Sunteți pe pagina 1din 121

10.

Tehnici cromatografice

METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN


CERCETAREA CRIMINALISTICA

MASTER: CRIMINALISTICA
ANUL UNIVERSITAR 2012-2013
SEMESTRUL II

Conf. Dr. Cecilia ARSENE/ Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU


FACULTATEA DE CHIMIE
LABORATORUL DE CHIMIE ANALITICA
1
Aspecte generale

botanistul rus Mikhail Semanovich Tswett -


„părintele” cromatografiei, prin studiul
fenomenului de adsorbţie în coloane cu
umplutură, dezvoltat în jurul anilor 1900
pe o coloană împachetată, cercetătorul
separa extracte din pigmenţii frunzelor,
precum clorofila şi xantofil spiriloxantina Mikhail Semanovich Tswett,
(1872–1919), parintele
separa „carotenul” (zonă galben roşie), cromatografiei
xantofilul (zonă galbenă) (carotinoida
oxigenată la C40) şi clorofila (zonă verde)
pe o coloană umplută cu inulină (C6H10O5-
H2O, o polizaharidă solubilă, alcătuită din
grupări fructoză, ce apare în diferite plante
ca rezervă de hrană)
foloseste ligroin ca solvent (un amestec de
hidrocarburi cu p.f. 70-120 °C)
cromatografie (grecescul „chroma” pentru
culoare şi „graphein” pentru scriere) 2
Aspecte generale
pas important înregistrat în 1931 când Kuhn (laureat al premiului Nobel în
1938) şi Lederer au separat în scop preparativ carotenul din morcovi
(morcovi roşii) în două hidrocarburi alfa şi beta caroten (C40H56), prin
adsorbţie pe coloane umplute cu oxid de aluminiu

alfa-caroten

beta-caroten
în aceeaşi perioadă, Winterstein separa pe o coloană cu umplutură de
CaCO3 (cu diametru de 7 cm) două xantofile, violaxantina (pigment
xantofilic de culoare portocalie care protejează plantele de eventualele
distrugeri foto-oxidative) şi luteina (carotenoid natural cu acţiune
antioxidantă)

3
luteina violaxantina
Aspecte generale
1903 Tswett: Fenomenul de adsorbţie în coloană cu umplutură
1931 Kuhn, Lederer, Winterstein: Primele separări semnificative din punct de vedere
preparativ
1937 Tiselius: Electroforeza soluţiilor libere într-un tub
1938 Izmailov, Shraiber: Cromatografia în strat subţire (TLC)
1941 Martin, Synge: Cromatografia de partitie/repartiţie (liquid chromatography,
LC)
1944 Consden, Gordon, Martin: Cromatografia pe hârtie (planar chromatography, PC)
1949 Spedding, Tompkins: Cromatografie de schimb ionic (ionic exchange
chromatography, IEC)
1952 James, Martin: Cromatografia de gaze (gas chromatography, GC)
1957 Galay: Cromatografia de gaze cu coloane capilare (CGC)
1959 Parath, Fladin: Gel cromatografia - gel filtrarea
1966 Piel: Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (high performance
(pressure) liquid chromatography, HPLC)
1969 Klesper: Cromatografia de fluide supercritice (supercritical fluid chromatography,
SFC)
4
1981 Nakagawa: Cromatografia electrocinetică
Aspecte generale

In 1952, A.J.P. Martin si R.L.M. Synge au primit premiul Nobel pentru


cercetările lor in descoperirea cromatografiei de partiţie

Synge spunea

“While still at school I heard tell of the science of biochemistry,


which should draw together two aspects of nature into a common
study. I had long been fascinated by living things (particularlly the
wilde plants) and more recently by chemistry”.

5
Aspecte generale

Clasificare funcţie de natura fazelor implicate în procesele cromatografice

Clasificare generală Metoda specifică Faza staţionară Tipul de echilibru


Cromatografia de Lichid-lichid sau partiţie Lichid adsorbit pe un Partiţie/repartiţie/distribuţie
lichide (faza mobilă solid între lichide nemiscibile
lichid) Fază cu lichid legat Specii organice legate la Partiţie/repartiţie/distribuţie
o suprafaţă solidă între lichid şi suprafaţa
legată
Lichid solid sau Solid Adsorbţie
adsorbţie
Schimb ionic Răşini schimbătoare de Schimb ionic
ioni
Excluziunea mărimii Lichid în interstiţiile unui Partiţie/repartiţie/distribuţie
polimer solid
Cromatografie de gaz Gaz lichid Lichid adsorbit pe un Partiţie/repartiţie/distribuţie
(faza mobilă gaz) solid între gaz şi lichid
Fază cu gaz legat Specii organice legate la Partiţie/repartiţie/distribuţie
o suprafaţă solidă între lichid şi suprafaţa
legată
Gaz solid Solid Adsorbţie
Cromatografia cu fluide Specii organice legate la Partiţie/repartiţie/distribuţie
supercritice o suprafaţă solidă între fluidul supercritic şi
suprafaţa legată
6
Distributia solutului (analitului) între două faze

Distribuţia solutului (analitului) între faze -


concept de bază în cromatografie
Dezvoltarea conceptelor termodinamice care
guvernează separarea cromatografică are la analit
bază folosirea noţiunilor de
analit
fază staţionară (sa fie sub formă de solid Faza I (stationara)
sau gel)
fază mobilă (să fie lichid)
Faza I (mobila)
Existenta celei de-a treia faze care contine
ANALITUL (SOLUT) Distribuţia analitului între fazele
aflate în contact.
Inceperea procesului de partitie/distributie
a analitului intre fazele mobila si stationara

7
Procesul de distributie a solutului/analitului

Faza
mobila uB uA Spre detector

(u)
B A
Injectie u - viteza liniara a fazei mobile Elutia solutilor
A+B tr,A < tr,B

Solutul i (A sau B) se
iM Faza mobila
distribuie intre faze
iS Faza stationara
8
Distributia solutului (analitului) între două faze

Coeficient de distribuţie (partiţie/repartiţie) notat KD

K D = C S CM
CS denotă concentraţiile solutului în faza staţionară
CM concentraţiile solutului în faza mobilă
La distribuţia solutului determinată pe criterii statistice KD are
intotdeauna valoare unitară
Procesul este însoţit (biased) de procesele chimice suplimentare ale
celor două faze şi, din acest motiv, KD este diferit de valoare 1

Pentru sistemele în care solutul are afinitate mare pentru faza staţionară,
KD poate avea valori mari (KD >1)
Pentru sistemele în care solutul preferă faza mobilă, KD ia valori foarte mici
(KD < 1))

9
Separarea cromatografică a solutului (analitului)

Echilibrul - timpul mediu petrecut de o moleculă de solut în una din cele


două faze
Analiţii A şi B, caracterizaţi de KDA < KDB, analitul A faţă de B va petrece o
fracţie mai mică a timpului în faza staţionară
Ambii analiţi eluează din coloană şi funcţie de viteza de deplasare din faza
staţionară se pot obţine separări parţiale sau picuri suprapuse

Faza mobila

Zona pentru B

Zona pentru A A
B

Timp sau Volum


D

Separarea cromatografică a două specii A şi B. KDB > KDA şi de aceea B este


eluat cu întârzâiere faţă de A. 10
Tipuri de izoterme si forma picurilor în
cromatografie

Procesul de separare cromatografică - echilibre interfazice sucesive

Valorile lui KD - estimate cu uşurinţă atunci când se cunosc


coeficienţii de activitate pentru un domeniu larg de concentraţii al
analitului în ambele faze

Idealitatea atribuita din izotermele de distribuţie valabile

Izotermele de distribuţie caracterizează procesul de separare şi descriu


modul în care coeficientul de distribuţie KD (CS/CM) variază la echilibru

11
Tipuri de izoterme si forma picurilor în
cromatografie

Izoterma - funcţia care raportează concentraţiile unui sistem


multicomponent între două faze la temperatură constantă

comportarea ideală liniara (coloana


cromatografică străbătută cu o viteză B
independentă de concentraţia analitului in cele
doua faze; KD = 1) A

izoterme neliniare de tip convex sau concav


(constanta de distribuţie depinde de
C
concentraţia solutului în faza mobilă)
izotermele neliniare convexe: viteza de Concentratia in faza mobila
străbatere a coloanei mai mare la concentraţii Tipuri de izoterme pentru
mici (KD > 1) distribuţia unei specii între două
faze.
izotermele neliniare concave: viteza este mai
mică la concentraţii mici (KD < 1)
12
Tipuri de izoterme si forma picurilor în
cromatografie

La eluţia unui amestec de componenţi ce prezintă mobilităţi cromatografice


apropiate şi izoterme de distribuţie curbe (convexe) apar dificultăţi
comparativ cu un amestec ce prezintă izoterme liniare
Dificultăţi:
- dispersie mai mare a zonelor cromatografice
- suprapunerea parţială a zonelor
- lărgirea exagerată a benzilor (anvelopare)

B C
A

Distanta Distanta Distanta

Picuri distorsionate. Profilul concentraţiei unui analit de-a lungul coloanei funcţie de distanţa parcursă
de la intarea în coloană. A, profil pentru KD constant. B, profil pentru izoterma de tip B. C, profil pentru
izoterma de tip C. 13
Distribuţia benzilor cromatografice. Lărgirea
benzilor cromatografice
Lăţire sau largirea picurilor - proces inevitabil în cromatografie
De nedorit atunci când se are în vedere separarea unor picuri multiple
Picurile oblice sunt nedorite
Cu cât izoterma este mai convexă (concavă), cu atât efectul va fi mai pronunţat şi
mai dăunător
Examinarea picurilor dintr-o cromatogramă reliefează similarităţi cu o curbă de
distribuţie Gaussiană

Cmax

0,607Cmax 2σ

0,5Cmax w1/2

Diverse metode de a determina deviaţia standard din 14


curba Gaussiana: w1/2=2,354σ; w=4σ.
Informaţii ce se pot obţine dintr-o cromatogramă

tR

Profilul unei cromatograme obţinută prin reprezentarea


grafică a dependenţei semnalului înregistrat funcţie de timpul
tM de înregistrare a cromatogramei
w – latimea picului la baza

W
0
0 Timp
Parametrii cantitativi
înălţimea picului (h)
aria picului cromatografic (A) iar
Parametrii calitativi
timpii de retenţie (tR = L/v unde L este lungimea coloanei şi v este viteza de eluţie a
unui component)
volumele de retenţie
Timpul mort, tM, este timpul necesar eluentului sau unui component nereţinut
de faza staţionară să ajungă la detector
Timpul de reţinere, tR, reprezintă timpul necesar componenţilor să ajungă la 15
detector
Informaţii ce se pot obţine dintr-o cromatogramă

Alţi parametri specifici separărilor cromatografice


includ eficienţa şi selectivitatea coloanelor
cromatografice care se determină în funcţie de:
N – numărul talerelor teoretice
H - înălţimea unui taler teoretic
α – factorul de selectivitate
H
N, H sunt mărimi caracteristice dispersiei
zonelor cromatografice
N = L/H L
H are semnificaţia unei lungimi din coloană, pe care
se realizează echilibrul complet al componenţilor în
cele două faze
Estimarea lui H se poate face din:
teoria talerelor teoretice: H = L/N

din teoria cinetică: B


H=A+ + C⋅u Tratarea ipotetică a unei
u coloane.
A, B, C – constante
u – viteza liniară de deplasare a fazei mobile sau
eluentului
A – contribuţia difuziei turbulente (Eddy difussion)
B – contribuţia difuziei moleculare longitudinale
C – contribuţia transferului de masă între faze
16
Overview pentru parametrii cu care se operează

A faza mobila ↔ A faza stationara

Coeficientul de partiţie
CS
KD =
CM

Timpul de retenţie
parametrul calitativ care redă timpul necesar după efectuarea injecţiei
pentru ca picul analitului să ajungă la detector (tR)
Timpul mort (aferent noţiunii de void volume)
timpul necesar speciilor nereţinute de coloană să ajungă la detector (tM)
Viteza liniară medie v (deplasarea analitilor)
L
v=
tR
Viteza liniară medie u (deplasarea moleculelor fazei mobile)
L
u=
tM
L - lungimea coloanei
17
Overview pentru parametrii cu care se operează
Factorul de capacitate kA’
parametru important folosit pentru descrierea vitezelor de migrare a analiţilor
prin coloană
funcţie de tipul cromatografiei implicate, de adsorbţie, de schimb ionic, de
excluziune sterică, factorul a fost denumit coeficient de adsorbţie, de
distribuţie ionică, respectiv de difuziune.
pentru o specie oarecare A, factorul de capacitate kA’ definit prin relaţia:
K A VS
k 'A =
VM
C M VM 1 1 1
v = u× = u× = u× v = u ×
1+ k A
'
C M VM + C S VS 1 + C S VS / C M VM 1 + KVS / VM
factor de capacitate mare indică o reţinere mai puternică în coloană a unui
component
cuprinşi între 1 şi 5
L L 1 tR − tM
= × kA =
'

tR t M 1 + k 'A tM

k’ = 0
18
k’ = 1
Overview pentru parametrii cu care se operează

Factorul de separare (selectivitate) α


descrie diferenţele ce apar între vitezele de migrare specifice componenţilor
trebuie să fie întotdeauna mai mare decât 1
este definit prin raportul dintre coeficientul de partiţie dintre componenta mai
puternic reţinută (B) şi coeficientul de partiţie pentru specia mai puţin reţinută
sau mai rapid eluată (A)

KB
α=
KA K A VS
k 'A =
VM '
k
α = 'B tR − tM
kA k 'A =
tM
t R(B) − t M
α=
t R(A) − t M

19
Overview pentru parametrii cu care se operează

Rezoluţia (R)
termenul cel mai adesea utilizat (
2(V2 − V1 ) 2 t R 2 − t R 1 )
R= =
pentru a descrie calitatea separării w1 + w 2 w1 + w 2
cromatografice
∆Z 2 ⋅ ∆Z 2[(t R )B − (t R )A ]
RS = = =
furnizează o măsură cantitativă a W A /2 + WB /2 W A + WB W A + WB
capacităţii sale de a separa doi analiţi
V1 si V2 sunt volumele de eluent V1
folosite pentru eluţia a doi analiţi
adiacenţi
V2
w1 si w2 sunt lăţimile picurilor la bază,
determinate prin trasarea tangentelor
la punctele de inflexiune ale picurilor
(∆Z = tR2 – tR1)
W1
W2

Rezoluţia la separarea a doi analiţi printr-o 20


coloană cromatografică.
Rezolutie si eficienta in separarile cromatografice

Eficienta scazuta
Rezolutie slaba

Eficienta crescuta
Rezolutie buna

Picurile sunt rezolvate in totalitate atunci cand nu se suprapun


Eficienta este o masura a capacitatii coloanei de a rezolva intre doua picuri
21
Rezolutie si suprapunerea picurilor

∆t R
Rs =
w
( tR )B − ( tR ) A
=
0.5 ( wA + wB )

Rezolutie
Rs ≥ 1.5

Rezolutii ≥ 0.8 sunt necesare pentru a obtine arii de incredere ale picurilor
cromatografice 22
Migrarea solutilor si largirea benzilor

Odata cu migrarea solutilor prin coloana


• are loc separarea
• intervine efectul de largire a benzilor cromatografice

Daca efectul de largire este marcant, este posibil ca separarea sa nu aiba loc.
De aceea, efectul de largire trebuie minimizat.
23
Eficienta coloanei sau inaltimea unui taler, H
Dispersia pe unitatea de lungime
Dispersare: Imprastiere.
Deviatia standard (σ) este o masura a dispersiei

Profilul analitului la
sfarsitul coloanei
Numar molecule

Inaltimea unui taler

σ2
H=
L
Distanta migrata
Umplutura
Pentru a minimiza efectul de largire
• minimizarea dispersiei (σ)
• minimizarea lui H
Proba in Detector
24
Calculul numarului de talere si a inaltimii unui taler

Punct de
inflexiune

2
⎛ tr ⎞ H=
L
N = 16 ⎜ ⎟
⎝ w⎠ N
tr si w trebuie sa aiba aceleasi unitati (timp sau distanta)
25
Teorii care guverneaza separarile cromatografice

Teoria talerelor
Teoria cinetică
Eficienţa coloanelor cromatografice creşte odată cu
creşterea numărului talerelor şi odată cu scăderea
înălţimii talerului
Eficienţa, în termeni de număr de talere, poate varia de
la câteva sute la câteva sute de mii, în timp ce, înălţimea
unui taler poate varia de la câteva zeci la o mie µm, sau
chiar dimensiuni mai mici.

26
Teoria talerelor

Nu reprezintă o teorie cromatografică propriu-zisă


Este mai mult o adaptare analogică pentru procesul cromatografic
A fost dezvoltată de către Martin si Synge faza mobila

faza stationara 0 1 2 3 n

Sistemul anterior prezentat include o serie de talere pe parcursul cărora conţinutul fazei
mobile din talerul 0 este transferat în talerul 1, ulterior 2, în timp ce conţinutul
corespunzător fazei staţionare rămâne stabil. Se poate considera o moleculă care se află
în talerul 0. După echilibrare, faza mobilă din talerul 0 este transferată în talerul 1 cu o
probabilitate p. În alte cuvinte, se poate spune că un transfer va permite deplasarea
moleculei printr-un număr de p talere astfel încât, numărul etapei (M) în care molecula se
află cu cea mai mare probabilitate după un număr de r transferuri va fi dat de relaţia M =
r×p. Pentru un număr mare de molecule, talerul M este talerul în care concentraţia
moleculelor va fi maximă.
Limitari ale teoriei talerelor:
are capacitate redusă de a prezice valori reale
poate oferi o relaţie de legătură credibilă între lărgimea benzii şi lungimea acesteia
nu poate furniza o modalitate de prezicere a mărimii dispersiei
nu pot fi prezise efectele modificării unor variabile cum ar fi debitul sau dimensiunea particulei, întrucât
nu se ţine cont de aceşti factori
Avantaj - simplitatea abordării 27
Teoria cinetică şi variabile cinetice care afectează
lărgirea benzilor

Cauze care conduc la largirea benzilor:


echilibrul de distribuţie al solutului între faze nu se stabileşte instantaneu în toate punctele
coloanei
apar modificări în structura solidelor din faza staţionară datorită diferenţelor dintre faza
mobilă şi faza staţionară
curgerea fazei mobilă are loc în mod întâmplător prin canale de lungimi diferite şi direcţii
diferite antrenând moleculele de solut cu viteze diferite (proprii cromatogramelor ideale)
faza staţionară solidă reţine o parte din faza mobilă care rămâne fixată în micropori,
participând în final la procesul de separare
distribuţia fazei staţionare lichide sub formă de filme neuniforme în jurul granulelor de
suport (solid inert)
Eficienţa unei coloane cromatografice poate fi aproximată de expresia
H = B/u + Csu +CMu (ecuaţia lui Van Deemter)
Eficienţa coloanei controlata prin:
H
diametrul particulelor umpluturii
diametrul coloanei CSu

Contribuţiile coeficienţilor transferului de


masă la înălţimea talerelor, H. CMu

B/u
28
-1
Viteza liniara a fazei mobile, u, cm s
Cromatografia

Tipuri de cromatografii dupa natura fazelor mobila si stationara

1. Cromatografia lichid-lichid

2. Cromatografia lichid-solid

3. Cromatografia gaz-lichid/gaz-solid

29
Cromatografia

Cromatografia lichid-lichid

Faza stationara: lichid


Faza mobila: lichid

Tehnici:
1. Cromatografia pe hartie

30
Cromatografia

Cromatografia solid-lichid

Faza stationara: solid


Faza mobila: lichid

Tehnici:
1. Cromatografia pe coloana
2. Cromatografia in strat subtire (TLC)
3. Cromatografia secventiala pe coloana
4. Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)

31
Cromatografia

Cromatografia gaz-lichid
Cromatografia gaz-lichid

Faza stationara: lichid/solid


Faza mobila: gaz

Tehnici:
1. Cromatografia de gaze

32
Cromatografia
Adsorbenti utilizati in cromatografie

Actiunea selectiva a unui adsorbent se datoreaza atractiilor


intermoleculare de tipul:
fortelor Van der Waals
atractiilor dipol-dipol
legaturilor de hidrogen
interactiilor de coordinare
formarii de saruri

33
Cromatografia

Interacţii intre moleculele analitului şi fazele mobilă şi staţionară

Interacţii Van der Waals Interacţii dipol-dipol

Legături de hidrogen

Legături de
hidrogen

34
Cromatografia

Interacţii intre moleculele analitului şi fazele mobilă şi staţionară

Legătura covalentă (formare de saruri)


reprezintă cea mai puternică interacţie moleculară (200-800 kJ/mol)
este de dorit ca aceasta să nu intervină în procesele cromatografice deoarece poate
conduce la absorbţii ireversibile

Interacţiile ionice
interactiile dintre doi ioni de sarcină opusă prezintă de asemenea o tărie crescută (40-400
kJ/mol)

Interactiuni tip dipol-dipol sau dipol-dipol indus


sunt interactii slabe cu rază medie de acţiune

Forţele Van der Waals


caracterizate ca interacţiuni de rază redusă între dipoli permanenţi sau induşi într-o altă
moleculă alăturată, dar şi forţe dispersive între moleculele neutre

35
Cromatografia
Adsorbenti uzuali folositi in cromatografia pe coloana

Alumina
Cresterea puterii
Carbune activat
de adsorbtie Silicat de magneziu
pentru molecule Silica gel
polare Carbonati anorganici
Celuloza, sucroza

In general, 20-30 g de adsorbent pe gram de proba


Inaltimea coloanei ar trebui sa fie de cel putin 10 ori diametrul sau

36
Cromatografia

Cel mai des utilizate solide:


HO OH OH

Silica gel sau acid silicic SiO2·xH2O R


O
Si
O
Si
O
Si
O
R

R R R
Alumina Al2O3·xH2O

O
δ- δ+ O
δ- δ+
O Al
R O O Al
C O RO O
δ+ δ− H
R δ+

dipol-dipol legaturi de H

37
Cromatografia

δ- +
O
δ-O δAl
+ O H
O Al -
RCOO
O δ-
O
R N H2

interactii de coordinare formare de saruri

Taria interactiilor pe silice sau alumina:

formare de saruri > legaturi de H > dipol-dipol > Van der Waals

38
Cromatografia
Ordinea de elutie asteptata a claselor de compusi organici

Numele clasei Formula generala

rapid alcani RH
alchene R2C CR2
eteri R2O
hidrocarburi halogenate RX
CH3

hidrocarburi aromatice , etc


cresterea
polaritatii
aldehide si cetone RCH O and R2C O
O
esteri RCOR
alcooli ROH
amine RNH2, R2NH, R3N
O
lent acizi carboxilici RCOH
39
Cromatografia

Solventii utilizati in separarile cromatografice

Solventii sunt compusi organici


Actiunea unui solvent, sau a unei serii de solventi, poate fi
utilizata pentru a realiza o separare
Polaritatea solventului nu trebuie modificata rapid

40
Cromatografia
Solventi utilizati in cromatografia pe coloana
Nume Structura

alcani (eter de petrol


hexan)
benzen C6H6
toluen C6H5CH3
hidrocarburi halogenate CH 2Cl2, CHCl3
(diclorometan, cloroform)
dietil eter (CH3CH2)2O
creste
polaritatea O
etil acetat CH3COCH2CH3
acetona (CH3)2C O
alcooli CH3OH,CH3CH2OH
O
acid acetic CH3 COH
41
Cromatografia planara

Cromatografia pe hartie

Cromatografia in strat subtire

42
Cromatografia pe hârtie (paper chromatography, PC)

bazata pe distribuirea/repartizarea diferenţiată a componenţilor


amestecului de separat între două faze
una staţionară lichidă (apa sau un alt electrolit fixat pe hârtia cromatografică)
o fază mobilă care poate fi un solvent organic sau un amestec de solvenţi

folosită la separarea coloranţilor, separarea aminoacizilor şi peptidelor,


analiza hidraţilor de C, studiul diverselor substanţe organice (acizi graşi),
etc
funcţia de separare/distributie, in cazul repartiţiei solutului între două faze
lichide, devine echivalent cu coeficientul de distribuţie dat de raportul

CS
D=
CM

43
Cromatografia pe hârtie
Funcţie de sensul de migrare a fazei mobile de-a lungul fazei staţionare
cromatografia descendentă – faza mobilă migrează în sensul forţelor de gravitaţie
cromatografia ascendentă – faza mobilă migrează prin forţe capilare în sens invers
forţei de gravitaţie

cromatografia radială, circulară sau pe discuri – faza mobilă migrează din centrul
discului de hârtie de filtru în direcţie radială

Funcţie de numărul de coordonate faţă de care se face separarea


cromatografie unidimensională (migrare pe o singură direcţie folosind un solvent s-au
amestec de solvenţi unici)
cromatografie bidimensională (migrarea se realizează pe două direcţii, în acelaşi
amestec de solventi în ambele direcţii sau, mai performant, în amestecuri diferite se
solvenţi pentru fiecare direcţie)

44
Cromatografia pe hârtie

principalul material folosit este hârtia cromatografică


poate fi o hârtie de filtru obişnuită sau o hârtie de filtru cu o serie de
caracteristici de puritate, porozitate, granulaţie, omogenitate, rezistenţă
mică, stabilitate mare
in general hârtia cromatografică conţine
o cantitate mică de grupe carboxilice care determină o încărcare negativă a
celulozei în soluţii apoase şi eventuale proprietăţi de schimb de ioni
substanţe lipofile care pot stânjeni determinarea substanţelor cu Rf ridicat
ioni de Mg2+, Co2+, Cu2+, Fe3+ în proporţiile 0,04 – 0,07 % ceea ce conduce
la o serie de erori în separare
H OH H OH

OH H OH H
O O
H H
H H
O O

CH2OH m CH2OCOCH3 m
45
celuloza celuloza monoacetat
Cromatografia in strat subtire

Una dintre cele mai populare metode de analiza


Avantaje
1. Usor de utilizat
2. Gama larga de aplicatii la un numar mare de probe
3. Sensibilitate ridicata
4. Viteza la separare
5. Cost relativ scazut
Tehnica analitica calitativa utila in:
1. Verificarea puritatii unui compus
2. Determinarea numarului de componenti dintr-un amestec
3. Identificarea solventului potrivit pentru cromatografie
4. Verificarea initiala a identitatii unui compus necunoscut

46
Cromatografia în strat subţire

are drept scop separarea şi concentrarea cantităţilor mici de substanţă


din amestecuri complexe
bazele tehniciii TLC au fost puse de Izmailov şi Schreider (1939) care au
folosit extracte de plante medicinale, iar ca suport Al2O3
zece ani mai târziu Mainhard şi Hall au folosit această tehnică pentru
separarea unor ioni anorganici folosind ca adsorbant alumina, ca liant
amidonul iar ca suport solid lamele de microscop
mai târziu Kelles (1951) foloseşte ca suport silicagelul, iar ca liant ipsosul

47
Adorbenţi folosiţi în TLC

Condiţii pentru adsorbent:


să nu reacţioneze cu substanţa de separat, cu solvenţii sau cu reactivii folosiţi
pentru vizualizarea spoturilor
să fie rezistenţi la temperaturi înalte
să aibă o suprafaţă activă şi specifică
să aibă o granulaţie cât mai fină şi un număr mare de pori cu diametru mic şi
controlat (de aceeaşi dimensiune).
Adsorbenţi
geluri de silice cum ar fi silicagel G care este un silicagel cu liant (ipsos),
silicagel cu indicator de fluorescenţă
adsorbenţi anorganici de tipul aluminei (Al2O3)

48
Adorbenţi folosiţi în TLC
δ-
δ+ O OH
δ+
SILICAGELUL Si Si
adsorbentul cu cea mai largă utilizare (caracter δ-
O O
polar, slab acid) δ-
este produsul de policondensare a cidului orto-silicic

OH OH a) legături siloxanice obţinute prin


O
dehidroxilarea unei anumite cantităţi din
Si Si Si Si
O O aceste grupări.
H H b) grupe silanolice hidratate ce pot apare într-
O
o anumită proporţie chiar după uscare. Se
H H
preferă această formă pentru compuşii
O O
polari deoarece are suprafaţă de contact
Si Si mare.
O

- +
Si OH Si O +H

CH3 CH3
H
Si O Si + H3C Si N Si CH3 Si O Si Si O Si

OH OH CH3 CH3 O CH O O O
3
Si
H3C Si Si CH3 H3C CH3
49
CH3 H3C CH
3
Adorbenţi folosiţi în TLC

ALUMINA
caracter bazic si mult mai reactiva decat silica gelul
după natura grupărilor funcţionale superficiale pe care le prezintă alumina există
trei tipuri de faze staţionare pe baza de alumina
OH OH

Al O Al a) Alumină acidă

O
b) Alumină neutră obţinută prin dehidroxilare
Al O Al
- + - +
O Na O Na

Al O Al c) Alumină bazică

50
Interactii si mecanisme de actiune în TLC

Deplasarea analitilor are loc sub actiunea fortelor


capilare.
Compusi distincti se deplaseaza cu viteze diferite,
functie de fortele intermoleculare dintre analit si
faza stationara de silica gel si component si faza
mobila.
http://www.instructables.com/id/EW1YDCYF4REC0IU/
Faza stationara este SiO2 si este foarte “polara”.
Este capabila de interactii puternice dipol-dipol and legaturi donor-acceptor de
H cu “analitii.
Analitii foarte polari interactioneaza mult mai puternic cu faza stationara si se
deplaseaza foarte incet in directia vertical in sus de-a luncul placutei de TLC.
Faza mobila folosita este mai putin polara (nepolara) si este capabila sa
interactioneze cu analitii prin forte London puternice, sau prin interactii dipol-
dipol si legaturi de H.
Analitii nepolari interactioneaza slab cu silica gelul polar si mult mai puternic
cu faza mobila si se deplaseaza pe o distanta mai mare de-a lungul placutei
TLC. 51
Interactii si mecanisme de actiune în TLC

Adsorbtia solutilor/analitilor
Intensitatea adsorbtiei compusilor creste cu cresterea polaritatii grupelor
functionale, asa cum este aratat mai jos:

-CH=CH2, -X, -OR, -CHO, -CO2R, -NR2, -NH2, -OH, -CONR2, -CO2H.
(slab adsorbiti) (puternic adsorbiti)
(nepolari) (mult mai polari)

52
Interactii si mecanisme de actiune în TLC

Puterea de elutie a fazei mobile (ε)


Puterea de elutie este considerata a fi echivalenta cu polaritatea.
Puterea de elutie a unui solvent depinde de fortele
intermoleculare dintre solvent si analiti si dintre analiti si faza
stationara.
Un solvent de elutie polar sau mai puternic polar va deplasa intr-o
oarecare masura toti analitii fata de un solvent mai putin polar.
De exemplu, puterea de elutie a hexanului este foarte scazuta; ε = 0.01.
puterea de elutie a acetatului de etil este ridicata; ε = 0.45
puterea de elutie a etanolului este foarte ridicata; ε = 0.68

53
Proprietatile solventilor si puterea de elutie
o
Solvent MF Bp ( C) Hazards* Dipole Elution
MW Density (g/mL) Stength
(ε)
Hexane C6H14 68.7 Flammable 0.08 0.01
CH3(CH2)4CH3 86.17 0.659 Toxic

Toluene C7H8 110.6 Flammable 0.31 0.22


C6H5CH3 92.13 0.867 Toxic

Diethyl ether C4H10O 34.6 Flammable 1.15 0.29


CH3CH2OCH2CH3 74.12 0.713 Toxic, CNS
Depressant

Dichloromethane CH2Cl2 39.8 Toxic, Irritant 1.14 0.32


CH2Cl2 84.94 1.326 Cancer suspect

Ethyl Acetate C4H8O2 77.1 Flammable 1.88 0.45


CH3CO2CH2CH3 88.10 0.901 Irritant

Acetone C3H6O 56.3 Flammable 2.69 0.43


CH3COCH3 58.08 0.790 Irritant

Butanone C4H8O 80.1 Flammable 2.76 0.39


CH3CH2COCH3 72.10 0.805 Irritant

1-Butanol C4H10O 117.7 Flammable 1.75 0.47


CH3CH2CH2CH2OH 74.12 0.810 Irritant

Propanol C3H8O 82.3 Flammable 1.66 0.63


CH3CH2CH2OH 60.09 0.785 Irritant

Ethanol C2H6O 78.5 Flammable 1.70 0.68


CH3CH2OH 46.07 0.789 Irritant

Methanol CH4O 64.7 Flammable 1.7 0.73


CH3OH 32.04 0.791 Toxic

Water H2O 100.0 1.87 >1


HOH 18.02 0.998 54
Solventi

Solventii se aleg functie de polaritatea compusilor


Slab polari Eter de petrol
Ciclohexan
Toluen
Cloroform
Acetona
Etanol
Puternic polar Metanol

55
Dezvoltarea cromatogramei şi detecţia (localizarea)
analiţilor pe cromatoplacă
Pentru separări se folosesc cromatoplaci activate (introducerea în etuvă la o
temperatură în jur de 100 oC, timp de 45 minute – 1 oră)
Pentru localizarea spoturilor (vizualizare) după realizarea separării se pot folosi atât
reactivi anorganici cât şi organici
Metodele de localizare a spoturilor pot fi sistematizate în orice caz după cum urmează:
folosirea caracteristicilor de luminiscenţă a analitului (fenomenul de fluorescenţă pentru
compuşi organici şi fenomenul de fosforescenţă pentru compuşi anorganici)
impregnarea stratului fazei staţionare cu o substanţă indicatoare fluorescentă (ca substanţe
indicatori se pot folosi derivaţii de piren, fluoresceina, morina sau rodamina B)
spray-ere cu un oxidant pouternic nespecific (HNO3, KMnO4, H2SO4). Apar spoturi negre la
oxidarea compyşilor organici
spray-ere cu soluţii de reactivi specifici (ninhidrina pentru a vizualiza gruparea NH2 conform
reactiei de mai jos)

O O O

C C
OH
C
R-NH2 C N Formarea produsului colorat în albastru
OH din reacţia dintre ninhidrină şi grupările
C C
NH2.
O O
O 56
ninhidrina produs albastru colorat
Vizualizarea

Metode destructive
Pulverizarea placutei cu H2SO4, urmata de uscare la 110
ºC pentru 15-20 minute. Compusii vor fi distrusi dar toate
spoturile vor fi vizibile
Metode nedestructive – datorita utilizarii luminii UV
probele nu vor fi distruse. In orice caz, nu toate
spoturile de pe placuta vor fi vizibile.
Lungimi de unda lungi UV
Lungimi de unda scurte UV
Vizualizare semi-destructiva

57
Definiţia şi metodele de calcul pentru factorul Rf

Rf – factor de retardare/intarzaiere/retentie

A= distanţa parcursă de solut


B= distanţa parcursă de solvent
A
Rf =
B

Figura 5.1: Principiul determinării factorului Rf.

58
Valorile specifice factorului Rf

Valorile factorului Rf trebuie sa fie intre 0,0 si 1,0

daca valoarea este peste 0,0 sau mai mica decat 1,0, se
considera ca exista o greseala de calcul

Daca valorile factorului Rf sunt mai mari de 0,8 sau mai mici
de 0,2 valorile sunt greu de interpretat, ceea ce poate conduce
la erori

Valorile optime pentru Rf trebuie sa fie intre 0,3 si 0,6

59
Separarea unui amestec de butil amina si
ciclohexan pe o placuta TLC
Aspecte de avut in vedere:
1. Polaritatea fiecarui compus din amestec
Butil amina este polara; ciclohexanul este nepolar
2. Polaritatea fazei stationare
Silica gel (sau alumina) este polar – inseamna ca butil amina va interactiona
cu faza stationara mult mai puternic
3. Polaritatea fazei mobile - solventul: se determina ce solvent se foloseste
H2
C
H2C CH2
H2C CH2
C
Predictii: H2
Ciclohexanul va elua primul/mai rapid prin faza stationara δ-
Butil amina va elua ultima/mai incet O O
δ+
δ+ Si
δ-
N H
Predictii la folosirea unei faze mobile nepolare:
Ciclohexanul si butil amina vor fi transportate de faza mobila H
Ciclohexanul va elua primul/mai rapid prin faza stationara
Butil amina va elua ultima/mai incet deoarece interactionaeaza si cu silica gelul
pe masura ce se deplaseaza 60
Separarea unui amestec de analgezice pe o placuta
TLC
Ac As C I
Aspirin
Spotul spot
aspirinei
placuta TLC (etichetata) Caffeine spot
Spotul cafeinei
cu probele incarcate
Aceaminophen
Spotul spot
acetaminofenului Spotul ibuprofenului
Ibuprofen spot

PREZICETI ORDINEA
ELUTIEI ACESTOR
COMPUSI PE O PLACUTA depth offazei
Nivelul mobile phase
mobile
pencil mark 1 cm
Linia de baza la 1 cm de la
De SILICAGEL FOLOSIND from bottom
partea inferioara
CA ELUENT…..

OH

CO2H O CH3
O CH3 H3C N
N
HN O
O N
O N
Aspirin
Aspirina CH3 CH3
CO2H
Acetaminophen
Acetaminofen Caffeine
Cafeina
Ibuprofen
Ibuprofen
61
Pros si cons pentru TLC

PROS
Sensibilitatea
Viteza
Costuri relativ scazute

CONS
Cantitati prea mici din probe
Cantitati prea mari din probe
Subiectiva

62
Cromatografia de lichide (faza mobila lichid, faza
stationara solid)/clasificare dupa principiul de separare
Cromatografia de partiţie/repartiţie
cromatografie de repartiţie directă (cu faze normale – clasică)
cromatografia de repartiţie cu faze inversate – metoda preferată în prezent
– pe care se realizează cele mai numeroase separări
Cromatografia prin schimb ionic
cromatografie de transfer cu schimb ionic clasic în procesul de bază din
coloana cromatografică
cromatografie prin perechi de ioni (substanţe ionice sau ionizabile)
foloseşte faze staţionare capabile să fixeze ioni de semn contrar (derivă din
LC)
Cromatografia de afinitate
afinitatea specifică a unor molecule cu alte molecule fixate pe suport
Cromatografia de excluziune
efectul indus de mărimea moleculelor, ceea ce înseamnă că molecule de o
anumită dimensiune nu pot intra în porii unui sorbent utilizat şi sunt excluşi
în raport cu molecule de dimensiuni mai mici

Principiul separării în cromatografia de


adsorbţie (a), de partiţie (b), prin schimb
ionic (c), de excluziune (d) şi prin
electroforeză (e). ● semnifică un
component mai puternic reţinut.
63
Chromatografia de lichide pe coloana

Proba continand analiti/soluti Faza mobila

Faza mobila

Separare in acord cu:


-masa moleculara/marime
-sarcina
-hidrofobicitate
-afinitate

Timp 1 2 3 4 5

64
Scopul cromatografiei de lichide de înaltă
performanţă Cresterea polaritatii

Insolubili in apa Solubili in apa

Popularitatea metodei data de Nepolari Ionici


sensibilitate
Polari neionici
capacitatea de a fi adaptată
la determinări cantitative Partitie
acurate Adsorbtie Schimb ionic
102
potrivită pentru separarea
Partitie cu faze Partitie
speciilor nevolatile sau inversate normala
instabile termic 103
folosită în analiza amino
acizilor, proteinelor, acizilor
nucleici, hidrocarburilor,
carbohidraţilor, 104
medicamentelor, terpenelor,
pesticidelor, antibioticelor, Excluziune
steroizilor, speciilor organo- 105
metalice, şi a unei varietăţi Permeatie prin gel Filtrare prin gel
mari de substanţe
anorganice
106

65
Aplicaţiile cromatografiei de lichide.
Instrumente folosite în cromatografia de lichide de
înaltă performanţă
Componentele unui cromatograf de lichide
Rezervor pentru mediul de eluţie conţinând solventul pentru faza mobilă
Coloana de separare în care materialul de umplutură este păstrat prin
intermediul unor frite
Seringă sau valvă de injecţie pentru introducerea probei
Colector de fracţiuni prin intermediul căruia câţiva mL de eluat din coloană
sunt colectaţi automat
Amortizare Injector,
Valvă pulsuri tip “6 căi”
partiţionare
solvent Pompă

Pre-coloană

Coloană Prezentarea schematica a unui cromatograf de


lichide (HPLC) modern.

Rezervoare fază
mobilă Detector 66
Faza mobila in cromatografia de lichide

conditii faza mobila


vâscozitate coborâtă
capacitate de dizolvare a
convex
componenţilor
inerţie fizico chimică asupra liniar
concav
funcţionării coloanei şi detectorului
alegerea fazei mobile se face în
concordanţă cu faza stationară,
tip scara
deoarece eluentul în LC nu reprezintă un
mediu inert precum gazul purtator din GC,
depinzând de tipul interacţiunilor
componentelor separate cu faza staţionară
din coloană
modalitati de operare Timp
eluţie isocratică (faza mobile de
concentratie constanta pe parcursul
achizitiei unei cromatograme) Forme de distribuţie a gradientului pentru
eluenţi combinaţi în regim binar din metanol
eluţia în gradient (faza mobila de şi apă.
concentratie variabila pe parcursul
achizitiei unei cromatograme)
67
Caracteristici faze mobile

Tăria relativa a celor mai comune faze mobile (monocomponente) utilizate în cromatografia de repartitie
cu faze normale sau inversate.

Index polaritate Ecranare UV Faze


Faze normale Solventi
(P’) (nm) inversate
ciclohexan 0.04 210
n-hexan 0.1 210
tetraclorură de carbon 1.6 265

↓ ↑
toluen 2.4 286
dietil eter 2.8 218
tetrahidrofuran 4.0 220
etanol 4.3 210
etil acetat 4.4 255
dioxan 4.8 215
metanol 5.1 210
acetonitril 5.8 190
apa 10.2 —

68
Faze stationare în cromatografia de lichide de înaltă
performanţă

proprietăţile unei faze staţionare sunt determinate de natura


grupărilor alchil organo-silanice (R este o grupare funcţională polară,
atunci faza staţionară va fi polară)
faze staţionare polare, cand R conţine grupări
diol (–(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH)
cian (–(CH2)3C=N)
amino (–(CH2)n NH2 cu n = 3 sau 4) scade polaritatea
dimetil amino (-CH2)3N(CH3)2)
diamino (-(CH2)3NH(CH2)2NH2)
fazele staţionare nepolare folosesc cel mai des un organoclorosilan
pentru care gruparea R este un lanţ de n-octil (C8) sau n-octildecil (C18)
deoarece substratul de silice în soluţii bazice poate suferi hidroliză, pH-ul
fazei mobile trebuie să fie mai mic de 7,5

69
Faze stationare în cromatografia de lichide de înaltă
performanţă

Silicagelul (SiO2) - materialul cel mai important utilizat ca fază


staţionară în tehnica HPLC
indiferent de formă, granulaţia trebuie să fie uniformă (se elimină partea
fină) - caracteristicile curgerii eluentului sunt mult îmbunătăţite
structură tridimensională cu o reţea de bază, tridimensională, formată din
legături Si-O-Si iar pe suprafaţa porilor sau cea exterioară mai prezintă
grupe silanol, ≡Si-OH

(a) (b)

Aspectul granulelor de silicagel folosite frecvent la umplerea coloanelor în HPLC (a) şi aspectul unei
granule sferice cu fază staţionară chimic legată pe suprafaţa suportului (b). 70
Faze stationare în cromatografia de lichide de înaltă
performanţă
Coloanele monolit - realizate din aceleaşi materii prime ca şi la silicagelul
sferic
coloana este formată direct în tubul rigid (metalic), de unde şi numele
se pot obţine coloane cu performanţe superioare faţă de cele umplute cu granule
tipuri de grupe silanol superficiale
I – legate
II – reactive
III – libere
in funcţie de tehnologia de obţinere diferă şi porozitatea internă, suprafaţa
specifică, rezistenţa la compresiune şi polaritatea

(a) (b)
Aspectul coloanelor monolit (a) şi principalele tipuri de grupări silanolice superficiale (b). 71
Cromatografia cu faze normale si faze inversate

tipuri de cromatografii de lichide dupa modul de operare

cromatografia de repartiţie normală (faza directă) - faza


staţionara polară, pentru o fază mobilă nepolară

cromatografie de repartiţie cu faze inverse (faza indirecta)


- folosirea unei faze staţionare nepolară şi a unei faze mobile
polară

72
Cromatografia de lichide cu faza stationara de
polaritate normala

Faza stationara din alumina sau silice prezinta locatii


polare care vor interactiona cu molecule polare

silice
O
Grupa polara HO Si
O

Componentii
Componentiielueaza
elueazainin
ordinea
ordineacresterii
cresteriipolaritatii
polaritatii

Cel mai polar…….Mai putin polar

73
Cromatografia de lichide cu faza stationara de
polaritate inversata

Daca faza stationara din alumina sau silice prezinta


locatii polare blocate de grupari nepolare, acestea vor
interactiona foarte puternic cu molecule nepolare

silice
faza C18 Me O
Si O Si
Me O

Componentii
Componentiielueaza
elueazainin
ordinea
ordineascaderii
scaderiipolaritatii
polaritatii

Mai puternic nepolar…….Mai putin nepolar

74
Detectori utilizaţi în HPLC

nu există detectori care să fie universal aplicabili

sistemul de detecţie trebuie să fie foarte sensibil deoarece


coloanele de separare performante au capacităţi de încărcare mici,
iar volumul de probă redus (5-20 µl), impune detectori cu volume
adecvate pentru sesizarea continuă a picului cromatografic

tehnica derivatizarii se poate practica înainte de introducerea probei


în coloană, dar şi după ieşirea componentelor separate din aceasta

75
Detectori spectrofotometrici în UV-VIS

bazati pe tranzitiile electronice dintr-o molecula


disponibilitatea compuşilor separaţi cromatografic de a absorbi lumina pe
domeniul lungimilor de undă ale detectorului, în timp ce eluentul trebuie să
fie practic transparent pe acelaşi domeniu spectral
substanţele organice, ce conţin legături duble (electroni π), respectiv au
grefate funcţiuni organice cu electroni neparticipanţi, absorb lumina în UV-
VIS
hidrocarburile olefinice şi aromatice
derivaţii tuturor hidrocarburilor cu diferite funcţiuni organice (=C=O,
=C=S, -N-O, -N=N-, -NH2), enzime, acizi nucleici etc.
celula de detecţie - spectrofotometru miniatural cu un volum de 1-10 µl,
respectiv un diametru interior de 1 mm la o lungime a celulei de 10 mm
fiind insensibil la micile variaţii de debit şi temperatură
drumul optic variază între 2 – 10 mm
pentru măsurători în UV fereastra trebuie să fie din quartz
76
Detectori spectrofotometrici în UV-VIS

Lampa Lampa UV

Ferestre Lentilă Intrare


Fotocelulă
Celula de
Celulă de Celulă fluorescenţă
referinţă probă

Ieşire

Ferestre
Lumina
Fotocelule Lumina UV fluorescentă

Schema bloc a unui detector cu două compartimente (stânga), şi a


unuia de fluorescenţă HPLC (dreapta).

Detector spectrofotometric specific sistemului HPLC. 77


Alţi detectori LC specifici

Alţi detectori utilizaţi în LC şi limite de detecţie şi pentru detectorii menţionaţi.

Limita de LOD(state of art) Caracteristici


Detectori LC detectie* (daca volumul injectat este
mai mic)
Absorbanţă 100 pg – 1 ng 1 pg
- 10
Sensibilitate 10 M
Fluorimetrici 1 – 10 pg 10 fg Este necesara uneori
derivatizarea
Indice de refracţie 100 ng -1 µg 10 ng
- 10
Sensibilitate 10 M
Electrochimici 10 pg - 1 ng 100 fg Compusi oxidabili sau
reductibili
Spectrometria de masa Coloane capilare, pulverizare
100 pg – 1 ng 1 pg
(MS)
FT-IR 1 µg 100 ng Absorbiţie IR
Adecvati pentru
Difuzia luminii 10 µg 500 ng
macromolecule
Activitate optica 1 ng Pentru substante optic active
Doar pentru ioni sau compusi
Elemente selective 10 ng
ionizabili
Fotoionizare 1 pg – 1ng

78
Aplicatii ale tehnicii HPLC

Standarde

8
7
6
5 2-NP
2,4-DNP
4 4-NP
amestec nitrofenoli
3 3-NP
2,5-DNP 50
2 Blanc
1
40
0
-500 -1 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
30

20

10

0
-5 0 5 10 15 20 25

79
-10
Aplicatii ale tehnicii HPLC
Mediu
Fenoli in apele potabile
Identificarea difenhidraminei in probele de sedimente
Biomonitorizarea poluarii cu hidrocarburi aromatice policiclice in lacurile montane de la mare altitudine
prin analiza fierii pestilor
Estrogeni in apele de coasta
Toxicitatea tetraciclinei si a produsilor de degradare ai tetraciclinei asupra bacteriilor
Atribuirea toxicitatii TNT asupra sedimentelor
Criminalistica
Cu un HPLC portabil la diferite petreceri – identificarea si cuantificarea direct la locatie a drogurilor
Ecstasy
Identificarea steroizilor anabolici in ser, urina, transpiratie si par
Analiza criminalistica a colorantilor textili
Determinarea cocainei si a metabolitilor in meconiu
Cuantificarea simultana a drogurilor psihoterapeutice in plasma umana
Clinic
Cuantificarea DEET un urina umana
Analiza antibioticelor
Excretie urinara intensificata a aquaporin 2 la pacientii cu ciroza hepatica
Detectarea neuropeptidelor endogene in fluidele extracelulare din creier
Alimente si aromatizanti
Asigurarea consistentei si calitatii bauturilor racoritoare
Analiza dicetonelor vicinale in bere
Analiza zaharurilor in sucurile din fructe
Analiza hidrocsarburilor aromatice policiclice in legumele si fructele Braziliene
Analiza urmelor de agenti chimici folositi in agricultura
80
Stabilitatea aspratamului in prezenta glucozei si a vanilinei
Cromatografia ionica

faza staţionară - răşină polimerică interlegată (divinil benzen interlegat cu


polistiren) cu grupări funcţionale ionice ataşate covalent

stiren
divinil benzen
Locaţie pentru
schimb ionic Interlegătură

Structuri ale stirenului, divinil-benzenului şi un copolimer modificat de stiren-divinil-benzen pentru a fi folosit


ca răşină schimbătoare de ioni. Site-ul pentru schimb este de obicei în poziţia para şi nu este neapărat
necesar să fie legat la toate unităţile de stiren. R- poate fi –SO3-H+, COO-H+, -NH3+OH- sau –N(CH3)3+OH-. 81
Schimbătorii de ioni ca faze stationare in
cromatografia ionica

materiale solide - derivaţi ai unor polimeri reticulaţi (poroşi), obţinuţi prin


legarea de catenele hidrocarbonate, ramificate, ale unor grupe funcţionale

Tipuri de schimbători de ioni.

Tip Grupare funcţională Exemple


Schimbători cationici puternic acizi Acid sulfonic -SO3-
-CH2CH2SO3-
Schimbători cationici slab acizi Acid carboxilic -COO-
-CH2COO-
+
Schimbători anionici puternic bazici Amine cuaternare -CH2N(CH3)3
-CH2CH2N(CH2CH3)3+
Schimbători anionici slab bazici Amine -NH3+
+
-CH2CH2NH(CH2CH3)2

82
Mecanisme de separare

amestec de Na+ şi K+ pe o coloana umplută cu un cationit


R-H + Na+ R-Na + H+
R-H + K+ R-K + H+
eluent prin coloana, (HCl diluat), ionii H+ din acid, fiind în concentraţie
mai mare, vor deplasa ionii fixaţi, prin echilibre ionice similare spre o
porţiune inferioară iar aceştia se vor putea fixa din nou, puţin mai jos, pe
alte centre de schimb din coloană
R-Na + H+ R-H + Na+
R-K + H+ R-H + K+
repetarea procesului migrarea ionilor prin coloană
afinitatea sporita a grupărilor funcţionale tip -SO3- pentru K+ faţă de
Na+ migrarea diferentiata separarea ionilor

83
Detectori conductometrici de supresie

detectorii conductometrici
sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici
specifici şi suficient de sensibili (500 pg – 1 ng)
sisteme caracterizate de sensibilitate ridicată, stabilitate, flexibilitate, acurateţe
şi reproductibilitate, şi de capacitate mare de a furniza date de încredere
la ieşirea din coloana cromatografică ionii nu pot fi detectaţi suficient de sensibil pe
cale conductometrică în mod direct (concentraţii coborâte, conţinuţi în eluentul format
dintr-un electrolit cu o concentraţie comparabilă sau chiar mai mare)
autosupresorul transforma eluentul (un acid sau o bază tare) în apă
eluent acid (acidul clorhidric) coloana supresor umplută cu o răşină schimbătoare de
anioni cu formula generală R-OH, caracterizată de capacitate de schimb mare
coloana de separare redată ca RH
coloana de supresie redata ca ROH
eluentul care conţine acid clorhidric diluat de exemplu, la ieşirea din coloana de
separare va pătrunde în coloana supresor unde se va petrece reacţia:
R-OH + (H+ + Cl-) → R-Cl + H2O
sărurile speciilor ionice de interes se transformă în hidroxizii corespunzători:
R-OH + (Na+ + Cl-) → R-Cl + (Na+ + OH-)
84
R-OH + (K+ + Cl-) → R-Cl + (K+ + OH-)
Supresorul electrochimic

procesul de schimb ionic în cromatografele moderne este accelerat


prin electrodializă (s-a mărit viteza procesului şi s-a micşorat volumul
mort; a crescut durata de funcţionare a detectorului)
trăsături care furnizează stabilitatea liniei de bază (se elimină influenţa
curentului indus de temperatură care este întîlnită la alte tipuri de
detectoare)
celula detectorului este localizată într-o incintă specială de
reglare a temperaturii, care are rolul de a izola celula detectorului
de fluctuaţiile externe de temperatură
un schimbător de căldură unic, încălzeşte faza mobilă şi proba
înainte ca acestea să ajungă în celula detectorului

85
Supresorul electrochimic
sistemul de supresie cu autoregenerare, înlocuieşte ionii de sodiu, Na+, (şi alţi cationi)
din eluent şi îi transportă odată cu ionii hidroniu (H+ sau H3O+) din apa folosită ca
regenerant
ionii hidroniu se combină cu ionii hidroxid (OH-) rezultaţi din eluent şi formează apa,
care are o conductivitatea mult mai mică decât a hidroxidului de sodiu folosit ca
eluent
conductivitatea analitului este intensificată deoarece anionii analitului se asociază cu
ionii hidroniu care sunt mult mai conductivi

Eluent (NaOH) Probă (F-, Cl-, SO42- Separare fără supresie

µS Ionii
interferenţi 2-
SO4
-
Coloana - Cl
analitică F

Tim
NaF, NaCl, Na2SO4, în H2O
Separare prin supresie
Reziduuri 2-
Sistem de µS - SO4
supresie cu Cl
regenerare -
H2O F

HF, HCl, H2SO4, în H2O


86
T
Reprezentarea schematică a procesului de îmbunătăţirea a raportului semnal-zgomot
Supresorul electrochimic

Anod Analit Catod


+ -
+
Reziduuri Na OH eluent Reziduuri -
Autosupresia într-un sistem de supresie cu auto-
H2O şi O2
+ -
Na OH şi H2
regenerare cationică.
Analit Catod
Anod + - -+
OH
- Reziduuri Na
MSAOHH eluent Reziduuri
+ -
+ +
H Na
+ -
H MSA şi O2 H2O şi H2
-
+ - H2 + OH
+ H + OH =H2O
H + O2 H
+

- -
H2O MSA OH
H2O
+ - -
H + OH =H2O H2 + OH
+
H + O2
Analit şi H2O
H2O
H2O
H2O H2O
Spre detector
Analit şi H2O

Membrană schimbătoare Membrană


H2O H2O
de cationi schimbătoare de cationi Spre detector

Autosupresia într-un sistem de supresie cu


Membrană schimbătoare de
auto-regenerare anionică. Membrană schimbătoare de anioni
anioni

87
IC-Dionex-3000

Imagine de ansamblu

Sectiune pompa

Sectiune corp
coloana/detector/supresor
88
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor
ionice F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-,
C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+

Faza mobilă Solut 1

Solut 2

Faza staţ
staţionară moleculele cu sarcina mare
sunt mai puternic retinute de
faza stationara, se
deplaseaza mai incet prin
coloana si se elueaza mai
tarziu
moleculele cu sarcina medie
se chilibreaza intre faza
stationara si faza mobila mult
mai usor
moleculele cu sarcina mica
sunt mai slab retinute de faza
stationara, se deplaseaza mai
rapid prin coloana si se
elueaza mai repede

89
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor
ionice F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-,
C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+

faza mobila
anioni: 4,5 mM Na2CO3 şi 1,4 mM NaHCO3
cationi: 6 mM acid metansulfonic (CH3SO3H)

standarde primare (exemplu):


7 anioni: F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-
6 cationi: Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+

alte materiale
apă ultra pură: 18,2 MΩ.cm rezistivitate
ion cromatograf DIONEX ICS-3000

90
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor
ionice F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-,
C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+
Exemple de cromatograme la analiza cationilor/anionilor
- cationi

- anioni

91
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor
ionice F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-,
C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+

Cromatograma cu efect de
deformare

Cromatograma cu vizualizarea
picurilor unor analiti in
concentratii mici/sensibilitate
scazuta a instrumentului

92
Cromatografia de gaze/Aspecte generale

faza mobilă nu interacţionează cu moleculele analitului şi funcţia sa este


doar aceea de a transporta analitul prin coloană
se întâlnesc
cromatografie gaz-solid (gas-solid chromatography GSC)
cromatografie gaz-lichid (gas-liquid chromatography GLC)
istoric
conceptul a fost enunţat pentru prima dată în 1941 de către Martin şi Synge
in 1955 a apărut primul aparat comercial şi de atunci utilizarea acestei tehnici
a luat o amploare remarcabilă
teoria GC capilara (1957) dezvoltata de Golay
instrumente GC capilare (1977)
coloane capilare din silice topita (1979)
GSC este de folos pentru separarea speciilor care nu sunt reţinute de
coloanele gaz-lichid, precum componenţii din aer, H2S, S2, NOx, CO, CO2 şi
gazele rare
se poate efectua atât pe coloane umplute cât şi coloane tubulare deschise
coloanele sunt denumite uneori coloane tubulare deschise cu strat poros
(porous layer open tubular column, PLOT column)
93
Cromatografia de gaze/Aspecte generale

Comparatie: GC & HPLC

HPLC GC

probe ne-volatile probe volatile & termic stabile

compusi termic instabili analiza rapida

macromolecule rezolutie buna

probe anorganice si probe ionice interfata simpla la un spectrometru


de masa
interfata mult mai complexa la un
spectrometru de masa

94
Instrumentaţia cromatografiei de gaze

compuşii amestecului supus separării pot fi atât lichide cât şi solide volatile
substanţele de analizat se introduc în coloana de separare, la o
temperatură superioară celei de volatilizare, prin intermediul unui dispozitiv
de introducere a probei

Debit-metru
Control debit

Bloc injector Septum Blocul detector


Regulator presiune

Cuptor
Faza
mobilă

Coloană
95
Schema de principiu a unui cromatograf de gaze
Gazul purtator in cromatografia de gaze

Inert

Heliu

Alegerea dictata de tipul detectorului, cost si disponibilitate

Presiunea controlata pentru valoare constanta a presiunii la intrarea in


sistem

Debit constant asigurat printr-un sistem de control al debitului

Gaze de puritate cromatografica (puritate foarte ridicata)

96
Sisteme de injecţie

introducerea probei se realizează cu seringi micrometrice


la probele lichide volumele se situează în domeniul 0,1 - 10 µL, în timp
ce pentru gaze se folosesc seringi ~0,5 mL, sau ventile pentru
introducerea probei
sistemele de injecţie sunt păstrate de obicei la temperaturi care
sunt cu 50 oC mai mari decât punctele de fierbere pentru compuşii
cei mai puţin volatili
dispozitivele pentru injecţie au totodată şi rolul volatilizării probei în
curentul de gaz purtător cât mai aproape de intrarea în coloana

97
Sisteme de injecţie

dispozitive “split/splitless” cu Septum

ajutorul cărora doar o fracţiune din


probă (1/20 - 1/500) intră în coloană Purjare
iar restul este evacuată septum Gaz purtător
Ventil split
cea mai utilizata metoda de injectie
Etanşare
in coloane capilare internă
adeseori cea mai neinteleasa
metoda Liner de sticlă
acelasi sistem de injectie folosit in
Punct
ambele tehnici de split
controlul electronic printr-o valva
solenoida modifica debitul gazului
pentru a determina functia de
Coloană
injectie
Diagrama schematică a unui injector
“split/splitless”.

98
Injectia split/splitless

Split Splitless

Mecanism prin care doar o Cea mai mare parte a probei


portiune din solutia injectata este transferata catre coloana (85-
descarcata in coloana (1/1000 - 100%)
1/20 din proba)
Utilizata pentru probe diluate
Utilizata pentru probe concentrate (<0.1%)
(>0.1%)
Viteza de injectie mica
Poate fi realizata izoterm
Nu ar trebui efectuata izoterm
Viteza mare de injectie
Focalizarea solventului este
Contaminarea injectorului si a importanta
septumului nu sunt notificabile
Control printr-o valva solenoida
99
Necesita optimizare atenta
Alte tipuri de injectii

Injectie direct in coloana Injectia de volume mari


Toata proba este Pentru modificarea sensibilitatii in
transferata in coloana aplicatiile de mediu.
Acul seringii introdus Utilizeaza seringi de 100µL: Injectii de
direct in coloana pana la 70 µL
Potrivit pentru Injectii cu viteze mici (temperatura
Analiza urmelor injectorului cu cateva grade sub punctul
Compusi termic de fierbere al solventului, debit la 150
instabili (pesticide, mls/ min, optiune de split deschis)
droguri) Concentrarea analitului
Domeniu larg al Split inchis
punctelor de Rampa rapida de temperatura la
fierbere inceputul coloanei +20°C
Masa moleculara Programarea coloanei functie de
mare necesitati

100
Sisteme de injecţie
Introducerea probelor gazoase – cilindri de un
anumit volum (prevazuti cu robinete)

introducerea probelor lichide – cea mai comuna


metoda este utilizarea unei microseringi

metoda “headspace” care se refera la determinarea


substanţelor organice volatile din faza gazoasa, care
se afla in echilibru cu cele din faza lichida sau solida

Tehnici de introducere a probei prin desorbţie termica:


desorbţia termica a compuşilor volatili reţinuţi pe
materiale cu proprietati de adsorbtie (C18/Tenax, glass
beads, etc.).

101
Coloane si faze stationare
Materiale utilizate in realizarea coloanelor
metal (1957)
sticla (1959)
silice topita (1979)
aluminiu placat (1984)
materiale inerte (1990)
Alte caracteristici
alegerea fazei stationare determina selectivitatea
sute de faze disponibile
multe faze dau separare similara
aceleasi faze pot avea nume diferite
alegerea fazei stationare pentru coloanele capilare mult mai simpla
asemanator dizolva asemanator
fazele polare se utilizeaza pentru compusi polari
fazele nepolare se utilizeaza pentru compusi nepolari
102
Caracteristicile coloanelor capilare

Caracteristici

lungime (10 m – 50 m)

diametru intern (0,1 mm – 0,53 mm)

faza stationara lichida

grosimea filmului (0,1 µm – 5 µm)

polaritate (nepolar - polar)

103
Criterii de alegere a coloanelor capilare

diametrul intern grosimea filmului


diametru intern mic cantitatea de faza stationara de
acoperire
rezolutie buna pentru picurile care afecteaza retentia si capacitatea
se elueaza rapid
filmele groase cresc retentia si
timpi mari de analiza capacitatea
domeniu dinamic limitat filmele subtiri utilizate pentru composi cu
puncte de fierbere ridicate
diametru intern mare
coloane capilare standard tipice de 0,25
rezolutie scazuta pentru picurile µm
care se elueaza rapid 0,53 mm ID (megabore)
timpi scurti de analiza lungime
rezolutie satisfacatoare pentru in analiza izoterma
amestecuri complexe retentia dependenta de lungime
domeniu dinamic bun dublarea lungimii coloanei dubleaza
grosimea filmului timpii de retentie
rezolutia este o functie de radacina
cantitatea de faza stationara de patrata a lungimii coloanei
acoperire
se castiga 41% imbunatatire a
afecteaza retentia si capacitatea rezolutiei
filmele groase cresc retentia si in analiza cu temperatura programata
capacitatea retentia mult mai puternic
filmele subtiri utilizate pentru composi dependenta de temperatura
cu puncte de fierbere ridicate creste timpul de analiza
coloane capilare standard tipice de conditiile de operare trebuiesc
0,25 µm optimizate
0,53 mm ID (megabore) faza
104
Pierderile din coloana

Pierderi intervin la coloanele cu film gros

Coloanele polare au pierderi mai mari

Pierderile sunt excesive atunci cand coloanele sunt distruse sau


degradate
De evitat acizii si bazele puternice
De utilizat in domeniul de temperatura indicat
De evitat scapari (lipsa de etansietate)

105
Capacitatea coloanelor

Cantitatea maxima care poate fi injectata fara o


deformare/distorsionare semnificativa a picurilor
Capacitatea coloanelor creste cu:
grosimea filmului
temperatura
diametru intern
Selectifitatea fazei stationare
Daca se depaseste, rezulta:
efect de largire a benzilor
asimetrie

106
Coloane folosite in gaz cromatografie

COLOANE

UMPLUTE CAPILARE

FSOT-fused silica WCOT-wall coated SCOT-support coated PLOT – porous layer


open tubular open tubular open tubular open tubular

Coloanele tip “wide bore, 530 mm”, nu sunt coloane capilare in adevaratul sens
al cuvantului si permit folosirea unor debite ale gazului purtător de pana la 15 mL
min-1. Au performante superioare coloanelor cu umplutura
Coloanele capilare presupun folosirea unor debite de cel mult 1,5 mL min-1
107
Sectiuni prin coloane

Coloane capilare
Lungime: 10 m la 100 m
Diametre: 180 µm, 250 µm, 320 µm & 530 µm
Debite:
1,0 mL/min la 250 µm
1,5 mL/min la 320 µm
2,0 mL/min la 530 µm
acoperite cu poliimida
polyimide coating
capilara din
fused silica
silicecapillary
topita
faza
stationary
phase
stationara WCOT PLOT SCOT
Wall Coated Porous Layer Support Coated
Open Tube Open Tube Open Tube

Coloane cu umplutura
Lungime: < 2 m
Diametre: 1/8” & ¼”
108
Faze stationare

Fazele stationare sunt de mai multe feluri:


polare (polietilenglicol)
nepolare (cauciucuri siliconice)
intermediare
cu punti de hidrogen
specifice (separarea amestecurilor racemice)

nepolar polar

X=0; nepolar X=0,1; polar polar


X=0,65; intermediar X=0; polar

109
Faze stationare

R R R
R Si O Si O Si
R R nR

Faze staţionare folosite în GC: siliconice –nepolare, intermediare şi polare şi polietilenglicolice – polare.

Faza staţionară Nume Temperatura maximă, Aplicaţii


o
C
Polidimetil siloxan OV-1, SE-30 350 Fază nepolară; hidrocarburi,
medicamente aromatice polinucleare,
steroizi, PCBs
Poli(fenilmetildimetil)s OV-3, SE-52 350 Esteri metilici ai acizilor graşi,
iloxan (10% fenil) alcaloizi, medicamente, compuşi
halogenaţi
Poli(fenilmetil)siloxan OV-17 250 Medicamente, steroizi, pesticide,
(50% fenil) glicoli
Poli(trifluoro[propildim OV-210 200 Aromate clorurrate, nitroaromate,
etil)siloxan benzeni alchil-substituiţi
Polietilen glicol Carbowax 20 M 250 Acizi liberi, alcooli, eteri, uleiuri
esenţiale, glicoli
Poli(dicianoalildimetil) OV-275 240 Acizi graşi polinesaturaţi, acizi liberi,
siloxan alcooli
110
Detectorii gaz cromatografici

sesizeaza în mod continuu, rapid şi cu o mare sensibilitate, componentele din proba


supusă analizei
un detector ideal pentru gaz cromatografie are:
sensibilitatea adecvată
stabilitate şi reproductibilitate
răspuns liniar la analiţi care variază într-un domeniu larg de concentraţii
temperaturi de la valori normale la 400 oC
timp de răspuns rapid independent de debit
răspuns selectiv în raport cu o clasă de compuşi
nedestructiv în raport cu proba

zgomotul de fond apare datorită sensibilităţii metodei ce lucrează la limita unde


interferă zgomotul electronic cu cel dat de detector; constă în perturbaţii minuscule
ale liniei de bază având cauze multiple
driftul este devierea liniei de bază într-un timp dat (1h) exprimat în unităţile de
măsură uzuale ale semnalului înregistrat (mV, mA etc)
domeniul dinamic liniar al detectorului - domeniul în care semnalul variază liniar
cu concentraţia (sau cu debitul masei de component) ce trece prin detector
111
Detectorii gaz cromatografici

Limite de detectie şi domeniul dinamic pentru principalii detectori utilizaţi în GC.

Detector Selectivitate Sensibilitate Domeniul


-1
(g•mL ) liniar
FID (flame ionization detector) Compuşi organici ce ard în flacără -12 7
10 10
– cu ionizare în flacăra H2/aer
ECD (electron capture detector) Compuşi cu grupe funcţionale -14 4
10 10
– cu captura de electroni electronegative (X)
TCD (termal conductivity detetcor) -7 4
Detector universal 10 10
– catarometrul
NPD (nitrogen and phosphorus
Detector specific compuşilor cu atomi -14 5
detector) 10 10
de N sau P
– cu emisie termo-ionică
FPD (flame photometric detector) Compuşi cu potenţial de ionizare -11 4
10 10
– flamfotometrici mare
PID (photoionization detector) Compuşi ionizabili cu radiaţie UV -12 5
10 10
– bazati pe fotoionizare (hidrocarburi aromatice)
MS -14 5
Detector universal 10 10
- spectrometru de masă

112
Detectorii gaz cromatografici

detectori preferaţi
detectorul bazat pe conductibilitate termică (TCD)
detectorul cu ionizare în flacără (FID), neselectiv, sensibil la compuşii
organici C-H
detectorul cu fotoionizare (PID), selectiv la compuşi aromatici şi
nesaturaţi
detectorul cu captura de electroni (ECD) sau de conductivitate
electrolitică (ELCD), sensibili la compuşii cloruraţi şi oxigenaţi
detectorul azot-fosfor (NPD), selectiv faţă de compuşii cu conţinut de N
şi P
detectorul flam-fotometric (FPD), selectiv pentru compuşii ce conţin S
şi P
spectrometrul de masă, universal.
efectul asupra probei poate fi destructiv sau nedestructiv
FID este un detector destructiv
TCD este nedestructiv iar proba separată poate fi izolată
113
Detectorul de ionizare în flacara (FID) Colector

Sursă tensiune
Aer

H2

Coloană

sensibil la compuşii cu carbon Gaz


purtător

modificarea conductibilităţii electrice a gazelor în prezenţa unor particule încărcate


ionizarea moleculelor probei este intensificată de prezenţa unei flăcări de hidrogen (2000
– 2200 oC), care arde într-o incinta aflata în aer
moleculele covalente simple: N2, O2, CO, CO2, H2O, CS2, NH3, CCl4, SiCl4, NOx, He şi alte
gaze rare, nu pot servi unei analize chimice prin această metodă, prezentând cele mai
slabe semnale
detectorul nu este sensibil la gaze necombustibile precum SO2, CO2, H2O şi NOx.
grupările funcţionale precum carbonilii, alcoolii, halogenii şi aminele formează foarte
puţini, sau chiar deloc, ioni în flacără
detector cu efect destructiv asupra probei
răspunsul depinde de numărul de molecule ionizate ce apar în flacară
cele mai stabile rezultate se obţin pentru alcani iar semnalul scade în general cu creşterea
numărului de heteroatomi din moleculă
deoarece detectorul FID răspunde la numărul de atomi de C care intră în detector pe
unitatea de timp acesta este un detector sensibil la masă şi nu un sistem sensibil la
concentraţie (calculul se poate face în baza numărului de atomi de C din moleculă).
are o sensibilitate ridicată (~10-13 g/s), domeniu liniar de răspuns mare (~107) şi zgomot
scăzut 114
este robust şi uşor de folosit
Detectorul cu captură de electroni (ECD)

în detector, gazul purtător (N2) este ionizat de către o sursa ß- radioactivă (câţiva mCi furnizaţi de
o sursă conţinând 63Ni sau tritiu adsorbiţi pe o folie de platină sau titan), şi trece printre doi
electrozi, între care se asigură o cădere de tensiune de 100V
in lipsa oricărei molecule organice în gazul purtător există un curent de bază redus datorat
azotului molecular (N2) – molecule ionizate negativ
la apariţia în detector a unei molecule organice M, care conţine elemente electronegative (Cl, F) -
cu afinitate pentru electroni, aceasta va “capta” parte dintre electronii radiaţiei ß-, diminuând
curentul de recombinare a ionilor de semne contrare prin această ecranare:
N2 = N2+ + e- Curent de fond
M + e- = M-
M- + N2+ = M + N2 Ecranarea curentului de fond din ultimile două reacţii
detectorul este unul selectiv, adecvat pentru detecţia compuşilor halogenaţi (pesticide)
nu este sensibil la grupări aminice, alcooli şi hidrocarburi
nu afectează proba ca detectorul FID (efect nondestructiv)
dezavantaj: domeniul de răspuns liniar este limitat la aproximativ două ordine de mărime
Electrod +

Intrare gaz Ieşire gaz


purtător purtător

Principiul detectorului cu captura de 115


Electrod - Emiţător β electroni (ECD).
Cromatografia gaz-lichid/coloane capilare/overview

Un amestec este injectat in coloana cromatografica

Proba se injecteaza ca gaz sau lichid

O componenta solida poate fi dizolvata intr-un solvent dar picul solventului va fi de


asemeni observat
Injectarea probei
Faza mobila gazoasa

Coloana in cuptor la aproximativ 300 oC.


Substantele trebuie sa aiba capacitatea sa Extrem de
vaporizeze si sa nu se descompuna sensibil

Elutie cu un gaz inert


detector FID

116
Cromatografia gaz-lichid/coloane capilare/overview

Instrumente pentru analiza

Echipamente pentru etapele preparative

117
Cromatograma reala pentru fractiuni petroliere
superioare

118
Cromatograma obtinuta la analiza pesticidelor
halogenate din apa

DDT

1. α-HCH
2. γ-HCH
3. β-HCH 4 7 10
4. Heptachlor
11
5. δ-HCH 6
6. Aldrin
8 12
7. Heptachlor epoxide
8. Endosulfan I 13
9. 4,4’-DDE 9 14
10. Dieldrin 1
11. Endrin 5 15
12. 4,4’-DDD
13. Endosulfan II
17 18
14. 4,4’-DDT 3 16
15. Endrin aldehyde
2
16. Endosulfan sulfate
17. Methoxychlor
18. Endrin ketone
2 ppb in Water 119
Cromatograma FID a unei probe reale de aer
Analiza calitativa - identificarea componenţilor de interes s-a realizat
utilizând amestec de 55 hidrocarburi non-metanice C2-C9 (22964-
RESTEK, Spectra Gases).
Analiza cantitativa – standard de calibrare cu etan, etena, propan, n-
butan.

2-Methyl-1-Butene
iso-Pentane
n-Hexane

2-Methyl-Pentane
Ethane

Methyl-Cyclopentane
1-Pentene
Isoprene

t-2-Pentene
iso-Butene

2-Methyl-2-Butene

cis-2-Pentene

3-Methyl-Pentane
iso-Butane
FID Signal

n-Pentane
Acetylene

Cyclo-Pentane
Ethene

1-Butene

cis-2-Butene

1,3-Butadiene

n-Hexane
t-Butane
n-Butane
Propane
Propene

Toluene 2,2,-Dimethyl-Butane
Benzene 2,3-Dimethyl-Butane
Cyclohexane

120
Retention time (min)
Cromatograme reale in laborator – analize off-line

n-pentan
izopren
Fără O3

2,2-dimetilbutan

α-pinenă
m-xilen
benzen
Intensitate relativă
Cu 100 ppb O3

metacroleina
metil vinil
cetona

Cu 100 ppb O3 şi trapă de O3

Timp (min) 121