
neuniforme prin coloan, de variaii necontrolate ale sorbiei i resorbiei. Eficiena unei
coloane cromatografice este cu att mai ridicat cu ct lirile W1 i W2 n condiii date
ale timpilor de retenie tr1 i tr2 snt mai mici, numrul de talere teoretice N fiind dat de
relaia:
tr

N 16

Din relaia de mai sus rezult c numrul de talere respectiv eficiena unei coloane
poate fi calculat din dou msurtori de timpi: tr i W.
O alt metod pentru determinarea eficienei, considerat de muli cercettori
de ncredere mai mare [Skoog] o reprezint determinare llimii peak-ului la jumtatea
nlimii lui, figura , numrul de talere teoretice rezultate fiind :

tr
N 5,54
W1/2

Fig. Definirea limii unui Peak la jumtatea nlimii lui ( VARIAN p1-18)

Dintre cele dou mrimi : nlimea H a talerului i numrul N de talere ce indic

ambele eficiena coloanei este preferat exprimarea prin numrul de talere deoarece
este adimensional i poate fi folosit n comparaii directe ale diferitelor tipuri de coloane
cu condiia ca eficiena s fi fost stabilit cu aceeai faz mobil. Numrul de talere
poate fi mrit foarte simplu prin creterea lungimii coloanei.
Rezoluia de separare Rs - reprezint msura separrii unui mai avansate sau
mai puin avansate aunui component de altul , cu ct distana ntre dou peak-uri este
mai mare cu atit rezoluia este mai bun, totodat crete i timpul de analiz
cromatografic:

Rs

t r2 t r1
0,5 (w1 w 2 )

unde : w1, w2 reprezint limea bazei picurilor celor dou componente. Exprimarea
pentru t i w poate fi n uniti de timp, de volum, sau de lungime. Atta timp ct pentru
cele dou mrimi se folosesc aceleai uniti se consider c dou peak-uri snt
complet separate la baz dac Rs = 1,5. In figura 2 snt prezentate dou Peak-uri
neseparate complet.

Fig.2. Situaia unei separri incomplete a Peak-urilor

Dac cele dou peak- uri snt apropiate i au ariile egale , figura 3, ecuaia () devine

Rs

t r2 t r1
4

ecuaie ce arat influena termodinamic a sistemului cromatografic asupra rezoluieiei

prin termenul de la numrtor i a eficienei de separare prin abaterea standard . In
situaia in care:
tr2 tr1 = 4
rezoluia Rs are valoarea egal cu unu ceea ce corespunde unei separri avansatea a
celor doi componeni de cca 98 %. Folosirea termenilor de statistic matematic este
justificat de asemnarea dintre peak-urilor cromatografice i curbe de tip Gauss
valoarea lirii W fiind egal cu 4
Lirea de band
Lirea de band a unei probe n cltoria ei prin
factori:
1. difuzia radial
2. difuzia longitudinal
3. efectele transportului de mas
4. efectele exterioare

coloan este influenat de patru

Difuzia radial se bazeaz pe faptul c o prob datorit drumului de curgere

distribuit radial parcurge ntr-o coloan lungimi diferite fcnd ca ea s soseasc pe
un interval mai mare de timp (band lit). Diferenele de lungime iau natere ca
urmare
a diferitelor forme i dimensiuni ale umpluturii coloanei precum i datorit
golurilor neuniforme din umplutur, reprezentarea schematic este dat n figura

Fig. Efectul difuziei radiale asupra lirii benzii [VARIAN P1-25]

Pentru ca o coloan s prezinte o lire de band mic este nevoie ca ea s aibe o
umplutur de dimensiune ct mai mic i de diametru ct mai uniform. Difuzia radial
este cu atit mai ridicat cu ct
proba traverseaz mai ncet coloana. La coloane
capilare fr umplutur , folosite n gazcromatografie, difuzia radial poate fi neglijat.
Difuzia longitudinal se datoreaz pe diferenierea axial a vitezei de curgere ca
urmare a difuziei axiale. Acest efect este mai pronunat pe msura creterii timpului de
staionare a probei n coloan. Spre deosebire de difuzia radial la cea axial se poate
reduce efectul asupra lirii de band prin mrirea vitezei fazei mobile. Din cauza
coeficientului de difuzie mai mic cu cca 103-104

Fig. Efectul difuziei longitudinale asupra lirii benzii VARIAN p1-26

la lichide dect la gaze difuzia longitudinal este minor n cazul cromatografiei de
lichide n schimb la cromatografia de gaze ea joac un rol hotrtor. Influena efectului
difuziei longitudinale asupra lirii de band este reprezentat n figura

Efectele transportului de mas se manifest asupra lirii de band datorit faptului

c cinetica de absorbie- desorbie a moleculelor probei ntre faza staionar i cea
mobil este mai lent dect viteza moleculelor n faza mobil. Atunci cnd o molecul
a fazei mobile intr n interaciune cu faza staionar petrece pe i n aceasta un un
anumit timp pn cnd intr din nou n fluxul de curgere i este transportat mai departe
de faza mobil. In tot acest timp molecula pierde timp fa de moleculele care nu au
interacionat cu faza staionar. Un rol important la retenia moleculelor o joac i
structura poroas (atunci cnd este cazul) a fazei staionare. Fenomenele de transport
de mas devin cu att mai pronunate cu ct viteza de curgere liniar este mai mare, ca
atare lirea de band datorit efectului de transport de mas poate fi redus prin
scderea vitezei de curgere a fazei mobile . De asemenea ea poate fi redus prin
folosirea , (la coloanele cu umplutur) a unor particule cu diametru ct mai mic i
neporoase pentru umplutur, precum i folosirea de solveni de vscozitate mic (la
cromatografia de lichide) .

Fig.
Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band

Fig. Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band . i- la curgere a
unui lichid printr-o conduct viteza liniar se schimb de-a lungul seciunii n sensul c
moleculele din centru se deplasez mai rapid dect cele din imediata vecintater a peretelui, iii difuzia multidirecional a probelor lichide duce la lirea de band
Efectele exterioare ale lirii de band se manifest n exteriorul coloanei i snt
cauzate de volume moarte n injector , n detector, precum i n conductele de transport.
Suma efectelor enunate mai sus se numesc Efecte extracolumnare un experiment [1]

simplu poate demonstra efectul diferitelor volume moarte intercalate n circuitul de lichid
iar n figura este exemplificat acest lucru pentru trei situa\ii concrete :

Fig. Lairea de band: i - la o cromatogram normal, ii- la o cromatogram care se obine

prin intercalarea intre detector i ieirea coloanei a unui tub cu lungimea de 15 cm i diametrul
interior de 0,8 mm, iii- la o cromatogram care se obine prin intercalarea intre detector i ieirea
coloanei a unui tub cu lungimea de 12,5 cm i un diametru interior de 4,6 mm
Simetria Peak-urtilor. Forma peak-urilor poate fi foarte diferit , n vederea
caracterizrii acestora IUPAC a elaborat o clasificare , astfel:
-

la crestere mai accentuat a frontului Peak-ului decit a scderii acestuia

denumirea este de Tailing
la cresterea mai lin a frontului peak-ului fa de scderea acestuia
denumirea este de Fronting

Factorul de Tailing sau de fronting reprezint o msur a simetriei peak-ului i se

determin la valoarea de 10% din nlimea peak-ului dup relaiile din figura

Analiza calitativ

Analiza cantitativ
Metoda normrii suprafeei (nlimii)
La analiza cantitativ se are n vedere faptul c suprafaa respectiv inlimea
unui peak este proportional cu concentraia componentului reprezentat de acel peak.
Pentru a exprima concentraia procentual a unui component trebuie avut n vedere
nlimea total sau suprafaa total a tuturor componentelor din amestec care este
considerat ca avnd o compoziie de 100% . Concentraia fiecrui component din
amestec se determin pe urm prin regula de trei simple. La acest mod de abordare a
analizei cantitative se accept urmtoarele:
1. se presupune c pe cromatogram snt evideniate toate componentele i c
fiecare component apare sub forma unui peak individual bine definit. Aceast
presupunere nu ine cont de faptul c dou sau mai multe componente pot parsi
n acelai timp coloana fiind identificate ca o singur specie, sau unele specii
pot fi reinute total pe coloan i iar altele eventual nici nu snt detectate
2. se presupune c sensibilitatea detectorului este aceeai pentru toate
componentele amestecului ceea ce n cele mai multe cazuri nu se adeverete
bazat pe aceste presupuneri i efectele generate de ele se procedeaz la calibrarea
sensibilitii detectorului prin diferite metode care vor fi descrise n continuare.
Metoda standardului extern
La folosirea acestei metode se prepar un standard extern care conine specia
(speciile) urmrit , dac se bnuiete ordinul de mrime al concentraiei componentei

10

(componentelor) urmrite este bine ca la standardul extern concentraia s fie n

acelai domeniu. Faza mobil astfel preparat se trimite prin cromatograf i se
traseaz o cromatogram , operaia se repet pentru proba de analizat. Din
cromatograma standard se determin pentru peak- ul urmrit, figura, un factor de
rspuns r ca fiind raportul dintre concentraia componentei [Ai] urmrite i nlimea h
sau suprafaa S a peak-ului, :
r

Ai
h

Ai
S

Fig. Mrimi caracteristice ale peak-ului luate n calcul la

determinarea concentraiei prin metoda standardului extern

n continuare concentraia oricrei componente din prob se determin prin nmulirea

factorului de rspuns r cu nlimea h sau cu suprafaa S peak-ului. De fapt prin
calcularea acestui factor de rspuns r se simplific determinarea concentraiei prin
regula de trei simple, factorul de rspuns regsindu-se de fiecare dat n aceast
regul sub forma unei constante, la calcularea concentraiei diferitelor componente din
amestec. Acest mod de determinare a concentraiei unei componente presupune o
dependen liniar ntre nlimea respectiv suprafaa peak-ului i concentraie. Atunci
cnd aceast dependen este cunoscut sau bnuit ca fiind neliniar se efectueaz
mai multe cromatograme etalon cu concentraii cunoscute care includ n domeniu
valoarea concentra iei necunoscute , figura i cu valorile obinute se traseaz o curb
de

Fig. nlimea i forma peak-urilor la

Fig. Curba de etalonare a componentului

calibrarea
multipl
cu
concentraii
cresctoare a componentului urmrit

urmrit oarecare

etalonare n coordonate h(S) i concentraie. Pe aceast curb de etalonare se

extrapoleaz valorile nlimii sau suprafeei peak-ului urmrit pentru detrminarea
concentraiei speciei pe care o reprezint acesta. Imprecizia acestei metode este legat
de erorile de dozare ale probei de analizat avnd n vedere i volumele mici ce se
dozeaz.

11

Metoda standardului intern

La folosirea acestei metode se obin cele mai mari precizii deoarece snt
evitate erorile datorate impreciziei de dozare a probei la injecie. Tehnica se bazeaz pe
adugarea atit la proba standard ct i la proba urmrit o cantitate bine stabilit dintrun standard intern. Raportul dintre suprafeele peak-urilor sau a nlimii probei i
suprafaa peak-ului standardului intern reprezint parametrul analitic urmrit respectiv
factorul de rspuns r :
S
Ss
factor care se poate exprima , atunci cnd se ine cont de corespondena dintre
suprafaa S a peak-ului i concentraia c , i ca fiind [LINDSAY]:
r

cS
cs Ss

unde: c - concentraia componentei care intereseaz

S - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului
cs - concentraia standardului intern
Ss - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului standardukui intern
In aceste condiii concentraia componentei urmrite cu are expresia:
cu Su r

c's
A's

unde: cu - concentraia componentei analizate

Su - suprafaa (respectiv nlimea) peak-ului componentei analizate
cs - concentraia standardului intern
Ss - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului standardului intern

12

13

14