Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Tehnici cromatografice
MASTER: CRIMINALISTICA
ANUL UNIVERSITAR 2012-2013
SEMESTRUL II
alfa-caroten
beta-caroten
în aceeaşi perioadă, Winterstein separa pe o coloană cu umplutură de
CaCO3 (cu diametru de 7 cm) două xantofile, violaxantina (pigment
xantofilic de culoare portocalie care protejează plantele de eventualele
distrugeri foto-oxidative) şi luteina (carotenoid natural cu acţiune
antioxidantă)
3
luteina violaxantina
Aspecte generale
1903 Tswett: Fenomenul de adsorbţie în coloană cu umplutură
1931 Kuhn, Lederer, Winterstein: Primele separări semnificative din punct de vedere
preparativ
1937 Tiselius: Electroforeza soluţiilor libere într-un tub
1938 Izmailov, Shraiber: Cromatografia în strat subţire (TLC)
1941 Martin, Synge: Cromatografia de partitie/repartiţie (liquid chromatography,
LC)
1944 Consden, Gordon, Martin: Cromatografia pe hârtie (planar chromatography, PC)
1949 Spedding, Tompkins: Cromatografie de schimb ionic (ionic exchange
chromatography, IEC)
1952 James, Martin: Cromatografia de gaze (gas chromatography, GC)
1957 Galay: Cromatografia de gaze cu coloane capilare (CGC)
1959 Parath, Fladin: Gel cromatografia - gel filtrarea
1966 Piel: Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (high performance
(pressure) liquid chromatography, HPLC)
1969 Klesper: Cromatografia de fluide supercritice (supercritical fluid chromatography,
SFC)
4
1981 Nakagawa: Cromatografia electrocinetică
Aspecte generale
Synge spunea
5
Aspecte generale
7
Procesul de distributie a solutului/analitului
Faza
mobila uB uA Spre detector
(u)
B A
Injectie u - viteza liniara a fazei mobile Elutia solutilor
A+B tr,A < tr,B
Solutul i (A sau B) se
iM Faza mobila
distribuie intre faze
iS Faza stationara
8
Distributia solutului (analitului) între două faze
K D = C S CM
CS denotă concentraţiile solutului în faza staţionară
CM concentraţiile solutului în faza mobilă
La distribuţia solutului determinată pe criterii statistice KD are
intotdeauna valoare unitară
Procesul este însoţit (biased) de procesele chimice suplimentare ale
celor două faze şi, din acest motiv, KD este diferit de valoare 1
Pentru sistemele în care solutul are afinitate mare pentru faza staţionară,
KD poate avea valori mari (KD >1)
Pentru sistemele în care solutul preferă faza mobilă, KD ia valori foarte mici
(KD < 1))
9
Separarea cromatografică a solutului (analitului)
Faza mobila
Zona pentru B
Zona pentru A A
B
11
Tipuri de izoterme si forma picurilor în
cromatografie
B C
A
Picuri distorsionate. Profilul concentraţiei unui analit de-a lungul coloanei funcţie de distanţa parcursă
de la intarea în coloană. A, profil pentru KD constant. B, profil pentru izoterma de tip B. C, profil pentru
izoterma de tip C. 13
Distribuţia benzilor cromatografice. Lărgirea
benzilor cromatografice
Lăţire sau largirea picurilor - proces inevitabil în cromatografie
De nedorit atunci când se are în vedere separarea unor picuri multiple
Picurile oblice sunt nedorite
Cu cât izoterma este mai convexă (concavă), cu atât efectul va fi mai pronunţat şi
mai dăunător
Examinarea picurilor dintr-o cromatogramă reliefează similarităţi cu o curbă de
distribuţie Gaussiană
Cmax
0,607Cmax 2σ
0,5Cmax w1/2
tR
W
0
0 Timp
Parametrii cantitativi
înălţimea picului (h)
aria picului cromatografic (A) iar
Parametrii calitativi
timpii de retenţie (tR = L/v unde L este lungimea coloanei şi v este viteza de eluţie a
unui component)
volumele de retenţie
Timpul mort, tM, este timpul necesar eluentului sau unui component nereţinut
de faza staţionară să ajungă la detector
Timpul de reţinere, tR, reprezintă timpul necesar componenţilor să ajungă la 15
detector
Informaţii ce se pot obţine dintr-o cromatogramă
Coeficientul de partiţie
CS
KD =
CM
Timpul de retenţie
parametrul calitativ care redă timpul necesar după efectuarea injecţiei
pentru ca picul analitului să ajungă la detector (tR)
Timpul mort (aferent noţiunii de void volume)
timpul necesar speciilor nereţinute de coloană să ajungă la detector (tM)
Viteza liniară medie v (deplasarea analitilor)
L
v=
tR
Viteza liniară medie u (deplasarea moleculelor fazei mobile)
L
u=
tM
L - lungimea coloanei
17
Overview pentru parametrii cu care se operează
Factorul de capacitate kA’
parametru important folosit pentru descrierea vitezelor de migrare a analiţilor
prin coloană
funcţie de tipul cromatografiei implicate, de adsorbţie, de schimb ionic, de
excluziune sterică, factorul a fost denumit coeficient de adsorbţie, de
distribuţie ionică, respectiv de difuziune.
pentru o specie oarecare A, factorul de capacitate kA’ definit prin relaţia:
K A VS
k 'A =
VM
C M VM 1 1 1
v = u× = u× = u× v = u ×
1+ k A
'
C M VM + C S VS 1 + C S VS / C M VM 1 + KVS / VM
factor de capacitate mare indică o reţinere mai puternică în coloană a unui
component
cuprinşi între 1 şi 5
L L 1 tR − tM
= × kA =
'
tR t M 1 + k 'A tM
k’ = 0
18
k’ = 1
Overview pentru parametrii cu care se operează
KB
α=
KA K A VS
k 'A =
VM '
k
α = 'B tR − tM
kA k 'A =
tM
t R(B) − t M
α=
t R(A) − t M
19
Overview pentru parametrii cu care se operează
Rezoluţia (R)
termenul cel mai adesea utilizat (
2(V2 − V1 ) 2 t R 2 − t R 1 )
R= =
pentru a descrie calitatea separării w1 + w 2 w1 + w 2
cromatografice
∆Z 2 ⋅ ∆Z 2[(t R )B − (t R )A ]
RS = = =
furnizează o măsură cantitativă a W A /2 + WB /2 W A + WB W A + WB
capacităţii sale de a separa doi analiţi
V1 si V2 sunt volumele de eluent V1
folosite pentru eluţia a doi analiţi
adiacenţi
V2
w1 si w2 sunt lăţimile picurilor la bază,
determinate prin trasarea tangentelor
la punctele de inflexiune ale picurilor
(∆Z = tR2 – tR1)
W1
W2
Eficienta scazuta
Rezolutie slaba
Eficienta crescuta
Rezolutie buna
∆t R
Rs =
w
( tR )B − ( tR ) A
=
0.5 ( wA + wB )
Rezolutie
Rs ≥ 1.5
Rezolutii ≥ 0.8 sunt necesare pentru a obtine arii de incredere ale picurilor
cromatografice 22
Migrarea solutilor si largirea benzilor
Daca efectul de largire este marcant, este posibil ca separarea sa nu aiba loc.
De aceea, efectul de largire trebuie minimizat.
23
Eficienta coloanei sau inaltimea unui taler, H
Dispersia pe unitatea de lungime
Dispersare: Imprastiere.
Deviatia standard (σ) este o masura a dispersiei
Profilul analitului la
sfarsitul coloanei
Numar molecule
σ2
H=
L
Distanta migrata
Umplutura
Pentru a minimiza efectul de largire
• minimizarea dispersiei (σ)
• minimizarea lui H
Proba in Detector
24
Calculul numarului de talere si a inaltimii unui taler
Punct de
inflexiune
2
⎛ tr ⎞ H=
L
N = 16 ⎜ ⎟
⎝ w⎠ N
tr si w trebuie sa aiba aceleasi unitati (timp sau distanta)
25
Teorii care guverneaza separarile cromatografice
Teoria talerelor
Teoria cinetică
Eficienţa coloanelor cromatografice creşte odată cu
creşterea numărului talerelor şi odată cu scăderea
înălţimii talerului
Eficienţa, în termeni de număr de talere, poate varia de
la câteva sute la câteva sute de mii, în timp ce, înălţimea
unui taler poate varia de la câteva zeci la o mie µm, sau
chiar dimensiuni mai mici.
26
Teoria talerelor
faza stationara 0 1 2 3 n
Sistemul anterior prezentat include o serie de talere pe parcursul cărora conţinutul fazei
mobile din talerul 0 este transferat în talerul 1, ulterior 2, în timp ce conţinutul
corespunzător fazei staţionare rămâne stabil. Se poate considera o moleculă care se află
în talerul 0. După echilibrare, faza mobilă din talerul 0 este transferată în talerul 1 cu o
probabilitate p. În alte cuvinte, se poate spune că un transfer va permite deplasarea
moleculei printr-un număr de p talere astfel încât, numărul etapei (M) în care molecula se
află cu cea mai mare probabilitate după un număr de r transferuri va fi dat de relaţia M =
r×p. Pentru un număr mare de molecule, talerul M este talerul în care concentraţia
moleculelor va fi maximă.
Limitari ale teoriei talerelor:
are capacitate redusă de a prezice valori reale
poate oferi o relaţie de legătură credibilă între lărgimea benzii şi lungimea acesteia
nu poate furniza o modalitate de prezicere a mărimii dispersiei
nu pot fi prezise efectele modificării unor variabile cum ar fi debitul sau dimensiunea particulei, întrucât
nu se ţine cont de aceşti factori
Avantaj - simplitatea abordării 27
Teoria cinetică şi variabile cinetice care afectează
lărgirea benzilor
B/u
28
-1
Viteza liniara a fazei mobile, u, cm s
Cromatografia
1. Cromatografia lichid-lichid
2. Cromatografia lichid-solid
3. Cromatografia gaz-lichid/gaz-solid
29
Cromatografia
Cromatografia lichid-lichid
Tehnici:
1. Cromatografia pe hartie
30
Cromatografia
Cromatografia solid-lichid
Tehnici:
1. Cromatografia pe coloana
2. Cromatografia in strat subtire (TLC)
3. Cromatografia secventiala pe coloana
4. Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
31
Cromatografia
Cromatografia gaz-lichid
Cromatografia gaz-lichid
Tehnici:
1. Cromatografia de gaze
32
Cromatografia
Adsorbenti utilizati in cromatografie
33
Cromatografia
Legături de hidrogen
Legături de
hidrogen
34
Cromatografia
Interacţiile ionice
interactiile dintre doi ioni de sarcină opusă prezintă de asemenea o tărie crescută (40-400
kJ/mol)
35
Cromatografia
Adsorbenti uzuali folositi in cromatografia pe coloana
Alumina
Cresterea puterii
Carbune activat
de adsorbtie Silicat de magneziu
pentru molecule Silica gel
polare Carbonati anorganici
Celuloza, sucroza
36
Cromatografia
R R R
Alumina Al2O3·xH2O
O
δ- δ+ O
δ- δ+
O Al
R O O Al
C O RO O
δ+ δ− H
R δ+
dipol-dipol legaturi de H
37
Cromatografia
δ- +
O
δ-O δAl
+ O H
O Al -
RCOO
O δ-
O
R N H2
formare de saruri > legaturi de H > dipol-dipol > Van der Waals
38
Cromatografia
Ordinea de elutie asteptata a claselor de compusi organici
rapid alcani RH
alchene R2C CR2
eteri R2O
hidrocarburi halogenate RX
CH3
40
Cromatografia
Solventi utilizati in cromatografia pe coloana
Nume Structura
Cromatografia pe hartie
42
Cromatografia pe hârtie (paper chromatography, PC)
CS
D=
CM
43
Cromatografia pe hârtie
Funcţie de sensul de migrare a fazei mobile de-a lungul fazei staţionare
cromatografia descendentă – faza mobilă migrează în sensul forţelor de gravitaţie
cromatografia ascendentă – faza mobilă migrează prin forţe capilare în sens invers
forţei de gravitaţie
cromatografia radială, circulară sau pe discuri – faza mobilă migrează din centrul
discului de hârtie de filtru în direcţie radială
44
Cromatografia pe hârtie
OH H OH H
O O
H H
H H
O O
CH2OH m CH2OCOCH3 m
45
celuloza celuloza monoacetat
Cromatografia in strat subtire
46
Cromatografia în strat subţire
47
Adorbenţi folosiţi în TLC
48
Adorbenţi folosiţi în TLC
δ-
δ+ O OH
δ+
SILICAGELUL Si Si
adsorbentul cu cea mai largă utilizare (caracter δ-
O O
polar, slab acid) δ-
este produsul de policondensare a cidului orto-silicic
- +
Si OH Si O +H
CH3 CH3
H
Si O Si + H3C Si N Si CH3 Si O Si Si O Si
OH OH CH3 CH3 O CH O O O
3
Si
H3C Si Si CH3 H3C CH3
49
CH3 H3C CH
3
Adorbenţi folosiţi în TLC
ALUMINA
caracter bazic si mult mai reactiva decat silica gelul
după natura grupărilor funcţionale superficiale pe care le prezintă alumina există
trei tipuri de faze staţionare pe baza de alumina
OH OH
Al O Al a) Alumină acidă
O
b) Alumină neutră obţinută prin dehidroxilare
Al O Al
- + - +
O Na O Na
Al O Al c) Alumină bazică
50
Interactii si mecanisme de actiune în TLC
Adsorbtia solutilor/analitilor
Intensitatea adsorbtiei compusilor creste cu cresterea polaritatii grupelor
functionale, asa cum este aratat mai jos:
-CH=CH2, -X, -OR, -CHO, -CO2R, -NR2, -NH2, -OH, -CONR2, -CO2H.
(slab adsorbiti) (puternic adsorbiti)
(nepolari) (mult mai polari)
52
Interactii si mecanisme de actiune în TLC
53
Proprietatile solventilor si puterea de elutie
o
Solvent MF Bp ( C) Hazards* Dipole Elution
MW Density (g/mL) Stength
(ε)
Hexane C6H14 68.7 Flammable 0.08 0.01
CH3(CH2)4CH3 86.17 0.659 Toxic
55
Dezvoltarea cromatogramei şi detecţia (localizarea)
analiţilor pe cromatoplacă
Pentru separări se folosesc cromatoplaci activate (introducerea în etuvă la o
temperatură în jur de 100 oC, timp de 45 minute – 1 oră)
Pentru localizarea spoturilor (vizualizare) după realizarea separării se pot folosi atât
reactivi anorganici cât şi organici
Metodele de localizare a spoturilor pot fi sistematizate în orice caz după cum urmează:
folosirea caracteristicilor de luminiscenţă a analitului (fenomenul de fluorescenţă pentru
compuşi organici şi fenomenul de fosforescenţă pentru compuşi anorganici)
impregnarea stratului fazei staţionare cu o substanţă indicatoare fluorescentă (ca substanţe
indicatori se pot folosi derivaţii de piren, fluoresceina, morina sau rodamina B)
spray-ere cu un oxidant pouternic nespecific (HNO3, KMnO4, H2SO4). Apar spoturi negre la
oxidarea compyşilor organici
spray-ere cu soluţii de reactivi specifici (ninhidrina pentru a vizualiza gruparea NH2 conform
reactiei de mai jos)
O O O
C C
OH
C
R-NH2 C N Formarea produsului colorat în albastru
OH din reacţia dintre ninhidrină şi grupările
C C
NH2.
O O
O 56
ninhidrina produs albastru colorat
Vizualizarea
Metode destructive
Pulverizarea placutei cu H2SO4, urmata de uscare la 110
ºC pentru 15-20 minute. Compusii vor fi distrusi dar toate
spoturile vor fi vizibile
Metode nedestructive – datorita utilizarii luminii UV
probele nu vor fi distruse. In orice caz, nu toate
spoturile de pe placuta vor fi vizibile.
Lungimi de unda lungi UV
Lungimi de unda scurte UV
Vizualizare semi-destructiva
57
Definiţia şi metodele de calcul pentru factorul Rf
Rf – factor de retardare/intarzaiere/retentie
58
Valorile specifice factorului Rf
daca valoarea este peste 0,0 sau mai mica decat 1,0, se
considera ca exista o greseala de calcul
Daca valorile factorului Rf sunt mai mari de 0,8 sau mai mici
de 0,2 valorile sunt greu de interpretat, ceea ce poate conduce
la erori
59
Separarea unui amestec de butil amina si
ciclohexan pe o placuta TLC
Aspecte de avut in vedere:
1. Polaritatea fiecarui compus din amestec
Butil amina este polara; ciclohexanul este nepolar
2. Polaritatea fazei stationare
Silica gel (sau alumina) este polar – inseamna ca butil amina va interactiona
cu faza stationara mult mai puternic
3. Polaritatea fazei mobile - solventul: se determina ce solvent se foloseste
H2
C
H2C CH2
H2C CH2
C
Predictii: H2
Ciclohexanul va elua primul/mai rapid prin faza stationara δ-
Butil amina va elua ultima/mai incet O O
δ+
δ+ Si
δ-
N H
Predictii la folosirea unei faze mobile nepolare:
Ciclohexanul si butil amina vor fi transportate de faza mobila H
Ciclohexanul va elua primul/mai rapid prin faza stationara
Butil amina va elua ultima/mai incet deoarece interactionaeaza si cu silica gelul
pe masura ce se deplaseaza 60
Separarea unui amestec de analgezice pe o placuta
TLC
Ac As C I
Aspirin
Spotul spot
aspirinei
placuta TLC (etichetata) Caffeine spot
Spotul cafeinei
cu probele incarcate
Aceaminophen
Spotul spot
acetaminofenului Spotul ibuprofenului
Ibuprofen spot
PREZICETI ORDINEA
ELUTIEI ACESTOR
COMPUSI PE O PLACUTA depth offazei
Nivelul mobile phase
mobile
pencil mark 1 cm
Linia de baza la 1 cm de la
De SILICAGEL FOLOSIND from bottom
partea inferioara
CA ELUENT…..
OH
CO2H O CH3
O CH3 H3C N
N
HN O
O N
O N
Aspirin
Aspirina CH3 CH3
CO2H
Acetaminophen
Acetaminofen Caffeine
Cafeina
Ibuprofen
Ibuprofen
61
Pros si cons pentru TLC
PROS
Sensibilitatea
Viteza
Costuri relativ scazute
CONS
Cantitati prea mici din probe
Cantitati prea mari din probe
Subiectiva
62
Cromatografia de lichide (faza mobila lichid, faza
stationara solid)/clasificare dupa principiul de separare
Cromatografia de partiţie/repartiţie
cromatografie de repartiţie directă (cu faze normale – clasică)
cromatografia de repartiţie cu faze inversate – metoda preferată în prezent
– pe care se realizează cele mai numeroase separări
Cromatografia prin schimb ionic
cromatografie de transfer cu schimb ionic clasic în procesul de bază din
coloana cromatografică
cromatografie prin perechi de ioni (substanţe ionice sau ionizabile)
foloseşte faze staţionare capabile să fixeze ioni de semn contrar (derivă din
LC)
Cromatografia de afinitate
afinitatea specifică a unor molecule cu alte molecule fixate pe suport
Cromatografia de excluziune
efectul indus de mărimea moleculelor, ceea ce înseamnă că molecule de o
anumită dimensiune nu pot intra în porii unui sorbent utilizat şi sunt excluşi
în raport cu molecule de dimensiuni mai mici
Faza mobila
Timp 1 2 3 4 5
64
Scopul cromatografiei de lichide de înaltă
performanţă Cresterea polaritatii
65
Aplicaţiile cromatografiei de lichide.
Instrumente folosite în cromatografia de lichide de
înaltă performanţă
Componentele unui cromatograf de lichide
Rezervor pentru mediul de eluţie conţinând solventul pentru faza mobilă
Coloana de separare în care materialul de umplutură este păstrat prin
intermediul unor frite
Seringă sau valvă de injecţie pentru introducerea probei
Colector de fracţiuni prin intermediul căruia câţiva mL de eluat din coloană
sunt colectaţi automat
Amortizare Injector,
Valvă pulsuri tip “6 căi”
partiţionare
solvent Pompă
Pre-coloană
Rezervoare fază
mobilă Detector 66
Faza mobila in cromatografia de lichide
Tăria relativa a celor mai comune faze mobile (monocomponente) utilizate în cromatografia de repartitie
cu faze normale sau inversate.
↓ ↑
toluen 2.4 286
dietil eter 2.8 218
tetrahidrofuran 4.0 220
etanol 4.3 210
etil acetat 4.4 255
dioxan 4.8 215
metanol 5.1 210
acetonitril 5.8 190
apa 10.2 —
68
Faze stationare în cromatografia de lichide de înaltă
performanţă
69
Faze stationare în cromatografia de lichide de înaltă
performanţă
(a) (b)
Aspectul granulelor de silicagel folosite frecvent la umplerea coloanelor în HPLC (a) şi aspectul unei
granule sferice cu fază staţionară chimic legată pe suprafaţa suportului (b). 70
Faze stationare în cromatografia de lichide de înaltă
performanţă
Coloanele monolit - realizate din aceleaşi materii prime ca şi la silicagelul
sferic
coloana este formată direct în tubul rigid (metalic), de unde şi numele
se pot obţine coloane cu performanţe superioare faţă de cele umplute cu granule
tipuri de grupe silanol superficiale
I – legate
II – reactive
III – libere
in funcţie de tehnologia de obţinere diferă şi porozitatea internă, suprafaţa
specifică, rezistenţa la compresiune şi polaritatea
(a) (b)
Aspectul coloanelor monolit (a) şi principalele tipuri de grupări silanolice superficiale (b). 71
Cromatografia cu faze normale si faze inversate
72
Cromatografia de lichide cu faza stationara de
polaritate normala
silice
O
Grupa polara HO Si
O
Componentii
Componentiielueaza
elueazainin
ordinea
ordineacresterii
cresteriipolaritatii
polaritatii
73
Cromatografia de lichide cu faza stationara de
polaritate inversata
silice
faza C18 Me O
Si O Si
Me O
Componentii
Componentiielueaza
elueazainin
ordinea
ordineascaderii
scaderiipolaritatii
polaritatii
74
Detectori utilizaţi în HPLC
75
Detectori spectrofotometrici în UV-VIS
Lampa Lampa UV
Ieşire
Ferestre
Lumina
Fotocelule Lumina UV fluorescentă
78
Aplicatii ale tehnicii HPLC
Standarde
8
7
6
5 2-NP
2,4-DNP
4 4-NP
amestec nitrofenoli
3 3-NP
2,5-DNP 50
2 Blanc
1
40
0
-500 -1 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
30
20
10
0
-5 0 5 10 15 20 25
79
-10
Aplicatii ale tehnicii HPLC
Mediu
Fenoli in apele potabile
Identificarea difenhidraminei in probele de sedimente
Biomonitorizarea poluarii cu hidrocarburi aromatice policiclice in lacurile montane de la mare altitudine
prin analiza fierii pestilor
Estrogeni in apele de coasta
Toxicitatea tetraciclinei si a produsilor de degradare ai tetraciclinei asupra bacteriilor
Atribuirea toxicitatii TNT asupra sedimentelor
Criminalistica
Cu un HPLC portabil la diferite petreceri – identificarea si cuantificarea direct la locatie a drogurilor
Ecstasy
Identificarea steroizilor anabolici in ser, urina, transpiratie si par
Analiza criminalistica a colorantilor textili
Determinarea cocainei si a metabolitilor in meconiu
Cuantificarea simultana a drogurilor psihoterapeutice in plasma umana
Clinic
Cuantificarea DEET un urina umana
Analiza antibioticelor
Excretie urinara intensificata a aquaporin 2 la pacientii cu ciroza hepatica
Detectarea neuropeptidelor endogene in fluidele extracelulare din creier
Alimente si aromatizanti
Asigurarea consistentei si calitatii bauturilor racoritoare
Analiza dicetonelor vicinale in bere
Analiza zaharurilor in sucurile din fructe
Analiza hidrocsarburilor aromatice policiclice in legumele si fructele Braziliene
Analiza urmelor de agenti chimici folositi in agricultura
80
Stabilitatea aspratamului in prezenta glucozei si a vanilinei
Cromatografia ionica
stiren
divinil benzen
Locaţie pentru
schimb ionic Interlegătură
82
Mecanisme de separare
83
Detectori conductometrici de supresie
detectorii conductometrici
sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici
specifici şi suficient de sensibili (500 pg – 1 ng)
sisteme caracterizate de sensibilitate ridicată, stabilitate, flexibilitate, acurateţe
şi reproductibilitate, şi de capacitate mare de a furniza date de încredere
la ieşirea din coloana cromatografică ionii nu pot fi detectaţi suficient de sensibil pe
cale conductometrică în mod direct (concentraţii coborâte, conţinuţi în eluentul format
dintr-un electrolit cu o concentraţie comparabilă sau chiar mai mare)
autosupresorul transforma eluentul (un acid sau o bază tare) în apă
eluent acid (acidul clorhidric) coloana supresor umplută cu o răşină schimbătoare de
anioni cu formula generală R-OH, caracterizată de capacitate de schimb mare
coloana de separare redată ca RH
coloana de supresie redata ca ROH
eluentul care conţine acid clorhidric diluat de exemplu, la ieşirea din coloana de
separare va pătrunde în coloana supresor unde se va petrece reacţia:
R-OH + (H+ + Cl-) → R-Cl + H2O
sărurile speciilor ionice de interes se transformă în hidroxizii corespunzători:
R-OH + (Na+ + Cl-) → R-Cl + (Na+ + OH-)
84
R-OH + (K+ + Cl-) → R-Cl + (K+ + OH-)
Supresorul electrochimic
85
Supresorul electrochimic
sistemul de supresie cu autoregenerare, înlocuieşte ionii de sodiu, Na+, (şi alţi cationi)
din eluent şi îi transportă odată cu ionii hidroniu (H+ sau H3O+) din apa folosită ca
regenerant
ionii hidroniu se combină cu ionii hidroxid (OH-) rezultaţi din eluent şi formează apa,
care are o conductivitatea mult mai mică decât a hidroxidului de sodiu folosit ca
eluent
conductivitatea analitului este intensificată deoarece anionii analitului se asociază cu
ionii hidroniu care sunt mult mai conductivi
µS Ionii
interferenţi 2-
SO4
-
Coloana - Cl
analitică F
Tim
NaF, NaCl, Na2SO4, în H2O
Separare prin supresie
Reziduuri 2-
Sistem de µS - SO4
supresie cu Cl
regenerare -
H2O F
- -
H2O MSA OH
H2O
+ - -
H + OH =H2O H2 + OH
+
H + O2
Analit şi H2O
H2O
H2O
H2O H2O
Spre detector
Analit şi H2O
87
IC-Dionex-3000
Imagine de ansamblu
Sectiune pompa
Sectiune corp
coloana/detector/supresor
88
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor
ionice F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-,
C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+
Solut 2
Faza staţ
staţionară moleculele cu sarcina mare
sunt mai puternic retinute de
faza stationara, se
deplaseaza mai incet prin
coloana si se elueaza mai
tarziu
moleculele cu sarcina medie
se chilibreaza intre faza
stationara si faza mobila mult
mai usor
moleculele cu sarcina mica
sunt mai slab retinute de faza
stationara, se deplaseaza mai
rapid prin coloana si se
elueaza mai repede
89
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor
ionice F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-,
C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+
faza mobila
anioni: 4,5 mM Na2CO3 şi 1,4 mM NaHCO3
cationi: 6 mM acid metansulfonic (CH3SO3H)
alte materiale
apă ultra pură: 18,2 MΩ.cm rezistivitate
ion cromatograf DIONEX ICS-3000
90
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor
ionice F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-,
C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+
Exemple de cromatograme la analiza cationilor/anionilor
- cationi
- anioni
91
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor
ionice F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-,
C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+
Cromatograma cu efect de
deformare
Cromatograma cu vizualizarea
picurilor unor analiti in
concentratii mici/sensibilitate
scazuta a instrumentului
92
Cromatografia de gaze/Aspecte generale
HPLC GC
94
Instrumentaţia cromatografiei de gaze
compuşii amestecului supus separării pot fi atât lichide cât şi solide volatile
substanţele de analizat se introduc în coloana de separare, la o
temperatură superioară celei de volatilizare, prin intermediul unui dispozitiv
de introducere a probei
Debit-metru
Control debit
Cuptor
Faza
mobilă
Coloană
95
Schema de principiu a unui cromatograf de gaze
Gazul purtator in cromatografia de gaze
Inert
Heliu
96
Sisteme de injecţie
97
Sisteme de injecţie
98
Injectia split/splitless
Split Splitless
100
Sisteme de injecţie
Introducerea probelor gazoase – cilindri de un
anumit volum (prevazuti cu robinete)
101
Coloane si faze stationare
Materiale utilizate in realizarea coloanelor
metal (1957)
sticla (1959)
silice topita (1979)
aluminiu placat (1984)
materiale inerte (1990)
Alte caracteristici
alegerea fazei stationare determina selectivitatea
sute de faze disponibile
multe faze dau separare similara
aceleasi faze pot avea nume diferite
alegerea fazei stationare pentru coloanele capilare mult mai simpla
asemanator dizolva asemanator
fazele polare se utilizeaza pentru compusi polari
fazele nepolare se utilizeaza pentru compusi nepolari
102
Caracteristicile coloanelor capilare
Caracteristici
lungime (10 m – 50 m)
103
Criterii de alegere a coloanelor capilare
105
Capacitatea coloanelor
106
Coloane folosite in gaz cromatografie
COLOANE
UMPLUTE CAPILARE
Coloanele tip “wide bore, 530 mm”, nu sunt coloane capilare in adevaratul sens
al cuvantului si permit folosirea unor debite ale gazului purtător de pana la 15 mL
min-1. Au performante superioare coloanelor cu umplutura
Coloanele capilare presupun folosirea unor debite de cel mult 1,5 mL min-1
107
Sectiuni prin coloane
Coloane capilare
Lungime: 10 m la 100 m
Diametre: 180 µm, 250 µm, 320 µm & 530 µm
Debite:
1,0 mL/min la 250 µm
1,5 mL/min la 320 µm
2,0 mL/min la 530 µm
acoperite cu poliimida
polyimide coating
capilara din
fused silica
silicecapillary
topita
faza
stationary
phase
stationara WCOT PLOT SCOT
Wall Coated Porous Layer Support Coated
Open Tube Open Tube Open Tube
Coloane cu umplutura
Lungime: < 2 m
Diametre: 1/8” & ¼”
108
Faze stationare
nepolar polar
109
Faze stationare
R R R
R Si O Si O Si
R R nR
Faze staţionare folosite în GC: siliconice –nepolare, intermediare şi polare şi polietilenglicolice – polare.
112
Detectorii gaz cromatografici
detectori preferaţi
detectorul bazat pe conductibilitate termică (TCD)
detectorul cu ionizare în flacără (FID), neselectiv, sensibil la compuşii
organici C-H
detectorul cu fotoionizare (PID), selectiv la compuşi aromatici şi
nesaturaţi
detectorul cu captura de electroni (ECD) sau de conductivitate
electrolitică (ELCD), sensibili la compuşii cloruraţi şi oxigenaţi
detectorul azot-fosfor (NPD), selectiv faţă de compuşii cu conţinut de N
şi P
detectorul flam-fotometric (FPD), selectiv pentru compuşii ce conţin S
şi P
spectrometrul de masă, universal.
efectul asupra probei poate fi destructiv sau nedestructiv
FID este un detector destructiv
TCD este nedestructiv iar proba separată poate fi izolată
113
Detectorul de ionizare în flacara (FID) Colector
Sursă tensiune
Aer
H2
Coloană
în detector, gazul purtător (N2) este ionizat de către o sursa ß- radioactivă (câţiva mCi furnizaţi de
o sursă conţinând 63Ni sau tritiu adsorbiţi pe o folie de platină sau titan), şi trece printre doi
electrozi, între care se asigură o cădere de tensiune de 100V
in lipsa oricărei molecule organice în gazul purtător există un curent de bază redus datorat
azotului molecular (N2) – molecule ionizate negativ
la apariţia în detector a unei molecule organice M, care conţine elemente electronegative (Cl, F) -
cu afinitate pentru electroni, aceasta va “capta” parte dintre electronii radiaţiei ß-, diminuând
curentul de recombinare a ionilor de semne contrare prin această ecranare:
N2 = N2+ + e- Curent de fond
M + e- = M-
M- + N2+ = M + N2 Ecranarea curentului de fond din ultimile două reacţii
detectorul este unul selectiv, adecvat pentru detecţia compuşilor halogenaţi (pesticide)
nu este sensibil la grupări aminice, alcooli şi hidrocarburi
nu afectează proba ca detectorul FID (efect nondestructiv)
dezavantaj: domeniul de răspuns liniar este limitat la aproximativ două ordine de mărime
Electrod +
116
Cromatografia gaz-lichid/coloane capilare/overview
117
Cromatograma reala pentru fractiuni petroliere
superioare
118
Cromatograma obtinuta la analiza pesticidelor
halogenate din apa
DDT
1. α-HCH
2. γ-HCH
3. β-HCH 4 7 10
4. Heptachlor
11
5. δ-HCH 6
6. Aldrin
8 12
7. Heptachlor epoxide
8. Endosulfan I 13
9. 4,4’-DDE 9 14
10. Dieldrin 1
11. Endrin 5 15
12. 4,4’-DDD
13. Endosulfan II
17 18
14. 4,4’-DDT 3 16
15. Endrin aldehyde
2
16. Endosulfan sulfate
17. Methoxychlor
18. Endrin ketone
2 ppb in Water 119
Cromatograma FID a unei probe reale de aer
Analiza calitativa - identificarea componenţilor de interes s-a realizat
utilizând amestec de 55 hidrocarburi non-metanice C2-C9 (22964-
RESTEK, Spectra Gases).
Analiza cantitativa – standard de calibrare cu etan, etena, propan, n-
butan.
2-Methyl-1-Butene
iso-Pentane
n-Hexane
2-Methyl-Pentane
Ethane
Methyl-Cyclopentane
1-Pentene
Isoprene
t-2-Pentene
iso-Butene
2-Methyl-2-Butene
cis-2-Pentene
3-Methyl-Pentane
iso-Butane
FID Signal
n-Pentane
Acetylene
Cyclo-Pentane
Ethene
1-Butene
cis-2-Butene
1,3-Butadiene
n-Hexane
t-Butane
n-Butane
Propane
Propene
Toluene 2,2,-Dimethyl-Butane
Benzene 2,3-Dimethyl-Butane
Cyclohexane
120
Retention time (min)
Cromatograme reale in laborator – analize off-line
n-pentan
izopren
Fără O3
2,2-dimetilbutan
α-pinenă
m-xilen
benzen
Intensitate relativă
Cu 100 ppb O3
metacroleina
metil vinil
cetona