CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA

PERFORMANTA (HPLC)

Generalitati

Cromatografia de lichide de înalta performanta (HPLC) acopera azi, în

proportie aproximativ 80%, analiza substantelor moleculare: organice,
organometalice si anorganice inclusiv compusii foarte polari sau labilitermic
precum si compusii cu masa molecula raridicata (naturali sau sintetici). De
aceea,împreuna cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin
important în analizele chimice moderne. Desi eficacitatea coloanelor nu o
egaleaza înca pe cea din GC, prin faptul ca se poate modifica, pelânga faza
stationara, si faza mobila, cromatografia de lichide (LC) face posibile separari si
analize uneori mposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria
de masa a transformat, în ultimul timp, aceasta metoda în principalul mijloc de
analiza a compusilor moleculari naturali sau sintetici, constituindunul din pilonii
pe care se sprijina chimia sintetica actuala si pe care s-a dezvoltat biochimia si
biotehnologia moderna.
In cromatografia de lichide sunt folosite urmatoarele tipuri de detectoare:
- de absorbţie în ultraviolet
- şir de fotodiode (diode - Array)
- de fluorescenţă
- electrochimic
- refractometrici
Diode Array

Detectorul sir de fotodiode poate fi folosit in numeroase situatii, de exemplu

determinarea puritatii unei solutii, separarea hidrocarburilor aromatice.

Principiul de utilizare.
Detectorul este utilizat cu lampa de deuteriusi
xenon care emit ultraviolete (1). Lumina de la lampa trece prin proba aflata in
tubul capilar (5) iar lumina dispersata trece printr-o retea de difractie (6) apoi
cade pedioda Array (7). Rezolutia detectorului depinde de numarul diodelor si
de numarul lungimilor de unda acoperite. Doda Array poate continr sute de
diode iar semnalul de la fiecare dioda este preluat si amplificat de catre
amplicator (8)ca la sfarsit sa ajunga la sistem de prelucrare, prelucrare si afişare
a datelor (9)care de obicei este un calculator care stocheaza datele pe hard disc.
La sfarsitul analizei informatile oferite de fotodiode sunt afisatepe o
cromatograma. Sunt oferite intensitatile substantelor din amestec (analiza
cantitativa) si timpii lor deretentie (analiza calitativa).
Sensitivitatea detectorului sir de fotodiodeeste de 1x10-7 g/ml iardomeniu
dinamicliniar de 5x103.

Principiul de funcţionare al detectorului sir de fotodiode

1- raze in ultraviolet
2- substanţace vine de la coloana cromatografica
3- substanţa ce pleacă la tratament chimic
4- geam de cuarţ
5- tub capilarprin care circulasubstanţa de analizat
6- reţea de difracţie
7- dioda Array
8- amplificator
9- sistem de preluare,achiziţie si afişare a datelor
10- cromatograma (in care se preiau concomitent toate lungimile de unda)

SISTEM CROMATOGRAFIC HPLC

I. Sistemul HPLC este format din:

1. Cabinetul de solvenţi - fazamobilă

⎯Stocareafazei mobile
2. Degazor ( cu vaccum)
⎯Condiţionarea fazei mobile ( extragerea gazelor dizolvate)
3. Pompă (izocratică, binară, cuaternară)
⎯Amestecarea şi deplasarea fazei mobile
4. Autosampler (sistemul de injecţie al probei lichide )
⎯Transferul probei de la operatorul sistemului către coloana cromatografică
5. Compartimentul coloanei
⎯Condiţionarea coloanei la o anumită temperatură (termostat)
⎯Separarea propriu – zisă (coloana)
6. Detectorul (UV – VIS) DAD
⎯Monitorizarea eluţiei, recunoaşterea analiţilor separaţi pe coloană
7. Staţia de prelucrare a datelorpe computer, program “LC solution”.

II. Parametrii sistemului cromatografic

1. Parametrii pompei
• Debit (exemplu: 0,8-1,2ml/min) - se selectează de operator înfuncţie de
metoda de analiză
• Compoziţiafazei mobile %
⎯pentru o pompăbinară se selectează %B iar %A se reglează automat din
100% ( B – solventul organic ACN, alcoolmetilic, înfuncţie de metodă)
Pmax< 200 bar (20MPa)
Pmin 2-3 bar (0,2-0,3 MPa)
2. Parametrii injectorului
• Volumul de injecţieμl
• Locul probei în autosempler
3. Parametrii coloanei
• Se alege coloana în funcţie de metoda de analiză
• Temperatura termostatului coloanei este dată de metoda de analiză
tray: 1L
vial:1, ....
105
4. Parametrii detectorului (UV-VIS) cel mai răspândit
• Lungimea de undă ( dată de metoda de analiză)
5. Timpul de analiză (min)
 METODA HPLC DE DETERMINARE A UNOR COLORANTI
ALIMENTARI SINTETICI DIN PREPARATELE DIN CARNE

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă înlocuieşte vechile metode

cromatografice de analiză a coloranţilor alimentari (cromatografia în strat
subţire, cromatografia pe hârtie) furnizând rezultate precise, reproductibile şi
rapide.

1. Stabilirea naturii colorantului şi extracţia sa din proba de analizat

Se aplica o metodǎ de testare calitativă a produselor alimentare pentru a

putea determina natura colorantului introdus în procesul de fabricaţie. Metoda
permite stabilirea naturii colorantului folosit şi anume: natural sau sintetic.

Dacă colorantul este sintetic, acesta este extras rapid din probă într-un amestec
apă-metanol 7/3. Se observă vizual o colorare intensă a amestecului de
extracţie, situaţie care nu apare în cazul în care colorantul este natural.
Dacă în urma acestei testări calitative, se constată prezenţa în probă a unui
colorant sintetic, se trece la extracţia acestuia în vederea dozării lui cantitative.

2. Determinarea coloranţilor alimentari sintetici

Este o metodă HPLC de determinarea unor coloranţi alimentari sintetici,

şi anume: tartrazină, ponceau 4 R, allura red şi galben de chinolină .
Se încerca mai întâi separarea coloranţilor sintetici menţionaţi utilizând:
O coloană cromatografică Pecosphere C18, 5 μm, 150 x 4,6 mm (BrownLee),
O fază mobilă constituitǎ dintr-un amestec acetat de amoniu:metanol (7:3, v/v)
Un debit al fazei mobile de 0,7 mL/min.
Detecţia coloranţilor alimentari sintetici separaţi se efectueaza
spectrofotometric, cu ajutorul detectorului diode array al sistemului HPLC.
Coloranţii ponceau 4 R şi galbenul de chinolină au timpii de retenţie
foarte apropiaţi şi nu se separǎ. Cu toate că cei doi coloranţi nu se pot separa
cromatografic, ei pot fi totuşi determinaţi prin efectuarea de mǎsurǎtori de
absorbanţǎ la lungimea de undă de 507 nm pentru determinarea ponceau 4 R
(galbenul de chinolină nu absoarbe la această lungime de undă) şi la 413 nm
pentru galben de chinolină. De asemenea, în cazul analizei unor probe reale, în
vederea identificării compusului separat, este recomandată compararea
spectrelor de absorbţie ale compuşilor separaţi (cu timpii de retenţie în jurul
valorii de 3 min) cu spectrul fiecăruia din cei doi coloranţi (ponceau 4 R şi
galben de chinolină).
Se foloseste o coloană cromatografică cu aceleaşi caracteristici generale,
dar produsă de altă firmă (Supelco),si seobţin picuri cromatografice bine
separate pentru coloranţii alimentari sintetici ponceau 4 R şi galben de
chinolină. Parametrii metodei cromatografice utilizate sunt prezentaţi în tabelul
următor:

coloana Coloana cu faza inversa supelcosil C 18 5µm,

150x4.6 mm
faza mobila Acetat de amoniu 0.1M: metanol : 7:3 (v/v)
Debit 0.7 ml/min
Temperatura 37°C
coloanei
detector UV Vis tip Diode Array
Volum de injectie 10µl

În figurile 1 şi 2 sunt prezentate cromatogramele ce se obţin pentru

tartrazină şi galbenul de chinolină folosind cea de a doua coloană
cromatografică (Supelcosil), precum şi spectrele de absorbţie corespunzǎtoare
acestora, spectre trasate cu detectorul diode array al aparatului HPLC.
Spre deosebire de cromatogramele obţinute pentru ponceau 4R, allura red şi tartrazină, în
care s-a obţinut câte un pic cromatografic bine definit corespunzător fiecăruia din coloranţii
menţionaţi, pentru colorantul galben de chinolină cromatograma este constituită din cinci
picuri cromatografice.
Colorantul sintetic galben de chinolină se prezintă sub forma unui amestec de săruri de sodiu
ale unor acizi di şi trisulfonici. Numărul şi poziţia grupărilor sulfonice pe nucleul benzenic,
explică comportamentul cromatografic diferit al componentelorgalbenului de chinolină.
Figura 1. Cromatograma pentru colorantul tartrazină şi spectrul de
absorbţie corespunzător acestuia

Dacă se compară alura spectrelor de absorbţie corespunzătoare picurilor

cromatografice ce se obţin la separarea componentelor galbenului de chinolină
(figura 1), se observă că forma acestora este asemănătoare. Acest lucru se poate
explica prin faptul cǎ este prezentǎ aceeaşi grupare cromoforǎ în toate
componentele amestecului, dar numărul şi poziţia grupărilor sulfonice din
molecula acestora determină un comportament cromatografic diferit pentru
fiecare component.
În figura 3 este prezentată cromatograma ce se obţine pentru amestecul
format din cei patru coloranţi alimentari sintetici analizaţi: ponceau 4R, allura
red, tartrazină, galben de chinolină. Studiind cromatograma prezentată în figura
3 se observă cǎ se obţin picuri cromatografice bine definite pentru tartrazină,
ponceau 4R şi allura red.
Figura 2. Cromatograma pentru colorantul galben de chinolină şi spectrele de
absorbţie corespunzătoare diferitelor componente ale acestuia.

În cazul colorantului sintetic galben de chinolină, se obţine un singur

peak cromatografic mai mic, care corespunde peak-ului cel mai proeminent din
cromatograma obţinută pentru proba etalon a acestuia. Acest lucru se poate
explica prin faptul că determinările se efectueaza la 450 nm, unde absorbanţa
corespunzătoare acestui colorant este mică. Picurile corespunzătoare celorlalte
forme sub care se găseşte colorantul, fie nu sunt puse în evidenţǎ, fiind foarte
mici, fie se suprapun peste picul tartrazinei (picul cu timpul de retenţie 2,08
min, figura 1), sau al ponceau 4R (picul cu timpul de retenţie 3,19 min, figura
2).
Din acest motiv se consideră că aceasta metoda deşi permite identificarea
celor patru coloranţi în amestec nu este adecvată pentru determinarea lor
cantitativă (atunci când sunt prezenţi toţi patru într-un amestec). Pot fi însă
efectuate determinări cantitative pentru următoarele amestecuri de coloranţi:
tartrazină, ponceau 4R şi allura red sau galben de chinolină şi allura red. De
cele mai multe ori, acest lucru este suficient deoarece într-un produs alimentar
se introduc un număr redus de coloranţi, de cele mai multe ori unul singur.
Figura 3. Cromatograma amestecului format din cei patru coloranţi sintetici
analizaţi.

3. Analiza unor probe reale

În figura 4, se prezintă un exemplu de analiză calitativă a unui colorant

sintetic dintr-o probă de cabanos. Se prezintă cromatogramele (figura 5 a şi 5 b)
şi spectrele de absorbţie (figura 5 c) ale unui standard de colorant sintetic şi ale
colorantului din proba de cabanos.

PRINCIPIUL METODEI:

este cel prezentat la punctele 1 si 2.

MATERIALE NECESARE:

 Proba (extras rapid din cabanos într-un amestec apă-metanol 7/3);

 sistem HPLC cu coloană cromatografică Pecosphere C18;
 sistem HPLC cu coloană cromatografică Supelcosil;
 spectrofotometru cu detector diode array;
 MOD DE LUCRU:

 din rezervoarele conţinând unul sau mai mulţi solvenţi pompa (sau
pompele), alimentează coloana cu eluent (de regula un amestec de doi sau mai
mulţi solvenţi);

 in imediata vecinătate a coloanei se introduce proba(extras rapid din

probă într-un amestec apă-metanol 7/3), automat, prin intermediul unui ventil cu
by pass;

 in coloana aflata într-o etuva termostat, are loc separarea propriu-zisa;

 Efluentul coloanei intra într-un detector de unde componentul, daca este

separat complet, poate fi colectat si izolat, cuajutorul unui colector de fracţiuni;

 Semnalul este înregistrat fie cu un înregistrator (detector), fie direct

în memoria unui calculator.

CONCLUZII:

S-a identificat prin metoda HPLC într-un preparat de carne (cabanos)

prezenţa colorantului sintetic ponceau 4R comparând valorile timpilor de
retenţie pentru un standard care conţine ponceau 4R şi pentru colorantul extras
din proba de analiza.
 S-a confirmat prezenţa colorantului ponceau 4R în proba analizatǎ prin
compararea spectrelor înregistrate pentru compuşii corespunzători cele două
picuri şi anume: al colorantului ponceau 4R şi al colorantului din proba
analizată. Spectrele înregistrate sunt foarte asemǎnatoare, ceea ce confirmă
prezenţa colorantului Ponceau 4R în preparatul de carne analizat
Este importantǎ determinarea coloranţilor sintetici din preparate de carne,
chiar la concentraţii foarte mici, deoarece în ţara noastră este
interzisă folosirea acestei clase de compuşi în carne şi preparate din carne.
Universitatea de Științe Agronomice și
Medicină Veterinară din București

Facultatea de Zootehnie

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA

PERFORMANTA (HPLC)

Paunescu C-tin Alexandru

Tehnologii speciale in industria alimentara

Anul I