Sunteți pe pagina 1din 56

UNIVERSITATEA " Lucian Blaga '' DIN SIBIU

FACULTATEA DE IINE AGRICOLE, INDUSTRIE


ALIMENTAR I PROTECIA MEDIULUI

TEHNICI CROMATOGRAFICE HPLC

Studeni:

-SIBIU-

2012

CUPRINS
Cuprins..............................................................................................................................................2
Cap. I Introducere.............................................................................................................................4
Cap II Principiul de cromatografie de lichide..................................................................................6
2.1 Sistemul de livrare.....................................................................................................................8
2.2 Pompe pentru HPLC...................................................................................................................8
2.2.1 Sisteme de injecie a probei.....................................................................................................9
2.3 Coloanele n LC..........................................................................................................................9
2.3.1 Corpul coloanei i mecanisme de separare..............................................................................9
2.4 Faza staionar..........................................................................................................................11
2.5 Faza mobil...............................................................................................................................12
2.6 Detectori...................................................................................................................................13
2.6.1 Detectori spectrofotometrici n UV-VIS...............................................................................14
2.6.2 Detectori refractometrici........................................................................................................15
2.6.3 Ali detectori..........................................................................................................................15
2.7 Analiza cantitativ ...................................................................................................................16
Cap III Aplicaii..............................................................................................................................18
3.1 Autenticitatea sucurilor de fructe.............................................................................................18
3.1.1 Detectarea de zaharuri ..........................................................................................................18
3.1.2 Detectarea de acizi.................................................................................................................19
3.1.3 Detectarea de compui fenolici..............................................................................................21
3.2 Fructe citrice.............................................................................................................................21
2

3.3 Alte fructe.................................................................................................................................22


3.3.1 Detectarea de antociani..........................................................................................................23
3.3.2 Detectarea de carotenoizi.......................................................................................................23
3.4 Autenticitatea vinurilor.............................................................................................................24
3.5 Autenticitatea mierii.................................................................................................................26
3.6 Autenticitatea uleiurilor, untului i cafelei...............................................................................27
3.6.1 Uleiurile vegetale...................................................................................................................27
3.6.2 Untul de cacao i cafeau......................................................................................................28
3.7 Autenticitatea brnzei i laptelui..............................................................................................29
Cap IV Concluzii............................................................................................................................31
Bibliografie....................................................................................................................56

Cap. I Introducere
Istoria de cromatografie dateaz din inceputul secolul al XIX-lea. Inaintea anilor 1970,
cromatografia cu coloana deschisa a fost utilizat n scop comercial n laboratoare. Termenul
HPLC provine din cauza tehnicii de nalt presiune utilizata pentru reducerea timpului care ia
analizei sa se faca. Dup numeroase etape de dezvoltare, instrumente au devenit capabile s
funcioneze la presiuni de pn la 6000 psi (400 bar). Cu o ameliorare de coloane i
detectoare, o dezvoltare esenial a fost realizat in privirea performanei, astfel nct tehnica a fost
redenumita cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC), n mijlocul anilor 1970 pn
la sfritul lunii. n aceast perioad, metode noi, inclusiv cromatografie de lichid de etapa
inversa, au permis o separare mai bun ntre compui foarte similari. Prin anii 1980,
calculatoarele i de automatizare au adugat comoditate in analiza HPLC. La nceputul
secolului al XXI-lea, un nou nivel de performan a fost realizat prin continuarea
mbuntirii tehnologii de coloana care a dus la utilizarea adsorbantilor cu paricule mai mici
(1,7 m), i dezvoltare a instrumentelor care permit aplicarea de nalt presiune pn la 1000 bar
pentru a livra solventi. Rezoluia, viteza i sensibilitatea au crescut. Aceasta tehnologie noua se
numeste cromatografie lichida ultra-performanta. (lori.academicdirect, 2012).
Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC) acoper azi, n proporie
aproximativ 80%, analiza substanelor moleculare: organice, organo-metalice i anorganice
inclusiv compuii foarte polari sau labili termic precum i compuii cu mas molecular ridicat
(naturali sau sintetici). De aceea, mpreun cu cromatografia de gaze constituie un punct de
sprijin important n analizele chimice moderne. Dei eficacitatea coloanelor nu o egaleaz nc pe
cea din GC, prin faptul c se poate modifica, pe lng faza staionar, i faza mobil,
cromatografia de lichide (LC) face posibile separri i analize uneori imposibil de realizat prin
alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de mas a transformat, n ultimul timp, aceast metod n
principalul mijloc de analiza a compuilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din
pilonii pe care se sprijin chimia sintetic actual i pe care s-a dezvoltat biochimia i
biotehnologia modern. ( traducere).
Metoda constituie o evoluie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloan clasic,
care servea n primul rnd la izolarea preparativ a compuilor naturali. Prin introducerea
pompelor i n consecin, lucrndu-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze
staionare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze
staionare sferice, cu diametre 2-5m), n coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, ncepnd cu
anul 1969, la configuraia actual (fig. 1.1). Se poate observa c din rezervoarele coninnd unul
sau mai muli solveni pompa (sau pompele), alimenteaz coloana cu eluent (de regul un
amestec de doi sau mai muli solveni). n imediata vecintate a coloanei se introduce proba,
automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. n coloana aflat ntr-o etuv termostat, are loc
separarea propriu-zis. Efluentul coloanei intr ntr-un detector de unde componentul, dac este
separat complet, poate fi colectat i izolat, cu ajutorul unui colector de fraciuni. Semnalul este
nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator. n esen, un cromatograf
analitic HPLC are structura din fig. 1.2 unde nu s-a mai prezentat colectorul de fraciuni,
interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemnarea cu GC singura
deosebire major constituind-o sursa de eluent - pompa. n cele ce urmeaz se vor prezenta cele

mai importante aspecte deoarece volumul de informaii publicate este deosebit de amplu, un mare
numr de date existnd chiar pe reeaua Internet . (lori.academicdirect, 2012).

Fig. 1.1 Prezentarea schematic a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern


(lori.academicdirect, 2012)

Solvent Pomp Injector Coloan Detector nregistrator


Fig. 1.2. Schema bloc a unui cromatograf HPLC (C. Luca1983).

Cap II Principiul de cromatografie de lichide


Cromatografia de lichide este o metod de separare care folosete o coloan umplut cu
suport solid (adsorbant) i un lichid care se deplaseaz prin suportul de baz. Compuii se misca
din partea de sus a coloanei care au cu etapa mobil, prin mediul adsorbant, timp n care compuii
individuali se separ. Suportul solid, peste care etapa mobil curge continuu, se numete etapa
staionar. Migraia compuilor la viteze diferite prin etapa staionar este datorita diferenei de
distribuire a acestora ntre etapa mobil i etapa staionar. Meninerea unui compus este
determinat de marimea coeficientului de partiie dintre cele dou etape; mai anume, meninerea
depinde de nivelul de interaciune dintre compus i etapa staionar. Informaiile obinute de la un
proces de cromatografie este evideniat de o cromatogram, care este o nregistrarea profilului de
concentraiei ai compuilor de prob. Cromatograma (Figura 2.1) este seria de modele (vrfuri
normale Gauss) de compui genera i de un detector care detecteaz schimbrile n concentraia
individual a compusilor la captul coloanei n funcie de timp (sau volumul etapeii mobile).
Cromatograma furnizeaz informaii complexe despre o prob, cum ar fi numrul de compui
separai, cantitatea ( maximul nlimii sau maxima ariei) i identitatea (parametrii de retenie) de
compui individuali. (H. Nacu, 2003).

Fig. 2.1 Varfurile cromatogrfice si atributia lor.


, timpul de retenie;
jumtatea vrfului nlimii,

, timpul pauz sau timpul mort al coloanei.

vrful nlimii, w vrful limii,

, varful limii msurat la

vrful limii msura la 4,4% a vrfului (lori.academicdirect,

2012)
Durata de timp necesar pentru un compus s treac printr-o coloan cromatografic
se numete timpul de retenie ( ). Molecule diferite iau timp diferit pentru a se muta prin
coloan n etapa staionar, dar aceeai cantitate de timp n etapa mobil. Acest timp din etapa
mobil se numete timpul mort al coloanei sau timpul pauz al coloanei ( ).Timpul petrecut de

molecule n etapa staionar se numete timpul de retenie corectat (

), si se calculeaz ca

tR= tRt0

diferen ntre timpul de retentie si timpul mort.

Cum lichidele pot fi considerate a fi incompresibile, n cromatografie de lichid, retenia


este de obicei msurat n uniti de timp pentru confort. Raportul dintre timpul de retenie
corectat i timpul mort este egal cu factorul de capacitate al compusului, care caracterizeaz separarea.
Factorul de capacitate (k) se calculeaz dup cum urmeaz: k= tR / t0 = ( tR - t0 ) / t0.
Retenia relativ a dou componente vecine este descris de: = tR( peak1)/ tR(peak2) =k(peak1)
/ k(peak2).
unde este factorul de separare. Factorul de separare este de asemenea cunoscut sub numele de
retenie relativ sau selectat.
In timp ce moleculele migreaz prin coloan, zona de compui se extinde continuu n
timpul trecerii acestor compusi. Eficiena cromatografiei este msurat in functie de lrgirea
aceste zone, care poate fi exprimat prin numrul de placa teoretic (N) sau de nlime
echivalent cu placa teoretic (H sau HETP). Placa teoretica este proporional cu lungimea
coloanei (L): N=L/H.

O valoare H mai mic indic o coloan mai eficient, cu o valoare N mai mare. Eficienta
coloanei se refer la performana etapeii staionare, furnizand informaii despre performanele
sale cinetice i ct de bine este coloana ambalata. (C. Luca, .a.,1983).
Descrierea matematic a eficienei coloanei cromatografice se obine din ecuaia van Deemter:
H=A+ B/u +Cu
unde u este viteza liniar a etapeii mobile. A este termenul de difuzie eddy, reprezentnd mai
multe cai pe care un compus poate sa ia prin coloan. Viteza de faz mobil afecteaz, de
asemenea, difuzarea Eddy. O rata mai mare de miscare rezult n marirea zonei de largire. B este
termenul pentru difuzarea longitudinal, care descrie o un proces de largire a bandei care este
invers proporional cu viteza din etapa mobil. HPLC n acest termen este neglijabil, deoarece
coeficientii de difuzie al lichidelor sunt foarte mici comparativ cu cele ale gazelor (ca n
cromatografia de gaze). C este coeficientul transferului de mas. n scopul de a obine o valoare
H mic i a permite separarea eficient sa fie realizata, ar trebuie sa fie utilizate ajutorul
particulelor mici, eluent de vascozitate scazuta, o coloan mai lungi i o temperatur mai mare.
Numrul teoretic de plac poate fi msurat prin mai multe metode, aplicand urmtoarea formul:
N= a(tr/w)2
unde a este o constant, n funcie de nlimea vrfului (n cazul n care acesta este msurat),
este timpul relativ de retenie al vrfului i w este vrful limii (figura 2.1). Valoarea a depinde
7

de metoda de calcul; poate fi 5.57, 25, 16 atunci cnd limea maxim este msurat la jumtatea
nlimii a vrfului (

), cand nlimea vrfului e 4,4%, si la linia de baz, respectiv. Vrful

limii (w) este distana dintre intersecia de baz i linia tangenta cu ambele pri ale vrfului.
Multe varfuri cromatografice nu prezint modelul de distribuie gaussian normal. Placa
teoretic nu este afectata de anomalii cromatografice (Figura 2.2), cum ar fi vrf "de coada" i
"frontal".

Fig. 2.2 Anomaliile de vrf cromatografice. As, factorul de asimetrie; w10%, limea maxim
msurat la o distanta de 10% de la inlimea vrfului (
). (lori.academicdirect, 2012)
Formula pentru asimetria de un vrf, adic a factorului de asimetrie, poate fi calculat din forma
vrfului: As= b/a
unde a este distana dintre maxima vrfului i fa vrfului, msurat la o distanta de 10% de la
nlimea vrfului, iar b este distana maxim dintre vrf i coada vrfului msurat la o dinstanta
de 10% de nlimea vrfului.
Gradul de separare a dou vrfuri se caracterizeaz prin separarea relativ, i anume
rezoluia.Rezoluia a dou vrfuri poate fi calculat din cromatografice variabile reglabil, cum ar
fi factorul de selectivitate, eficiena i capacitatea compuilor separati prin urmtoarea formul:
Rs=N1/2/4(1)/k/1+k
unde k este media de factor de capacitate a celor dou vrfuri de interes. n cazul n care

este

1.25, separarea a dou vrfuri este considerat satisfctor. Acesta const dintr-o livrare de
sistem, coloane, detectoare, i un sistem de operare i control. (C. Luca, .a.,1983).
8

2.1 Sistemul de livrare


Sistem de livrare in cromatografie de lichide const dintr-o pompa de inalta presiune,
supape, regulatoare de curgere , o camer de amestec, un amortizor de impulsuri i traductoare de
presiune.Sistemul trebuie s fie capabil s ofere solveni din rezervoare prin tot cromatograful la
o presiune ridicat (pn la 500 bar), la o gam larg de curgere (0.1 - 10 mk min -1), cu fluctuatii
de curgere minime, asigurarand reproductibilitatea timpul de retenie i stabilitatea iniial a
detectoarelor. Prin amestecarea a solvenilor n camera de amestecare, pompa de nalt presiune
asigur o compoziie constant a eluentului n timpul separarii isocratice, n timp ce marirea
puterii eluentului cu timpul ar trebui s fie realizata n perioada de eluare a gradientului.
Instrumentele sofisticate sunt echipate cu un degazor cu solvent, prin aplicarea unei epurri heliu
sau vid.Unii factori care afecteaz performana sistemului de livrare pot fi controlati prin
pregtirea eluentului. Degazarea eluentului este folosit pentru a preveni formarea de bule de gaz
n etapa mobil. Bule formate de obicei din oxigen, pot provoca degradare a probelor i a
etapelorlor prin care trec, i n plus afecteaz sensibilitatea i stabilitatea detectoarelor de baz.
Degazare poate fi realizat prin aplicarea unui vacuum, tratamente cu ultrasunete sau prin epurare
cu heliu. Solventul refluxiv a fost dovedit a fi cea mai eficient metod de reducere a
concentraiei de oxigen. Particule solide n eluent pot provoca tulburri n timpul separrii,
afectnd, astfel, presiunea i randamentul solventului de livrare i care s duc la fluctuatia ratei
de curgere. Prin urmare, filtrarea particulelor solide din solveni sau a se lua soluii de prob este
un pas important nainte de analiz. (lori.academicdirect, 2012)
2.2 Pompe pentru HPLC
Pompa este considerat una dintre cele mai importante componente ale HPLC deoarece
permite realizarea unui debit constant al eluentului prin ntreg sistemul: injector, coloan,
detector mrind deosebit de mult viteza separrii. ntr-un cromatograf de lichide pot exista una
sau mai multe pompe, fiecare furniznd o presiune care poate atinge 20mii kPa (cca. 200atm).
Presiunea deosebit este necesar deoarece coloana are o umplutur de finee mare i, n lipsa
presiunii, debitul ar fi nepractic de mic. Diagrama bloc a instrumentului HPLC arat ca n figura
2.3.(traducere).

SR, rezervorul de solvent; HPP, pompa de inalta presiun; I, injectorsul; C, coloana; OCS,
operatia si systemul de control; DP procesarea datelor
Fig. 2.3 Diagrama bloc a instrumentului HPLC (. S. Gocan,2002).

Exist n uz dou tipuri principale de pompe, clasificate astfel n funcie de debit:


pompe cu presiune constant (i debit variabil) i pompe cu debit constant. Pompele cu presiune
constant sunt mai simple (a se citi ieftine) i nu prezint pulsaii n funcionare (care nu ar
permite obinerea unei linii de baz netede). Acestea, prezint dezavantajul c debitul trebuie
frecvent modificat pentru a se menine ct mai constant, ceea ce la separri de durat pune
probleme, deoarece prin obturarea coloanelor debitul se modific continuu. Se nelege c orice
modificare de debit (datorit viscozitii sau temperaturii eluentului i a structurii umpluturii)
afecteaz timpul de retenie i totodat semnalul detectorilor, n majoritate sensibili la
concentraie. (wikipedia, 2012)
Pompele cu debit constant nu mai prezint dezavantajele de mai sus. De-a lungul
timpului s-au selecionat dou variante: pompele cu piston (alternative) i pompele de tipsering
(cu deplasare pozitiv). La primele, cele mai utilizate, micarea du-te-vino a pistoanelor i a
supapelor cu bil permit o funcionare indefinit dar presupun existena unor atenuatoare de
pulsaii - dispozitive care s elimine micile variaii de debit. Acestea constau dintr-o alternan de
mai multe rezistene, de exemplu tuburi subiri i capaciti - care pot fi incinte cu perei elastici,
fie chiar manometre. Pompele cu presiune constant, asemntoare cu o sering dar avnd o
capacitate mai mare, pompeaz continuu pe toat durata separrii, pistonul deplasndu-se cu o
vitez liniar constant dar dup fiecare curs este necesar oprirea debitului i reumplerea cu
solvent a corpului pompei. ( traducere)
Dei solvenii utilizai se degazeaz pentru a se reduce efectele corozive ale oxigenului,
datorit presiunilor ridicate la care se lucreaz, coroziunea este totui deosebit. De aceea aceste
pompe (corpul, cilindrii, garniturile i supapele) se execut din materiale rezistente la coroziune:
safir, agat, teflon sau aliaje speciale. (hplc.chem.shu.edu, 2012)
2.2.1 Sisteme de injecie a probei
n cazul HPLC injecia probei trebuie fcut ntr-un timp ct mai scurt, pentru a nu
deranja regimul dinamic al eluentului prin coloan i detector. Dificultatea provine de la
presiunea ridicat la care lucreaz coloana (20mii kPa). Sistemul cel mai utilizat n
cromatografele de lichide este ventilul cu 6 ci, numit i ventil de introducere a probei, prevzut
cu bucle interschimbabile (fig. 2.4).

10

Fig. 2.4 Ventilul pentru introducerea probei (cu 6 ci); lucreaz n dou etape:
A - alimentarea buclei cu proba; B - dup o rotire cu 60 n sensul acelor de ceasornic,
antrenarea probei din bucl n coloan (lori.academicdirect, 2012)
Deoarece eluentul ader la perei, pentru completa ndeprtare a sa n momentul
alimentrii buclei cu prob, este necesar injectarea prin bucl a unui volum de cel puin de trei
ori volumul acesteia, nainte de comutarea pe analiz. Bucla lucreaz n dou etape. Etapa A n
care bucla este umplut cu prob cu ajutorul unei seringi sau n alt mod. Apoi are loc comutarea
pe analiz cnd prin rotire cu 60, n direcia acelor de ceasornic, manual sau automat, bucla este
parcurs de eluentul de la pomp i coninutul acesteia este antrenat n coloan. Volumul probelor
pentru coloane obinuite (25cmx4.6mm) este de 10-50l. Evident aceste ventile sunt
confecionate din materiale rezistente la coroziune i la solveni (oel inoxidabil, tantal, teflon
etc). (H. Nacu, 2003).
2.3 Coloanele n LC
Locul n care se petrece separarea propriu-zis i - n funcie de calitatea acesteia - se mrete
sau micoreaz raportul semnal/zgomot, este coloana cromatografic. Dei muli autori denumesc
coloana piesa cea mai important dintr-un cromatograf, acesta din urm, fiind format dintr-o
serie de componente, rezult c fiecare compartiment n parte, contribuie separat la obinerea
rezultatului analitic. Pentru un practician din domeniul LC ns, locul unde acesta intervine
efectiv i unde se concepe logic separarea este ntr-adevr coloana. (S. Gocan,2002).
2.3.1 Corpul coloanei i mecanisme de separare
Materialul din care se confecioneaz corpul coloanei n LC trebuie s asigure acesteia
rezistena mecanic adecvat presiunilor nalte (20mii kPa) precum i rezistena la coroziune fa
de faza mobil. n majoritatea cazurilor a fost preferat oelul inoxidabil 316 lucios. Acesta rezist
la majoritatea solvenilor, excepie fcnd doar srurile halogenilor, n special n soluie puternic
acid. Alte alternative o constituie coloanele compozite: sticl sau plastic n interior - oel
inoxidabil sau material plastic n exterior. ( traducere)
Din punctul de vedere al geometriei (fig. 2.5), aceste coloane sunt cilindrice, iar
dimensiunile depind, n primul rnd, de dimensiunea granulelor i porozitatea umpluturii. Astfel
diametrul coloanelor variaz ntre 0.3-5cm iar lungimea poate fi ntre 3-25cm. Pentru scopuri
preparative, n cazul unor componente necunoscute, se utilizeaz chiar diametre mai mari.

Fig. 2.5. Aspectul coloanelor din LC: coloan analitic (stnga), semipreparativ (dreapta)
(lori.academicdirect, 2012)

11

Cu ct umplutura este mai fin, cu att coloana este mai scurt. Pentru a se reine
eventualele impuriti sau componeni care nu pot prsi coloana (fiind reinui practic
ireversibil) se folosesc adesea precoloane care, fiind de dimensiuni mai mici (acelai diametru i
lungimi de 0.4-1cm), pot fi nlocuite mai des, evitndu-se astfel scoaterea prematur din funcie a
coloanei principale. Pentru a nu fi antrenat faza staionar n afara coloanei, aceasta este blocat
la capete de dou discuri metalice, poroase, avnd diametrul porilor ntre 0.5- 10m. De
asemenea pentru a nu se lrgi prea mult prin coloan zona cromatografic (cu diluarea ce are loc
simultan), tot volumul mort ale acesteia (goluri n coloan, tubul de aduciune de la injector, tubul
de evacuare spre detector) trebuie redus la minim. Se cunosc pn n prezent mai multe
mecanisme de separare prin coloane, care depind mult de fazele mobil i staionar. Mai exact,
depind de natura fenomenului fizico-chimic pe care se bazeaz retenia difereniat i separarea.
Metodele LC (HPLC) se pot clasifica, dup mecanismele principale amintite, astfel: de adsorbie,
de repartiie, ionic, i de excluziune steric.Se disting dou moduri de realizare a cromatografiei
de repartiie:
Cromatografie de repartiie direct (sau cu faze normale - clasic);
Cromatografia de repartiie cu faze inversate - metoda preferat n zilele noastre - pe care se
realizeaz cele mai numeroase separri. (S. Gocan,2002).
n primul caz faza staionar este format dintr-un lichid polar iar faza mobil dintrun
solvent organic nepolar iar n al doilea, situaia se inverseaz: lichidul imobil este nepolar iar
faza mobil este un amestec de solveni polari. De exemplu, una dintre cele mai rspndite faze
inversate este cea staionar - silicagel, iar cea mobil - un amestec ap, metanol, acrilonitril (sau
tetrahidrofuran). O separare reuit pe o astfel de faz este prezentat n fig. 2.6.
Coloan: Supelcosil (SiO2)
LC-ABZ, 25x4,6cm;
Granulaia: 5m, t = 40C;
Eluent: 10 pn la 90%
acetonitril n ap 0.5%/min;
Detector: UV la 225nm;
Debit: 1mLmin-1;

12

Fig. 2.6. Separarea unor pesticide prin HPLC (lori.academicdirect, 2012)


Componente
1. Izoproturon
2. Profam
3. Propazin
4. Terbutilazin
5. Linuron
6. Propanil
7. Prometrin
8. Fenamifos
9. Fenitrotion
10. Cafein
11. Metamitron
12. Fenuron
13. Metoxuron
14. Simazin
15. Bromacil
16. Cianazin
17. Atrazin
18. Carbaril
Cromatografia ionic (IC) are mai multe variante. Cea mai frecvent ntlnit astzi
folosete n calitate de faz mobil solveni apoi diluai de electrolii iar ca faz staionar
schimbtori de ioni. Metoda va fi descris ntr-un capitol separat datorit implicaiilor actuale n
analizele de ape legate de protecia mediului. O alt variant denumit cromatografie prin
perechi de ioni folosete faze staionare capabile s fixeze anumii ioni care fixeaz ioni de semn
contrar (perechi de ioni). Acest mecanism se prefer n cazul substanelor ionice sau ionizabile.
n fine, mai exist cromatografia de afinitate, o variant considerat uneori un mecanism separat,
se bazeaz pe afinitatea extrem de specific a unor molecule cu alte molecule fixate pe suport.
Dei este vorba de interaciuni coordinative sau alte afiniti de natur biochimic dintre suport i
componentele de separat mecanismul poate fi asemnat cu adsorbia sau chiar cu schimbul ionic
dar mult mai specific. Suportul este materialul pe care ligandul este fixat (ideal este ca acesta s
fie rigid, stabil i s aib o suprafa mare). De exemplu agarul este cel mai cunoscut suport, de
asemenea se mai folosete celuloza, dextranul i poliacrilamida. Ligandul este fixat pe gelul de

13

agaroz fiind un polimer al D-galactozei i al 3,6-anhidro-L-galactozei i poate fi folosit la o


presiune de 1atm i ntr-un interval de pH de la 4 la 9. Avndu-se n vedere complexitatea
problemei i diversitatea acestor perechi de faze mobile i staionare, vom limita n cele ce
urmeaz discuia doar la cele mai utilizate dintre acestea pentru domeniul analizei poluanilor
mediului. n funcie de componentele de separat i tipul de mecanism preferat, faza mobil se
alege folosind schema din tabelul 2.1. (C. Luca, .a., 1983).
Tabelul 2.1. Tipurile de mecanisme de separare cunoscute n LC (C. Luca, .a, 1983).

Mas molecular

Solubil n
Ap

Caracter
Ionic
Neionic

Cromatografie
ionic (IC)
cu perechi de ioni

Solveni organici

Polar

cu faz invers
cu faz polar
legat

lichid-solid
(CLS)

excluziune
steric
CLS
IC

excluziune
steric
Excluziune
steric
Schimb ionic
Interaciuni
hidrofobe

<2000
Proba
Nepolar

Ap

Solveni organici

> 2000

2.4 Faza staionar


Silicagelul (SiO2) este considerat materialul cel mai important utilizat ca faz
staionar. Acesta a devenit, n ultimii 20 de ani, doar suportul adevratelor faze - fazele chimic
legate - ceea ce nu schimb importana sa. Silicagelul s-a obinut la nceput n form granular,
neregulat, apoi n form sferic (fig. 2.7). Indiferent de form, granulaia trebuie s fie uniform
(se elimin partea fin) pentru c astfel caracteristicile curgerii eluentului sunt mult mbuntite.
Obinerea silicagelului sferic se face plecnd de la soluii coninnd silicat de sodiu dar i ali
compui hidrolizabili ai siliciului (tetraclorur de siliciu, silicat de etil etc.). De la acetia, printr-o
reacie cu apa urmat de o pulverizare i apoi de o sinterizare, procese vizibile, se obin granule
cu aspect sferic. ( Amelio M., .a,1993) .

14

Fig. 2.7. Aspectul granulelor de silicagel folosite


frecvent la umplerea coloanelor din HPLC (lori.academicdirect, 2012)
Puritatea sa avansat este o condiie a bunei funcionri a materialului n LC deoarece
prezena unor ioni metalici modific structura determinnd apariia unor centre de adsorbie
puternice i de aici apariia unor cozi ale picurilor. Silicagelul are o structur tridimensional cu o
reea de baz, tridimensional, format din legturi Si-O-Si iar pe suprafaa porilor sau cea
exterioar mai prezint grupe silanol, Si-OH. Punile de oxigen apar ntre atomii de siliciu cu
ocazia polimerizrii acidului silicic, Si(OH)4. n ultimul timp a mai aprut un tip de faz
staionar cu performane ridicate. Este vorba de coloanele monolit, realizate din aceleai materii
prime i printr-o tehnologie asemntoare din punct de vedere chimic. Coloana este format
direct n tubul rigid (metalic), de unde i numele. Aceasta nu mai are granule dup cum se poate
observa din fig 2.8. Prin noua tehnologie, s-au obinut coloane cu performane superioare fa de
cele umplute cu granule. (S. Gocan, 2002).

Fig. 2.8. Aspectul la microscopul electronic al


coloanelor monolit (lori.academicdirect, 2012)
Exist trei tipuri de grupe silanol superficiale I- legate, II- reactive i III- libere cu
tria relativ I < III < II. n funcie de tehnologia de obinere difer i porozitatea intern,
suprafaa specific, rezistena la compresiune i polaritatea. Silicagelul este considerat, n general,
un material puternic polar. Grupele funcionale de pe suprafa au un caracter acid (pK a pentru
grupele silanol este similar fenolului). Pentru a se reduce cozile picurilor pe care le dau centrele
de adsorbie puternice, silicagelul se poate dezactiva, de exemplu prin adaos controlat de ap (38% ap). Cteva mrci de silicagel comercial sunt prezentate n tabelul 2.2. ( traducere)

15

Tabelul 2.2 Cteva dintre cele mai cunoscute tipuri de silicagel pentru HPLC(S. Gocan,2002).
Marca

Diametrul
porilor

Suprafaa
specific

pH-ul n
suspensie 10%

Tipul
particulelor

Zorbax 300
Vydac TP
Hypersil
Spherisorb
Polysil
LiChrosorb
Rosil
Rsil

30
32
12.5
8
6
10
8
6

39
82
149
190
245
297
357
433

5.4
4.1
8.2
7
6.5
6.7
8.4
8.0

Sferice
Sferice
Sferice
Sferice
Neregulate
Neregulate
Sferice
Neregulate

Se poate observa c suprafaa specific scade cu creterea diametrului porilor iar pHul
acestora se situeaz n domeniul 5.4-8.4. Ali adsorbeni mult mai puin utilizai sunt alumina,
oxidul de zirconiu, crbunele macroporos, polimerii poroi (de ex. spuma poliuretanic).
( traducere)
Fazele staionare chimic legate au aprut n urma ncercrilor mai puin eficace de
utilizare a unor faze staionare lichide depuse pe un suport poros solid - permeabil pentru eluent
(a fost preferat kieselgur-ul sau pmntul diatomitic - n esen tot SiO2 dar cu pori mari i o
suprafa mult mai mic.
Deoarece n toate aceste ncercri faza staionar era splat de pe suport de ctre eluentul
n micare i n felul acesta deranja funcionarea detectorului, s-a recurs la soluia crerii unor
faze care s fie fixate prin legturi chimice - mult mai puternice dect cele fizice. Aspectul unei
faze staionare chimic legate poate fi imaginat ca n fig. 2.8, adic catenele legate alctuiesc o
adevrat pdure de molecule care se comport fizic asemntor unui strat subire, aderent la
suport (imposibil de dizolvat) dar cu o valoare a factorului de capacitate k mai favorabil.
Dac gruprile silanol Si-OH de pe suprafaa silicagelului sunt puse n situaia de a
reaciona cu anumii derivai organometalici, se poate realiza sinteza unor faze chimic legate.
Cele mai stabile legturi sunt cele care au la baz apariia structurilor legate prin intermediul unei
puni: Si-O-Si. Obinerea acestora se realizeaz prin reacii de condensare la care particip
grupele silanol - superficiale, efectuate n prezena unor clorsilani. Un exemplu este reacia:
SiOH + ClSi(CH3)2R -HCl Si-O-Si(CH3)2-R, unde cel mai frecvent R = C8H17 sau
C18H37. Prin astfel de reacii (astzi se cunosc mai multe variante) suprafaa silicagelului se
acoper cu un strat monomolecular de dimetil-alchilsiloxan nepolar. Pentru se mri i mai mult
stabilitatea s-a recurs la soluia legrii radicalului de hidrocarbur R prin intermediul mai multor
legturi cu suprafaa silicagelului. Stratul de hidrocarbur grefat de suport se comport ca un strat
foarte subire, uniform, de lichid nepolar dar mult mai stabil. Aceste faze stau la baza
cromatografiei cu faze inversate. Polaritatea acestor faze se poate regla prin legarea n cadrul
unor catene laterale ale radicalului de hidrocarbur R, de exemplu a unor funciuni aminopropil,
cianopropil, benzil, crendu-se astfel o mare diversitate de faze staionare. ( Nacu, 2003).

16

2.5 Faza mobil


Faza mobil sau eluentul n LC nu reprezint un mediu inert ca gazul purttor din GC.
De aceea alegerea fazei mobile se face aici n perfect concordan cu faza staionar. Astfel
faza mobil difer destul de mult n funcie de tipul interaciunilor componentelor separate cu
faza staionar din coloan. Singurele caracteristici generale sunt urmtoarele: faza mobil
trebuie s aib o viscozitate cobort, aceasta trebuie s dizolve bine componentele, nu trebuie s
afecteze funcionarea coloanei i trebuie s permit funcionarea detectorului. .
Unii elueni provoac migrarea unui anumit component mai repede prin coloan. Se spune c
acetia au o trie relativ mai mare sau, altfel spus, au o putere de eluie mai ridicat. Aceast
denumire provine de la faptul c factorul de capacitate, k, este mai mare i de aceea componentul
migreaz mai repede. Dar totul depinde de trio-ul component - faz mobil - faz staionar.
Astfel, pe o faz staionar polar, folosind o faz mobil nepolar, se vorbete de cromatografie
de repartiie normal (sau cu faze directe). Din contr, pe o faz staionar nepolar utilizndu-se
o faz mobil polar se vorbete de cromatografie de repartiie cu faze inverse (sau inversate). n
acest ultim caz au devenit uzuale fazele mobile formate din amestecuri metanol - ap care n
cromatografia de repartiie sunt considerate printre fazele mobile mai puin tari. ( Amelio M.
.a.,1993) .
Pe o faz staionar polar, amestecul metanol-ap face parte dintre cei mai tari elueni
cunoscui. n tabelul 2.3 se prezint civa dintre cei mai ntlnii solveni i ordinea n care crete
tria lor relativ, n cele dou tipuri de cromatografie de repartiie. n cromatografia ionic (IC) se
folosesc soluii diluate de electrolii ca: NaOH, NaHCO3, HCl, iar n cea de excluziune steric
solveni simpli - evident compatibili cu polimerii, separai unii de alii dup dimensiuni. O alt
cale de mbuntire a separrilor existent n LC (cale inexistent n GC) este folosirea
gradienilor de eluie. De exemplu, n GC, prin modificarea eluentului gazos nu se constat nici o
mbuntire a calitii separrii, n sensul mririi selectivitii. n HPLC, din contr, solventul are
o contribuie important n procesul de separare, dar nu trebuie neglijat importana decisiv a
cuplului faz mobil - faz staionar. Dei unii compui sunt reinui slab prin coloan, ieind
destul de repede, cei reinui puternic ies din coloan dup un timp cteodat nepractic de lung,
lucru care determin diluarea n eluent a componentul n urma parcurgerii coloanei, aceasta
micorndu-se calitatea analizei. De aceea s-a recurs la introducerea treptat peste primul solvent
(eluent), a unui al doilea solvent mai tare sau a celui de-al treilea, ceea ce n limbajul de
specialitate se numete gradient de eluie (sau de concentraie). (lori.academicdirect, 2012)
Tabelul 2.3 Cteva faze mobile (monocomponente) utilizate n cromatografia de repartiie
n ordinea triei lor relative n LC de repartiie cu faze normale (lori.academicdirect, 2012)
Faze normale

Solveni
Hexan
Benzen
Triclormetan
Clorur de metilen
Eter etilic
Acetat de etil
Acetonitril

17

Faze inversate

Capacitate

Metanol
Ap
de

dizolvare (trie)

La ora actual soluia la care s-a recurs n practic const, n general, dintr-un sistem de
ventile electromagnetice care permite intrarea solvenilor n aceeai pomp, prin intermediul unei
camere de amestecare aflate la joas presiune. Este posibil i un alt montaj n care fiecare solvent
are pompa proprie, comandat de un dispozitiv de control al debitului. Aceti solveni intr n
camera de amestec i de aici n coloan. ( traducere).
2.6 Detectori
Tehnica HPLC s-a dezvoltat o dat cu perfecionarea detectorilor. Am amintit c
detectorii n cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la ieirea eluentului
dintr-o coloan i care pot nregistra continuu substanele separate de ctre aceasta. Deci
detectorii constituie acea parte a instrumentaiei care permite s se observe modul cum decurge
separarea prin coloan fr a se vedea componenii propriu zii ci doar semnalul lor. ntruct
coloanele de separare performante au capaciti de ncrcare mici, sistemul de detecie trebuie s
fie unul foarte sensibil. Totodat, pentru c n LC volumul de prob este de ordinul microlitrilor
(8-10l), volumul detectorilor trebuie s fie de volum apropiat pentru a se putea sesiza n mod
continuu picul cromatografic. n calitate de instrumente se poate utiliza, n principiu, oricare
dispozitiv de analiz chimic cunoscut, pentru probe lichide, precum i orice combinaii de
instrumente fizice. De exemplu, n ultimul timp, combinaia dintre un detector refractometric i
unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace n analiza polimerilor n amestec cu
monomeri sau oligomeri dintr-un material. Exist chiar posibilitatea creterii sensibilitii
deteciei printr-o reacie chimic n urma adugrii, cu un debit controlat, a unui reactiv potrivit.
Tehnica se numete derivatizare i se poate practica chiar nainte de introducerea probei n
coloan, dar i dup ieirea din coloan a componentelor separate. Metoda a fost utilizat pn n
prezent n special legat de metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice i mai
ales pentru analiza unor amestecuri de compui numeroi avnd aceleai funciuni reactive (de
exemplu aminoacizi). Caracteristicile detectorilor sunt asemntoare cu ale celorlalte instrumente
analitice i oarecum similare cu cele descrise la metoda GC. ( hplc.chem.shu.edu, 2012).
2.6.1 Detectori spectrofotometrici n UV-VIS
Acest grup de detectori sunt cei mai folosii detectori pn n prezent, att n LC, ct i
n HPLC. Pentru a putea fi utilizai, compuii separai cromatografic trebuie s fie colorai - adic
s absoarb lumina pe domeniul de lungimi de und al detectorului. Pe de alt parte, eluentul
trebuie s fie practic transparent pentru acelai domeniu spectral. Legea fizic pe baza creia
funcioneaz aceti detectori a fost prezentat - este vorba de legea Lambert-Beer (A = lC). Deci
unitile vor fi uniti de absorban, adimensionale. De aceea limita de detecie sau zgomotul de
fond se prezint n cazul acestor detectori n AUFS (de la Absorbance Units Full Scale). Astfel n
cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de 0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%.
Motivul principal al popularitii acestor detectori este acela c numeroasele substane organice,
anume cele care conin legturi duble (electroni ), respectiv au grefate funciuni organice cu
electroni neparticipani, absorb lumina n UV-VIS. Este vorba de toate hidrocarburile olefinice i
aromatice precum i derivaii tuturor hidrocarburilor cu diferite funciuni organice (=C=O, =C=S,

18

-N-O, -N=N-, -NH2). ntre acestea se includ i numeroasele combinaii de interes biologic ca
enzime, acizi nucleici etc. Un mare avantaj al acestor detectori este faptul c sunt insensibili la
micile variaii de debit i temperatur. Celula de detecie face parte dintr-un spectrofotometru i
are un volum extrem de mic, de 8-10l, respectiv un diametru interior de 1mm la o lungime a
celulei de10 mm. (Al. Crian, 1983).
Se pot distinge i n cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori
Detectorii monocromatici au fost primii utilizai, fiind mai ieftini deoarece lucreaz doar la o
lungime de und. Modelul cel mai rspndit se compune dintr-o surs luminoas cu deuteriu sau
cu vapori de mercur, un monocromator care separ un domeniu ngust (de ex. linia 254nm a
mercurului) i un detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezentat n fig.
2.9.Detectorii policromatici mai frecvent utilizai n cromatografele HPLC moderne permit i
selectarea lungimii de und la care se lucreaz, dar chiar pot nregistra electronic absorbana
celulei la mai multe lungimi de und simultan. Acest mod de lucru d o mai mare siguran
analizei, n sensul c permite stabilirea puritii, adic dac picul constituie un semnal dat de o
singur substan sau de un amestec (ceea ce se cunoate sub numele de stabilirea puritii
picului). Aceti detectori conin celula amintit montat ntr-un spectrofotometru cu reea de
diode.
Surs MonocromatorCelulnregistrator
Fig. 2.9. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric (hplc.chem.shu.edu, 2012)

2.6.2 Detectori refractometrici


Detectorii refractometrici, au la baz legile refraciei luminii. Principiul de funcionare
al acestor detectori are la baz legea lui Fresnel - de transmitere a luminii prin medii transparente
avnd un indicele de refracie dat. Astfel, un fascicul luminos (mono sau policomponent) trece
printr-o celul cu dou compartimente unul coninnd doar eluentul pur iar cellalt faza mobil
care prsete coloana .Diferena dintre indicii de refracie pentru soluiile aflate n cele dou
compartimente vor fi practic nule, atta timp ct din coloan iese doar eluentul pur, dar diferit n
momentul n care n eluent mai apare un component separat - antrenat de ctre eluent din coloan.
n momentul ieirii unui component are loc o deplasare a poziiei fascicolului emergent din
detector - deplasare care este proporional cu concentraia i sesizat de ctre detectorul D. n
cazul acestui tip de detector sunt posibile i picuri negative, ceea ce face necesar aducerea liniei
de baz la jumtatea scalei lucru care, pe lng sensibilitatea relativ cobort (10 -5molL-1),
constituie un dezavantaj. Acest detector este universal, dar nu poate fi utilizat n cromatografia cu
gradieni deoarece, n acest caz, compoziia eluentului la intrarea n coloan difer de cea de la
ieire i se modific continuu, neexistnd o linie de baz. De asemenea fenomenul este foarte
sensibil la temperatur (0.0001C) fiind necesar termostatarea, att a detectorului ct i a
coloanei. (Luca Al. .a., 1983).

19

2.6.3 Ali detectori


Pe lng cei amintii, mai rspndii, n practica analitic se mai ntlnesc i ali
detectori prezentai schematic n tabelul 2.4. Dintre acetia o meniune special trebuie fcut
pentru cei bazai pe spectrometria de mas i FT-IR , care au permis determinri calitative uneori
imposibil de realizat prin alte variante de detecie n lipsa etaloanelor cunoscute. Aceti detectori
permit ca, pe baza unei baze de date format din spectre cunoscute, s se obin compuii cei mai
apropiai (3 dintre acetia), din toate substanele chimice cunoscute, care ar putea fi prezeni n
prob. (lori.academicdirect, 2012)

Tabelul 2.4. Ali detectori utilizai n LC (lori.academicdirect, 2012)


Detectori LC
Fluorimetrici
Electrochimici
(Amperometrici)

Limita de
detecie
1-10pg

Caracteristici
Sensibilitate 10-10M
Este
necesar
uneori
derivatizarea
Sensibilitate 10-10M
Compui
oxidabili
sau
reductibili
Necesare coloane capilare
Necesar pulverizarea
Pre de cost ridicat
Pre de cost ridicat
Adecvai
pentru
macromolecule
Pentru substane optic active
Doar pentru ioni sau compui
ionizabili
-

10pg = 1ng

Bazai pe Spectrometria de 100pg - 1ng


Mas
FT-IR
Difuzia luminii

1g
10g

Activitate optic
Electrozi ion selectivi

1ng
10ng

Fotoionizare

1pg - 1ng

nainte de separarea componentelor studiate, probele trebuie s fie pregtite astfel


nct acestea sunt ntr-o form adecvat pentru separare i detectare. Uneori, diluie i/sau
filtrarea simpla este suficient. Multe metode care utilizeaz diferite proprieti fizice pot fi
aplicate pentru a izola compui de interes. Una dintre tehnicile cele mai frecvent utilizate pentru
izolarea componentelor nevolatile este technical de extracie. n funcie de etapa de matricea
probei care conine compuii de interes, extracie lichid-lichid sau solid-lichid poate fi folosita
(tabelul 2.5) . (S. Gocan, 2002).

20

Tabelul 2.5 Detectoare folosite in cromatografie de lichide de performanta nalta (S.


Gocan,2002).
Limita
Detectoare
detectoarelor
Detector Indicele de refracie (RI) - foloseste cabilitatea compuilor de a indoi
sau a refracta lumina
~10-100ng
Detectro de luminia difuzat (LS) sau detector de lumin- difuzat
evaporatoare (ELS) - msoar lumina difuzat de particule ntr-o soluie sau,
dup nebulizare ntr-un tub nclzit naintea celulelor de detectare.

Detector ultra violet (UV) vizibil - foloseste capacitatea compuilor de a


absorbi lumina.
Detector de lungime de und fix - msoara la o lungime de und, de obicei,
254 nm
Detector de lungime de und variabil - msoar la o lungime de und o dat,
folosind game largi ale lungimi de und
Detector de raza foto diod (PDA) - creeaz spectrul UV i / sau spectrul
vizibil n intervale facultative de lungimi de und simultan, adecvate pentru
identificarea unor compui (n primul rnd de carotenoizi)
~0.1 ng
Detector electrochimic masoara compui care trec prin oxidare sau reactii de
reducere care trec prin electrozi de potenial electric diferit
~0.01-0.001 ng
Detector de conductivitate - masoara conductivitatea de compui ntr-o soluie
Detector fluorescent msoara compui care absorb lumina apoi re-emit la o
anumita lungime de und
Detector de spectrometrie de mas (MS) - masoara compui ionizati, care
trece printr-un analizor de mas i detecteaz curentul de ioni; creeaz
spectrul MS ai compuilor analizati; este una dintre metodele cele mai
potrivite de identificare a compuilor
Metode de ionizare: impact electronic (EI) - foloseste curent de electroni sau
fascicul de creat n conformitate cu potenial electric ridicat
Ionizare chimic (CI) - foloseste gaz ionizat pentru a elimina electronii din

21

~1-10 ng
~0.01-0.001 ng
~0.1-0.001 ng

compuii, metoda mai putin agresiva


Bombardament atom rapid (FAB) - folosete atomi de xenon accelerat la
viteza mare
Pentru a fraciona o prob dup extracie cu solvent, cromatografia de lichid sau de
extracie n faz solid poate fi utilizat. n tehnica din urm, cartue mici umplute cu sorbeni
particule mici sunt utilizate prin aplicarea solvenilor potriviti pentru simplificarea matricei sau
pentru izolarea componentelor de interes. Un numr mare de absorbani pot fi gsiti n pia, cum
ar fi dioxid de siliciu pe baza de legat-faz sorbeni sau polimeri macroreticular poroase,
adsorbani spum poliuretanic sau rinile de ioni schimbtoare. Avantajele etapei solide de
extracie sunt posibilitatea de mbogire a unui analit foarte diluat, i de economisire a timpului
de automatizare. Derivatizarea compuilor este necesar n HPLC , mai ales pentru a mbunti
reactia detectoarelor. Derivatizare poate fi efectuata nainte de (pre-coloan) sau dup (postcoloan) separare. Reactivii utilizat pentru detectarea vizibila UV ar trebui s conin un grup
cromofor, cu un coeficient mare molar de absorbie. Reactivii trebuie s fie mici i ne-polari, n
scopul de a nu modifica caracteristicile de separare a moleculelor de interes. Grupul cromofor n
structura chimic a moleculei de reactiv este n primul rnd un derivat de un inel de benzen.
Reactivii aplicati n detectarea fluorescente ar trebui s aib o reactie fluorescenta semnificativa.
Derivatele fluorescente sunt utilizate n principal stabilirea de amine i aminoacizi, i n
etichetarea proteinelor i enzimelor sau peptidelor. Unii compui fluorescenti sunt, de asemenea,
utilizati pentru derivatizare de acizi i alcooli. Reactivii utilizati pentru detectarea electrochimic
pot fi gasiti printre cele utilizate n detectarea UV-vizibil i fluorescent. Reactivii de oxidare sunt
favorizati peste cei reductivi, din cauza dificultilor n excluderea de oxigen de la ambele probe
i faza mobil. (Amelio M.,1993).
2.7 Analiza cantitativ
Unul dintre scopurile mai eseniale ale metodelor cromatografice este de a determina
cantitatea de componente ntr-o soluie de prob. Analiza cantitativ se bazeaz pe determinarea
de magnitudine a semnalului detectorului pentru compusii de interes. Semnalul ar trebui s se
schimbe liniar cu cantitatea de compui, i semnalul poate fi msurat ca nlimea sau suprafaa
de un vrf cromatografic. Majoritatea instrumentelor HPLC achiziionate n pia includ
integratori sau computere care pot efectua achiziii i management. Precizie de analiz cantitativ
n HPLC este afectat de mai muli factori, cum ar fi precizia de injectare, precum i procesele de
separare i de detectare. Mai mult, erorile pot proveni, de asemenea, de la metodele de preparare
a probei i de calibrare. Detectoarele genereaza semnale pentru compui diferii cu sensibilitati
diferite, i, prin urmare, curbele de calibrare trebuie s fie elaborate pentru fiecare vrf de interes
separat. n acest caz, cuantificarea se bazeaz pe o comparaie a vrfului acelei zone/nlimea
probei, cu curba de etalonare a unui standard de analit n cauz. Utilizarea standardelor interne
este deosebit de important pentru cuantificarea analizelor de concentraie sczut, i / sau n cazul
n care o gam larg de concentraii de compui este de ateptat n eantion. Erorile datorate
preparararii probelor (extracie, derivatizare) sau injectare pot fi reduse prin aplicarea unui
standard de interior. Pentru a obine rezultate valoroase folosind metoda standard de interior,
vrfuri care sunt complet separate sunt necesare. O condiie esenial pentru un standard de
interior este ca vrful s fie complet separat de alte vrfuri de interes. n al doilea rnd, standardul
de interior ar trebui s scad ntr-o zon goal de cromatograma a probei, i trebuie s fie ct mai
aproape posibil de compuii analizati. Validarea unei metode analitice este o asigurare de analiz
22

precis. Aceasta nseamn c o metod validat este corect, specific, reproductibila i robusta,
peste intervalul specificat n cazul n care proba va fi analizat. (Amelio M., .a.,1993).

Cap III Aplicaii


3.1 Autenticitatea sucurilor de fructe
Autentificarea sucurilor de fructe procesate este frecvent utilizat n prezent n Europa, n
scopul de a detecta falsificarea, n conformitate cu codul de bune practici pentru sucurile de
fructe i legume (Asociaia Industriei de suc i nectaruri din fructe i legume ale Uniunii
Europene, AIJN, 2003 ). Acesta reprezinta o colectie de valori minime i maxime i / sau zone
care precizeaz criteriile de autenticitate n analiza multicomponentilor. (Andrade P.B. .a.,1998)
n Europa, AIJN i mai multe sisteme de auto-control formeaz Sistemul European de
Control de Calitate (EQCS) pentru industria de sucuri de fructe. Obiectivele principale ale
sistemului de control sunt de a asigura o concuren loial i liber, n industria de suc, de a
armoniza activitatea cu interpretarea constant a rezultatelor analitice, precum i pentru a
mbunti sistemul de avertizare de falsificare. (H. Nacu, 2003).
Cu toate acestea, n ciuda tuturor regulilor i reglementelor actuale, posibilitatea de
alterare nu poate fi eliminata din industria alimentar. Diluare cu ap, care este cea mai simpla
metoda de alterare a sucurilor de fructe, a fost folosit de mai muli ani. Avnd n vedere creterea
de informaii cu privire la compoziia chimic a fructelor, metode mai rafinate sunt folosite acum
pentru alterare. Suplimentarea cu sucuri mai ieftine sau cu past de splare i extract de coaja este
o practic sofisticata. Una dintre diferenele de alterare a diferitelor sucuri este n materialul
utilizat pentru sucurile fraudate. Din cauza costului mai mic de concentrat de mere, acesta poate
fi folosit ca un corp strin; n alte situaii, produse de suc de mere pot cdea prad la alterarea cu
un suc mai ieftin (Andrade P.B., .a., 1998).
Lupta mpotriva fraudei necesit cunotine precise i extinse n ceea ce privete
compoziia chimic minora i specifica de fructe sau suc de fructe. Prin urmare, unul din
obiectivele de cercetare este de a studia componentele individuale minore sau grupurile de
componente specifice soiului i / sau specii de materii prime. Una dintre cele mai bune

23

instrumente de analiz pentru acest scop este cromatografia de lichide de inalta performanta. La
data de fata, numerosi compui au fost investigati pentru adecvarea acestora n evaluarea
autenticitatea sucurilor.Acizi organici (n special acid isocitric), componente de zahr i acizi
amino liberi au fost investigate de mai multi lucrtori. Potenialul de compui flavonoide i
carotenoide pentru detectarea fraudei n sucuri a fost deosebit de studiata. Metode chemometrice
n evaluarea de compoziia acestor compui specifice pot oferi un instrument eficient pentru
stabilirea autenticitii produselor din fructe, cu o difereniere de probe n funcie de specie,
origine geografic, etc. (C. Luca, .a., 1983).
3.1.1 Detectarea de zaharuri
O metod de alterare n industria de suc este adugarea de mediu i de sfecl de zahr
invertit de medie sau mare contrentatie sau sirop de porumb cu mult fructoz. Utilizarea acestor
substane naturale pentru fraud nseamn ca metode sofisticate de detectare sunt necesare.
Aplicarea raportului stabil izotop de carbon este metoda cea mai acceptat i eficienta pentru
detectarea de alterare cu astfel de siropuri naturale. Cu toate acestea, mai multe aplicaii de HPLC
sunt utilizate pentru a identifica suplimentelor de zahr n sucurile de fructe.
(academicdirect.org).
Cele mai importante glucide sunt prezente n sucurile de glucoz, fructoz i zaharoz.
Unele fructe, cum ar fi mere, pere, gutui, viine, caise i prune conin alcool, carbohidrati, i
sorbitol. Mai multe coloane sunt disponibile pentru analiza HPLC de reducere a compuilor de
zahr. O coloan de analiz carbohidrati sau coloana de schimb de ioni de legat in cruce cu
calciu permite analiza completa a zaharurilor reductoare menionate mai sus. Investigarea
raportului de reducere de zahr nu ofer ntotdeauna rezultate precise, deoarece reducerea
raporturi de zahr se poate schimba n specii de fructe, n funcie de varietatea lor, maturitatea,
starea n cretere, de origine geografic, etc. (Andrikopoulos N.K. , 2002).
Determinarea raportului de componente de zahr sau al proporiei de zahr i sorbitol
poate duce la succes n determinarea suplimentarii cu ndulcitori . Determinarea de sorbitol n
sucul de produse care n mod natural nu conin sorbitol indic adugarea de alte fructe. De
exemplu, n suc de coacze negre, adaosul de 10% de suc de viine poate fi detectat pe baza
nivelului de sorbitol. Abateri in msuratorile de sorbitol/zaharoa i sorbitol/ raporturi de zahr
totale pot fi folosite pentru a detecta adaosul de suc de pere la sucul de mere. Alterarea de
concentrat de suc de mure i vinuri, cu suc de fructe care contine sorbitol, poate fi, de asemenea,
detectat prin determinarea coninutului de carbohidrai i sorbitol. Alt abordare a acestei
probleme este investigarea i determinarea de oligozaharide din sucul de fructe prin HPLC.
Aceasta pare a fi o metod eficient pentru a indica alterare cu indulcitori nedeclarate. Sucul de
portocale este un exemplu de suc, care este bogat n zaharoz, i, prin urmare, sucurile portocalii
sunt sensibile la adugarea de mediu, inclusiv siropuri invertite de zaharoz. Investigarea
modelelor oligosaccharide de suc de portocale alterat poate duce la identificarea de fraud.
(traducere)

24

Unele oligozaharide, care sunt prezente n concentraii mult mai mari din sfecl de
zahr invertit dect n sucuri, pot fi analizate pe coloana de schimb de anioni umplute cu un tip de
rin de amine cuaternare, dup cum s-a artat de mai multi. Carbohidratii absorb slab n lumin
UV i lumina vizibila. Cu toate acestea, sensibilitatea detectorilor de indice de refractie este n
mod normal, prea mic pentru a detecta compusi minoro, cum ar fi oligozaharide. In mod invers,
un detector de impulsuri amperometric cuplat cu cromatografie de lichid, ofer una dintre cele
mai bune metode de detectare de carbohidrati adugati la sucuri n scopul de alterare. Unele
metode HPLC de analiz de zahr cu pregtirea eantionului sunt prezentate n tabelul 3.1. Dup
cum se indic n tabelul 3.1, profilul oligosaccharide este util n screening-ul sucurilor citrice i
de ananas pentru alterarea potenial. Metodele descrise n Tabelul 3.1 ofer o estimare bun a
adaugarii de sfecl de zahr la sucurile citrice. O limitare a acestor metode este c zaharide
endogene pot interfera cu cele de sfecl de zahr sczut si zahr mediu invertit. Sensibilitatea
ridicat a detectorului a impulsuri amperometrice pot fi, de asemenea, folosite pentru a detecta
adugarea de splri paste enzimei tratate din suc. Fragmentul oligogalacturonide produs din
degradarea pectinei n timpul tratamentului enzimatic poate fi detectat chiar i atunci cnd un
nivel sczut de pulp spala (10%), se adaug la un suc. (Andrade P.B, .a., 1998).
Tabelul 3.1 Metode cromatografice de lichide de nalt performan pentru separare a mono-,
di- i oligozaharide (Andrade P.B. .a 1998).
Zaharuri Pregtirea
Stare de separare HPLC
Detectia
Referint
probei *
e
Rafinoz
Portocale: nici o
Coloana: Supelcosil LC18,
Detector H2O2
1
pregatire probei
isocratic eluie, faza mobil:
sensibil
0.2 mol l-1 Puffer fosfat (pH 6.3) electrochimic,
cuplare cu
enzima-reactor
n cazul n care
H2O2
este produsa din
rafinozei de
galactosidase
Zaharuri
Grapefruit: nici o CarboPac PA1 (Dionex) coloan Detector pulsat
2
reduse
pregatire a probei de schimb de anioni, eluie
amperometric
isocratica, faza mobil: 0,14 mol
l-1 NaOH, temperatura ambiant
Mere, Pere: nici
a) Coloana Du Pont Zorbax de
Detector de
2a, 3b, 4c
o pregatire a
amine cu coloana de paza amine, indicele de
probei
eluie isocratica, faza mobil:
refracie
acetonitril / ap (76/24),
b) Coloan Capcell-Pak-NH2,
eluie isocratica, faza mobil:
acetonitril / ap (80/20),
c ) Coloan CarboPac PA1,
eluie isocratica, faza mobil: 60
mmol l-1 NaOH

25

Oligozaha
ride

Mrul trece prin


cartu C18 SEPPAK activat

Coloana Aminex HPX-87C de


analiza monozaharida cu CarboC, micro-coloana de paza, eluie
isocratica, faza mobil: 200 mg
L-1 Ca(NO3)2

Detector de UVvizibile

Mure si prune:
utilizarea
cationand si
coloane de
schimb de anioni
dupa extracia cu
Grapefruit4,
portocala7,8: prin
educaie i rin
schimbtoare de
anioni i n plus
cartu C18 SepPak

Coloan Aminex HPX-87 de


cationi de schimb n form Ca,
eluie isocratica, faza mobil:
ap deionizat, temperatura
coloanei: 86.9C

Detector de
indicele de
refracie

Dou Coloane CarboPac Pa1 de


schimb de anioni, cu paza7,4,
CarboPac PA1 conectate n
serie8, gradient de eluie, faza
mobil: A: 100 mmol l-1 NaOH.
B: 100 mmol l-1 NaOH
coninand 100 sau 200 mmol
NaOAc, C: 300 mmol L-1
NaOH4,7,8, post-coloan reactiv:
300 mmol NaOH L-1, sistemul
de livrare este utilizat pentru a
reduce derivarea de referin4,7,
introducerea unui ventil de
comutare pentru a devia deeuri
de zaharuri simple8

Detector pulsat
amperometric

4,7,8

Portocala: sucul
este amestecat cu
rin de Celit,
centrifugare,
supernatantul este
eluat
printr-un cartu
C18 SPE, eluentul
este trecut prin
cationi i cartue
de schimb de
conectate n serie

Dou coloane CarboPac Pa1 de


schimb de anioni, cu gardele de
CarboPac PA1 conectate n serie
(supapa de comutarea fost
inclus ntre cele dou coloane
analitice), faza de eluie
isocratica mobil: 300 mmol L-1
NaOH, temperatura: 30 C.

Detector pulsat
amperometric

26

Sucuri de citrice:
trec prin cartu
On-guard H

OligoSucuri de citrice:
galacturon trec prin cartu
ide

Coloan CarboPac PA-100 cu


coloan de paza, gradient de
eluie, faza mobil: A: 2 mmol
de acetat de sodiu la 100 mmol
L-1 NaOH, B: 400 mmol de
acetat de sodiu la 100 mmol L-1
NaOH
coloan cu CarboPac PA-100 de
paza, gradient de eluie, faza
mobil: A: 2 mmol de acetat de
sodiu la 100 mmol L-1 NaOH, B:
800 mmol de acetat de sodiu la
100 mmol L-1 NaOH

Detector pulsat
amperometric

10

Detector pulsat
amperometric

10

3.1.2 Detectarea de acizi


n funcie de specia fructului, acizi organici principali gasiti in fructe sunt: acid tartric
(struguri), acid citric (fructe citrice, caise) i acid malic (mere, pere, gutui, struguri, caise).
Pentru portocale, n funcie de soi, de gradul de maturitate, condiiile climatice, de origine, etc,
nivelurile de acid citric poate varia ntre 7,6 i 11,5 gl -1. n unele cazuri, valorile maxime de acid
citric pot fi depit destul de mult. Acid D-isocitric poate fi gsit n concentraii mici, n cele mai
multe sucuri de fructe, cum ar fi suc de portocale (65-200 mg l -1), suc de grapefruit (140 - 350 mg
mg l-1), suc de lmie (230-500 mg l-1), suc de ananas (80-250 mg l-1), suc de caise (75-200 mg l1)
, suc de rosii (65 -150 mg l-1), suc de coacze negre (160-150 mg l-1) i suc de piersici (30-160
mg l-1). Deoarece acidul D-isocitric nu este folosit ca un corp strin, din cauza costurilor mari de
producie,aceti compui ar putea fi folositi pentru a estima coninutul de fructe de suc din
produse.Raporturile de acid citric i acid isocitric caracterizeaza speciile de fructe enumerate mai
sus, chiar dac valorile se schimba datorita varietatii, originei, etc. ( traducere).
n mere, acidul organicprincipal este L-malic. Acid malic srodus sintetic const din
raceme de amestec D/L . Datorita faptului ca acidul L-malic costa mult mai mult n comparaie cu
amestecul D/L descurajeaz utilizarea de acid L-malic ca adulterant. Prin urmare, msurarea
acidului D-malic este suficient pentru a detecta adugarea ilegala de acid malic sintetic. Un raport
de acid L-malic/ acid malic total sub valoarea de 0,9 indic un suc de mere neautentic. ntr-un
studiu de colaborare facut de 14 laboratoare folosind 10 probe de sucuri de mere, utilizarea
raportului a fost recomandata pentru testarea autenticitatii. n ananas, raportul acidului citric/
acidului L-malic este de aproape 2, i aceast valoare poate fi, prin urmare, utilizata ca un index
de autenticitate a produselor de ananas . Mai multe tipuri de coloana HPLC sunt disponibile
pentru separarea acizilor. Coloana folosita de cele mai multe ori este etapa de suprimare a ionilor
invers. Etapa mobila utilizata pentru separare este de 0,2 M fosfat-amortizor (pH 2.2 - 2.4).
Celelalte tipuri de coloan comune sunt cele umplute cu polimer pe baz de schimb de rin de
ioni. Faza mobil aplicat pentru acest tip de coloane este, de obicei, sunt acizi anorganici (H 2SO4,
H3PO4) de o concentratie de 0,005 mol l-1. Pentru aceste coloane, in pregatirea probelor nu se
implic proceduri complicate de extracie. (wikipedia, 2012).

27

Shui i Leong (2002) au conceput o metod HPLC pentru separarea de acizi i compui
fenolici, n sucurile de fructe ntr-un singur pas de separare (n probele de mere), i a indicat c
metoda ar putea sa fie folosita pentru a evalua autenticitatea de sucuri. ( traducere)
Cu toate acestea, pentru determinarea acidului isocitric, mai multe metode HPLC sunt
descrise n literatura de specialitate. Printre acestea, metoda simpla enzimatic este de preferat n
laboratoarele de analiz, deoarece pregtirea probelor nainte de analiz cromatografic este
foarte complicata pentru alte metode. (Andrade P.B. , .a., 1998).
3.1.3 Detectarea de compui fenolici
Constituenti fenolici sunt metabolii secundari de plante. Ei au un rol important in
aroma i culoarea plantelor, produselor chimice i sunt semnificative componente nutritive.
Compoziia specific i nivelul de compui fenolici pot fi utilizati ca un indicator de suc fructe de
alterare. Ele pot fi mprite n dou grupe majore fenolici acizi i compui conexene, precum i
flavonoide. Acizi fenolici includ instrumentele financiare derivate de la acid cinamic (cum ar fi pcumaric, cafeic, ferulic, clorogenic, p-cumaroylquinic i de acid neochlorogenic) i derivate ale
acidului benzoic (cum ar fi p-hidroxi benzoic, protocatechuic, vanilic i acid galic). "Cinnamics"
apar n natur sub form de ester cu ali compui (de exemplu, ester al acidului cafeic cu acidul
clorogenic sau cu acid quinic), n timp ce "bensoics", apar de obicei n form liber.
Flavonoidele , care sunt n mare parte pigmeni biologici, aparin derivailor fenil ale structurii
benzopyrane (Figura 3.1). (Andrikopoulos N.K. 2002).

28

Fig. 3.1 Structura flavonoizilor (Andrikopoulos N.K. 2002 ).


Aa cum se vede n figura 3.1, structura benzopyrane const din dou inele de benzen
cuplate impreuna printr-un inel heterociclic de ase membri care conin un atom de oxigen.
Principalele grupe de flavonoizi difer n inelele heterociclice. Grupri hidroxil fenolice poat s
aparin la inelul de la pozitia 3, 5, 6, 7, 3 , 4 , si 5 , care poate fi gratuita, metilica sau legata de
zahr. Flavonoidele sunt sintetizate n plante, i compoziia lor variaz n funcie de speciile de
plante Flavanones, flavonols i anthocyanidines sunt grupurile de flavonoizi, care apar mai ales n
forma glycosilated n fructe. Flavonoli glicozide se gsesc n principal n coaja fructelor. Alte
grupuri alte flavonoide care apar pe scar larg n fructe sunt flavan-3-etanoli (catechine),
(procyanidins condensat taninuri), format de polimerizare de flavan-3-etanoli sau / i flavan-3 ,4diolilor.Speciile de plante (chiar cultivari) au fiecare o compoziie caracteristic de flavonoide,
care este la fel de specific ca o amprent digital i, prin urmare, este potrivita pentru studiile
29

chemotaxonomic. Aceste grupuri de componente pot fi utilizate n teste de autenticitate, n ciuda


mai multor componentilor care nu sunt nc identificati. (Andrade P.B. , s.a., 1998).
3.2 Fructe citrice
Glicozidele flavanone sunt cele mai abundente n citricele flavonoide. Compnentele
de zahr sunt mono-sau di-zaharide de ramnose i / sau glucoz . Flavonele polymethoxylated
pot fi gsite cu distribuii specifice n citrice, n special n partea de flavedo din fructe.
Glicozidele flavanone i flavonele polymethoxylated care au fost identificate n fructe citrice sunt
prezentate n tabelul 3.2. Glicozidele flavanone pot fi determinate prin diferite metode analitice,
dintre care HPLC este una dintre cele mai eficiente pentru separarea i determinarea cantitativ a
acestora. Procedura originala a fost dezvoltata de Fisher i Wheaton (1976), care au angajat
coloan C18 cu faz invers de ap i de eluare a acetonitril isocratice. Recent, aceasta faza
mobil a fost modificata cu ali solveni de volume mici, pentru a permite separarea de glicozide
flavanone ntr-un timp rezonabil. Tabelul 3.3 rezum unele metode cromatografice cu pregtirea
probelor. Detectare de compui efectuate cu metoda HPLC este aproape ntotdeauna de detecie
UV la 260-283 nm. n portocale dulci, glicozidele flavanone majoree sunt hesperidina i
narirutin. Hesperidina pot fi gsite n cea mai mare cantitate. Deoarece hesperidina este insolubil,
el poate fi gsit n sucuri, n form de suspensie fina. Modelele flavanone glicozide n portocale i
mandarine sunt similare. Grapefruitul contine hesperidina, narirutin, naringin i neohesperidinei;
cu toate acestea, cantitatea de hesperidina i neohesperidinei este foarte mic. Naringin i
neohesperidinei apar rar sau nu poat fi detectate n suc de portocale. Diferenele n compoziia de
glicozide flavanone dintre portocale ofer un instrument pentru detectarea de adaosul de suc de
grapefruit la sucul de portocale. ntr-un alt studiu de colaborare, de ctre 15 laboratoare, s-a
stabilit c determinarea de naringin i neohesperidinei n suc de portocale, metoda de HPLC este
o metod fiabil pentru detectarea prezenei de suc de grepfrut n sucul de portocale . (Andrade
P.B., 1998).
Tabelul 3.2 Flavonoidele din unele specii de citrice i hibrizi (Andrade P.B. , .a , 1998) .
(Poli) flavone methoxylated,
flavone

Flavanone glicozide

Sucuri Citirice

Didymin

Clementine (7), grapefruit


(2,9), lamaie (9), mandarine
(4), portocala (2,4,7),
ortanique (7), satsuma (7),
portocala acra (4), tangelo (4),
tangor (2,4)

Eriocitrin

Grapefruit (9), lamaie (9),


mandarine (4), portocala (4),
portocala acra (4),
tangelo (4), tangor (4)

Hesperidin

Clementine (7), grapefruit


(3,2,9), lamaie (6,9),
mandarine (3,4,6), portocala

30

(3,2,4,6,7), ortanique (7),


pummelo (6), satsuma (7),
tangelo (3,4),
tangor (3,2,4)
Naringin

Grapefruit (1,3,2,9), lamaie


(6,9), mandarine (6), portocala
(3,4,6), pummelo
(6), acra portocala (3,4),
tangelo (3,4)

Narirutin

Clementine (7), grapefruit


(1,3,2,9), lamaie (9),
mandarine (4), portocala
(3,2,4,7), ortanique (7),
pummelo (3), satsuma (7),
portocala acra (4),
tangelo (3,4), tangor (3,2,4)

Neoeriocitrin

Grapefruit (9), portocala (4),


portocala acra (4), tangelo (4)
Grapefruit (2), lamaie (6),
mandarine (6), pummelo (6),
portocala (6), portocala acra
(4), tangelo (4)

Neohesperidin

Poncirin

Grapefruit (2,9)
Portocala (8)
Lamaie (6), mandarine (6),
portocala (6), ortanique (6),
pummelo (6)
Clementine (7), portocala
(5,7), ortanique (7), satsuma
(7), tangelo (5)
Portocala (2), tangor (2)

Apigenin * -7-O glucoside


Diosmetin-7-O rutinoside
(diosmin)
Heptamethoxyfl avone
Hexamethoxyfl avone
Hexamethyl-O-gossypetin

Clementine (7), portocala (7),


ortanique (7), satsuma (7)

Hexamethyl-O-quercetagetin

Clementine (7), portocala (7),


ortanique (7), satsuma (7)
Clementine (7), portocala (7),
ortanique (7), satsuma (7)
Lamaie (6), mandarine (6),
portocala (6), ortanique (6)
Portocala (8)

Isosinensetin
Luteolin *
Luteolin * -7-O-glucoside

31

Nobiletin

Clementine (7), portocala


(2,5,7), ortanique (7), tangelo
(5), tangor (2)

Scutellarein* and
heptamethoxyfl avone

Portocala (2), tangor (2)

Sinensetin

Clementine (7), lamaie (6),


portocala (2,5,6,7), ortanique
(7,6), pummelo (6),
tangelo (5), tangor (2)

Tangeretin

Clementine (7), portocala


(2,5,7), ortanique (7), tangor
(2), tangelo (5)

Tetramethyl-O-isoscutellearin

Clementine (7), ortanique (7)

Tetramethyl-O-scutellarein

Clementine (7), portocala


(5,7), ortanique (7), tangelo
(epi-), mesocarp (5)

Tabel 3.3 Separarea HPLC a glicozidelor flavonoide i a flavonilor polymethoxylati


(traducere)
Componente
Pregtirea probei
Separarea HPLC
Referine
Extracia sucului cu benzen de
Coloana: Novapak RP C18,
trei ori, centrifugarea, separarea
gradientul de eluare, faza
stratului de benzen, uscarea sub
mobil:A: (84/16), B: apa/
N2 la 40C, dizolvarea
acetonitril/ tetrahidrofuran
PMF
(42/42/16), A/B de la 100/0 la
1, 2, 3, 4
0/100, temperatura: 35C,
detector PDA:340 nm.
Extracia de suc cu benzen,
Coloana: Luna II C18,
eluia de FG si FMF cu
gradientul de eluie, faza
ap/acetonitril (4/6) pe un pachet mobil: A: apa/ tetrahidrofuran
C-18 Sep de cartue active +
(98.75/1.25), pH: 3,5 cu H3 PO
standarde interne
4, B: acetonitril/
FMF i FG
tetrahidrofuran (98.75/1.25),
5
A/B de la 100/0 la 30/70,
temperatura mediului ambiant,
detectorul PDA: 280 nm(FGS),
330 nm (FMF)
Diluarea probelor de suc cu
Coloana: C18 cu precoloana
dimetilformamida, introducerea
din aceeai rin, gradientul

32

PMF i FG

de eluie, faza mobil: A:


acetonitril, B: apa/ acid acetic
(96/4), A/B de la 0/100 la
70/30, detectorul PDA: 280 nm
(FG), 330 nm (PMF)
Coloana: Lichrospher R 100RP
18, gradientul de eluie, faza
mobil: A: 0.5% acid acetic n
ap, B: 0.5% acid acetic n
soluie ap-acetonitril (50/50),
A/B de la 95/5 la 0/100,
temperatura mediului ambiant,
detectorul PDA: 280nm, 330
nm

n baie de ap la 90C,
centrifugare

Glicozide
flavonoide

Coloana: Nucleosil C18, eluie


izocratic, faza mobil: apa/
acetonitril/ tetrahydrofuran/
acid acetic (80/16/3/1) detector
PDA: 280 nm
Coloana: Bondapack C18,
izocratic, faza mobil: apa/
acetonitril (80/20), detector
PDA: 280 nm

Nu se pregtete filtrarea
probelor

Glicozide
flavonoide

Glicozide
flavonoide

Coloana: Supelco C18 cu


Speroi-5 C-18 pre-coloana,
eluie izocratic, faza mobil:
apa/ acetonitril/ acid acetic
glacial (79.5/20/0.5), detector
PDA: 280nm

Centrifugare

Eantion + standard intern


(rhoifolin) de centrifugare,
extracia solidelor cu metanol de
dou ori, centrifugarea,
colectarea de supernatani,
diluare
Eantion + standard intern
(rhoifolin) + metanol, nclzire
la 55 C n baie de ap,
centrifugare, extraia de solide
cu metanol n baie de ap,

33

Coloana: Alltima C18, eluie


izocratic, faza mobil: apa/
acetonitril/ 2-propanol/ acid
formic 158/23/19/0.2, detector
PDA: 283 nm, 335 nm

10

11

centrifugare, combinarea
supernatanilor, diluare, filtrare
Eantion uscat la rece + 62.5%
metanol coninnd BHA (tertbutyl-4-hidroxianysol),
sedimentare, diluare cu ap

Punerea sucului de fructe n baie


de ap fiart, centrifugare

Punerea sucului pe cartuul SepPack C-18, spalarea cartuului


cu 10% metanol, eluia
glicozidelor flavonoide cu
metanol

Coloana: Purospher RP C 18,


gradient de eluie, faza mobil:
A: apa cu 1% acid formic, B:
100% acetonitril, A/B de la
95/5 la 40/60, detectoare: PDA
din compui cu UV maxime,
spectometru de mas
Coloana: Novapak RP C18,
gradient de eluie, faza mobil:
A: 80 ml 0.25 mol-1 K2HPO4 +
400l 80% H3PO4 diluat cu 2l
ap; B: 40 ml 0.25 mol l-1
K2HPO4 + 200 l 85% H3PO4 +
507.65 g acetonotril diluat cu 1
l ap , A/B de la 100/0 la
0/100, detectorul PDA: 280
nm.
Coloana: Zorbax ODS C18,
eluie izocratic, faza mobil:
apa/ acetonitril/ acid acetic
glacial (79.5/20/0.5), detector:
lungimea de und fix UVvizibil: 280 nm

12

4, 13,
14,15

16

Deoarece exist mai multe soiuri care conin naringin i poae fi n mod legal n suc de
portocale comercial, utilizarea de naringin numai pentru a detecta prezena de suc de grapefruit
este n mod clar imposibil. Cu toate acestea, raportul naringin / neohesperidinei poate fi folosit
pentru a diferenia sucuri de portocale, care pot include suc de grapefruit adugat sau alte
naringin care conin soiuri de citrice. Adaosul de Citrus aurantium i / sau C. bergamia la
portocale (C. sinensis), poate fi detectat prin prezena de naringin i lipsa de prezen a unor alte
flavonoide specifice. Adaosul de tangerine (mandarine), sau un hibrid de portocale i tangerine
poate fi stabilit de un raport sczut de hesperidina / narirutin . (traducere)
Compoziia de flavone polymethoxilate n sucurile de citrice difer foarte
mult.Variaia specific a modelului flavone polymethoxilated prevede un alt instrument de
difereniere de sucuri citrice. Ooghe .a. (1994) au stabilit, n studiul lor, care determinri de
glicozide flavanone i flavone polymethoxylated sunt tehnici complementare. Folosind aceste
dou grupuri de compui, mpreun cu diferite modele, ofer o ans bun de a detecta alterarea
sucurilor de portocale.Compoziia de flavoni polimetoxilai n sucurile de citrice difer foarte
mult. Variaia specific a flavonilor polimetaxilai prevede un alt instrument pentru diferenierea
sucurilor citrice.

34

Ooghe .a ., 1994 au stabilit prin studiul lor c determinrile glicozidelor flavonoide i


flavonilor polimetaxilai sunt tehnici complementare. Folosind aceste dou grupuri de
componente mpreun cu modele variate ofer o ans bun de detectare a alterrii din sucurile
citrice. ( traducere)
3.3 Alte fructe
Pe lang fructele citrice, alte fructe studiate include mrul, prul, gutuie, prune, caise,
piersici i fructe de pdure. Tabelul 3.4 enumer compuii fenolici din aceste fructe.Aceti
compui fenolici sunt deasemenea specifici amprente de detectare a alterrii din sucurile
acestor fructe. Exist unul sau dou componente cheie printre fenoli specific unui singur tip de
fructe. Florizina (Phloretin 2'-glucozide), de exemplu, apare numai la mr n timp ce glicozidele
isorhamnetin i arbutin (glicozida hidrochinina) sunt specifice perelor. Determinarea acestor
componente este un instrument util pentru detectarea alterrii. Multe metode HPLC pot fi
utilizate pentru separarea i determinarea compuilor fenolici, dup cum este raportat n
literatura de specialitate.

35

Tabel 3.4 Compui fenolici ai fructelor i/sau al produselor din fructe (Andrade , P.B., 1998).
Acizi fenolici si derivati, aldehide

Specii de frute
Referine
Acid cafeic
Isomerii acidului
clorogenic
4-O-acid
cafeoylquinic
5-O-acid
cafeoylquinic
Ester cafeoyl
Acid caftaric
Acid cinamic
Acid clorogenic
Acid p-coumaric
Ester coumariol (din
acid tartaric)
Acid
coumaroylquinic
Acid coutaric
3,4- aldehida
dihidroxibenzoic
Acid elagic
Derivaii acidului
elagic
Acid ferulic
Ester feruloyl(din
acid tartaric)
Glucoza feruloyl
Acid galic
2-S- acid
glutathionylcaftaric
Acid phidroxibenzoic
Acid sinapic
Aldehida siringica
Acid vanilic
Aldehida vanilica

Mere
1

2
+

4
+

5
+

10

6
+

12
+

Pere
1

2
+

5
+

8
+

6
+

12
+

Gutui
1

6
+

Caise

Piersici

Ananas

Portocale

Cpuni

5
+

5
+

12
+

12
+

Struguri
albi
5
5
+
+

4
+

+
+

+
+

+
+

12
+

11

11

Zmeur
12
+

+
+

+
+

+
+

+
+
+

+
+

+
+
+

+
+

+
+

+
+

+
+

+
+

+
+

+
+

t
+
+

+
+

+
+

+
+

n
t

+
+
+

+
+

+
+

+
+
+

Referine
aesculetin

5
+

10

12

Pere
1

12

Gutui
1

Struguri
albi
5
5
+

Caise

Piersici

Ananas

Portocale

Cpuni

4
+

5
t

12

12

scopoletin

Hidrochinina

(+) - catechin
Isomeri catechincatechin-gallate
Catechin-gallate
(-) -epicatechin
(-) -epigallocatechin
(-) epigallocatechin
gallate
Procyanidina B1
Procyanidina B2
Procyanidina B3
Procyanidina B4
Floretin 2'
glucozide
(phloridzin)
Floretin 2'
xylosilgalactoside
Floretin 2'
xylosilglucozide
Hidrochininaglucozida (arbutin)

Glicozide flavonol

Dihidrochalcones

Catechine / procianidine cumariniceAnticoagulante

Tabel 3.4 Compui fenolici ai fructelor i/sau al produselor din fructe (Continuare)
Specii de fructe
Mere

2,3-dihidroquecetin rhamnoside
2,3-dihidrokempferol
- rhamnoside
Glucozidaisorhamnetin
Glucozida-

+
+
+

+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+

+
+

+
+
+
+

36

12

11

11

Zmeur
12

isorhamnetin
Kemferol
3-O-rutinozide
kemferol
3-O-glucozide
kemferol glicozid
miricetin
3-O-ramnoside
quercetin

+
+

+
+

37

+
+

Glicozide flavonol
Flavonoli

3-O-galactozide
quercetin 3-Oglucozide quercetin
3-O-glucuronide
quercetin
3-O-ramnoside
quercetin
3-O-xyloside
quercetin
3-O-arabinoside
quercetin glicozide
quercetin
3-O-rutinoside
(rutin)
kemferol

+
+

+
+

+
+

+
+

myricetin
quercetin

+
+

+
+

+
+

t, urma; bd, hidroxil benzoic acid derivativ; n, nedetectate n toate variantele.


1, Andrade et al ., 1998 ; 2, Escarpa and Gonzalez, 1999 ; 3, Shui and Leong, 2002 ; 4, Dragovic-Uzelac et al ., 2005 ; 5, de Simone et al ., 1992 ; 6, McRae et al ., 1990 ; 7, Thavarajah and
Low, 2006 ; 8, Tanrioven and Eksi, 2005 ; 9, Silva et al ., 2000 ; 10, Spanos and Wrolstad, 1992 ; 11, Versari et al ., 1997 ; 12, Mattila et al ., 2006 .

Cea mai comun utilizare a metodelor este ( tabelul 3.5) aceea de a studiat compoziia
chimic a merelor, datorit popularitii sale i a preului sczut i deoarece piureul de mere sau
sucul este cel mai favorizat alterrii naturale fa de alte sucuri de fructe. Folosind detectoarele
colriometrice ale matricei de elctrozi, Sontag i Bernwieser (1994) au concluzionat ca
compoziiile fenolice ale merelor i perelor sunt foarte simple dar diferite, i prin urmare este
posibil detectarea alterrii nectarului de pere cu suc de mere pn la nivelul de 1%. Dragovic
.a , (2005) au dovedid n studiul lor c adaosul piureului de mere la piureul de caise n timpul
procesrii nectarurilor de caise i dulceurilor poate fi uor detectat prin prezena Phloretin 2'glucozide i a Phloretin 2'-xiloglucozide. Phloretin 2'-xiloglucozide poate fi folosit n particular
ca un marker n detectarea alterrii nectarului de caise ce conin 10% din piureul de mere. n
dulceurile de caise se poate detecta minim 20% din piureul de mere. n anumite situaii sucul de
mere poate fi alterat cu suc de pere. Deoarece arbutinul i glicozidele isorhamnetin sunt
caracteristice sucului de pere, pot fi folosite ca indicatori ai alterrii sucului de mere cu suc de
pere. Silva .a .(2000) au studiat cteva eantioane de gemuri procesate de gutui care conineau
i arbutin i, au sugerat c aceste eantioane de dulceuri au fost alterate cu piure de pere.
(Andrade P.B. , .a , 1998).
Tabel 3.5 Separarea HPLC a compusilor fenolici din esantioanele fructelor ( traducere)
Fructe
Prepararea
Separarea HPLC
Detectarea
esantioanelor
Mar, gutui, para,
Evaporarea la
Coloana:
Detector PDA
pruna, piersici,
uscare a butanolului Spherisorb ODS2,
280, 350 nm
portocale acre,
extras din
gradient de elutie,
caise, capsuni
esantioane, dilutia
faza mobila: A:
cu apa acida (pH2, apa/acid formic
HCI), filtrarea,
(19/1), B: metanol,
trecand prin
A/B de la 95/5 la
Amberlie XAD-2,
20/80
dupa spalarea
coloana:
coloanei cu apa
Lichrochart100 RP
(pH2 cu HCI) elutie 18, gradient de
38

Referinte

1, 2, 3

fenolica fractie cu
metanol, evaporare,
re-dizolvare

Mar, para

Mar, para, gutuie

Mere, pere,
portocale, piersici,
caise, struguri,

Izolarea
flavonoidelor:
extragerea
esantioanelor cu
metanol (ce contin
1% BHT) in
intuneric, hidroliza
de glicozide:
extragerea
esantioanelor de
acetat de etil,
hidroliza cu 2 mol lHCI, curatat cu
Sep-Pack C18,
izolarea
procianidelor:
elutia diluata a
probelor pe
Sephadex LH-20 cu
20% metanol
Centrifugarea
sucului +
standardul intern
(etil syringate), sau
extragerea sucului
cu metanol , elutia
compusilor
fenoliciprin coloana
de poliamide cu
metanol, evaporare,
re-dizolvare

elutie, faza mobila:


A: apa/ acid formic
(95/5), B: metanol,
A/B (95/5) de la
A/B 95/5 la 20/80
Coloana: Nucleosil Detector PDA,
120, C18, gradient
280 nm
de elutie, faza
mobila: A: 0,01
mol l-1 acid
fosforic, B: metanol
sau acetonitril, A/B
de la 95/5 la 0/100
sau de la 98/2 la
65/35

Coloana:
Lichrospher100
C18, elutie
isocratica, faza
mobila:
metanol/acid acetic
glacial/ apa
(35/2/63)temperatur
a coloanei: 32 C
coloana: Hypersil
ODS, C18, gradient
de elutie sau elutie
isocratica, faza
mobila: A: acid
acetic 1%, B:
acetonitril, A/B
(81/19) sau A/B de
la 85/15 la 75/25
Concentratia
Coloana: Nova-Pak
sucului, extractia cu C18, gradient de
eter etilic, apoi cu
elutie pentru fenolii

39

Detector matrice
pentru electrodul
colorimetric
detector PDA,
284 nm
6, 5, 8

Detector PDA ,
280nm, 340 nm

ananas

acetat de etil,
evaporarea dupa
punerea in comun a
fractiilor

cu greutata
moleculara mica si
flavan-3-ols,
faza mobila: A: 2%
acid acetic, B:
metanol/ acid
acetic/ apa
(30/2/68), A/B de la 254 nm, 365 nm
100/0 la 15/85,
elutie isocratica
pentru glicozidele
flavanol,
faza mobila: A: 2,5
% acid acetic, B:
tetrahidrofuran/apa/
acid acetic
(50/47.5/2.5), A/B
(65/35), elutie
isocratica pentru
agliconii flavanol,
faza mobila:
apa/metanol/acid
acetic
(57.5/37.5/5/5)

Para, strugure

Para: izolarea
fenolilor folosind
C18 Sep-Pak,
evaporarea, redizolvarea,
strugure: filtrare
pentru acizi fenolici
si glicozide
flavonol, izolarea
procianidelor
folosind Sephadex
LH-20, evaporare,
re-dizolvare.

Coloana: Supelcosil Detector PDA,


LC-18 cu ODS
280 nm, 320 nm
coloana de paza,
gradient de elutie,
faza mobila: A:
0,07 mol l-1
KH2PO4 (pH: 2.5
cu acid fosforic), B:
metanol, A/B de la
98/2 la 60/40

9
10

3.3.1 Detectarea de antociani


Antocianii sunt pigmeni de tip flavonoid responsabili pentru culoarea de la rou la
albastru-nchis a fructelor, florilor i legumelor. Ele sunt glicozide de antocianidine.
Antocianinele sunt prezente n coninut ridicat n fructe de pdure, cpuni, zmeur, mure,
coacaze negre i roii. Figura 3.2 prezint structura antocianidelor, cu cea mai frecvent

40

combinaie de grupuri secundare i numele lor. Exist un interes special n antocianii naturali din
industria alimentar deoarece ei pot fi folosii ca alternativ la coloranii sintetici. Exist cteva
metode analitice disponibile n literatura de specialitate bazate pe structura i concentraia
antocianidelor n fructe, dar informaii cu privire la astfel de metode sunt incomplete, n parte din
cauza limitrii n metodele de analiz. ( traducere)

Fig.3.2. Structura anticianizilor (C. Luca, .a, 1983).


Wu i Prior (2005) au efectuat un studiu sistematic pentru a identifica i caracteriza
antocianinii n diverse fructe de pdure (afine, cpuni, mure, zmeur), prune, piersici, ciree,
mere i nectarine. Codul de bune practici (AIJN, 2003) definete protocoale pentru determinarea
HPLC modelelor de antociani folosind calistephine ca standard intern. Compoziia acestor acizi
precum compuii ce ofer anumite amprente pe cromatograma HPLC, n acelai mod ca i
compuii fenolici despre care am discutat mai sus. ntruct condiiile de prelucrare i depozitare
afecteaz compoziia de antociani, acestea pot fi utilizate ca markeri pentru a stabilii
autenticitatea produselor din fructe . (C. Luca, .a, 1983).
3.3.2 Detectarea de carotenoizi
Alt grup de pigmeni distribuii pe scar larg n rndul organismelor vii sunt
carotenoizii. Carotenoizii sunt sintetizai numai n plante i se crede c animalele nu sunt
capabile s sintetizeze carotenoizi, n afar de unele specii de bacterii. Culoarea fructelor citrice
se datoreaz n mare parte carotenoidelor, care sunt galbene pn la roii. Carotenoidele pot fi
distruse n timpul prelucrrii i, prin urmare, coloranii pot fi adugai produselor din sucuri
pentru mbuntirea culorii lor finale sau mascarea deficienelor . Cei mai comuni aditivi sunt caroten si -apo-8'-carotenal, licopen sau extracte naturale carotenoide cum sunt florile de
glbenele, boia de ardei , extract de coaj de citrice sau suc de mandarine sau tangerine. Adaosul
extractului de mandarine sau tangerine este permis pn la 10% n sucul de portocale, n unele
ri, dar este interzis n Europa. Extrastul de boia de ardei este folosit pentru colorarea buturilor

41

de portocale, n Europa. Muli cercettori au studiat profilurile carotenoidelor din citrice folosind
HPLC. Tabelul 3.6 rezum condiiile de pregtire a eantioanelor i de separare HPLC n aceste
studii. Dintre toi carotenoizii prezeni n sucul de portocale, -cryptoxantin are cele mai mari
concentraii. Marea majoritate a carotenoidelor din sucul de portocale care conin grupuri de OH
pot forma esteri acizi grai, cum ar fi acizii lauric, miristic i palmitic. Concentraia
carotenoizilor individuali depinde n mod semnificativ de soiul fructului i originea geografic.
(Andrade P.B. , .a , 1998).
ntr-un studiu realizat de Philip .a. (1989) s-a stabilit c raportul calculat dintre esterii
criptoxantin i diesterii luteina ar putea fi utilizat pentru a detecta adaosul de suc de tangerine n
sucul de portocale la nivelul peste 25%. Folosind aceast metod, adugarea carotenoidelor
sintetice -caroten si -apo-8'-carotenal ar putea fi detectate la nivel de peste 5 mg kg -1 n
concentratul de suc de portocale. n plus, Pan .a. (2002) pot detecta adaosul de 100g kg-1 tangelo
la sucul de portocale pe baza raportului ntre flavonii polimetaxilati i carotenoizi, analiza
canonic de discriminare. Separarea HPLC a carotenoidelor din sucul fructelor citrice se
realizeaz conform tabelului 3.6. ( traducere)
Tabelul 3.6 Separarea HPLC a carotenoidelor din sucul fructelor citrice (traducere).
Pregtirea eantioanelor
Separarea HPLC
Referine
Omogenizarea probelor cu metanol,
Coloana: Waters Resolve C18 cu
filtrarea, extragerea rezidurilor cu
coloana de pz din aceeai rin,
aceton, adaosul de 10% de HCI
gradient de eluie, faza mobil: A:
metanolic combinat filtrat, extracie
metanol, B: acetat de etil, A/B de la
1
cu eter de petrol, evaporarea,
100/0 la (0/100), detector: lungime de
dizolvarea rezidurilor n aceton
und variabil detector de radiaii UV,
465 nm
Precipitaii de suc cu soluie apoas
Coloana: YMC C30 nelimitat, gradient
de ZnSO4H2O + K4 [Fe(CN6)]3H2O,
de eluie, faza mobil:A: eter metil-tertcentrifugare, extracie de precipitat cu butyl, B: metanol, C: apa, A/B/C de la
aceton, extracie de supernatant cu
5/90/5 la 50/50/0; detector PDA,290,
eter de petrol, evaporare de petrol,
350, 430, 486 nm
2, 3
reziduri de hidroliz cu 10% metanol
KOH, extracie de carotenoizi cu eter
etilic, evaporare. Dizolvare de
reziduri.
Extracia de suc cu acetat de etil ce
Coloana: Vydac 201TP54 C18 cu
conine BHT, evaporare, dizolvare
coloana de pz Alltima C18, eluie
isocratic, faza mobil:
acetonitril/metanol/1,2-diclormetan
(30/35/5) cu 0,1% BHT, 0,1% amin
4
trietil, i 0,05 mol acetat de amoniu,
detector: detector de scanare a spectrului
de focus, 450 nm
Centrifugarea sucului, extracia de
Coloana: Du Pont Zorbax ODS, gradient
dou ori a rezidurilor cu metanol,
de eluie, faza mobil: acetonitril,
hidroliza cu 10% metanol KOH,
clorura de metilen, tetrahidrofuran i
extracia de carotenoizi cu clorur de acetat de etil, detector: detector PDA,
5

42

etilen, evaporare, dizolvare, eantion 465 nm


curat cu C18 coloana de metanol/ apa
95/5 urmat de clorura de metilen
BHT, 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol; PDA, matrice fotodiodic.
1, Philip et al ., 1989 ; 2, Rouseff et al ., 1996; 3, Mouly et al ., 1999b ; 4, Pupin et al ., 1999 ;
5, Fisher and Rouseff, 1986 .

3.4 Autenticitatea vinurilor


Vinul este definit ca o butur fcut din suc fermentat de fructe sau de plante care
conine 10-15% alcool din volumul propriu. n cazul n care o butur nu este produs n acest
fel, ea nu este vin. Autenticitatea vinurilor este n conformitate cu standardele i regulile stabilite;
vinurile sunt deasemenea considerate a fi alterate n cazul n care eticheta de pe sticl nu este
exact.Vinurile aduse ilegal pe pia pot fi alterate alterri ce pot avea loc att nainte ct i dup
fermentare. Vinurile alterate pot include aditivi neautorizai, sau au fost produse prin procese
neautorizate. Metodele de alterare sunt de multe ori similare cu cele folosite la sucurile de fructe,
cum ar fi diluarea cu ap, sau adaosul de zahr, acizi i colorani interzii.Vinul este deasemenea
alterat dac nivelul substanelor autorizate depete limitele specifice.
Pierderile i modificrile din compuii caracteristici n timpul procesului de vinificare
(fermentare, filtrare, clarificare) i n cursul mbtrnirii afecteaz compoziia speciilor chimice
specifice, astfel nct aceasta devine mai simpl i/sau diferit dect cea din sucuri. O
caracteristic important a vinurilor o reprezint originea geografic, care afecteaz foarte mult
savoarea, aroma i gustul. Din acest motiv, originea geografic este considerat a fi un factor
important pe pia. Protecia originii este atribuit doar produselor de nalt calitate i detaliaz
regiunea geografic i/sau factorii subiectivi. Protecia calitii i originii vinurilor sunt strns
legate. Cteva metode HPLC care descriu detectarea zaharurilor i sorbitolului n fructe (Tabel
3.4) pot fi adaptate pentru analizarea vinului. De exemplu, HPLC este un instrument adecvat
pentru determinarea coloranilor artificiali din vinuri. Mai multe componente au fost studiate ca
i compui cheie n diferenierea calitii i/sau varietii. Acidul elagic poate fi privit ca un
compus caracteristic mbtrnirii n butoi a vinului i ar putea deveni un marker de maturitate.
Aldehidele furale, absente n vinul natural, pot fi considerate componente tipice vinurilor din
butoaie . Acidul shikimic poate fi util pentru diferenierea soiurilor de vin rou. ( traducere)
n ultimii ani, utiliznd calculatorul, analiza bazat pe recunoaterea modelului
(analiza componentelor principale, analiza discriminant), tehnicile cromatografice de separare
au devenit instrumente eficiente n testarea autenticitii. Civa muncitori au studiat mai muli
cimpui polifenolici, cum ar fi acizi fenolici i derivai, precum i flavonoide, antociani i
folosind metode HPLC pentru a studia adecvarea lor pentru testarea autenticitii. Se crede c
aceste clase compuse pot fi utilizate pentru clasificarea i diferenierea vinurilor n funcie de
soiul de struguri i/sau de originea geografic, prin metode statistice. O categorie de vinuri o
reprezint vinurile dulci sau de desert, care sunt foarte preuite, uoare i nobile, cu un buchet
plcut. Aceste vinuri sunt produse din struguri infectai cu Botrytis cinerea (putregai nobil). n
condiii meteorologice adecvate, strugurii infectai iau o form ca de stafid, cunoscut n

43

Ungaria cu denumirea de struguri Aszu. Strugurii aszu conin amine biogenice, care apar n
special n timpul infectrii cu Botrytis cinerea. (lori.academicdirect, 2012)
Figura 3.3 reprezint marcarea lotului i lotul de ncrcare a variabilelor (amine
biogenice) i specialitile vinurilor botritizate originare din Ungaria i din strintate. Tokaji
Aszu i esena Tokaji Aszu; vinuri botritizate strine; Vinuri nebotritizate (albe) ungureti;
dezacord, 71%. Variabile: amine i-butil (iBa), necunoscute1 (Unk1), tiramine (Tyr),
necunoscute2 (Unk2), 2-metilbutilamine (2MeBa), agmatine (Agm), necunoscute3 (Unk3), 3metilbutilamine (3MeBa), n-pentilamine (npa), feniletilamine (Phe).
Compoziia de amine biogenice const n primul rnd din amine alifatice primare
specifice vinurilor botritizate. Utilizarea analizei factoriale multivariat (FA) i analiza
discriminantului liniar ,vinurile Tokaji Aszu ar putea fi clasificate i difereniate fa de vinurile
normale i de vinurile din alte origini geografice botritizate . Specificitatea compoziiei
aminelor, care depinde de infecia cu Botrytis cinerea i tehnologia de vinificare, ofer baza
pentru discriminare. (traducere)

Factor secundar

Factor primar
(a) Marcarea lotului

Factor secundar

Factor primar

44

(b) Lot de incarcare


Fig. 3.3 Marcarea lotului i lotul de ncrcare a variabilelor (H. Nacu, 2003).
O metod grafic simpl i alternativa pentru difereniere este prezentat n Figura 3.4, care
ofer rezultate similare pentru diferenierea vinurilor Tokaji de alte vinuri. Introducnd
logaritmul grafic al concentraiei de amine din vinurile Tokaji Aszu ntr-o diagram web, formele
lor trebuie s fie similare fiecruia, formele diagramei pentru vinurile de alt origine i vinurile
normale sunt diferite. (H. Nacu, 2003).

(a) Vinuri Tokaji Aszu i vinuri strine botritizate


(a) Vinuri Tokaji Aszu i vinuri strine botritizate

(b) Vinuri normale


Fig. 3.4. Diagrama web-paianjen a logaritmului concentraiei aminelor a vinurilor normale i
aszu. (H. Nacu, 2003).
3.5 Autenticitatea mierii
Mierea este un material dulce natural care este colectat din nectarul organele plantelor
vii de ctre specia de albine Apis mellifera sau insecte. Substana dulce este livrat la lucrtorii
din stup, pe care o modific enzimatic, nainte de depozitarea, maturarea i deshidratarea ei.

45

Directiva european referitoare la miere (Directiva Consiliului 2001/110/EC) stabileste reguli


privind compoziia i fabricarea mierii. Pentru criteriile de calitate specifice trebuie indicat
originea botanic sau regional, teritorial i topografic a produselor de miere. n meire, un grup
de compui provine din plante i ceilali de la albine. Unii dintre aceti compui apar sau se
modific n timpul maturrii mierii. (wikipedia, 2012)
Ca i n cazul altor produse alimentare, mierea este predispus la alterare. Un tip comun
de fraud este diluarea mierii cu ap sau prin adaosul de siropuri (de exemplu: siropul de porumb
cu extrafructoz(HFCS). O form sofisticat de manipulare se bazeaz pe hrnirea albinelor cu
zaharuri i siropuri. O alt metod este etichetarea greit cu privire la originea floral i
geografic a mierii. Carbohidraii majori din miere sunt glucoza (26.3-39.8%) i fructoza (35.942.1%).Zaharoza (sucroza) este prezent la 1.7-2.9 % din miere, iar rata medie de frutoz la
glucoz este de 1.2/1. Pe lang aceste dou monozaharide principale, mierea conine, de
asemena, un numr relativ mare de carbohidrai, cum ar fi di-, tri-i tetra-zaharide. (traducere).
Ca i n alte produse alimentare, compuii de zahr din miere pot fi determinai prin
diferite metode.Schimbul lichidului cromatografic-anioni cuplat cu detecia amperometric
pulsat (PAD) este cel mai bun mod de a verifica autenticitatea mierii, ntr-un mod similar cu
metodele discutate mai sus cu privire la fructe. Analiza amprentei oligozaharidelor este extrem de
bun pentru detectarea adaosului de siropuri invertite sau HFCS la miere, la niveluri sczute de 510% .Lipp (1988 ); Swallow si Low (1990) ; Swallow i Low (1994) ; Cordella (2003) ; Cotte
(2003 ). Goodall (1995) a studiat profilurile oligozaharidelor din 91 de eantioane de miere
autentic britanic, folosind analiza discriminantului canonic. Ei au stabilit c profilurile
oligozaharidelor pot avea un rol potenial n identificarea originii florale de miere, cu toate
acestea, ei au declarat c aceast procedur nu ar permite stabilirea cert a tuturor tipurilor
florale. (wikipedia, 2012)
Fenolii formeaz o clas de compui, similari cu cele din fructe, care dau informaii
despre originea floral i geografic a mierii datorat compoziiei ei florale. Un numr mare de
compui fenolici au fost identificai att n miere ct i n fructe. Pregtirea probei i separarea
HPLC pentru compuii fenolici ai mierii i pentru fructe sunt similare i, n anumite cazuri,
aceleai ca i cele folosite la. Compuii fenolici ofer din nou amprenta originii botanice sau
geografice de miere, i a unor compui de marcare care au fost gsii printre flavonoide, cum ar
fi hesperetin n mierea de citrice, tricetin, myricetinsi doi derivai n mierea de iarb i
pinobankin, pinocembrin i chrisin n mierea de eucalipt .Prin studierea acizilor fenolici din
diferite tipuri de miere, monoflorale, Dimitrova .a (2007) a descoperit mai muli compui care
servesc ca markeri n controlul calitii mierii. ( traducere)
3.6 Autenticitatea uleiurilor, untului i cafelei
3.6.1 Uleiurile vegetale
Uleiurile de origine vegetal pot fi mprite n uleiuri de semine i uleiuri de fructe.
Compoziia chimic a uleiurilor este considerat a fi mai puin complex dect ceea ce privete
elementele constitutive pentru alte elimente. Cu toate acestea, acest lucrur nu nseamn c
practicile de fraud sunt mai puin diverse n acest domeniu, sau ca aceste metode de fraud nu
cauzeaz probleme grave n evaluarea autenticitii. La uleiurile vegetale, procesul de alterare cel
mai des utilizat este diluarea cu ulei mai ieftin. (Andrikopoulos N.K. , 2002).
46

Principalii compui utili ai uleiurilor vegetale pentru detectarea autenticitii uleiurilor


i grsimilor triacylglycerolii i acizii grai. Componentele minore, cum ar fi (fito)sterolii sau
tocoferolii, carotenoide i sterens pot fi, deasemenea, utilizai pentru detectarea alterrii.
Fraciunea trigliceridelor din uleiuri i grsimi poate fi analizat prin tehnici HPLC pe o coloan
cu faz invers. Faza mobil utilizat de obicei pentru separarea trigliceridelor const n principal
din acetonitril, cu un solvent mai puin polar, cum ar fi acetona sau diclormetanul. Propor ia de
solvent poate varia n funcie de probele studiate. Pentru separarea izomerilor poziionali,
lichidul cromatografic pentru argintarea de nalt performan (Ag-HPLC) pare promtor.
Utilizarea unui detector de UV este dificil din cauza absorbiei sczute a triglicerolilor. Cele mai
utilizate tipuri de detectoare sunt detectoarele cu index de refracie sau detectoarele de
mprtiere a luminii. Detectorul cu index de refracie este potrivit doar pentru separarea
isocratic, n timp ce detectorul de mprtiere a luminii ofer posibilitatea utilizrii gradientului
de eluie. Detectoarele spectometrice de mas au nceput s fie folosite n laboratoare recent.
Unele metode HPLC utilizate n analiza triacylglicerolilor din uleiuri i grsimi sunt prezentate
n tabelul 3.7. (Andrikopoulos N.K. , 2002)
Tabelul 3.7 Separarea HPLC a triacylglycerolilor (Andrikopoulos N.K., 2002)
Eantioane: uleiuri
Separarea HPLC
Detector
Referine
sau grsimi
Coloana: Bondapak C18, eluie
isocratic, faza mobil: acetona /
Detector indice de
Susan, susan slbatic
acetonitril(50/50), temperatura: 30 C
refracie
1
Coloana: LiChroCART 100-RP-18 sau
Novena C18*, eluie isocratic, faza
Palmier*, untur, carnea mobil: acetona/acetonitril (63.5/36.5), Detector indice de
de pui, carnea de vit,
temperatura: 30 C
refracie
2, 3*
carnea de oaie
Coloana: Supelcosil LC-C18 , gradient Detector de
de eluie, faza mobil: A: acetonitril,
evaporare
B: 2-propanol/hexane (2/1), A/B de la mprtiere
Limfa
75/25 la 55/45 sau * de la 90/10 la
lumin, *
4
40/60
ionizarea chimic
a presiunii
atmosferice MS
Coloana: Supelcosil LC-18, cu precoloana ODS -5S, eluie isocratic,
Msline, canola
faza mobil: acetona/acetonitril (93/7) Detector indice de
5
refracie
Coloana: Superspher RP-100 C18,
gradient de eluie, faza mobil: 1) de
la acetonitril / izooctan 90/10 la
Soia, rapi, palmier,
acetonitril/ etanol/ izooctan (40/35/25),
semine de in
2) de la acetonitril la acetonitril /
Detector de
etanol (59/41), temperatura: 50 C
mprtiere a
6

47

luminii
Semine de rapi,
floarea soarelui, soia,
semine de in, de
palmier, macadn,
migdale, semine de
mac, alune, alune
braziliene, fistic
Dracocephalum
moldavica ,
Silybum arianum ,
ciuboica cucului de
sear, porumb, amarant
Palmier, grsimi calite
trans (cis, transtriacylgliceroli)

Coloane: dou Nova-Pak C18


conectate n serie, gradientul de eluie,
faza mobil: A: apa, B: acetonitril, C:
2-propanol, A/B/C de la 30/70/0 prin
0/100/0 la 0/40/60, temperatura: 40 C

Detector UV, 205


nm ionizarea
chiumic a
presiunii
atmosferice MS

Coloana: Nova-Pak C18, gradient de


eluie, faza mobil: A: acetonitril, B:
etanol, A/B de la 100/0 la 30/70,
temperatura: 40 C
Coloana: ChromSpher Lipide TM mod
de schimb ntre cationi i ioni de
argint, faza mobil: A: acetonitril, B:
diclorometan/ 1,2-dicloretan(1/1), C:
acetona, A/B/C de la 0/98/2 prin
0/40/60 la 20/80/0

Lumina laser,
detector de
mprtiere

Acizii grai din triacylglyceroli sunt specifici speciilor de plante. Distribuia specific
speciilor de acizi grai n triacylglyceroli permite detectarea adaosului de uleiuri de origine
strin, precum i a gradului de alterare. Coninutul de trilinoleina din uleiul de msline virgin
este mai puin de 0,3 %, n timp ce alte uleiuri (de arahide, porumb, ovaz, soia, floarea soarelui,
susan, de struguri i de canola) conin trilinoleina la niveluri mai ridicate. Uleiul de soia este
detectabil la niveluri de peste 4% n uleiul de msline bazndu-se pe uleiul de trilinoleina.
Salivaras i McCurdy (1992) au detectat alterarea uleiului de msline cu ulei de canola, la
niveluri de peste 7,5 % folosind analiza modelului de recunoastere a triacylglycerolilor. Bazat pe
analiza HPLC a esterilor de cear cu ajutorul testelor statistice, poate fi identificat alterarea
uleiurilor de msline cu uleiuri extrase cu solvent .n scopul studiului tocoferolilor,
carotenoizilor i clorofilei, mai muli cercettori , Tan(1989) ; Psomiadou i Tsimidou( 1998 );
Bonvehi .a., 2000 ) au oferit o serie de instrumente sensibile alternative pentru detectarea
uleiurilor vegetale. (Amelio M. .a ,1993).
Puspitasari-Nienaber .a (2002) au constatat c profilul carotenoide/caroten analizate
prin HPLC cuplat cu o putere a obiectivului detectorului spectometric termal (TLS) i poate fi
folosit pentru a evolua autenticitatea uleiurilor din semine de in, susan de msline i germeni de
gru.Concentraiile din total -caroten i -caroten mpreun cu raportul ntre isomerii trans i
isomerii cis din caroten sunt indici fiabili pentru screening-ul rapid al uleiurilor. O alt frac ie
foarte studiat a uleiurilor i grsimilor o reprezint sterolii, care pot fi utilizai pentru detectarea
autenticitii. Recent, unul dintre instrumentele analitice cele mai utilizate a acestor compui
cuplai este lichidul cromatografic de gaz on-line (LC-GC). Adaosul solventului extras din
uleiuri la uleiurile de msline presate la rece poate fi detectat prin investigaia eritrodiolului liber
i uvaolului din uleiurile de msline. Nu este nevoie de pregtirea probei nainte de analiza LCGC, n afar de filtrare. Prin determinarea enantiomerilor filberton cuplai on-line cu HPLC-GC,

48

poate fi detectat alterarea uleiurilor de msline cu un nivel de 5-10% de uleiuri de alune virgine
i rafinate. Conform testului internaional al inelului folosind tyrosol i o component
necunoscut ca i compui cheie, s-a descoperit c analiza HPLC este potrivit pentru detectarea
adaosului uleiului de alune presat uleiul virgin de msline la 80% din eantioanele studiate. .
(Andrikopoulos N.K. , 2002 )
3.6.2 Untul de cacao i cafeau
Untul de cacao este o substan extrem de apreciat folosit nu numai n produsele
alimentare, dar i n industria produselor de patiserie. Directiva 2000/36/EC a Parlamentului
European permite utilizarea grsimilor vegetale n produsele de cacao la un nivel de pn la 5%,
n afar de untul de cacao. n acest caz, compoziia grsimilor vegetale permis pentru
suplimentare ar trebui s fie similar cu cea a untului de cacao. Aceste grsimi vegetale sunt
numite ca fiind echivalente cu untul de cacao (CBE). Detectarea i cuantificarea grsimilor CBE
este unul dintre principalele obiective ale testelor de autenticitate ale untului de cacao . (Andrade
P.B. .a, 1997).
Determinarea profilului triacilglicerolilor este un instrument util pentru evaluarea
autenticitii untului de cacao i pentru estimarea coninutului de CBE n ciocolat. Adaosul de
grsimi strine (cu excepia illipe) la untul de cacao poate fi estimat pe baza determinrii
triagliceridelor, cum ar fi dipalmitil-oleoil (POP), oleoil-palmitilstearil glicerol (POS) i disteariloleoil glicerol (SOS). Dionisi .a (2004) au elaborat un model matematic pentru a evalua
cantitatea de CBE adaugat n untul de cacao. Raportul de triacilgliceroli att din POS/PLP
(dipalmitil-linoleil glicerol) i din POP/PLS (palmitil-linoleil-stearil glicerol) discrimineaz
perfect untul de cacao i CBE-eurile pn la 5% n ciocolat. Principalii traclgliceroli, POP,
SOS,LOO (dioleoil-linoleil glicerol) i PSS (distearil-palmitil glicerol),au fost utilizate n analiza
discriminat pentru a separa 20 de eantioane n funcie de originea lor geografic. Unele grsimi
componete minore,cum ar fi tocoferolii individuali sau izomerii tocotrienoli, pot fi, deasemenea,
folosii ca indicatori la adaosul uleiurilor CBE n untul de cacao.Cu toate acestea, determinarea
cantitativ de CBE-uri n amestecuri din untul de cacao veritabil pare a fi limitat.Distribuia i
coninutul de aminoacizi n cacaoa brut variaz diferit n funcie de origine, i n unele cazuri,
pot fi gsite diferenele specifice rii i. (Andrade P.B. , .a, 1997).
Cafeaua este deasemenea valoroas i o butur foarte popular n ntreaga lume.
Exist dou specii comerciale importante: Coffea canephora var. robusta i Coffea arabica .
Arabica este considerat a fi de calitate mai bun, cu un gust fin, i care este comercializat la un
pre mai mare dect robusta. Dup prjire, diferenele vizuale ntre cele dou specii dispar, prin
urmare una dintre principalele inte ale testelor de autenticitate este de a indica dac Robusta a
fost adaugat la cafeaua Arabica. HPLC este un bun instrument de analiz a triacylglycerolilor i
tocoferolilor sau a acizilor fenolici, care sunt prezeni n cafea. Unele metode HPLC de analiz a
acestor compui sunt prezentate n Tabelul 3.8. (Andrade P.B. .a, 1997).

49

Tabelul 3.8 Separarea HPLC a untului de cacaco i a cafelei (Andrade P.B. .a, 1997).
Componente
Eantioane
Separarea HPLC
Detectare

50

Ref

Triacylglyceroli

Untul de cacao

Coloana: Microsorb RP C18 i Detector PDA,


Supelcosil RP C18 conectate n ESI-MS / MS
serie, eluie isocratic, faza
mobil: acetonitril/2propanol/hexan (57/38/5),
temperatura ambiant

Coloana: Lichrospher 100-5RP 18, eluie isocratic, faza


mobil: acetonitril / cloroform
(40/60)

Detector de
evaporare a
mprtierii
luminii

Boabe de cafea

Extract de
cafea Soxhlet

Tocoferoli

Extract de
cafea Soxhlet

Tocoferoli
tocotrienoli

Unt de cacao,
CBE

Coloana: Spherisorb ODS2 sau


una sau dou Hypersil ODS
conectate n serie, eluie
isocratic sau gradient de
eluie, faza mobil:
acetonitril/diclormetan (70/30)
sau de la 80/20 pn la
respectiv 45/54, temperatura:
30 C

Detector de
evaporare a
mprtierii
luminii

Coloana: Microsorb RP-C18 si


Supercosil RP-18C, conectate
n serie, eluie isocratic, faza
mobil: acetonitril/2propanol/hexan (57/38/5)

Detector PDA,
ESI-MS/MS

Coloana: Superspher 100 RP18, eluie isocratic, faza


mobil: acetonitril / acetona
(50/50), temperatura: 40-35 C
Coloana: LiChrospher SI60,
eluie isocratic, faza mobil:
hexane / 2-propanol (99/1),
temperatura: 40-35 C
Coloana: LiChrosorb SI60,
gradient de eluie, faza mobil:
A: metil tert-butyl eter/hexane
(3/100), B: metil tert-butyl
eter/hexane (10/100) de la A la
B

Detectorul
indicelui de
refracie

3.7 Autenticitatea brnzei i laptelui

51

Detector de
fluorescenta, 330
nm (excitaie 290
nm)
Detector de
fluorescen, 330
nm (excitaie 290
nm)

Produsele lactate au fost consumate nc de timpuriu. Volumul mare al produciei de


brnzeturi i consumul de lapte, face din reglementarea autenticitii produselor de brnz o
problem important. Etichetarea fals a laptelui n ceea ce privete originea animal, precum i
utilizarea laptelui praf reconstituit au fost subiecte de studiu ale autenticitii. Originalitatea
brnzei depinde de mai muli factori, cum ar fi procesul de luare a brnzei i laptelui ca materie
prim. Ambele depind de originea geografic. Confirmarea originii geografice este, prin urmare,
necesar asigurrii autenticitii unui produs lactat. (traducere).
Faza revers a separrii HPLC poate fi utilizat pentru a analiza mai multe fraciuni
de proteine, cum ar fi cazeina i/sau -globuline sau furosine, care vin de la complexul fructolisin
la nceputul reaciei Maillard n timpul tratamentului termic al laptelui. Aceste substane sunt
utile pentru determinarea originii laptelui i posibila alterare a produselor din brnz. Metodele
de determinare a acestor compui sunt, n general, bazate pe schimbul cromatografic de ioni
utiliznd o faz mobil acid modificat cu acetonitril. Gradientul de eluie este, n general,
aplicat n analiza consumatoare de timp. Mai multe dintre aceste metode HPLC sunt rezumate n
Tabelul 3.9. Precipitaii la pH4 sau hidrolizarea plasminelor sunt de obicei utilizai pentru
izolarea proteinelor din lapte sau brnz. ( traducere)
Tabelul 3.9 Separarea HPLC a laptelui i brnzei
Compui
Metoda HPLC
Coloana: Chrompack P 300
RP cu pre-coloana
Chrompack P RP, gradient
Lapte de bovine,
de eluie, faza mobil: A:
ovine, caprine,
-lactoglobuline
0,01 % de acid
amestecul lor n
trifuoroacetic, B: 0,1% acid
lapte i brnz
trifluoroacetic n acetonitril
/ apa (80/50), A/B de la
64/36 la 40/60,
temperatura: 45 C
Coloana: perfuzie cu faza
invers POROS 1 10
R/glicerol preparat n
Amestecuri:
-lactoglobuline
laborator, gradient de
lapte de vac,
lactalbumina, eluie, faze mobile: A:
i/sau de oaie,
albumina
acetonitril/ apa/ acid formic
i/sau de capr
(5/75/20); B:
acetonitril/apa (93/7), A/B
de la 75/25 la 65/35,
temperatura: 50 C
Coloana: C4 Phenomenex,
gradient de eluie, faza
Lapte de vac n
mobil: A: 0,1% acid
brnz de
-lactoglobuline
trifluoacetic, B: 0,1% acid
bivoli
lactalbumina trifluoracetic n acetonitril,
Eantioane

52

(traducere).
Detectare

Referine

Detector
PDA, 215 nm

Detector
PDA, 280 nm

Detector UV,
205 nm

Lapte de
caprine, ovine,
bovine n brnza
de vac*, lapte
de oaie,capr n
brnz

Lapte de ovine,
bovine n laptele
de caprine

para--cazeina
* cazeina i
para--cazeina

-, -, -cazeina

A/B de la 65/35 la 10/90,


temperatura ambiant
Coloana: Shodex IEC CM825 (schimb de cationi),
pori largi (100 ), gradient
de eluie, faza mobil: A:
10 mmol acid malonic, 5
mol uree n ap (pH 6 cu
NAOH), B: la fel ca la A
coninnd 0,5 mol l-1 NaCl,
A/B de la 100/0la 0/100,
temperatura: 30 C
Coloana: Chrompack P 300
RP cu precoloana
Chrompack P RP, gradient
de eluie, faza mobil: A:
0,1% acid trifluoracetic, B:
acetonitril/ apa/ acid
trifluoracetic (95/5/0.1),
A/B de la 71/29 la 0/100
acetonitril/apa/acid
trifluoracetic, temperatura:
46 C

Detector
UV/VIS, 280
nm

Detector
pentru
lungimea de
und variabil
UV, 280 nm

4,5*

6,7

Analiza cazeinei prin HPLC este o metod bine standardizat pentru detectarea adaosului
de zer n chegat la laptele praf. (UE, 1990).
Separarea i cuantificarea fraciunilor majore de cazein (-, -, - si para -cazeina)
poate fi un instrument util pentru recunoaterea adaosului de lapte strin la lapte sau brnz. Prin
analiza cazeinei utiliznd HPLC, 20% din laptele de bovine poate fi detectat n laptele i
branza de ovine. (S. Gocan, 2002).
Torre .a, (1996) a dezvoltat o metod HPLC bazat pe analiza de -lactoglobuline.
Metoda pare s fie util n detectarea de proteine omologate din zer din amestecuri de lapte de
specii diferite (vac, oaie, capr). Nivelurile ridicate de -lactoglobuline denaturate, folsine i
lactulozapoate indic un plus de lapte nclzit la temperaturi ridicate. Nivelurile ridicate de
furosine indic prezena de lapte praf reconstituit.Cuantificarea -lactoglobulinelor prin HPLC
poate fi utilizat pentru determinarea originii laptelui de la diferite specii de animale de
exemplu, poate fi detectat lapte de bovine, ovine i caprine n branz i adaos de lapte de bovine
la apa mozarellei de bivoli. (hplc.chem.shu.edu, 2012).

53

Cap IV Concluzii

Cererile de HPLC pentru determinarea autenticitii produselor alimentare au fost


discutate aici. A fost demonstrat succesul tehnicii HPLC n analiza complex a matricei, cum ar fi
produsele alimentare.
Unul dintre obiectivele n lupta impotriva alterrii este acela de a dezvolta metode
analitice sensibile detectrii prezenei sau determinrii lipsei compusului (compuilor) specific
care caracterizeaz materiile prime de alimente de origine vegetal sau animal. Principalul
avantaj al autenticiii HPLC cu privire la capacitatea sa este de a separa i detecta compusul
(compuii) sau grupuri de compui care sunt la niveluri sczute n produsele alimentare de
interes. Masa molecular relativ sczut a compuilor sau cei cu mas molecular mare, cum ar fi
proteinele, sunt alese ca inte de analize, i prin utilizarea acestor compui buni rezultatele pot fi
obinute n determinarea autenticitii. HPLC este un instrument excelent pentru studierea i
descoperirea compuilor minori i specifici menionai mai sus. Aplicarea metodelor
chemometrice ofer avantaje suplimentare n evaluarea datelor HPLC.

54

Bibliografie
1. Amelio M. Rizzo R. and Varazini F. ,1993, Separarea esterilor de cear din uleiurile de
msline prin cromatografia lichid de nalt performan. Journal of the American Oil Chemists
Society .
2. Andrade P.B. , Leitao , R. , Seabra , R.M. et Al, 1997, Nivelurile de acid 3,4-dimethoxycinamic
ca un instrument de difereniere a cafelei canefora respectiv.robusta i cafeaua arabica Food
Chemistry.
3. Andrade P.B. , Carvalho , A.R.F. , Seabra , R.M. and Ferreira , M.A. , 1998, Un studiu
anterior al profilelor fenolice din piureurile de gutui, pere, mere prin detectarea mediului diodei
HPLC pentru detectarea i evaluarea autenticitii piureului de gutui. Journal of Agricultural
and Food Chemistry .
4. Andrikopoulos N.K. 2002 ,Compoziia speciilor de trigliceride din uleiurile vegetale
comestibile comune i metodele utilizate pentru identificarea i cuantificarea lor. Food Reviews
5. C. Luca, Al. Duca, Al Crian, 1983, Chimie Analitic i Analiz instrumental, Editura
Bucureti International.
6. H. Nacu, 2003, Metode i Tehnici de Analiz Instrumental,Editura U.T.PRES, Cluj-Napoca.
7. S. Gocan,2002, Cromatografie de nalt Performan Partea a II a, Cromatografia de lichide
pe coloan, Editura Risoprint, Cluj- Napoca.
8. *Directiva 2000/36/EC a Parlamentului European permite utilizarea grsimilor vegetale n
produsele de cacao la un nivel de pn la 5%, n afar de untul de cacao.
9. *Directiva Consiliului 2001/110/EC privind regulile de compoziie i fabricare a mierii.
10*Directiva 2000/36/EC a Parlamentului European privind utilizarea grsimilor vegetale n
produsele de cacao.
11.*Hotrrea UE din 1990 privind brnzeturile.
12.* http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html.
13.* lori.academicdirect.org/books/work_list.php?user=lori&id=207.
14.* http/ wikipedia.ro.
.

55