Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Studeni:
-SIBIU-
2012
CUPRINS
Cuprins..............................................................................................................................................2
Cap. I Introducere.............................................................................................................................4
Cap II Principiul de cromatografie de lichide..................................................................................6
2.1 Sistemul de livrare.....................................................................................................................8
2.2 Pompe pentru HPLC...................................................................................................................8
2.2.1 Sisteme de injecie a probei.....................................................................................................9
2.3 Coloanele n LC..........................................................................................................................9
2.3.1 Corpul coloanei i mecanisme de separare..............................................................................9
2.4 Faza staionar..........................................................................................................................11
2.5 Faza mobil...............................................................................................................................12
2.6 Detectori...................................................................................................................................13
2.6.1 Detectori spectrofotometrici n UV-VIS...............................................................................14
2.6.2 Detectori refractometrici........................................................................................................15
2.6.3 Ali detectori..........................................................................................................................15
2.7 Analiza cantitativ ...................................................................................................................16
Cap III Aplicaii..............................................................................................................................18
3.1 Autenticitatea sucurilor de fructe.............................................................................................18
3.1.1 Detectarea de zaharuri ..........................................................................................................18
3.1.2 Detectarea de acizi.................................................................................................................19
3.1.3 Detectarea de compui fenolici..............................................................................................21
3.2 Fructe citrice.............................................................................................................................21
2
Cap. I Introducere
Istoria de cromatografie dateaz din inceputul secolul al XIX-lea. Inaintea anilor 1970,
cromatografia cu coloana deschisa a fost utilizat n scop comercial n laboratoare. Termenul
HPLC provine din cauza tehnicii de nalt presiune utilizata pentru reducerea timpului care ia
analizei sa se faca. Dup numeroase etape de dezvoltare, instrumente au devenit capabile s
funcioneze la presiuni de pn la 6000 psi (400 bar). Cu o ameliorare de coloane i
detectoare, o dezvoltare esenial a fost realizat in privirea performanei, astfel nct tehnica a fost
redenumita cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC), n mijlocul anilor 1970 pn
la sfritul lunii. n aceast perioad, metode noi, inclusiv cromatografie de lichid de etapa
inversa, au permis o separare mai bun ntre compui foarte similari. Prin anii 1980,
calculatoarele i de automatizare au adugat comoditate in analiza HPLC. La nceputul
secolului al XXI-lea, un nou nivel de performan a fost realizat prin continuarea
mbuntirii tehnologii de coloana care a dus la utilizarea adsorbantilor cu paricule mai mici
(1,7 m), i dezvoltare a instrumentelor care permit aplicarea de nalt presiune pn la 1000 bar
pentru a livra solventi. Rezoluia, viteza i sensibilitatea au crescut. Aceasta tehnologie noua se
numeste cromatografie lichida ultra-performanta. (lori.academicdirect, 2012).
Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC) acoper azi, n proporie
aproximativ 80%, analiza substanelor moleculare: organice, organo-metalice i anorganice
inclusiv compuii foarte polari sau labili termic precum i compuii cu mas molecular ridicat
(naturali sau sintetici). De aceea, mpreun cu cromatografia de gaze constituie un punct de
sprijin important n analizele chimice moderne. Dei eficacitatea coloanelor nu o egaleaz nc pe
cea din GC, prin faptul c se poate modifica, pe lng faza staionar, i faza mobil,
cromatografia de lichide (LC) face posibile separri i analize uneori imposibil de realizat prin
alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de mas a transformat, n ultimul timp, aceast metod n
principalul mijloc de analiza a compuilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din
pilonii pe care se sprijin chimia sintetic actual i pe care s-a dezvoltat biochimia i
biotehnologia modern. ( traducere).
Metoda constituie o evoluie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloan clasic,
care servea n primul rnd la izolarea preparativ a compuilor naturali. Prin introducerea
pompelor i n consecin, lucrndu-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze
staionare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze
staionare sferice, cu diametre 2-5m), n coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, ncepnd cu
anul 1969, la configuraia actual (fig. 1.1). Se poate observa c din rezervoarele coninnd unul
sau mai muli solveni pompa (sau pompele), alimenteaz coloana cu eluent (de regul un
amestec de doi sau mai muli solveni). n imediata vecintate a coloanei se introduce proba,
automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. n coloana aflat ntr-o etuv termostat, are loc
separarea propriu-zis. Efluentul coloanei intr ntr-un detector de unde componentul, dac este
separat complet, poate fi colectat i izolat, cu ajutorul unui colector de fraciuni. Semnalul este
nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator. n esen, un cromatograf
analitic HPLC are structura din fig. 1.2 unde nu s-a mai prezentat colectorul de fraciuni,
interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemnarea cu GC singura
deosebire major constituind-o sursa de eluent - pompa. n cele ce urmeaz se vor prezenta cele
mai importante aspecte deoarece volumul de informaii publicate este deosebit de amplu, un mare
numr de date existnd chiar pe reeaua Internet . (lori.academicdirect, 2012).
2012)
Durata de timp necesar pentru un compus s treac printr-o coloan cromatografic
se numete timpul de retenie ( ). Molecule diferite iau timp diferit pentru a se muta prin
coloan n etapa staionar, dar aceeai cantitate de timp n etapa mobil. Acest timp din etapa
mobil se numete timpul mort al coloanei sau timpul pauz al coloanei ( ).Timpul petrecut de
), si se calculeaz ca
tR= tRt0
O valoare H mai mic indic o coloan mai eficient, cu o valoare N mai mare. Eficienta
coloanei se refer la performana etapeii staionare, furnizand informaii despre performanele
sale cinetice i ct de bine este coloana ambalata. (C. Luca, .a.,1983).
Descrierea matematic a eficienei coloanei cromatografice se obine din ecuaia van Deemter:
H=A+ B/u +Cu
unde u este viteza liniar a etapeii mobile. A este termenul de difuzie eddy, reprezentnd mai
multe cai pe care un compus poate sa ia prin coloan. Viteza de faz mobil afecteaz, de
asemenea, difuzarea Eddy. O rata mai mare de miscare rezult n marirea zonei de largire. B este
termenul pentru difuzarea longitudinal, care descrie o un proces de largire a bandei care este
invers proporional cu viteza din etapa mobil. HPLC n acest termen este neglijabil, deoarece
coeficientii de difuzie al lichidelor sunt foarte mici comparativ cu cele ale gazelor (ca n
cromatografia de gaze). C este coeficientul transferului de mas. n scopul de a obine o valoare
H mic i a permite separarea eficient sa fie realizata, ar trebuie sa fie utilizate ajutorul
particulelor mici, eluent de vascozitate scazuta, o coloan mai lungi i o temperatur mai mare.
Numrul teoretic de plac poate fi msurat prin mai multe metode, aplicand urmtoarea formul:
N= a(tr/w)2
unde a este o constant, n funcie de nlimea vrfului (n cazul n care acesta este msurat),
este timpul relativ de retenie al vrfului i w este vrful limii (figura 2.1). Valoarea a depinde
7
de metoda de calcul; poate fi 5.57, 25, 16 atunci cnd limea maxim este msurat la jumtatea
nlimii a vrfului (
limii (w) este distana dintre intersecia de baz i linia tangenta cu ambele pri ale vrfului.
Multe varfuri cromatografice nu prezint modelul de distribuie gaussian normal. Placa
teoretic nu este afectata de anomalii cromatografice (Figura 2.2), cum ar fi vrf "de coada" i
"frontal".
Fig. 2.2 Anomaliile de vrf cromatografice. As, factorul de asimetrie; w10%, limea maxim
msurat la o distanta de 10% de la inlimea vrfului (
). (lori.academicdirect, 2012)
Formula pentru asimetria de un vrf, adic a factorului de asimetrie, poate fi calculat din forma
vrfului: As= b/a
unde a este distana dintre maxima vrfului i fa vrfului, msurat la o distanta de 10% de la
nlimea vrfului, iar b este distana maxim dintre vrf i coada vrfului msurat la o dinstanta
de 10% de nlimea vrfului.
Gradul de separare a dou vrfuri se caracterizeaz prin separarea relativ, i anume
rezoluia.Rezoluia a dou vrfuri poate fi calculat din cromatografice variabile reglabil, cum ar
fi factorul de selectivitate, eficiena i capacitatea compuilor separati prin urmtoarea formul:
Rs=N1/2/4(1)/k/1+k
unde k este media de factor de capacitate a celor dou vrfuri de interes. n cazul n care
este
1.25, separarea a dou vrfuri este considerat satisfctor. Acesta const dintr-o livrare de
sistem, coloane, detectoare, i un sistem de operare i control. (C. Luca, .a.,1983).
8
SR, rezervorul de solvent; HPP, pompa de inalta presiun; I, injectorsul; C, coloana; OCS,
operatia si systemul de control; DP procesarea datelor
Fig. 2.3 Diagrama bloc a instrumentului HPLC (. S. Gocan,2002).
10
Fig. 2.4 Ventilul pentru introducerea probei (cu 6 ci); lucreaz n dou etape:
A - alimentarea buclei cu proba; B - dup o rotire cu 60 n sensul acelor de ceasornic,
antrenarea probei din bucl n coloan (lori.academicdirect, 2012)
Deoarece eluentul ader la perei, pentru completa ndeprtare a sa n momentul
alimentrii buclei cu prob, este necesar injectarea prin bucl a unui volum de cel puin de trei
ori volumul acesteia, nainte de comutarea pe analiz. Bucla lucreaz n dou etape. Etapa A n
care bucla este umplut cu prob cu ajutorul unei seringi sau n alt mod. Apoi are loc comutarea
pe analiz cnd prin rotire cu 60, n direcia acelor de ceasornic, manual sau automat, bucla este
parcurs de eluentul de la pomp i coninutul acesteia este antrenat n coloan. Volumul probelor
pentru coloane obinuite (25cmx4.6mm) este de 10-50l. Evident aceste ventile sunt
confecionate din materiale rezistente la coroziune i la solveni (oel inoxidabil, tantal, teflon
etc). (H. Nacu, 2003).
2.3 Coloanele n LC
Locul n care se petrece separarea propriu-zis i - n funcie de calitatea acesteia - se mrete
sau micoreaz raportul semnal/zgomot, este coloana cromatografic. Dei muli autori denumesc
coloana piesa cea mai important dintr-un cromatograf, acesta din urm, fiind format dintr-o
serie de componente, rezult c fiecare compartiment n parte, contribuie separat la obinerea
rezultatului analitic. Pentru un practician din domeniul LC ns, locul unde acesta intervine
efectiv i unde se concepe logic separarea este ntr-adevr coloana. (S. Gocan,2002).
2.3.1 Corpul coloanei i mecanisme de separare
Materialul din care se confecioneaz corpul coloanei n LC trebuie s asigure acesteia
rezistena mecanic adecvat presiunilor nalte (20mii kPa) precum i rezistena la coroziune fa
de faza mobil. n majoritatea cazurilor a fost preferat oelul inoxidabil 316 lucios. Acesta rezist
la majoritatea solvenilor, excepie fcnd doar srurile halogenilor, n special n soluie puternic
acid. Alte alternative o constituie coloanele compozite: sticl sau plastic n interior - oel
inoxidabil sau material plastic n exterior. ( traducere)
Din punctul de vedere al geometriei (fig. 2.5), aceste coloane sunt cilindrice, iar
dimensiunile depind, n primul rnd, de dimensiunea granulelor i porozitatea umpluturii. Astfel
diametrul coloanelor variaz ntre 0.3-5cm iar lungimea poate fi ntre 3-25cm. Pentru scopuri
preparative, n cazul unor componente necunoscute, se utilizeaz chiar diametre mai mari.
Fig. 2.5. Aspectul coloanelor din LC: coloan analitic (stnga), semipreparativ (dreapta)
(lori.academicdirect, 2012)
11
Cu ct umplutura este mai fin, cu att coloana este mai scurt. Pentru a se reine
eventualele impuriti sau componeni care nu pot prsi coloana (fiind reinui practic
ireversibil) se folosesc adesea precoloane care, fiind de dimensiuni mai mici (acelai diametru i
lungimi de 0.4-1cm), pot fi nlocuite mai des, evitndu-se astfel scoaterea prematur din funcie a
coloanei principale. Pentru a nu fi antrenat faza staionar n afara coloanei, aceasta este blocat
la capete de dou discuri metalice, poroase, avnd diametrul porilor ntre 0.5- 10m. De
asemenea pentru a nu se lrgi prea mult prin coloan zona cromatografic (cu diluarea ce are loc
simultan), tot volumul mort ale acesteia (goluri n coloan, tubul de aduciune de la injector, tubul
de evacuare spre detector) trebuie redus la minim. Se cunosc pn n prezent mai multe
mecanisme de separare prin coloane, care depind mult de fazele mobil i staionar. Mai exact,
depind de natura fenomenului fizico-chimic pe care se bazeaz retenia difereniat i separarea.
Metodele LC (HPLC) se pot clasifica, dup mecanismele principale amintite, astfel: de adsorbie,
de repartiie, ionic, i de excluziune steric.Se disting dou moduri de realizare a cromatografiei
de repartiie:
Cromatografie de repartiie direct (sau cu faze normale - clasic);
Cromatografia de repartiie cu faze inversate - metoda preferat n zilele noastre - pe care se
realizeaz cele mai numeroase separri. (S. Gocan,2002).
n primul caz faza staionar este format dintr-un lichid polar iar faza mobil dintrun
solvent organic nepolar iar n al doilea, situaia se inverseaz: lichidul imobil este nepolar iar
faza mobil este un amestec de solveni polari. De exemplu, una dintre cele mai rspndite faze
inversate este cea staionar - silicagel, iar cea mobil - un amestec ap, metanol, acrilonitril (sau
tetrahidrofuran). O separare reuit pe o astfel de faz este prezentat n fig. 2.6.
Coloan: Supelcosil (SiO2)
LC-ABZ, 25x4,6cm;
Granulaia: 5m, t = 40C;
Eluent: 10 pn la 90%
acetonitril n ap 0.5%/min;
Detector: UV la 225nm;
Debit: 1mLmin-1;
12
13
Mas molecular
Solubil n
Ap
Caracter
Ionic
Neionic
Cromatografie
ionic (IC)
cu perechi de ioni
Solveni organici
Polar
cu faz invers
cu faz polar
legat
lichid-solid
(CLS)
excluziune
steric
CLS
IC
excluziune
steric
Excluziune
steric
Schimb ionic
Interaciuni
hidrofobe
<2000
Proba
Nepolar
Ap
Solveni organici
> 2000
14
15
Tabelul 2.2 Cteva dintre cele mai cunoscute tipuri de silicagel pentru HPLC(S. Gocan,2002).
Marca
Diametrul
porilor
Suprafaa
specific
pH-ul n
suspensie 10%
Tipul
particulelor
Zorbax 300
Vydac TP
Hypersil
Spherisorb
Polysil
LiChrosorb
Rosil
Rsil
30
32
12.5
8
6
10
8
6
39
82
149
190
245
297
357
433
5.4
4.1
8.2
7
6.5
6.7
8.4
8.0
Sferice
Sferice
Sferice
Sferice
Neregulate
Neregulate
Sferice
Neregulate
Se poate observa c suprafaa specific scade cu creterea diametrului porilor iar pHul
acestora se situeaz n domeniul 5.4-8.4. Ali adsorbeni mult mai puin utilizai sunt alumina,
oxidul de zirconiu, crbunele macroporos, polimerii poroi (de ex. spuma poliuretanic).
( traducere)
Fazele staionare chimic legate au aprut n urma ncercrilor mai puin eficace de
utilizare a unor faze staionare lichide depuse pe un suport poros solid - permeabil pentru eluent
(a fost preferat kieselgur-ul sau pmntul diatomitic - n esen tot SiO2 dar cu pori mari i o
suprafa mult mai mic.
Deoarece n toate aceste ncercri faza staionar era splat de pe suport de ctre eluentul
n micare i n felul acesta deranja funcionarea detectorului, s-a recurs la soluia crerii unor
faze care s fie fixate prin legturi chimice - mult mai puternice dect cele fizice. Aspectul unei
faze staionare chimic legate poate fi imaginat ca n fig. 2.8, adic catenele legate alctuiesc o
adevrat pdure de molecule care se comport fizic asemntor unui strat subire, aderent la
suport (imposibil de dizolvat) dar cu o valoare a factorului de capacitate k mai favorabil.
Dac gruprile silanol Si-OH de pe suprafaa silicagelului sunt puse n situaia de a
reaciona cu anumii derivai organometalici, se poate realiza sinteza unor faze chimic legate.
Cele mai stabile legturi sunt cele care au la baz apariia structurilor legate prin intermediul unei
puni: Si-O-Si. Obinerea acestora se realizeaz prin reacii de condensare la care particip
grupele silanol - superficiale, efectuate n prezena unor clorsilani. Un exemplu este reacia:
SiOH + ClSi(CH3)2R -HCl Si-O-Si(CH3)2-R, unde cel mai frecvent R = C8H17 sau
C18H37. Prin astfel de reacii (astzi se cunosc mai multe variante) suprafaa silicagelului se
acoper cu un strat monomolecular de dimetil-alchilsiloxan nepolar. Pentru se mri i mai mult
stabilitatea s-a recurs la soluia legrii radicalului de hidrocarbur R prin intermediul mai multor
legturi cu suprafaa silicagelului. Stratul de hidrocarbur grefat de suport se comport ca un strat
foarte subire, uniform, de lichid nepolar dar mult mai stabil. Aceste faze stau la baza
cromatografiei cu faze inversate. Polaritatea acestor faze se poate regla prin legarea n cadrul
unor catene laterale ale radicalului de hidrocarbur R, de exemplu a unor funciuni aminopropil,
cianopropil, benzil, crendu-se astfel o mare diversitate de faze staionare. ( Nacu, 2003).
16
Solveni
Hexan
Benzen
Triclormetan
Clorur de metilen
Eter etilic
Acetat de etil
Acetonitril
17
Faze inversate
Capacitate
Metanol
Ap
de
dizolvare (trie)
La ora actual soluia la care s-a recurs n practic const, n general, dintr-un sistem de
ventile electromagnetice care permite intrarea solvenilor n aceeai pomp, prin intermediul unei
camere de amestecare aflate la joas presiune. Este posibil i un alt montaj n care fiecare solvent
are pompa proprie, comandat de un dispozitiv de control al debitului. Aceti solveni intr n
camera de amestec i de aici n coloan. ( traducere).
2.6 Detectori
Tehnica HPLC s-a dezvoltat o dat cu perfecionarea detectorilor. Am amintit c
detectorii n cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la ieirea eluentului
dintr-o coloan i care pot nregistra continuu substanele separate de ctre aceasta. Deci
detectorii constituie acea parte a instrumentaiei care permite s se observe modul cum decurge
separarea prin coloan fr a se vedea componenii propriu zii ci doar semnalul lor. ntruct
coloanele de separare performante au capaciti de ncrcare mici, sistemul de detecie trebuie s
fie unul foarte sensibil. Totodat, pentru c n LC volumul de prob este de ordinul microlitrilor
(8-10l), volumul detectorilor trebuie s fie de volum apropiat pentru a se putea sesiza n mod
continuu picul cromatografic. n calitate de instrumente se poate utiliza, n principiu, oricare
dispozitiv de analiz chimic cunoscut, pentru probe lichide, precum i orice combinaii de
instrumente fizice. De exemplu, n ultimul timp, combinaia dintre un detector refractometric i
unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace n analiza polimerilor n amestec cu
monomeri sau oligomeri dintr-un material. Exist chiar posibilitatea creterii sensibilitii
deteciei printr-o reacie chimic n urma adugrii, cu un debit controlat, a unui reactiv potrivit.
Tehnica se numete derivatizare i se poate practica chiar nainte de introducerea probei n
coloan, dar i dup ieirea din coloan a componentelor separate. Metoda a fost utilizat pn n
prezent n special legat de metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice i mai
ales pentru analiza unor amestecuri de compui numeroi avnd aceleai funciuni reactive (de
exemplu aminoacizi). Caracteristicile detectorilor sunt asemntoare cu ale celorlalte instrumente
analitice i oarecum similare cu cele descrise la metoda GC. ( hplc.chem.shu.edu, 2012).
2.6.1 Detectori spectrofotometrici n UV-VIS
Acest grup de detectori sunt cei mai folosii detectori pn n prezent, att n LC, ct i
n HPLC. Pentru a putea fi utilizai, compuii separai cromatografic trebuie s fie colorai - adic
s absoarb lumina pe domeniul de lungimi de und al detectorului. Pe de alt parte, eluentul
trebuie s fie practic transparent pentru acelai domeniu spectral. Legea fizic pe baza creia
funcioneaz aceti detectori a fost prezentat - este vorba de legea Lambert-Beer (A = lC). Deci
unitile vor fi uniti de absorban, adimensionale. De aceea limita de detecie sau zgomotul de
fond se prezint n cazul acestor detectori n AUFS (de la Absorbance Units Full Scale). Astfel n
cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de 0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%.
Motivul principal al popularitii acestor detectori este acela c numeroasele substane organice,
anume cele care conin legturi duble (electroni ), respectiv au grefate funciuni organice cu
electroni neparticipani, absorb lumina n UV-VIS. Este vorba de toate hidrocarburile olefinice i
aromatice precum i derivaii tuturor hidrocarburilor cu diferite funciuni organice (=C=O, =C=S,
18
-N-O, -N=N-, -NH2). ntre acestea se includ i numeroasele combinaii de interes biologic ca
enzime, acizi nucleici etc. Un mare avantaj al acestor detectori este faptul c sunt insensibili la
micile variaii de debit i temperatur. Celula de detecie face parte dintr-un spectrofotometru i
are un volum extrem de mic, de 8-10l, respectiv un diametru interior de 1mm la o lungime a
celulei de10 mm. (Al. Crian, 1983).
Se pot distinge i n cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori
Detectorii monocromatici au fost primii utilizai, fiind mai ieftini deoarece lucreaz doar la o
lungime de und. Modelul cel mai rspndit se compune dintr-o surs luminoas cu deuteriu sau
cu vapori de mercur, un monocromator care separ un domeniu ngust (de ex. linia 254nm a
mercurului) i un detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezentat n fig.
2.9.Detectorii policromatici mai frecvent utilizai n cromatografele HPLC moderne permit i
selectarea lungimii de und la care se lucreaz, dar chiar pot nregistra electronic absorbana
celulei la mai multe lungimi de und simultan. Acest mod de lucru d o mai mare siguran
analizei, n sensul c permite stabilirea puritii, adic dac picul constituie un semnal dat de o
singur substan sau de un amestec (ceea ce se cunoate sub numele de stabilirea puritii
picului). Aceti detectori conin celula amintit montat ntr-un spectrofotometru cu reea de
diode.
Surs MonocromatorCelulnregistrator
Fig. 2.9. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric (hplc.chem.shu.edu, 2012)
19
Limita de
detecie
1-10pg
Caracteristici
Sensibilitate 10-10M
Este
necesar
uneori
derivatizarea
Sensibilitate 10-10M
Compui
oxidabili
sau
reductibili
Necesare coloane capilare
Necesar pulverizarea
Pre de cost ridicat
Pre de cost ridicat
Adecvai
pentru
macromolecule
Pentru substane optic active
Doar pentru ioni sau compui
ionizabili
-
10pg = 1ng
1g
10g
Activitate optic
Electrozi ion selectivi
1ng
10ng
Fotoionizare
1pg - 1ng
20
21
~1-10 ng
~0.01-0.001 ng
~0.1-0.001 ng
precis. Aceasta nseamn c o metod validat este corect, specific, reproductibila i robusta,
peste intervalul specificat n cazul n care proba va fi analizat. (Amelio M., .a.,1993).
23
instrumente de analiz pentru acest scop este cromatografia de lichide de inalta performanta. La
data de fata, numerosi compui au fost investigati pentru adecvarea acestora n evaluarea
autenticitatea sucurilor.Acizi organici (n special acid isocitric), componente de zahr i acizi
amino liberi au fost investigate de mai multi lucrtori. Potenialul de compui flavonoide i
carotenoide pentru detectarea fraudei n sucuri a fost deosebit de studiata. Metode chemometrice
n evaluarea de compoziia acestor compui specifice pot oferi un instrument eficient pentru
stabilirea autenticitii produselor din fructe, cu o difereniere de probe n funcie de specie,
origine geografic, etc. (C. Luca, .a., 1983).
3.1.1 Detectarea de zaharuri
O metod de alterare n industria de suc este adugarea de mediu i de sfecl de zahr
invertit de medie sau mare contrentatie sau sirop de porumb cu mult fructoz. Utilizarea acestor
substane naturale pentru fraud nseamn ca metode sofisticate de detectare sunt necesare.
Aplicarea raportului stabil izotop de carbon este metoda cea mai acceptat i eficienta pentru
detectarea de alterare cu astfel de siropuri naturale. Cu toate acestea, mai multe aplicaii de HPLC
sunt utilizate pentru a identifica suplimentelor de zahr n sucurile de fructe.
(academicdirect.org).
Cele mai importante glucide sunt prezente n sucurile de glucoz, fructoz i zaharoz.
Unele fructe, cum ar fi mere, pere, gutui, viine, caise i prune conin alcool, carbohidrati, i
sorbitol. Mai multe coloane sunt disponibile pentru analiza HPLC de reducere a compuilor de
zahr. O coloan de analiz carbohidrati sau coloana de schimb de ioni de legat in cruce cu
calciu permite analiza completa a zaharurilor reductoare menionate mai sus. Investigarea
raportului de reducere de zahr nu ofer ntotdeauna rezultate precise, deoarece reducerea
raporturi de zahr se poate schimba n specii de fructe, n funcie de varietatea lor, maturitatea,
starea n cretere, de origine geografic, etc. (Andrikopoulos N.K. , 2002).
Determinarea raportului de componente de zahr sau al proporiei de zahr i sorbitol
poate duce la succes n determinarea suplimentarii cu ndulcitori . Determinarea de sorbitol n
sucul de produse care n mod natural nu conin sorbitol indic adugarea de alte fructe. De
exemplu, n suc de coacze negre, adaosul de 10% de suc de viine poate fi detectat pe baza
nivelului de sorbitol. Abateri in msuratorile de sorbitol/zaharoa i sorbitol/ raporturi de zahr
totale pot fi folosite pentru a detecta adaosul de suc de pere la sucul de mere. Alterarea de
concentrat de suc de mure i vinuri, cu suc de fructe care contine sorbitol, poate fi, de asemenea,
detectat prin determinarea coninutului de carbohidrai i sorbitol. Alt abordare a acestei
probleme este investigarea i determinarea de oligozaharide din sucul de fructe prin HPLC.
Aceasta pare a fi o metod eficient pentru a indica alterare cu indulcitori nedeclarate. Sucul de
portocale este un exemplu de suc, care este bogat n zaharoz, i, prin urmare, sucurile portocalii
sunt sensibile la adugarea de mediu, inclusiv siropuri invertite de zaharoz. Investigarea
modelelor oligosaccharide de suc de portocale alterat poate duce la identificarea de fraud.
(traducere)
24
Unele oligozaharide, care sunt prezente n concentraii mult mai mari din sfecl de
zahr invertit dect n sucuri, pot fi analizate pe coloana de schimb de anioni umplute cu un tip de
rin de amine cuaternare, dup cum s-a artat de mai multi. Carbohidratii absorb slab n lumin
UV i lumina vizibila. Cu toate acestea, sensibilitatea detectorilor de indice de refractie este n
mod normal, prea mic pentru a detecta compusi minoro, cum ar fi oligozaharide. In mod invers,
un detector de impulsuri amperometric cuplat cu cromatografie de lichid, ofer una dintre cele
mai bune metode de detectare de carbohidrati adugati la sucuri n scopul de alterare. Unele
metode HPLC de analiz de zahr cu pregtirea eantionului sunt prezentate n tabelul 3.1. Dup
cum se indic n tabelul 3.1, profilul oligosaccharide este util n screening-ul sucurilor citrice i
de ananas pentru alterarea potenial. Metodele descrise n Tabelul 3.1 ofer o estimare bun a
adaugarii de sfecl de zahr la sucurile citrice. O limitare a acestor metode este c zaharide
endogene pot interfera cu cele de sfecl de zahr sczut si zahr mediu invertit. Sensibilitatea
ridicat a detectorului a impulsuri amperometrice pot fi, de asemenea, folosite pentru a detecta
adugarea de splri paste enzimei tratate din suc. Fragmentul oligogalacturonide produs din
degradarea pectinei n timpul tratamentului enzimatic poate fi detectat chiar i atunci cnd un
nivel sczut de pulp spala (10%), se adaug la un suc. (Andrade P.B, .a., 1998).
Tabelul 3.1 Metode cromatografice de lichide de nalt performan pentru separare a mono-,
di- i oligozaharide (Andrade P.B. .a 1998).
Zaharuri Pregtirea
Stare de separare HPLC
Detectia
Referint
probei *
e
Rafinoz
Portocale: nici o
Coloana: Supelcosil LC18,
Detector H2O2
1
pregatire probei
isocratic eluie, faza mobil:
sensibil
0.2 mol l-1 Puffer fosfat (pH 6.3) electrochimic,
cuplare cu
enzima-reactor
n cazul n care
H2O2
este produsa din
rafinozei de
galactosidase
Zaharuri
Grapefruit: nici o CarboPac PA1 (Dionex) coloan Detector pulsat
2
reduse
pregatire a probei de schimb de anioni, eluie
amperometric
isocratica, faza mobil: 0,14 mol
l-1 NaOH, temperatura ambiant
Mere, Pere: nici
a) Coloana Du Pont Zorbax de
Detector de
2a, 3b, 4c
o pregatire a
amine cu coloana de paza amine, indicele de
probei
eluie isocratica, faza mobil:
refracie
acetonitril / ap (76/24),
b) Coloan Capcell-Pak-NH2,
eluie isocratica, faza mobil:
acetonitril / ap (80/20),
c ) Coloan CarboPac PA1,
eluie isocratica, faza mobil: 60
mmol l-1 NaOH
25
Oligozaha
ride
Detector de UVvizibile
Mure si prune:
utilizarea
cationand si
coloane de
schimb de anioni
dupa extracia cu
Grapefruit4,
portocala7,8: prin
educaie i rin
schimbtoare de
anioni i n plus
cartu C18 SepPak
Detector de
indicele de
refracie
Detector pulsat
amperometric
4,7,8
Portocala: sucul
este amestecat cu
rin de Celit,
centrifugare,
supernatantul este
eluat
printr-un cartu
C18 SPE, eluentul
este trecut prin
cationi i cartue
de schimb de
conectate n serie
Detector pulsat
amperometric
26
Sucuri de citrice:
trec prin cartu
On-guard H
OligoSucuri de citrice:
galacturon trec prin cartu
ide
Detector pulsat
amperometric
10
Detector pulsat
amperometric
10
27
Shui i Leong (2002) au conceput o metod HPLC pentru separarea de acizi i compui
fenolici, n sucurile de fructe ntr-un singur pas de separare (n probele de mere), i a indicat c
metoda ar putea sa fie folosita pentru a evalua autenticitatea de sucuri. ( traducere)
Cu toate acestea, pentru determinarea acidului isocitric, mai multe metode HPLC sunt
descrise n literatura de specialitate. Printre acestea, metoda simpla enzimatic este de preferat n
laboratoarele de analiz, deoarece pregtirea probelor nainte de analiz cromatografic este
foarte complicata pentru alte metode. (Andrade P.B. , .a., 1998).
3.1.3 Detectarea de compui fenolici
Constituenti fenolici sunt metabolii secundari de plante. Ei au un rol important in
aroma i culoarea plantelor, produselor chimice i sunt semnificative componente nutritive.
Compoziia specific i nivelul de compui fenolici pot fi utilizati ca un indicator de suc fructe de
alterare. Ele pot fi mprite n dou grupe majore fenolici acizi i compui conexene, precum i
flavonoide. Acizi fenolici includ instrumentele financiare derivate de la acid cinamic (cum ar fi pcumaric, cafeic, ferulic, clorogenic, p-cumaroylquinic i de acid neochlorogenic) i derivate ale
acidului benzoic (cum ar fi p-hidroxi benzoic, protocatechuic, vanilic i acid galic). "Cinnamics"
apar n natur sub form de ester cu ali compui (de exemplu, ester al acidului cafeic cu acidul
clorogenic sau cu acid quinic), n timp ce "bensoics", apar de obicei n form liber.
Flavonoidele , care sunt n mare parte pigmeni biologici, aparin derivailor fenil ale structurii
benzopyrane (Figura 3.1). (Andrikopoulos N.K. 2002).
28
Flavanone glicozide
Sucuri Citirice
Didymin
Eriocitrin
Hesperidin
30
Narirutin
Neoeriocitrin
Neohesperidin
Poncirin
Grapefruit (2,9)
Portocala (8)
Lamaie (6), mandarine (6),
portocala (6), ortanique (6),
pummelo (6)
Clementine (7), portocala
(5,7), ortanique (7), satsuma
(7), tangelo (5)
Portocala (2), tangor (2)
Hexamethyl-O-quercetagetin
Isosinensetin
Luteolin *
Luteolin * -7-O-glucoside
31
Nobiletin
Scutellarein* and
heptamethoxyfl avone
Sinensetin
Tangeretin
Tetramethyl-O-isoscutellearin
Tetramethyl-O-scutellarein
32
PMF i FG
n baie de ap la 90C,
centrifugare
Glicozide
flavonoide
Nu se pregtete filtrarea
probelor
Glicozide
flavonoide
Glicozide
flavonoide
Centrifugare
33
10
11
centrifugare, combinarea
supernatanilor, diluare, filtrare
Eantion uscat la rece + 62.5%
metanol coninnd BHA (tertbutyl-4-hidroxianysol),
sedimentare, diluare cu ap
12
4, 13,
14,15
16
Deoarece exist mai multe soiuri care conin naringin i poae fi n mod legal n suc de
portocale comercial, utilizarea de naringin numai pentru a detecta prezena de suc de grapefruit
este n mod clar imposibil. Cu toate acestea, raportul naringin / neohesperidinei poate fi folosit
pentru a diferenia sucuri de portocale, care pot include suc de grapefruit adugat sau alte
naringin care conin soiuri de citrice. Adaosul de Citrus aurantium i / sau C. bergamia la
portocale (C. sinensis), poate fi detectat prin prezena de naringin i lipsa de prezen a unor alte
flavonoide specifice. Adaosul de tangerine (mandarine), sau un hibrid de portocale i tangerine
poate fi stabilit de un raport sczut de hesperidina / narirutin . (traducere)
Compoziia de flavone polymethoxilate n sucurile de citrice difer foarte
mult.Variaia specific a modelului flavone polymethoxilated prevede un alt instrument de
difereniere de sucuri citrice. Ooghe .a. (1994) au stabilit, n studiul lor, care determinri de
glicozide flavanone i flavone polymethoxylated sunt tehnici complementare. Folosind aceste
dou grupuri de compui, mpreun cu diferite modele, ofer o ans bun de a detecta alterarea
sucurilor de portocale.Compoziia de flavoni polimetoxilai n sucurile de citrice difer foarte
mult. Variaia specific a flavonilor polimetaxilai prevede un alt instrument pentru diferenierea
sucurilor citrice.
34
35
Tabel 3.4 Compui fenolici ai fructelor i/sau al produselor din fructe (Andrade , P.B., 1998).
Acizi fenolici si derivati, aldehide
Specii de frute
Referine
Acid cafeic
Isomerii acidului
clorogenic
4-O-acid
cafeoylquinic
5-O-acid
cafeoylquinic
Ester cafeoyl
Acid caftaric
Acid cinamic
Acid clorogenic
Acid p-coumaric
Ester coumariol (din
acid tartaric)
Acid
coumaroylquinic
Acid coutaric
3,4- aldehida
dihidroxibenzoic
Acid elagic
Derivaii acidului
elagic
Acid ferulic
Ester feruloyl(din
acid tartaric)
Glucoza feruloyl
Acid galic
2-S- acid
glutathionylcaftaric
Acid phidroxibenzoic
Acid sinapic
Aldehida siringica
Acid vanilic
Aldehida vanilica
Mere
1
2
+
4
+
5
+
10
6
+
12
+
Pere
1
2
+
5
+
8
+
6
+
12
+
Gutui
1
6
+
Caise
Piersici
Ananas
Portocale
Cpuni
5
+
5
+
12
+
12
+
Struguri
albi
5
5
+
+
4
+
+
+
+
+
+
+
12
+
11
11
Zmeur
12
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
t
+
+
+
+
+
+
+
+
n
t
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Referine
aesculetin
5
+
10
12
Pere
1
12
Gutui
1
Struguri
albi
5
5
+
Caise
Piersici
Ananas
Portocale
Cpuni
4
+
5
t
12
12
scopoletin
Hidrochinina
(+) - catechin
Isomeri catechincatechin-gallate
Catechin-gallate
(-) -epicatechin
(-) -epigallocatechin
(-) epigallocatechin
gallate
Procyanidina B1
Procyanidina B2
Procyanidina B3
Procyanidina B4
Floretin 2'
glucozide
(phloridzin)
Floretin 2'
xylosilgalactoside
Floretin 2'
xylosilglucozide
Hidrochininaglucozida (arbutin)
Glicozide flavonol
Dihidrochalcones
Tabel 3.4 Compui fenolici ai fructelor i/sau al produselor din fructe (Continuare)
Specii de fructe
Mere
2,3-dihidroquecetin rhamnoside
2,3-dihidrokempferol
- rhamnoside
Glucozidaisorhamnetin
Glucozida-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
36
12
11
11
Zmeur
12
isorhamnetin
Kemferol
3-O-rutinozide
kemferol
3-O-glucozide
kemferol glicozid
miricetin
3-O-ramnoside
quercetin
+
+
+
+
37
+
+
Glicozide flavonol
Flavonoli
3-O-galactozide
quercetin 3-Oglucozide quercetin
3-O-glucuronide
quercetin
3-O-ramnoside
quercetin
3-O-xyloside
quercetin
3-O-arabinoside
quercetin glicozide
quercetin
3-O-rutinoside
(rutin)
kemferol
+
+
+
+
+
+
+
+
myricetin
quercetin
+
+
+
+
+
+
Cea mai comun utilizare a metodelor este ( tabelul 3.5) aceea de a studiat compoziia
chimic a merelor, datorit popularitii sale i a preului sczut i deoarece piureul de mere sau
sucul este cel mai favorizat alterrii naturale fa de alte sucuri de fructe. Folosind detectoarele
colriometrice ale matricei de elctrozi, Sontag i Bernwieser (1994) au concluzionat ca
compoziiile fenolice ale merelor i perelor sunt foarte simple dar diferite, i prin urmare este
posibil detectarea alterrii nectarului de pere cu suc de mere pn la nivelul de 1%. Dragovic
.a , (2005) au dovedid n studiul lor c adaosul piureului de mere la piureul de caise n timpul
procesrii nectarurilor de caise i dulceurilor poate fi uor detectat prin prezena Phloretin 2'glucozide i a Phloretin 2'-xiloglucozide. Phloretin 2'-xiloglucozide poate fi folosit n particular
ca un marker n detectarea alterrii nectarului de caise ce conin 10% din piureul de mere. n
dulceurile de caise se poate detecta minim 20% din piureul de mere. n anumite situaii sucul de
mere poate fi alterat cu suc de pere. Deoarece arbutinul i glicozidele isorhamnetin sunt
caracteristice sucului de pere, pot fi folosite ca indicatori ai alterrii sucului de mere cu suc de
pere. Silva .a .(2000) au studiat cteva eantioane de gemuri procesate de gutui care conineau
i arbutin i, au sugerat c aceste eantioane de dulceuri au fost alterate cu piure de pere.
(Andrade P.B. , .a , 1998).
Tabel 3.5 Separarea HPLC a compusilor fenolici din esantioanele fructelor ( traducere)
Fructe
Prepararea
Separarea HPLC
Detectarea
esantioanelor
Mar, gutui, para,
Evaporarea la
Coloana:
Detector PDA
pruna, piersici,
uscare a butanolului Spherisorb ODS2,
280, 350 nm
portocale acre,
extras din
gradient de elutie,
caise, capsuni
esantioane, dilutia
faza mobila: A:
cu apa acida (pH2, apa/acid formic
HCI), filtrarea,
(19/1), B: metanol,
trecand prin
A/B de la 95/5 la
Amberlie XAD-2,
20/80
dupa spalarea
coloana:
coloanei cu apa
Lichrochart100 RP
(pH2 cu HCI) elutie 18, gradient de
38
Referinte
1, 2, 3
fenolica fractie cu
metanol, evaporare,
re-dizolvare
Mar, para
Mere, pere,
portocale, piersici,
caise, struguri,
Izolarea
flavonoidelor:
extragerea
esantioanelor cu
metanol (ce contin
1% BHT) in
intuneric, hidroliza
de glicozide:
extragerea
esantioanelor de
acetat de etil,
hidroliza cu 2 mol lHCI, curatat cu
Sep-Pack C18,
izolarea
procianidelor:
elutia diluata a
probelor pe
Sephadex LH-20 cu
20% metanol
Centrifugarea
sucului +
standardul intern
(etil syringate), sau
extragerea sucului
cu metanol , elutia
compusilor
fenoliciprin coloana
de poliamide cu
metanol, evaporare,
re-dizolvare
Coloana:
Lichrospher100
C18, elutie
isocratica, faza
mobila:
metanol/acid acetic
glacial/ apa
(35/2/63)temperatur
a coloanei: 32 C
coloana: Hypersil
ODS, C18, gradient
de elutie sau elutie
isocratica, faza
mobila: A: acid
acetic 1%, B:
acetonitril, A/B
(81/19) sau A/B de
la 85/15 la 75/25
Concentratia
Coloana: Nova-Pak
sucului, extractia cu C18, gradient de
eter etilic, apoi cu
elutie pentru fenolii
39
Detector matrice
pentru electrodul
colorimetric
detector PDA,
284 nm
6, 5, 8
Detector PDA ,
280nm, 340 nm
ananas
acetat de etil,
evaporarea dupa
punerea in comun a
fractiilor
cu greutata
moleculara mica si
flavan-3-ols,
faza mobila: A: 2%
acid acetic, B:
metanol/ acid
acetic/ apa
(30/2/68), A/B de la 254 nm, 365 nm
100/0 la 15/85,
elutie isocratica
pentru glicozidele
flavanol,
faza mobila: A: 2,5
% acid acetic, B:
tetrahidrofuran/apa/
acid acetic
(50/47.5/2.5), A/B
(65/35), elutie
isocratica pentru
agliconii flavanol,
faza mobila:
apa/metanol/acid
acetic
(57.5/37.5/5/5)
Para, strugure
Para: izolarea
fenolilor folosind
C18 Sep-Pak,
evaporarea, redizolvarea,
strugure: filtrare
pentru acizi fenolici
si glicozide
flavonol, izolarea
procianidelor
folosind Sephadex
LH-20, evaporare,
re-dizolvare.
9
10
40
combinaie de grupuri secundare i numele lor. Exist un interes special n antocianii naturali din
industria alimentar deoarece ei pot fi folosii ca alternativ la coloranii sintetici. Exist cteva
metode analitice disponibile n literatura de specialitate bazate pe structura i concentraia
antocianidelor n fructe, dar informaii cu privire la astfel de metode sunt incomplete, n parte din
cauza limitrii n metodele de analiz. ( traducere)
41
de portocale, n Europa. Muli cercettori au studiat profilurile carotenoidelor din citrice folosind
HPLC. Tabelul 3.6 rezum condiiile de pregtire a eantioanelor i de separare HPLC n aceste
studii. Dintre toi carotenoizii prezeni n sucul de portocale, -cryptoxantin are cele mai mari
concentraii. Marea majoritate a carotenoidelor din sucul de portocale care conin grupuri de OH
pot forma esteri acizi grai, cum ar fi acizii lauric, miristic i palmitic. Concentraia
carotenoizilor individuali depinde n mod semnificativ de soiul fructului i originea geografic.
(Andrade P.B. , .a , 1998).
ntr-un studiu realizat de Philip .a. (1989) s-a stabilit c raportul calculat dintre esterii
criptoxantin i diesterii luteina ar putea fi utilizat pentru a detecta adaosul de suc de tangerine n
sucul de portocale la nivelul peste 25%. Folosind aceast metod, adugarea carotenoidelor
sintetice -caroten si -apo-8'-carotenal ar putea fi detectate la nivel de peste 5 mg kg -1 n
concentratul de suc de portocale. n plus, Pan .a. (2002) pot detecta adaosul de 100g kg-1 tangelo
la sucul de portocale pe baza raportului ntre flavonii polimetaxilati i carotenoizi, analiza
canonic de discriminare. Separarea HPLC a carotenoidelor din sucul fructelor citrice se
realizeaz conform tabelului 3.6. ( traducere)
Tabelul 3.6 Separarea HPLC a carotenoidelor din sucul fructelor citrice (traducere).
Pregtirea eantioanelor
Separarea HPLC
Referine
Omogenizarea probelor cu metanol,
Coloana: Waters Resolve C18 cu
filtrarea, extragerea rezidurilor cu
coloana de pz din aceeai rin,
aceton, adaosul de 10% de HCI
gradient de eluie, faza mobil: A:
metanolic combinat filtrat, extracie
metanol, B: acetat de etil, A/B de la
1
cu eter de petrol, evaporarea,
100/0 la (0/100), detector: lungime de
dizolvarea rezidurilor n aceton
und variabil detector de radiaii UV,
465 nm
Precipitaii de suc cu soluie apoas
Coloana: YMC C30 nelimitat, gradient
de ZnSO4H2O + K4 [Fe(CN6)]3H2O,
de eluie, faza mobil:A: eter metil-tertcentrifugare, extracie de precipitat cu butyl, B: metanol, C: apa, A/B/C de la
aceton, extracie de supernatant cu
5/90/5 la 50/50/0; detector PDA,290,
eter de petrol, evaporare de petrol,
350, 430, 486 nm
2, 3
reziduri de hidroliz cu 10% metanol
KOH, extracie de carotenoizi cu eter
etilic, evaporare. Dizolvare de
reziduri.
Extracia de suc cu acetat de etil ce
Coloana: Vydac 201TP54 C18 cu
conine BHT, evaporare, dizolvare
coloana de pz Alltima C18, eluie
isocratic, faza mobil:
acetonitril/metanol/1,2-diclormetan
(30/35/5) cu 0,1% BHT, 0,1% amin
4
trietil, i 0,05 mol acetat de amoniu,
detector: detector de scanare a spectrului
de focus, 450 nm
Centrifugarea sucului, extracia de
Coloana: Du Pont Zorbax ODS, gradient
dou ori a rezidurilor cu metanol,
de eluie, faza mobil: acetonitril,
hidroliza cu 10% metanol KOH,
clorura de metilen, tetrahidrofuran i
extracia de carotenoizi cu clorur de acetat de etil, detector: detector PDA,
5
42
43
Ungaria cu denumirea de struguri Aszu. Strugurii aszu conin amine biogenice, care apar n
special n timpul infectrii cu Botrytis cinerea. (lori.academicdirect, 2012)
Figura 3.3 reprezint marcarea lotului i lotul de ncrcare a variabilelor (amine
biogenice) i specialitile vinurilor botritizate originare din Ungaria i din strintate. Tokaji
Aszu i esena Tokaji Aszu; vinuri botritizate strine; Vinuri nebotritizate (albe) ungureti;
dezacord, 71%. Variabile: amine i-butil (iBa), necunoscute1 (Unk1), tiramine (Tyr),
necunoscute2 (Unk2), 2-metilbutilamine (2MeBa), agmatine (Agm), necunoscute3 (Unk3), 3metilbutilamine (3MeBa), n-pentilamine (npa), feniletilamine (Phe).
Compoziia de amine biogenice const n primul rnd din amine alifatice primare
specifice vinurilor botritizate. Utilizarea analizei factoriale multivariat (FA) i analiza
discriminantului liniar ,vinurile Tokaji Aszu ar putea fi clasificate i difereniate fa de vinurile
normale i de vinurile din alte origini geografice botritizate . Specificitatea compoziiei
aminelor, care depinde de infecia cu Botrytis cinerea i tehnologia de vinificare, ofer baza
pentru discriminare. (traducere)
Factor secundar
Factor primar
(a) Marcarea lotului
Factor secundar
Factor primar
44
45
47
luminii
Semine de rapi,
floarea soarelui, soia,
semine de in, de
palmier, macadn,
migdale, semine de
mac, alune, alune
braziliene, fistic
Dracocephalum
moldavica ,
Silybum arianum ,
ciuboica cucului de
sear, porumb, amarant
Palmier, grsimi calite
trans (cis, transtriacylgliceroli)
Lumina laser,
detector de
mprtiere
Acizii grai din triacylglyceroli sunt specifici speciilor de plante. Distribuia specific
speciilor de acizi grai n triacylglyceroli permite detectarea adaosului de uleiuri de origine
strin, precum i a gradului de alterare. Coninutul de trilinoleina din uleiul de msline virgin
este mai puin de 0,3 %, n timp ce alte uleiuri (de arahide, porumb, ovaz, soia, floarea soarelui,
susan, de struguri i de canola) conin trilinoleina la niveluri mai ridicate. Uleiul de soia este
detectabil la niveluri de peste 4% n uleiul de msline bazndu-se pe uleiul de trilinoleina.
Salivaras i McCurdy (1992) au detectat alterarea uleiului de msline cu ulei de canola, la
niveluri de peste 7,5 % folosind analiza modelului de recunoastere a triacylglycerolilor. Bazat pe
analiza HPLC a esterilor de cear cu ajutorul testelor statistice, poate fi identificat alterarea
uleiurilor de msline cu uleiuri extrase cu solvent .n scopul studiului tocoferolilor,
carotenoizilor i clorofilei, mai muli cercettori , Tan(1989) ; Psomiadou i Tsimidou( 1998 );
Bonvehi .a., 2000 ) au oferit o serie de instrumente sensibile alternative pentru detectarea
uleiurilor vegetale. (Amelio M. .a ,1993).
Puspitasari-Nienaber .a (2002) au constatat c profilul carotenoide/caroten analizate
prin HPLC cuplat cu o putere a obiectivului detectorului spectometric termal (TLS) i poate fi
folosit pentru a evolua autenticitatea uleiurilor din semine de in, susan de msline i germeni de
gru.Concentraiile din total -caroten i -caroten mpreun cu raportul ntre isomerii trans i
isomerii cis din caroten sunt indici fiabili pentru screening-ul rapid al uleiurilor. O alt frac ie
foarte studiat a uleiurilor i grsimilor o reprezint sterolii, care pot fi utilizai pentru detectarea
autenticitii. Recent, unul dintre instrumentele analitice cele mai utilizate a acestor compui
cuplai este lichidul cromatografic de gaz on-line (LC-GC). Adaosul solventului extras din
uleiuri la uleiurile de msline presate la rece poate fi detectat prin investigaia eritrodiolului liber
i uvaolului din uleiurile de msline. Nu este nevoie de pregtirea probei nainte de analiza LCGC, n afar de filtrare. Prin determinarea enantiomerilor filberton cuplai on-line cu HPLC-GC,
48
poate fi detectat alterarea uleiurilor de msline cu un nivel de 5-10% de uleiuri de alune virgine
i rafinate. Conform testului internaional al inelului folosind tyrosol i o component
necunoscut ca i compui cheie, s-a descoperit c analiza HPLC este potrivit pentru detectarea
adaosului uleiului de alune presat uleiul virgin de msline la 80% din eantioanele studiate. .
(Andrikopoulos N.K. , 2002 )
3.6.2 Untul de cacao i cafeau
Untul de cacao este o substan extrem de apreciat folosit nu numai n produsele
alimentare, dar i n industria produselor de patiserie. Directiva 2000/36/EC a Parlamentului
European permite utilizarea grsimilor vegetale n produsele de cacao la un nivel de pn la 5%,
n afar de untul de cacao. n acest caz, compoziia grsimilor vegetale permis pentru
suplimentare ar trebui s fie similar cu cea a untului de cacao. Aceste grsimi vegetale sunt
numite ca fiind echivalente cu untul de cacao (CBE). Detectarea i cuantificarea grsimilor CBE
este unul dintre principalele obiective ale testelor de autenticitate ale untului de cacao . (Andrade
P.B. .a, 1997).
Determinarea profilului triacilglicerolilor este un instrument util pentru evaluarea
autenticitii untului de cacao i pentru estimarea coninutului de CBE n ciocolat. Adaosul de
grsimi strine (cu excepia illipe) la untul de cacao poate fi estimat pe baza determinrii
triagliceridelor, cum ar fi dipalmitil-oleoil (POP), oleoil-palmitilstearil glicerol (POS) i disteariloleoil glicerol (SOS). Dionisi .a (2004) au elaborat un model matematic pentru a evalua
cantitatea de CBE adaugat n untul de cacao. Raportul de triacilgliceroli att din POS/PLP
(dipalmitil-linoleil glicerol) i din POP/PLS (palmitil-linoleil-stearil glicerol) discrimineaz
perfect untul de cacao i CBE-eurile pn la 5% n ciocolat. Principalii traclgliceroli, POP,
SOS,LOO (dioleoil-linoleil glicerol) i PSS (distearil-palmitil glicerol),au fost utilizate n analiza
discriminat pentru a separa 20 de eantioane n funcie de originea lor geografic. Unele grsimi
componete minore,cum ar fi tocoferolii individuali sau izomerii tocotrienoli, pot fi, deasemenea,
folosii ca indicatori la adaosul uleiurilor CBE n untul de cacao.Cu toate acestea, determinarea
cantitativ de CBE-uri n amestecuri din untul de cacao veritabil pare a fi limitat.Distribuia i
coninutul de aminoacizi n cacaoa brut variaz diferit n funcie de origine, i n unele cazuri,
pot fi gsite diferenele specifice rii i. (Andrade P.B. , .a, 1997).
Cafeaua este deasemenea valoroas i o butur foarte popular n ntreaga lume.
Exist dou specii comerciale importante: Coffea canephora var. robusta i Coffea arabica .
Arabica este considerat a fi de calitate mai bun, cu un gust fin, i care este comercializat la un
pre mai mare dect robusta. Dup prjire, diferenele vizuale ntre cele dou specii dispar, prin
urmare una dintre principalele inte ale testelor de autenticitate este de a indica dac Robusta a
fost adaugat la cafeaua Arabica. HPLC este un bun instrument de analiz a triacylglycerolilor i
tocoferolilor sau a acizilor fenolici, care sunt prezeni n cafea. Unele metode HPLC de analiz a
acestor compui sunt prezentate n Tabelul 3.8. (Andrade P.B. .a, 1997).
49
Tabelul 3.8 Separarea HPLC a untului de cacaco i a cafelei (Andrade P.B. .a, 1997).
Componente
Eantioane
Separarea HPLC
Detectare
50
Ref
Triacylglyceroli
Untul de cacao
Detector de
evaporare a
mprtierii
luminii
Boabe de cafea
Extract de
cafea Soxhlet
Tocoferoli
Extract de
cafea Soxhlet
Tocoferoli
tocotrienoli
Unt de cacao,
CBE
Detector de
evaporare a
mprtierii
luminii
Detector PDA,
ESI-MS/MS
Detectorul
indicelui de
refracie
51
Detector de
fluorescenta, 330
nm (excitaie 290
nm)
Detector de
fluorescen, 330
nm (excitaie 290
nm)
52
(traducere).
Detectare
Referine
Detector
PDA, 215 nm
Detector
PDA, 280 nm
Detector UV,
205 nm
Lapte de
caprine, ovine,
bovine n brnza
de vac*, lapte
de oaie,capr n
brnz
Lapte de ovine,
bovine n laptele
de caprine
para--cazeina
* cazeina i
para--cazeina
-, -, -cazeina
Detector
UV/VIS, 280
nm
Detector
pentru
lungimea de
und variabil
UV, 280 nm
4,5*
6,7
Analiza cazeinei prin HPLC este o metod bine standardizat pentru detectarea adaosului
de zer n chegat la laptele praf. (UE, 1990).
Separarea i cuantificarea fraciunilor majore de cazein (-, -, - si para -cazeina)
poate fi un instrument util pentru recunoaterea adaosului de lapte strin la lapte sau brnz. Prin
analiza cazeinei utiliznd HPLC, 20% din laptele de bovine poate fi detectat n laptele i
branza de ovine. (S. Gocan, 2002).
Torre .a, (1996) a dezvoltat o metod HPLC bazat pe analiza de -lactoglobuline.
Metoda pare s fie util n detectarea de proteine omologate din zer din amestecuri de lapte de
specii diferite (vac, oaie, capr). Nivelurile ridicate de -lactoglobuline denaturate, folsine i
lactulozapoate indic un plus de lapte nclzit la temperaturi ridicate. Nivelurile ridicate de
furosine indic prezena de lapte praf reconstituit.Cuantificarea -lactoglobulinelor prin HPLC
poate fi utilizat pentru determinarea originii laptelui de la diferite specii de animale de
exemplu, poate fi detectat lapte de bovine, ovine i caprine n branz i adaos de lapte de bovine
la apa mozarellei de bivoli. (hplc.chem.shu.edu, 2012).
53
Cap IV Concluzii
54
Bibliografie
1. Amelio M. Rizzo R. and Varazini F. ,1993, Separarea esterilor de cear din uleiurile de
msline prin cromatografia lichid de nalt performan. Journal of the American Oil Chemists
Society .
2. Andrade P.B. , Leitao , R. , Seabra , R.M. et Al, 1997, Nivelurile de acid 3,4-dimethoxycinamic
ca un instrument de difereniere a cafelei canefora respectiv.robusta i cafeaua arabica Food
Chemistry.
3. Andrade P.B. , Carvalho , A.R.F. , Seabra , R.M. and Ferreira , M.A. , 1998, Un studiu
anterior al profilelor fenolice din piureurile de gutui, pere, mere prin detectarea mediului diodei
HPLC pentru detectarea i evaluarea autenticitii piureului de gutui. Journal of Agricultural
and Food Chemistry .
4. Andrikopoulos N.K. 2002 ,Compoziia speciilor de trigliceride din uleiurile vegetale
comestibile comune i metodele utilizate pentru identificarea i cuantificarea lor. Food Reviews
5. C. Luca, Al. Duca, Al Crian, 1983, Chimie Analitic i Analiz instrumental, Editura
Bucureti International.
6. H. Nacu, 2003, Metode i Tehnici de Analiz Instrumental,Editura U.T.PRES, Cluj-Napoca.
7. S. Gocan,2002, Cromatografie de nalt Performan Partea a II a, Cromatografia de lichide
pe coloan, Editura Risoprint, Cluj- Napoca.
8. *Directiva 2000/36/EC a Parlamentului European permite utilizarea grsimilor vegetale n
produsele de cacao la un nivel de pn la 5%, n afar de untul de cacao.
9. *Directiva Consiliului 2001/110/EC privind regulile de compoziie i fabricare a mierii.
10*Directiva 2000/36/EC a Parlamentului European privind utilizarea grsimilor vegetale n
produsele de cacao.
11.*Hotrrea UE din 1990 privind brnzeturile.
12.* http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html.
13.* lori.academicdirect.org/books/work_list.php?user=lori&id=207.
14.* http/ wikipedia.ro.
.
55