Metode cromatografice

Istoric

1906 – Tswett (botanist rus, 1872-1919) introduce pigmenţi

extraşi din plante într-o coloană umplută cu CaCO3 şi
observă separarea unor benzi colorate

denumeşte metoda cromatografie după cuvintele greceşti

chroma (culoare) şi graphein (a scrie)

metoda rămâne practic necunoscută şi neutilizată până în

anii 40

1931 – separări ale carotenoidelor (Kuhn şi Lederer,

Heidelberg)
 Metode cromatografice
Istoric

1941 – descoperirea cromatografiei de partiţie lichid-lichid

(Martin şi Synge, premiul Nobel în 1952)

1952 – introducerea cromatografiei în fază gazoasă (Martin şi

James, Londra)

12 premii Nobel pentru lucrări care au avut în plan central

metodele cromatografice

Cromatografia grupează o variată şi importantă grupă de metode

care permit cercetătorului să separe compuşi foarte asemănători din
amestecuri complexe. În toate separările cromatografice proba este
dizolvată într-o fază mobilă: gaz, lichid sau fluid supercritic. Această
fază este frecvent numită eluent, iar după ce trece de capătul coloanei
se numeşte eluat.
 Principiul cromatografiei
Trecerea continuă a unei faze mobile peste o fază care
rămâne fixă (faza staţionară)

Proba (care conţine componenţii de separat) este

introdusă în faza mobilă

Are loc o distribuţie continuă a componenţilor între

faza mobilă şi cea staţionară

Fiecare component are un coeficient propriu de

distribuţie între faze

Coeficienţi diferiţi de distribuţie contribuie la

separarea componenţilor datorită vitezelor diferite de
migrare
Principiul cromatografiei
Clasificarea metodelor cromatografice

 în funcţie de natura fazelor

 în funcţie de mecanismul de separare

după modul de contact între faza mobilă şi cea staţionară

- cromatografia pe coloană
- cromatografia planară: pe hârtie, pe strat subţire
Clasificarea metodelor cromatografice în funcţie
de natura fazelor

 faza mobilă – un fluid

- lichid
- gaz (în stare normală, în stare supercritică)
 faza staţionară
- solid
- film lichid depus pe un suport solid
Denumirea unei metode
- cromatografie “faza mobila” - “faza
staţionară”
Clasificarea metodelor cromatografice în funcţie
de natura fazelor
Clasificarea metodelor cromatografice în
funcţie de mecanismul de separare
 Cromatografia de adsorbţie

 rezultă din interacţiunea grupărilor funcţionale polare

ale solutului cu zone discrete ale suprafeţei adsorbante
solutul este adsorbit în funcţie de:
- configuraţia spaţială a funcţiunilor
- abilitatea solutului de a forma legături de hidrogen

 este caracteristică cromatografiei pe strat subţire (CSS

sau TLC)

 nu poate fi utilizată pentru substanţe cu polaritate

mare (aminoacizi)
 Cromatografia de repartiţie

 repartiţia solutului între 2 lichide nemiscibile

 faza staţionară – un film de lichid depus pe un

suport solid inert

 caracteristică cromatografiei pe hârtie şi celei

clasice pe coloană

 dezavantaj
- instabilitatea lichidului “legat” pe suport
Cromatografia de adsorbţie - repartiţie (fază legată)

 mecanism complex: între adsorbţie şi repartiţie

 faza staţionară poate să fie:

- legată chimic de un suport fizic
- ataşată suportului

 avantaje:
- stabilitate crescută a fazei staţionare faţă de
repartiţie
- echilibrare mai rapidă decât la adsorbţie
 Cromatografia de schimb ionic

 separarea se bazează pe afinitatea diferită a unei

faze staţionare ionice faţă de ionii solutului
- răşini cationice
Matrice–A-Y+ + M+ → Matrice–A-M+ + Y+
- răşini anionice
Matrice–A+Y- + X- → Matrice–A+X- + Y-

 condiţie pentru schimb ionic

- ionul Y este mai puţin atras de răşină faţă de
ionul solutului
 Cromatografia de excludere

 separarea este bazată pe diferenţele bazate pe

“dimensiunile” şi “forma” moleculei

 porii fazei staţionare nu permit accesul moleculelor mari

 moleculele mici sunt reţinute în interiorul porilor

 dezavantaje:
- molecule cu “formă” identică şi “funcţiuni chimice”
diferite se comportă asemănător
Clasificarea metodelor cromatografice după
modul de contact între faze
Clasificarea metodelor cromatografice după
modul de contact între faze
Clasificarea generală a metodelor
cromatografice
 TEORIA GENERALĂ A SEPARĂRILOR
CROMATOGRAFICE PE COLOANĂ

Procesul cromatografic
 introducerea probei ca o bandă îngustă

 componenţii migrează sub acţiunea fazei mobile

 în funcţie de interacţiunea cu faza staţionară,

componenţii se separă

 benzile devin mai late şi au un profil Gaussian

avi
 Volumul mort (Vm)

Volumul fazei lichide din interiorul coloanei:

Volumul mort este de cca. 65% din

volumul coloanei:
 Factorul de capacitate (k’)

- raportul masei de analit în faza staţionară şi mobilă

K - coeficientul de distribuţie – raportul dintre concentratiile

analitului in faza stationara si mobila
Cromatograma
 Retenţia cromatografică

- viteza de migrare relativa la cea a fazei mobile

tm – timpul mort (corespunzător Vm)

tr – timpul de retenţie
t’r – timpul de retenţie ajustat
Timpul de retenţie
Picul cromatografic
Forma picului cromatografic
 Eficienţa separării cromatografice
Modelul termodinamic (talere)

 introdusă de Martin şi Synge

 descrie separarea cromatografică asemănător cu distilarea

şi extracţia în contracurent

 un taler (platou) este lungimea coloanei pe care are loc

stabilirea echilibrului între cele 2 faze
- trecerea solutului în faza staţionară şi
revenirea în faza mobilă
 Eficienţa separării cromatografice

Numărul de talere teoretice (n)

- pătratul raportului dintre retenţia unui analit şi

deviaţia standard a picului corespunzător acestuia

- pentru un pic gaussian

 Eficienţa separării cromatografice
Numărul de talere teoretice pentru picuri asimetrice
 Eficienţa separării cromatografice

Numărul efectiv de talere teoretice (N sau nef)

- similar cu n dar înlocuieşte tr cu t‘r
- corectează deficienţele picurilor eluate foarte devreme,
pentru care timpul mort le influenţează semnificativ

- între n şi N există relaţia:

 Eficienţa separării cromatografice

Înălţimea talerelor

 înălţimea talerelor determinată de lungimea

coloanei:

 înălţimea talerelor efective :

 Modelul cinetic

 introdus de van Deemter şi colab.

 este orientat pe influenţa factorilor cinetici asupra
înălţimii echivalente a unui taler teoretic H
 H este suma individuală a factorilor cinetici:
- difuzia turbionară
- difuzia longitudinală
- rezistenţa la transferul de masă
 Rezoluţia

 ia în calcul diferenţele de retenţie (timpii de

retenţie) şi de eficacitate (lăţimea picurilor)

 pentru 2 picuri cu
- timpii de retenţie (tr)1 şi respectiv (tr)2
- lăţimea la bază a picurilor (wb)1 şi (wb)2
Rezoluţia