UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ “ION IONESCU DE LA BRADˮ DIN IAŞI

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

Cromatografia de lichide de
înaltă performanţă (HPLC)

Student,
Andrei BĂIȚUC

2018
 CUPRINS

Istoric ………………………………………………….…….….3
Introducere……………………………………………….……. 5
Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC)..… 5
Pompe pentru HPLC ……………………………………….…7
Sisteme de introducere a probei ………………………….…..7
Bibliografie ……………………………………………….……9

2
 Istoric

Începutul cromatografiei de lichide este atribuit lui Ţwet (1903), care a reuşit pentru prima
dată separarea unor compuşi naturali coloraţi pe o coloană umplută cu carbonat de calciu, utilizând o
fază mobilă alcătuită din solvenţi organici. Dezvoltarea cromatografiei de lichide ca tehnică analitică
are loc ceva mai târziu şi este legată de necesitatea crescândă de separare a compuşilor organici din
matrici complexe.
In iunie 1941, Societatea Britanică de Biochimie, îşi ţinea cea de-a 214-a şedinţă de
comunicări, la Institutul Naţional de Cercetări Medicale. La această întâlnire Martin şi Synge, doi
tineri chimişti (Martin avea 31 de ani; Synge – 26), au prezentat o lucrare despre separarea şi
determinarea amino-acizilor N-acilaţi din probe de lână, printr-o nouă metodă analitică. Aceştia au
separat acetil-prolina de acetil-leucina, utilizând o coloană umplută cu silicagel impregnat cu apă (un
material foarte polar) şi cloroform ca fază mobilă. Lua naştere astfel „cromatografia de partiţie”,
recunoscută apoi ca separare prin cromatografie de lichide în fază normală. [106,107] Exact 10 ani
mai târziu, Martin şi un alt tânăr cercetător (A.James – 29 ani) trimiteau spre publicare o lucrare
descriind un proces cromatografic în care faza mobilă este un gaz.[108,109] Se puneau bazele
„cromatografiei de partiţie gaz-lichid”. In anul 1948 Martin şi grupul său de cercetare încep cercetări
la Institutul Naţional din Londra cu privire la problema separării cromatografice a acizilor graşi, cu
catenă hidrocarbonată mare. Aplicarea separării cromatografice în fază normală nu a dat rezultatele
dorite, deoarece coeficienţii de partiţie ai acestor compuşi erau aproape total în favoarea fazei mobile.
Deci retenţia şi astfel separarea lor pe o coloană polară nu avea loc. Ideea de a schimba rolurile celor
două faze a venit imediat. Astfel au realizat prima fază staţionară nepolară prin tratarea kiselgurului cu
Si(CH3)2Cl2, care devine total neaderent de către solvenţi polari şi hidrofili. In anul următor au
realizat pentru prima dată separarea acidului lauric (C12) de acidul stearic (C18). Mai târziu, tehnica
bazată pe acest principiu avea să fie cunoscută ca separare prin cromatografie de lichide în fază
inversă, deşi până în 1970 chiar şi IUPAC considera această tehnică analitică doar de interes istoric.
Prin realizarea fazelor staţionare chimic legate această tehnică ia o mare dezvoltare, în prezent
fiind cea mai importantă tehnică analitică de separare.[110] Contribuţiile esenţiale ale lui Martin şi
Synge la dezvoltarea cromatografiei au fost răsplătite în anul 1952 prin acordarea Premiului Nobel în
Chimie.
Prima fază staţionară sintetizată este atribuită autorilor Halasz şi Sebastian (1969), care au
refluxat silicagelul cu 1-octanol, obţinând eterul având la bază o structură destul de instabilă în
prezenţa apei, caraterizată de legăturile Si-O-C:

3
 In 1970 Kirkland şi DeStefano au ataşat lanţuri hidrocarbonate la structura silicagelului prin
utilizarea reactivilor de derivatizare de tip silanic, obţinând structuri mult mai stabile pe bază de
legături Si-O-Si, ca în exemplul următor:

Horvath, Knox, Soczewinski, Snyder, Scott, Kirkland, Guiochon sunt doar câteva nume mari
de oameni de ştiinţă care au adus contribuţii fundamentale, teoretice sau experimentale, la dezvoltarea
cromatografiei de lichide ca tehnică analitică de mare performanţă.

4
Ce este cromatografia?

Cromatografia (din limba greacă: chroma „culoare” și graphein „a scrie”) face referire la
tehnicile de laborator prin care se separă substanțele chimice din amestecuri sau soluții. Se deosebesc
două faze cromatografice: faza mobilă și faza staționară (sau fixă). Principiul separării cromatografice
constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec între cele două faze. Amestecul este
dizolvat întru-un fluid (faza mobilă), care îl va trece printr-o structură ce conține un alt material (faza
staționară). Diferitele componente ale amestecului trec prin faza staționară cu viteze diferite, ceea ce
presupune separarea lor.

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC)

Introducere

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC [112]) acoperă azi, în proporţie

aproximativ 80%, analiza substanţelor moleculare: organice, organo-metalice şi anorganice inclusiv
compuşii foarte polari sau labili termic pecum şi compuşii cu masă moleculară ridicată (naturali sau
sintetici). De aceea, împreună cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important în
analizele chimice moderne. Deşi eficacitatea coloanelor nu o egalează încă pe cea din GC, prin faptul
că se poate modifica, pe lângă faza staţionară, şi faza mobilă, cromatografia de lichide (LC) face
posibile separări şi analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de
masă a transformat, în ultimul timp, această metodă în principalul mijloc de analiza a compuşilor
moleculari naturali sausintetici, constituind unul din pilonii pe care s-a dezvoltat biochimia şi
biotehnologia modernă.

5
 Figura 1

Metoda constituie o evoluţie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloană clasică, care
servea în primul rând la izolarea preparativă a compuşilor naturali. Prin introducerea pompelor şi în
consecinţă, lucrându-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze staţionare
performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze staţionare sferice, cu
diametre 2-5µm), în coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, începând cu anul 1969, la configuraţia
actuală (fig. 1). Se poate observa că din rezervoarele conţinând unul sau mai mulţi solvenţi pompa
(sau pompele), alimentează coloana cu eluent (de regulă un amestec de doi sau mai mulţi solvenţi). În
imediata vecinătate a coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul unui ventil cu by pass.
În coloana aflată într-o etuvă termostat, are loc separarea propriu-zisă. Efluentul coloanei intră
într-un detector de unde componentul, dacă este separat complet, poate fi colectat şi izolat, cu ajutorul
unui colector de fracţiuni. Semnalul este înregistrat fie cu un înregistrator, fie direct în memoria unui
calculator. În esenţă, un cromatograf analitic HPLC are structura din fig. 2 unde nu s-a mai prezentat
colectorul de fracţiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemănarea cu
GC singura deosebire majoră constituind-o sursa de eluent - pompa.

6
Pompe pentru HPLC

Pompa este considerată una dintre cele mai importante componente ale HPLC deoarece
permite realizarea unui debit constant al eluentului prin întreg sistemul: injector, coloană, detector
mărind deosebit de mult viteza separării.
Într-un cromatograf de lichide pot exista una sau mai multe pompe, fiecare furnizând o
presiune care poate atinge 20mii kPa (cca. 200atm). Presiunea deosebită este necesară deoarece
coloana are o umplutură de fineţe mare şi, în lipsa presiunii, debitul ar fi nepractic de mic.
Există în uz două tipuri principale de pompe, clasificate astfel în funcţie de debit: pompe cu
presiune constantă (şi debit variabil) şi pompe cu debit constant.
Pompele cu presiune constantă sunt mai simple (a se citi ieftine) şi nu prezintă pulsaţii în
funcţionare (care nu ar permite obţinerea unei linii de bază netede). Acestea, prezintă dezavantajul că
debitul trebuie frecvent modificat pentru a se menţine cât mai constant, ceea ce la separări de durată
pune probleme, deoarece prin obturarea coloanelor debitul se modifică continuu. Se înţelege că orice
modificare de debit (datorită viscozităţii sau temperaturii eluentului şi a structurii umpluturii)
afectează timpul de retenţie şi totodată semnalul detectorilor, în majoritate sensibili la concentraţie.
Pompele cu debit constant nu mai prezintă dezavantajele de mai sus. De-a lungul timpului s-au
selecţionat două variante: pompele cu piston (alternative) şi pompele de tip seringă (cu deplasare
pozitivă).
La primele, cele mai utilizate, mişcarea du-te-vino a pistoanelor şi a supapelor cu bilă permit o
funcţionare indefinită dar presupun existenţa unor atenuatoare de pulsaţii - dispozitive care să elimine
micile variaţii de debit. Acestea constau dintr-o alternanţă de mai multe rezistenţe, de exemplu tuburi
subţiri şi capacităţi - care pot fi incinte cu pereţi elastici, fie chiar manometre.
Pompele cu presiune constantă, asemănătoare cu o seringă dar având o capacitate mai mare,
pompează continuu pe toată durata separării, pistonul deplasându-se cu o viteză liniară constantă dar
după fiecare cursă este necesară oprirea debitului şi reumplerea cu solvent a corpului pompei.
Deşi solvenţii utilizaţi se degazează pentru a se reduce efectele corozive ale oxigenului,
datorită presiunilor ridicate la care se lucrează, coroziunea este totuşi deosebită.
De aceea aceste pompe (corpul, cilindrii, garniturile şi supapele) se execută din materiale
rezistente la coroziune: safir, agat, teflon sau aliaje speciale.

Sisteme de introducere a probei

În cazul HPLC injecţia probei trebuie făcută într-un timp cât mai scurt, pentru a nu deranja
regimul dinamic al eluentului prin coloană şi detector. Dificultatea provine de la presiunea ridicată la

7
care lucrează coloana (20mii kPa). Sistemul cel mai utilizat în cromatografele de lichide este ventilul
cu 6 căi, numit şi ventil de introducere a probei,
prevăzut cu bucle interschimbabile (fig. 3).

Deoarece eluentul aderă la pereţi, pentru completa îndepărtare a sa în momentul alimentării

buclei cu probă, este necesară injectarea prin buclă a unui volum de cel puţin de trei ori volumul
acesteia, înainte de comutarea pe analiză. Bucla lucrează în două etape.
Etapa A (fig. 3-A) în care bucla este umplută cu probă cu ajutorul unei seringi sau în alt mod.
Apoi are loc comutarea pe analiză (fig. 3-B) când prin rotire cu 60°, în direcţia acelor de ceasornic,
manual sau automat, bucla este parcursă de eluentul de la pompă şi conţinutul acesteia este antrenat în
coloană. Volumul probelor pentru coloane obişnuite (25cmx4.6mm) este de 10-50µl.
Evident aceste ventile sunt confecţionate din materiale rezistente la coroziune şi la solvenţi
(oţel inoxidabil, tantal, teflon etc).

Sistemul HPLC este folosit în analizele:

• farmaceutice;
• clinice;
• toxicologice;
• de mediu;
• industrial;
• alimentare.

8
 Bibliografie

https://ro.wikipedia.org/wiki/HPLC

https://www.scribd.com/presentation/52221700/2-Prezentare-metoda-HPLC-MS

https://biblioteca.regielive.ro/proiecte/chimie-generala/cromatografia-lichida-de-inalta-
performanta-25713.html

http://www.scritub.com/stiinta/chimie/Cromatografia-de-lichide54483.php