1.

Defini ie

Cromatografia reprezint o metod de separare bazat pe reparti ia diferen iat a componen ilor unui amestec de separat ntre dou faze n contact i situndu-se ntr-un raport de micare relativ una fa de cealalt (generic definite prin termenii de faz sta ionar, respectiv faz mobil). Comentarii a) reparti ia diferen iat a componen ilor amestecului de separat ntre cele dou faze este realizabil prin intermediul oricrui proces de echilibru dinamic de distribu ie, bazat pe anumite propriet i fizico-chimice comune anali ilor i respectiv fazelor n contact; procesele de distribu ie ireversibil deplasate ctre una din faze nu pot constitui baza procesului cromatografic de separare. b) majoritatea tehnicilor cromatografice presupun reparti ia diferen iat a anali ilor ntre o faz fix (sta ionar) i una mobil. Cromatografia electrocinetic micelar (MEKC) i cromatografia n contracurent (CCC) apeleaz ns la faze lichide nemiscibile care se deplaseaz n direc ii opuse, fapt ce explic formularea defini iei prezentat anterior. c) sistemele cromatografice s-au dezvoltat nu numai n sensul asigurrii reparti iei diferen iate, deci a separrii componen ilor unui amestec, ci i n sensul realizrii altor dou procese de baz: 1. transferul amestecului de separat de la operator ctre sistemul cromatografic, ntr-o manier cantitativ i reproductibil (- sistem de injec ie); 2. analiza cantitativ i uneori calitativ a fiecrui component separat din amestecul ini ial injectat, pa baza monitorizrii unei propriet i intrinseci fiecrui analit (- sistem de detec ie). In func ie de complexitatea amestecului supus separrii, sistemul de injec ie poate asigura transferul neselectiv al probei, sau, dimpotriv poate ac iona discriminatoriu, deci selectiv, n sensul transferului doar a unor componen i de interes analitic. In cea de-a doua ipostaz, sistemul de injec ie poate fi considerat un sistem de preseparare inclus sistemului cromatografic. In consecin , dei cromatografia reprezint n esen o metod de separare, ea se realizeaz practic pe sisteme complexe, care asigur att injec ia, ct i separarea ca atare i detec ia, ceea ce face ca, n ultim instan , s se reproduc la nivelul unui dispozitiv de laborator toate etapele procesului analitic: pregtirea probei, separarea componen ilor individuali, analiza cantitativ i/sau calitativ, prelucrarea datelor.

2. Clasificarea metodelor cromatografice

1

2.1.

Natura fazelor aflate n contact

Clasificarea metodelor cromatografice n raport cu natura fazelor ntre care anali ii se distribuie diferen iat este prezentat n tabelul 1. Tabelul 1. Clasificarea metodelor cromatografice func ie de natura fazelor. Faza mobil Gaz Gaz Faza sta ionar Solid* Lichid** Denumire Apelativ generic

Fluid Solid* sau supercritic*** Lichid** Lichid Solid*

Lichid

Lichid**

Cromatografie de reparti ie GC gaz-solid Cromatografie de reparti ie GC gaz-lichid Cromatografie de fluide n SFC stare supercritic Cromatografie de reparti ie LC lichid-solid (adsorb ie) Cromatografie de reparti ie lichid-lichid (polaritatea fazei mobile mai mic dect NP-LC polaritatea fazei sta ionare cromatografie de lichide n faz normal) Cromatografie de reparti ie lichid-lichid (polaritatea fazei mobile mai mare dect RP-LC polaritatea fazei sta ionare cromatografie de lichide n faz invers)

solid cu propriet i absorbante;

** lichid vscos, repartizat sau imobilizat chimic, n mod uniform pe suprafa a unui solid inert; *** gaz adus la o temperatur i presiune superioare valorilor critice (T>Tc; P>Pc). Rezult un fluid cu propriet i intermediare ntre lichid i gaz (capacitate de solubilizare i densitate similare lichidelor, vscozitate i difuzivitate similare gazelor). 2.2. Modul de dispunere relativ a fazelor (sub aspect geometric) 2

Se diferen iaz astfel dou moduri de separare cromatografic: a) Cromatografia planar - faza sta ionar este distribuit la nivelul unei suprafe e plane, iar faza mobil se deplaseaz fie prin fenomenul de capilaritate, fie n cmp gravita ional, fie n gradient de presiune. Sunt cunoscute dou variante de cromatografie planar: I. Cromatografie pe hrtie; II. Cromatografie pe strat sub ire. In primul caz, faza sta ionar este reprezentat fie de celuloz compactat, sub form de folie poroas (prin tehnologia de ob inere a hrtiei, porii vor fi orienta i riguros ntr-un anumit sens), fie de orice lichid imobilizat fizic sau chimic pe suprafa a foliei de celuloz. In cel de-al doilea caz, este vorba de un strat de o anumit grosime de solid pulverulent depus pe o suprafa plan din sticl, metal (aluminiu), sau material plastic. Stratul de solid pulverulent (granula ia particulelor este extrem de fin, n general inferioar valorii de 20 m) constituie fie faza sta ionar ca atare, fie un suport inert destinat reparti iei unui strat uniform de lichid (eventual imobilizat chimic) care va ac iona, n acest caz, drept faz sta ionar. Dac planul de dispunere al fazei sta ionare este vertical, iar alimentarea cu faz mobil se realizeaz la partea superioar (elu ia cromatografic se face n cmp gravita ional), vom vorbi despre cromatografia planar descendent. In cazul n care alimentarea cu faz mobil se efectueaz la partea inferioar (elu ia cromatografic se realizeaz prin fenomenul de capilaritate), ne situm n cazul cromatografiei planare ascendente. Dac planul de dispunere al fazei sta ionare este circular i orizontal, iar alimentarea cu faz mobil se realizeaz central (micarea fazei mobile efectundu-se prin capilaritate), prin intermediul unui fitil poros, ne situm n cazul cromatografiei planare radiale. Dac faza sta ionar va fi dispus ntr-un plan orizontal, ntre dou perne pneumatice, iar circula ia fazei mobile se realizeaz ntr-o singur direc ie prin aplicarea unei presiuni de alimentare la unul din capetele planului, ne vom situa n cazul cromatografiei planare de nalt presiune (HPTLC). Dac faza sta ionar este dispus plan i se vor aplica succesiv, pe direc ii perpendiculare, dou tipuri distincte de faz mobil, ne vom situa n cazul cromatografiei planare multidimensionale. In sfrit, n cazul n care exist mai multe tipuri de faz mobil, aplicate succesiv i dup aceeai direc ie, vom putea vorbi despre cromatografia planar secven ial. Diversele tipuri de cromatografie planar sunt prezentate succint n Figurile 1 i 2. b) Cromatografia pe coloan - se realizeaz n condi iile n care faza sta ionar se va dispune uniform n interiorul unui tub cilindric (de un anumit diametru interior i o anumit lungime), faza mobil i amestecul de separat

d TL

direc ie controlat a orientrii porilor strat sub ire plac sticl, folie aluminiu sau material plastic film faz sta ionar uniform distribuit (eventual imobilizat chimic) material solid inert granular (5 - 20 m)

sau liant macromolecule de celuloz molecule de faz sta ionar adsorbite sau imobilizate chimic

sau

faz sta ionar (solid granular - 5 ~ 20 m, cu anumit porozitate - zeci ~ sute ngstromi)

Cromatografie pe Hrtie (PC)

Cromatografie pe Strat Sub ire (TLC)

direc ii radiale de elu ie (capilaritate) Faz Mobil Sistem fixare Band poroas flexibil Folie hrtie sau strat Sub ire Rezervor Folie hrtie sau strat sub ire Faz Mobil Fitil Poros Rezervor

capilaritate

Cromatografie radial
sistem pompare faz mobil la nalt presiune

direc ia de elu ie

direc ia de elu ie Faz Mobil cmp gravita ional - G Strat Sub ire Faz Mobil

Perne Pneumatice direc ia de elu ie

cmp gravita ional - G

Rezervor

Cromatografie descendent

Cromatografie ascendent

Cromatografie pe strat sub ire de nalt presiune (OP[HP]TLC)

Figura 1. Diverse tipuri de cromatografie planar. 4

Plac cromatografic Componen i individuali direc ie de elu ie 1 90 Dt ; uscare plac direc ie de elu ie 2 Faza Mobil B

Faza Mobil A

punct aplicare prob

Frac ii ale amestecului ini ial

direc ii de migrare rezultante

Cromatografie planar multidimensional

direc ie de elu ie 1

direc ie de elu ie 2

direc ie de elu ie N

Dt ; uscare plac

Dt ; uscare plac

Frac ii ale amestecului ini ial punct aplicare prob Faza Mobil A Faza Mobil B

Frac ii ale amestecului ini ial

Componen i individuali

Faza Mobil N

Cromatografie planar secven ial

Figura 2. Cromatografia planar cu elu ie multipl 5

aplicndu-se la unul dintre capetele coloanei, iar detec ia efectundu-se la captul opus. Sunt cunoscute 2 tipuri de coloane: coloane umplute (packed columns) i coloane deschise (open tubular columns). Coloanele umplute con in faza sta ionar ct mai uniform distribuit n tot volumul interior al tubului cilindric. In cazul n care faza sta ionar este un lichid, acesta se va distribui mai nti pe suprafa a unui suport granular inert, care ulterior se va tasa n interiorul coloanei. Coloanele umplute sunt ndeobte caracterizate prin diametre mari i lungimi relativ reduse. Aceste caracteristici sunt n esen logice, deoarece cu ct lungimea unei coloane va fi mai mare, cu att rezisten a hidrodinamic pe care umplutura coloanei o exercit la deplasarea fazei mobile va fi mai mare. Dac faza mobil prezint vscozitate i densitate reduse valoric (cum este cazul gazelor), lungimea coloanelor poate fi de pn la 4 m, n func ie i de granula ia suportului inert sau a fazei sta ionare solide. In cazul n care faza mobil este un lichid (solvent pur sau un amestec de solven i), densitatea i vscozitatea sporit limiteaz lungimea coloanelor la valori de pn la 50 cm. Diametrul interior al coloanei poate fi n egal msur corelat cu volumul de faz mobil utilizabil, deci, n ultim instan , cu scopul separrii. Dac diametrul interior al coloanei depete 6 mm, volumul de faz mobil utilizabil este nsemnat, scopul separrii fiind n acest caz cel preparativ sau semipreparativ. Dac diametrul interior variaz n domeniul 2 - 6 mm, ne vom situa n cazul coloanelor clasice (normale), scopul separrii fiind n esen analitic. Deoarece n cromatografie sunt utilizate frecvent faze mobile (gaze sau lichide) fie cu pre de cost ridicat, fie toxice, n cazul separrilor n scop analitic se va urmri ntotdeauna limitarea volumului utilizat de faz mobil. Aceast observa ie a condus la utilizarea coloanelor de tip narrow-bore (nguste) cu diametre interioare cuprinse ntre 0,75 - 2 mm. Tehnologiile moderne permit astzi ob inerea de coloane cu diametre interioare extrem de reduse pe de-o parte, iar pe de alt parte a umpluturilor (suport inert sau faz sta ionar solid) cu granula ie extrem de fin (sub 5 m). In aceste condi ii, n practica analitic de laborator curent se utilizeaz microcoloanele umplute, cu diametre interioare cuprinse n domeniul 0,32 0,75 mm. Coloanele deschise (open tubular columns) con in faza sta ionar uniform distribuit pe suprafa a peretelui interior al tubului. Faza mobil va circula n spa iul rmas liber n zona axei longitudinale a coloanei. Pentru ca reparti ia cromatografic s aib loc n condi ii optime, este necesar ca filmele de faz sta ionar i de faza mobil aflate n contact s fie extrem de nguste. Acesta este motivul pentru care, ntotdeauna, coloanele deschise sunt n egal msur microcoloane (i.d. cuprins ntre 0,72 - 0,1 mm). Utilizarea coloanelor deschise n cromatografia de gaze este astzi preponderent. Deoarece, rezisten a hidrodinamic a unei astfel de coloane, 6

exercitat n momentul deplasrii fazei mobile, este redus, lungimile acceptate variaz ntre 10 i 100 m. Este consacrat termenul generic de coloan capilar pentru coloanele deschise (i.d. 0,52 - 0,1 mm i lungime de pn la 100 m) utilizate n cromatografia de gaze. Este dovedit posibilitatea practic de utilizare a coloanelor deschise (cu i.d. sub 0,16 mm) i n cromatografia de lichide. Aplicabilitatea unei astfel de tehnici este nc relativ redus, datorit necesit ii utilizrii unor sisteme de injec ie de volum mic (c iva nanolitri) fiabile i a unor sisteme hidraulice precise de pompare a fazei mobile cu debite de ordinul zecilor de nanolitri per minut. Coloanele deschise, care se ob in prin depunerea pe suprafa a interioar a coloanei a unui film sub ire (de ordinul micrometrilor), cu grosime constant i perfect uniform, poart denumirea WCOT (wall coated open tubular). Nu trebuie ns ignorat faptul c, n cromatografia de gaze, coloanele sunt exploatate la temperaturi mari (ntre 60 - 300C), iar debitele de gaz (faza mobil) sunt adeseori nsemnate (1 -7 mL/min). In aceste condi ii, filmele prea groase de faz sta ionar nu vor fi n mod stabil aderente la peretele interior al coloanei. Pentru a spori aderen a, este de dorit imobilizarea chimic (reac ia ntre centrii de activitate chimic ridicat situa i la nivelul moleculei de faz sta ionar cu centrii corespunztori existen i n suprafa a materialului din care este confec ionat coloana) a fazei sta ionare la nivelul peretelui interior. Se ob in astfel coloanele capilare deschise de tip BP (bonded phase - faz legat). Imobilizarea chimic nu este ns ntotdeauna posibil. Se ncearc de aceea uneori doar o ancorare mecanic a filmului de faz sta ionar. Sporirea rugozit ii peretelui interior al coloanei (prin atac chimic) permite depunerea de filme cu grosime sporit, fr ns a exista riscul pierderii accidentale de faz sta ionar n momentul exploatrii coloanei (proces cunoscut sub denumirea de column bleeding). Este generat astfel o nou familie de coloane capilare deschise, cunoscute sub denumirea SCOT (suport coated open tubular). Creterea rugozit ii suprafe ei interioare a coloanei este realizabil i prin depunerea de material microgranular poros aderent. Tehnologic este posibil ca simultan cu procesul de tragere a tubului capilar s se depun pe peretele interior un strat sub ire de material inert poros (NaCl, Ca2CO3), peste care ulterior se va depune n film uniform faz sta ionar. Coloanele deschise de acest tip poart denumirea de PLOT (porous layer open tubular). Tipurile de coloane capilare (umplute sau deschise) sunt prezentate, n sec iune transversal, prin analogie cu o coloan clasic, n Figura 3. Tabelul 2. prezint, comparativ, diverse tipuri de coloane utilizate n tehnicile cromatografice, men ionndu-se succint i cteva date constructive i de exploatare.

Coloan umplut i.d. > 1 mm

Coloane cromatografice deschise (OT) - coloane particule de suport inert cu form neregulat grosimea filmului de faz sta ionar (d ) f film uniform de faz imobilizare chimic sta ionar lichid particule de faz sta ionar (solid adsorbant) cu form neregulat diametrul interior (i.d.)
peretele coloanei diametrul exterior (d.ext.)

capilare

WCOT
film uniform de faz sta ionar lichid particule de suport inert cu form sferic particule de faz sta ionar (solid adsorbant) cu form sferic peretele coloanei

WCOT - BP
solid inert microgranular

Microcoloan umplut 0.3 mm < i.d. < 0.7 mm

SCOT

PLOT 0.10 mm < i.d. < 0.70 mm

Figura 3. Prezentare schematic a tipurilor de coloane utilizate n cromatografie (sec iune transversal). 8

D.i. (mm) 7 4,6-7 3-4,6 1-2,1 0,3-0,8 0,16 1-10 0,75-1 0,16-0,52 0,16

Tabelul 2. Tipuri de coloane cromatografice; detalii constructive i de exploatare. Domeniu Material Debit Grosime Scopul Granula ie Lung. Tip aplicabi- confec . faz film faz (cm) coloan separrii umplutur litate coloan mobil sta ionar prepara- zeci umplut LC o el, sticl -40 5-20 m tiv mL/min semipre- 5-10 umplut LC o el -40 5-12 m parativ mL/min 0,5-2 umplut LC o el analitic -50 3-7 m mL/min 0,1-0,8 umplut LC o el analitic -30 3-5 m mL/min max 100 cuar , umplut LC analitic -100 3-5 m teflon L/min zeci deschis LC cuar analitic -1.000 5 m nL/min sticl, zeci umplut GC cuar , analitic 400 20-100 m - mL/min metal sticl, 10 deschis GC analitic -50g 20 m cuar mL/min sticl, 4 analitic -10.000 deschis GC 15 m cuar mL/min 1 cuar analitic -10.000 deschis GC 5 m mL/min 9

Denumire particular coloan preparativ coloan semiprepa-rativ coloan normal coloan narrow bore microcoloan umplut microcoloan WCOT coloan gaz cromatografic umplut coloan megabore coloan capilar coloan ultrabore

2.3. ntre cele

Natura proceselor care determin reparti ia diferen iat a anali ilor dou faze.

a) Similitudinea ntre caracterul hidrofob (sau apolar) al uneia dintre faze i cel al componentului separat. Interac iile bazate pe caracterul intrinsec hidrofob al anali ilor, cu fazele aflate n contact presupun legturi intermoleculare slabe de tip Van der Waals. Dac se discut fenomenologic procesul cromatografic de reparti ie diferen iat n termeni de polaritate vor trebui luate n considerare legturile intermoleculare mai puternice de tip dipoldipol sau legtur de hidrogen. De asemenea, vor trebui considerate no iunile de dipol permanent, respectiv dipol indus. In ciuda complexit ii proceselor la scar molecular, o regul sigur de reparti ie poate fi formulat. Este cunoscut sub numele de criteriu "like-like" i se enun astfel: orice analit se va distribui cu precdere n acea faz al crei caracter din punct de vedere al polarit ii se aseamn cel mai bine cu propriul su caracter. In consecin , dac analitul se distribuie cu precdere n faza mobil, el va fi re inut un timp redus n coloana cromatografic, deci va elua mai rapid. Dac analitul se distribuie cu precdere n faza sta ionar (reparti ia diferen iat este un proces de echilibru, deci afinitatea analitului ctre faza sta ionar nu trebuie asimilat cu distribu ia ireversibil a acestuia n faza sta ionar) acesta va parcurge coloana ntr-un timp mai lung, va fi deci re inut mai mult n coloan, deci se va elua mai lent. Schematic, procesul de reparti ie bazat pe similitudinea caracterului hidrofob ntre anali i i fazele n contact este ilustrat n Figura 4. I. Factorul steric. Factorul steric poate controla procesul de reparti ie cromatografic. Prin factorul steric putem n elege fie mrimea edificiului molecular propriu analitului (volum molecular), fie o anumit particularitate geometric molecular (de pild, gradul de planeitate molecular), fie o particularitate de dispunere spa ial a unor grupri func ionale din structura analitului capabil s interac ioneze cu centrii de activitate riguros distribui i geometric n faza sta ionar (mecanisme de discriminare chiral). Procese de reparti ie cromatografic diferen iate bazate pe volumul molecular. Inc de la nceput trebuie fcut urmtoarea precizare: echivalen a volum molecular mare mas molecular mare este n general valabil n domeniul de mase moleculare mici (<<1.000). Dac discu ia se poart cu referire la substan e polimere, trebuie fcut distinc ia ntre no iunile de mas molecular vscozimetric i mas molecular numeric. Masa molecular vscozimetric este o mrime care caracterizeaz macromolecula sub aspectul mpachetrii acesteia. Dac modul de mpachetare molecular este globular, volumul ocupat de macromolecul este mare. Dimpotriv, dac o macromolecul se orienteaz strict ntr-o direc ie a spa iului (filiform),

10

Componen ii amestecului de separat F.S. F.M. H H

F.S.

F.M.

F.S.

F.M.

R.D.

Caracter hidrofob redus (polar) Caracter pronun at hidrofob (apolar)

t (min)

Figura 4. Mecanismul de separare cromatografic bazat pe similitudinea caracterului hidrofob (apolar) dintre anali i i fazele n contact. volumul su molecular este redus. Masa molecular numeric este corelat practic numai cu gradul de polimerizare. In consecin , o macromolecul cu mas molecular numeric mare nu este n mod riguros i o molecul cu mas vscozimetric mare, deci cu volum molecular considerabil i invers. De exemplu, polimerii dimetilsiloxanici utiliza i n sistemele mecanice de amortizare prezint mase moleculare numerice medii de ordinul 15.000 i mase moleculare vscozimetrice medii superioare cu un ordin de mrime. Pentru a ilustra mecanismul de reparti ie cromatografic controlat prin factorul steric, vom considera un suport solid inert, poros, avnd proprietatea de a prezenta pori cu diametre interioare riguros identice (n fapt, distribu ia valoric a diametrelor interioare a porilor este extrem de ngust). De subliniat este faptul c lungimea i orientarea spa ial a porilor nu este important, deci nu intervine explicit n mecanismul de reparti ie cromatografic. De asemenea, vom presupune c n interiorul acestor pori cu lungime i orientare variabile, dar cu diametre interioare riguros identice, se distribuie uniform faza sta ionar lichid. Practic, lichidul distribuit n porii suportului inert poate fi acelai cu lichidul utilizat drept faz mobil. Mecanismul cromatografic este deci bazat pe reparti ia lichid-lichid. In ultim instan , reparti ia diferen iat a anali ilor are loc ntre un lichid repartizat (i imobilizat) n interiorul unor pori cu diametre interioare egale (dar de lungime i orientri diferite) i respectiv acelai lichid, aflat n micare 11

relativ n raport cu suprafa a granulelor de suport inert poros. S presupunem faptul c amestecul de separat este un amestec bicomponent, alctuit din dou specii moleculare cu volume diferite (pentru simplificare vom considera molecule sferice, ntr-unul din cazuri diametrul molecular este mai mare dect diametrul porilor, n cel de-al doilea caz diametrul molecular fiind mai mic dect diametrul porilor). Faza mobil reprezint un solvent ideal pentru ambele specii moleculare. In mod firesc, va exista tendin a de reparti ie a moleculelor celor dou tipuri de anali i i n lichidul imobilizat n porii suportului inert. Procesul poate avea loc ns doar n cazul speciei al crei diametru molecular este mai mic dect diametrul porilor. Moleculele de diametre mai mari dect cel ce caracterizeaz porii suportului inert nu au acces fizic la lichidul din interiorul acestor pori. In consecin , analitul caracterizat prin diametru molecular mare se va repartiza numai n faza mobil, deci se va elua mai rapid. Analitul cu volum molecular mic se poate distribui i n lichidul imobilizat n porii suportului (deci n faza sta ionar), ceea ce face ca el s se elueze mai lent. Acest mecanism de separare poart numele de cromatografie de excluziune steric i este ilustrat schematic n Figura 5.

Suport inert poros F.S.

F.S.

F.M.

F.S. R.D.

F.M.

F.M.

F.M. t (min)

Figura 5. Mecanismul de separare cromatografic bazat pe excluziune steric. Procese de reparti ie cromatografic bazate pe gradul de planeicitate molecular. Apeleaz la faze sta ionare (de cele mai multe ori imobilizate chimic) speciale, cunoscute sub numele de cristale lichide. O substan de tip cristal lichid se caracterizeaz printr-o molecul riguros distribuit ntr-un singur plan (form lamelar). 12

La temperaturi nalte, moleculele lamelare se orienteaz dup toate direc iile spa iului, nepreferen ial, substan a comportndu-se ca un lichid izotrop. Prin diminuarea temperaturii este posibil tranzi ia ctre o stare mai ordonat, n care moleculele lamelare se organizeaz dup direc ii axiale paralele pe distan e macroscopice, denumit stare nematic. Evolund ctre temperaturi mai joase, gradul de organizare local sporete, ajungndu-se ca, n stare smetic, substan a lichid s posede o structur cu propriet i de cristal lichid. Dac un film de substan cu propriet i de cristal lichid, n stare smetic, este depus uniform pe suprafa a unui solid inert (i eventual imobilizat chimic), accesul n interiorul filmului este permis doar anali ilor a cror structur molecular permite interferen a izomorf n re eaua ordonat de structur lamelar. Ceilal i componen i de separat, cu structur dezvoltat bidimensional, se vor repartiza preferen ial n faza mobil i se vor fi elua i rapid. Creterea temperaturii are ca efect tranzi ia fazei sta ionare din starea smetic n cea nematic. Defectele de organizare local ale structurii lamelare permit i moleculelor altor anali i, cu abateri de la dispunerea plan, s fie nglobate izomorf i deci reten ia acestora n coloana cromatografic crete. Operarea fazei sta ionare n condi ii de temperatur ce favorizeaz starea de lichid izotrop conduce la imposibilitatea separrii anali ilor n raport cu gradul lor de planeicitate molecular. Mecanismul de separare este ilustrat n Figura 6.
F.S. - form smetic F.M. F.S. - form nematic F.M. F.S. - form isotrop F.M.

R.D.

R.D.

R.D.

? ?

t (min)

t (min)

t (min)

Figura 6. Mecanism de separare cromatografic bazat pe recunoaterea gradului de planeitate molecular. Procese de separare chiral. Mecanismele de separare cromatografic pot avea la baz interac iile specifice care apar ntre gruprile func ionale din structura analitului i centrii de activitate caracteristici fazei sta ionare. Pentru ca astfel de interac iuni s se poat manifesta este necesar ca modul de dispunere geometric a centrilor de activitate din faza sta ionar s coincid cvasiperfect cu orientarea spa ial caracteristic gruprilor func ionale din 13

structura molecular a analitului. Astfel de mecanisme complexe servesc deseori n procese cromatografice chirale (separare de enantiomeri). In general, pentru ca faza sta ionar s poat s recunoasc doar pe unul dintre enantiomerii analitului (cel care se va repartiza preferen ial n faza sta ionar, deci cel care va fi mai mult re inut n coloan), este necesar ca la rndul ei s posede centri de activitate optic i, mai mult dect att, aceti centri s corespund riguros unei singure configura ii (L sau D). In Figura 7. este ilustrat mecanismul de separare chiral bazat pe coinciden a dintre dispunerea spa ial a centrilor de activitate din faza sta ionar i gruprile func ionale din molecula analitului. Uneori, fazele sta ionare utilizate n procesele de discriminare chiral pot fi polimeri care prezint n structura lor cavit i cu form, dispunere i suprafe e cu propriet i riguros definite. Sunt tipice cazurile ciclodextrinelor (oligomeri ciclici de tip zaharidic) cu molecule n form de trunchi de con, cu o cavitate cilindric longitudinal, sau a celulozelor, amilazelor i proteinelor modificate chimic, cu macrostructur helicoidal, deci cu cavit i cilindrice longitudinale caracterizate prin diametre interne bine definite valoric.

F.M. C*

E1

F.M.

C*

E2

* F.S. R.D.

* F.S.

E2

E1

t (min)

Figura 7. Mecanismul de separare a enantiomerilor pe faze sta ionare chirale (forma enatiomeric pur - configura ie L sau D). In aceste cazuri, pe lng similitudinea distribuirii geometrice dintre centrii de activitate specifici fazei sta ionare i gruprile func ionale din structura analitului, vor exista i fenomene generate de incluziunea/ excluziunea moleculei de solut n/din interiorul cavit ilor existente n faza sta ionar. 14

Schematic, procesul este ilustrat n Figura 8.

E1
C*

F.M.

F.M.

E2

C*

F.S. R.D.

F.S.

E2

E1

t (min)

Figura 8. Mecanism de recunoatere chiral bazat i pe fenomenul de incluziune. Procesele de incluziune pot uneori servi i separrilor ntre izomerii de pozi ie ai deriva ilor cu caracter aromatic. Mecanismul este ilustrat n Figura 9.
F.M. F.M. X X X X X X F.M.

F.S. R.D. o m

F.S. p

F.S.

t (min)

Figura 9. Mecanismul separrii izomerilor de pozi ie bazat pe fenomenul de incluziune n cavit ile generate de structurile dextrinice ciclice. c) Schimbul ionic. Mecanismul cromatografic de separare prin schimb ionic are la baz interac iile electrostatice care se stabilesc ntre anumite grupri func ionale disociabile din structura fazei sta ionare i ionii de semn contrar ai amestecului de separat. 15

Sunt de fcut urmtoarele precizri: fazele sta ionare utilizate n cromatografia de schimb ionic pot fi considerate polielectroli i greu solubili. In fapt, sunt structuri polimere (fie de natur organic, fie de natur anorganic) care prezint grupri func ionale disociabile n mediu apos, n anumite condi ii de pH. De exemplu, un polimer stiren-divinilbenzenic modificat cu grupri sulfonice reprezint o faz sta ionar tipic pentru cromatografia de schimb ionic. Structura tridimensional a polimerului organic (macromolecule polistirenice reticulate prin pun i divinilbenzenice) este insolubil n medii apoase i prezint grefate chimic grupri sulfonice, care n anumite condi ii de pH ale fazei mobile pot disocia. Este disponibilizat n acest mod un proton, iar gruparea -SO3- din structura polimer este apt de a interac iona cu unul din ionii amestecului de separat (ioni organici moleculari sau ioni anorganici). n cazul cromatografiei de schimb ionic, componen ii amestecului de separat sunt fie structuri organice disociabile n mediu apos i deci solubile, fie ioni (atomici sau moleculari) de tip anorganic (rezulta i prin disocierea n mediu apos a unor sruri, acizi sau baze). Faza mobil n cromatografia de schimb ionic este apa. Pentru a se putea controla schimbul ionic ntre cele dou faze, pH-ul fazei mobile va fi n mod continuu modificat. Interac iile electrostatice sunt interac ii puternice, n general cu tendin de ireversibilitate, ceea ce face ca ele s fie improprii reparti iei cromatografice diferen iate n echilibru. Tocmai de aceea, condi iile de pH i trie ionic ce caracterizeaz faza mobil sunt alese n aa fel nct interac iile mijlocite prin atrac ia electrostatic ntre grupri de semn contrar s rmn procese de echilibru. fazele sta ionare utilizate n procesele cromatografice de schimb ionic, avnd n structura lor grupri func ionale care prin disociere n mediu apos elibereaz cationi, sunt generic cunoscute sub denumirea de schimbtori de cationi sau cationi i. Gruprile func ionale purttoare de sarcin, imobilizate la nivelul structurii polimere tridimensionale insolubile, sunt n acest caz fie -SO3(provenit n urma disocierii gruprii -SO3H), fie -COO- (provenit n urma disocierii gruprii -COOH), fie -O- (provenit n urma disocierii gruprii -OH de tip fenolic). Fazele sta ionare utilizate n procese cromatografice de schimb ionic, avnd n structura lor grupri func ionale, care prin disociere n mediu apos elibereaz anioni, sunt generic cunoscute sub denumirea de schimbtori de anioni, sau anioni i. Gruprile func ionale purtoare de sarcin, imobilizate la nivelul structurii polimere tridimensionale insolubile, sunt n acest caz fie (N+R3) (provenit n urma disocierii gruprii amoniu cuaternar -NR3X), fie (N+HR2) (provenit n urma disocierii gruprii amino ter iare -NR2HX), fie (NH2R) (provenit n urma disocierii gruprii amino secundare -NHRHX). exist o clasificare a fazelor sta ionare utilizate n cromatografia de schimb ionic, n raport cu uurin a gruprilor func ionale de a disponibiliza, n 16

mediu apos, cu pH neutru, fie protonul (n cazul schimbtorilor de cationi), fie ionul hidroxil (n cazul schimbtorilor de anioni). Dac procesul de disociere are loc rapid (eliberarea protonului sau ionului hidroxil este cvasi instantanee) ne situm n cazul schimbtorilor tari de ioni. Dac dimpotriv, disocierea gruprilor func ionale din structura fazei sta ionare necesit condi ii specifice de pH ale fazei mobile, din ce n ce mai bazice pentru schimbul de cationi, sau din ce n ce mai acide pentru schimbul de anioni, ne situm n cazul schimbtorilor de ioni cu trie medie sau redus. Tria schimbtorilor de cationi variaz n ordinea: -SO3- > -COO- >-O-. Tria schimbtorilor anionici variaz n ordinea: -(N+R3) > -(N+HR2) -> (NH2R). o alt mrime ce caracterizeaz fazele sta ionare utilizate n cromatografia de schimb ionic se refer la numrul de grupri func ionale disociabile raportate la masa sau volumul de substan solid. Aceast caracteristic este cunoscut sub numele de capacitate de schimb i se exprim prin numrul de miniechivalen i protoni (n cazul cationi ilor), sau ioni hidroxil (n cazul anioni ilor) disponibiliza i n procesul de disociere a gruprilor existente n unitatea de mas sau de volum de faz sta ionar, n contact cu faza mobil. Pentru ca procesul de separare cromatografic s aib loc n bune condi ii este necesar ca numrul ionilor ce se doresc separa i n volumul de prob injectat n coloana cromatografic s fie mai mic cu cel pu in un ordin de mrime n raport cu numrul total de grupri func ionale din volumul fazei sta ionare:
c t Vi 10 C V unde: ct - concentra ia total a ionilor de separat din prob; Vi - volumul de prob injectat; C - capacitatea de schimb a fazei sta ionare (mEchiv/cm3); V - volumul fazei sta ionare din coloana cromatografic. cromatografia de schimb ionic poate avea loc n dou variante: secven ial sau continu. Varianta secven ial (cronologic, cea mai veche modalitate aplicat n schimbul ionic) presupune anumite etape bine definite ale procesului de separare, i anume: I. aducerea fazei sta ionare n form ini ial (form H+ pentru cationit, respectiv form HO- pentru anionit); II. injectarea probei i imobilizarea speciilor ionice de separat la nivelul gruprilor func ionale din structura fazei sta ionare (disponibilizarea simultan a unui numr echivalent de protoni sau ioni hidroxil); III. eliminarea din coloana cromatografic a protonilor sau ionilor hidroxil disponibiliza i prin schimbul ionic efectuat n etapa precedent; IV. alimentarea coloanei cu faz mobil avnd o valoare de pH care s permit trecerea n faza mobil doar a unei singure specii ionice din amestecul de separat, re inut neselectiv n faza sta ionar pe parcursul etapei II.

17

Colectarea acestei frac ii se va face cantitativ; V. alimentarea coloanei cu faz mobil avnd pH diferit de cel utilizat n etapa anterioar, care s permit trecerea n faza mobil a unei alte specii ionice din amestecul ini ial. Opera iile de la punctele IV i V se repet, individualizat pentru toate speciile ionice existente n amestecul de separat. Varianta secven ial presupune o serie de dezavantaje, i anume: cunoaterea prealabil, sub aspect cantitativ, a tuturor speciilor de interes analitic, din prob; durata mare a procesului de separare; utilizarea de volume mari de faz mobil. Singurul avantaj evident al acestei tehnici este simplicitatea aparaturii utilizate. Elu ia are loc n general n cmp gravita ional, nu este necesar un sistem de pompare a fazei mobile la debite fixe, nu este necesar un sistem automatizat de control al modificrii pH-ului fazei mobile, nu este necesar un sistem de detec ie on-line (frac iile culese pot fi analizate ulterior, off-line, prin intermediul metodelor clasice, electrometrice sau titrimetrice). Varianta continu presupune aplicarea unui gradient controlat de pH al fazei mobile, imediat dup injec ia probei. Astfel, se creeaz condi iile favorabile de trecere n faza mobil a tuturor speciilor ionice din amestecul de separat, re inute ini ial n faza sta ionar. Procesul de separare este rapid, nu necesit informa ii exhaustive de ordin cantitativ asupra speciilor de interes analitic, din prob. El necesit ns o aparatur complex. Elu ia are loc n regim de presiune nalt, exist necesitatea utilizrii unui sistem controlat de formare a gradien ilor de pH i, binen eles, un sistem de detec ie adecvat, online. Cele dou modalit i de aplicare a mecanismului de schimb ionic n separarea cromatografic sunt prezentate n Figura 10. d) Mecanismul de asociere ionic. Mecanismul de asociere ionic este o modalitate prin care se evit utilizarea mecanismelor de schimb ionic n procesele de separare cromatografic, prin realizarea tranzi iei ctre mecanismul ce are la baz similitudinea ntre gradul de hidrofobicitate existent ntre analit i faza sta ionar. Mecanismul de asociere ionic se aplic atunci cnd componen ii amestecului de separat sunt molecule care disociaz n faza mobil, crend astfel specii purttoare de sarcin. Pentru a nu fi pui n situa ia de a separa ioni, n faza mobil se va aduga o specie chimic care prin disociere produce ioni de semn contrar n raport cu speciile generate prin disocierea anali ilor. Are loc astfel asocierea purttorilor liberi de sarcin, crea i n faza

18

a) varianta secvenial
H+ H+ H+ H+ H+ H+ F.S. + + F.M. + (pH 2 ) H+ + H+ H+ H+ H+ H+ H+ + H+ H+ H+ F.S.

F.M.

(pH3 )

F.M.

(pH1 )

F.S.

H+ H+ H+ H+ H+ H+ F.S.

F.M.

(pH4 )

b) varianta continu pH ( 0 ) pH ( t1 )
+ + + ) + + + + + + + + + pH ( 0 ) pH (t1 ) pH pH (t2) +

pH ( t2 )

H+ H+ H+ H+ H+ H+ F.S.

+ + +

F.M. (pH - gradient R.D.

t0

t1

t2 t (min)

Figura 10. Modalit i practice de aplicare a proceselor de schimb ionic n separrile cromatografice.
mobil. Speciile generate prin asociere ionic se vor comporta ca agregate moleculare neutre, interac iile lor cu faza sta ionar limitndu-se la similitudinile de hidrofobicitate (polaritate), mecanism descris anterior. Un model simplificat al acestui proces este prezentat n Figura 11. e) Mecanisme de separare bazate pe transferul de electroni. Procesele de interac ie ntre specii chimice, bazate pe transferul de electroni sunt cunoscue sub numele de procese redox. Procesele redox, n accep iunea general a termenului, nu pot constitui baza unui mecanism de separare cromatografic, deoarece sunt procese al cror echilibru este puternic deplasat ntr-un anumit sens, n condi iile practice de elu ie. Separarea cromatografic bazat pe transferul de electroni trebuie mai degrab asimilat cu interac iile care se stabilesc ntre centrii de densitate electronic sporit, din structura fazei sta ionare i cei cu densitate electronic redus, din structura analitului, sau invers.

19

Anali i: Polaritatea anali ilor: La dizolvarea anali ilor n faza mobil: Se adaog n faza mobil compusul de asociere ionic Are loc asocierea Are loc separarea speciilor: Polaritatea speciilor rezultate prin asocierea ionic: + +

; > + + H ; ; + ; >

; > + + H ; + + OH + ; >

+ + H +

F.S. F.M. 1 R.D. 3 2

3 Pol.< Pol.>
Figura 11. Asocierea ionic ca mecanism de separare cromatografic. 20

t (min)

S presupunem cazul concret n care faza sta ionar con ine n structura sa cicluri aromatice disubstituite n pozi iile 3 i 5 cu grupri nitro. Densitatea electronilor delocaliza i la nivelul ciclului benzenic este redus, datorit efectului de atrac ie electronic conjugat, pe care cele dou grupri nitro l exercit. S mai presupunem, de asemenea, c va trebui separat un amestec tricomponent alctuit din toluen, o-xilen i 1,2,4-trimetilbenzen. Densitatea electronilor delocaliza i la nivelul structurii aromatice din molecula anali ilor crete n ordinea toluen < o-xilen < 1,2,4-trimetilbenzen, datorit efectelor generate de gruprile alchil (respingtoare de electroni), prin conjugare. Interac ia cea mai puternic ntre anali i i faza sta ionar se va stabili n cazul benzenului 1,2,4 trisubstituit, datorit complementarit ii ntre densitatea electronic sczut la nivelul ciclurilor aromatice substituite cu grupri nitro din structura fazei sta ionare i densitatea electronic ridicat la nivelul ciclului aromatic substituit cu grupri alchil din molecula analitului. Ordinea de elu ie va fi, n consecin , urmtoarea: toluen; o-xilen; 1,2,4-trimetilbenzen. Exemplul oferit este un caz tipic de interac ie electronic -, diferen iat n raport cu natura analitului i structura fazei sta ionare. Procesul este ilustrat n Figura 12.
+ Y X Y ++ +++ Y Y Y' Y' Y'' X ++ Y +++ Y Y' Y' Y''
R.D.

X F.S. F.M. t (min)

Figura 12. Mecanismul cromatografic de separare bazat pe transferul electronic generat prin interac iile - .
Cazul interac iilor de tip - nu este ns cazul unic ce poate constitui baza unui proces de separare cromatografic. S acceptm existen a n structura fazei sta ionare a unor orbitali liberi, extini sub aspect spa ial. Este cazul tipic al silicagelului impregnat cu sruri de argint. Ionul metalic prezint orbitali liberi (de tip d) extini spa ial. Aceti orbitali sunt capabili s interac ioneze cu centrii de densitate electronic sporit (de exemplu, orbitalii ai unei nesaturri - legtur dubl sau tripl) din structura analitului. Interac iile mijlocite prin complementaritatea densit ii centrilor de sarcin electronic sunt ntr-att de fine nct se poate face chiar 21

diferen ierea ntre geometria unei nesaturri (izomerul cis est re inut mai puternic n faza sta ionar, cci pozi ia substituen ilor favorizeaz steric interac ia ntre electronii i orbitalii d liberi, pe cnd izomerul trans este re inut mai slab, deoareece pozi ia substituen ilor defavorizeaz steric respectiva interac ie). Un model simplificat este prezentat n Figura 13.
Ag contraion + d d d t (min) R.D.

F.M.

F.S.
d d t (min) R.D.

Figura 13. Principiul separrii cromatografice bazate pe interac ii d (sau f) - . f) Mecanisme de schimb al liganzilor. Separarea cromatografic mijlocit prin schimbul liganzilor are la baz diferen ierile existente ntre constantele cinetice i termodinamice de formare a unor specii complexe ntre anali i i centrii specifici de activitate din faza sta ionar, respectiv moleculele adugate n faza mobil, cu proprietate de ligand. Mecanismele de separare bazate pe schimbul liganzilor au evoluat din procesele cromatografice de schimb ionic particularizate pentru cazurile n care, ntre cationii reprezenta i de anali i i contraionii grefa i n structura fazei sta ionare se exercitau, pe lng interac iile electrostatice i alte interac ii, de tip donor - acceptor (vezi Figura 14.). Mecanismul de schimb al liganzilor este ns ceva mai complex. El se aplic atunci cnd ntre anali i i faza sta ionar pot avea loc procese de formare de compleci, cu specifica ia particular c, n faza mobil, se vor aduga, de asemenea, structuri chimice capabile de a realiza echilibre de complexare concuren iale. Figura 15. prezint un astfel de mecanism. Aa cum se observ din Figura 15.(b), prin mecanisme de schimb al liganzilor pot fi realizate separri ale unor amestecuri de molecule care au capacitatea de a forma compleci organo-metalici. Se apeleaz n acest caz la
22

faze sta ionare care posed un ion metalic imobilizat chimic i nesaturat coordinativ.

S N C S Me + CF 3 S O O+ Me

O SO 3 + Me H 2N HO OMe+

Figura 14. Procese de schimb ionic controlate n fapt prin stabilitatea complecilor forma i (cteva exemple). g) Mecanisme de afinitate. Presupun interac ii specifice ntre analit i faza sta ionar, bazate pe afinitatea chimic (de exemplu, interac ii enzim substrat). Este n fapt un mecanism complex care asigur separarea unei anumite structuri n raport cu o matrice chimic, n general, extrem de complex (cum ar, fi de pild, fluidele biologice). Mecanismul este de fapt secven ial. Intr-o prim etap componentul de interes analitic este ireversibil re inut n faza sta ionar, to i ceilal i componen i ai probei fiind elua i. Ulterior, faza mobil i va schimba caracteristicile, favoriznd disocierea complexului de afinitate stabilit ntre analit i faza sta ionar. In consecin , va avea loc elu ia analitului i detec ia acestuia. Figura 16. ilustreaz acest mecanism.
2.4. Natura for elor care determin deplasarea fazei mobile n raport cu faza sta ionar. a) Gradientul de presiune aplicat unei coloane cromatografice poate genera deplasarea fazei mobile n raport cu faza sta ionar. In fapt, faza mobil este aplicat la intrarea n sistemul cromatografic la o presiune mai mare dect aceea permis prin construc ia sistemului, la ieire (pin>pout).

23

Me L L L L L L F.S.

+ + Me 1 2

+ +
L* L

R.D.

L*

a)

L F.M.

L*

t (min)

Me 1

+ + + + + +
Me L* Me L*

Me 1

b)
L* R.D.

2 Me L* Me

+
L

L L

Me 1 Me 1

Me

L* L Me 1 Me 1 L*

L Me 1 L Me 1 L L F.S. Me 1 Me 1 F.M.

Me

Me 1

Me 1

Me

L*

Me

+
L

t (min) L*

Me 1

Me 1

L*

Me

Figura 15. Separarea cromatografic bazat pe schimbul liganzilor. 24

substrat

Anali i

F.S.

F.S.
R.D.

F.M.
enzima imobilizat suport chimic inert "spacer"

F.M.

t (min)

Figura 16. Mecanismul cromatografiei de afinitate.

Coloana cromatografic va determina ntotdeauna o cdere de presiune, propor ional cu propriet ile sale constructive. Astfel, coloanele umplute exercit rezisten e hidrodinamice mai mari la naintarea fazei mobile n raport cu coloanele deschise, deci genereaz o cdere de presiune mai mare. In astfel de cazuri, pentru a deplasa cu viteze optime faza mobil n raport cu cea sta ionar, este nevoie de presiuni mari de aplicare a fazei mobile la intrarea n coloan. Cu ct diametrul coloanelor va fi mai redus, cu att este nevoie de presiuni mai mari ale fazei mobile la intrarea n coloan. De asemenea, cu ct granula ia particulelor suportului inert (la nivelul creia este distribuit faza sta ionar lichid), sau a fazei sta ionare solide, este mai mic, cu att se va genera o rezisten hidrodinamic mai mare la naintarea fazei mobile. Ceea ce trebuie subliniat este faptul c profilul de curgere generat prin gradient de presiune va avea ntotdeauna o form hiperbolic (vezi Figura 17.a).
Pin E+

P exit

E-

Figura 17. Profiluri de curgere ale fazei mobile n coloana cromatografic, n raport cu for a care genereaz micarea.
25

Profilul de curgere prin coloan este extrem de important, cci are ca efect imediat men inerea sau lrgirea zonei geometrice n care analitul migreaz n procesul cromatografic. Este lesne de n eles c un profil de curgere hiperbolic va genera l irea continu a zonei de migrare a anali ilor n coloan. b) Capilaritatea poate fi unul dintre fenomenele utilizate pentru deplasarea fazei mobile n raport cu faza sta ionar, n cromatografia planar ascendent. Fenomenul de capilaritate este generat de tensiunea superficial proprie fiecrui lichid sau amestec de lichide, la deplasarea prin pori cu diametre extrem de nguste. Vitezele de transport ale fazei mobile sunt relativ reduse, ceea ce face ca procesele cromatografice controlate prin capilaritate s fie lente. c) Gradientul de cmp electric aplicat coloanelor capilare deschise sau umplute, poate genera prin for electroosmotic deplasarea fazei mobile n raport cu faza sta ionar. Mecanismul nu trebuie ns confundat cu cel al migrrii electroforetice. In electroforez, analitul este cel care migreaz n cmp electric, datorit propriei sale densit i de sarcin. In metodele cromatografice conduse electrocinetic, anali ii nu posed sacin electric proprie. Deplasarea lor prin coloan se efectueaz prin deplasarea fazei mobile, datorit for ei de migrare electroosmotic care apare la interfa a lichid - peretele coloanei capilare. Profilul de curgere n cmp electric este un profil plan (vezi Figura 17.b). Metodele cromatografice conduse n gradient de cmp electric (aanumitele tehnici electro-driven chromatography) vor prezenta deci avantajul de a conserva lrgirea zonei de migrare a anali ilor prin coloan. Gradientul de densitate poate genera deplasarea fazei mobile n raport cu d) faza sta ionar. Acest caz se aplic izolat, doar pentru anumite tehnici de cromatografie n contracurent (CCC - counter current chromatography). Procesul se realizeaz n coloane capilare deschise, fazele aflate n contact fiind ambele lichide. Nu exist suport inert pentru faza sta ionar lichid i nici nu se poate realiza aderen a acesteia la peretele coloanei prin mijloace mecanice sau chimice. Cele dou lichide sunt nemiscibile, iar densitatea fazei mobile este mult redus n raport cu cea a fazei sta ionare. Dac faza mobil se va aplica n form de micropicturi la partea inferioar a coloanei, datorit nemiscibilit ii i densit ii reduse n raport cu faza sta ionar, aceasta se va deplasa de jos n sus. Separarea cromatografic se realizeaz prin echilibre multiple de reparti ie a anali ilor ntr-un sistem bifazic lichid - lichid. e) For a centrifug este, de asemenea, utilizat n generarea deplasrii fazei mobile n raport cu faza sta ionar. Se aplic tot n cazul cromatografiei n contracurent, fazele aflate n contact fiind nemiscibile, dar cu densit i relativ apropiate.

3. Mrimi ce definesc reparti ia cromatografic

Reparti ia diferen iat a anali ilor ntre dou faze aflate n contact este controlat prin constanta de distribu ie, Ki, descris prin raportul: 26

K =

i CS

C iM

(1)

i unde: C S reprezint concentra ia analitului i n faza sta ionar; CiM reprezint concentra ia analitului i n faza mobil. Dac exprimm termenii de concentra ie n form polar, rela ia (1) se poate rescrie astfel:

K =

i nS

VS

VM n iM

(2)

i unde: n S reprezint numrul de moli de analit i n faza sta ionar; n iM reprezint numrul de moli de analit i n faza mobil; VS reprezint volumul fazei sta ionare; VM reprezint volumul fazei mobile. Redistribuirea termenilor n rela ia (2) conduce la o nou expresie a constantei de distribu ie:

K=

i nS

n iM

VM = k VS

(3)

unde: k reprezint factorul de capacitate; reprezint raportul dintre numrul de molecule de analit i aflat n faza sta ionar i numrul corespondent de molecule existente n faza mobil, la echilibru; reprezint o constant ce caracterizeaz coloana cromatografic din punct de vedere constructiv.

4. Procesul cromatografic de separare

Procesul cromatografic de separare se realizeaz prin alternarea succesiv a strilor de echilibru i neechilibru generate de reparti ia analitului ntre faze. Sistemul cromatografic evolueaz n sensul realizrii strii de echilibru la reparti ie (constanta de distribu ie, K, pentru fiecare dintre anali i este atins). Starea de neechilibru, imediat consecutiv strii de echilibru, este generat prin micarea fazei mobile. S presupunem, pentru simplificare, c fazele aflate n contact sunt distribuite sub forma a dou filme continue, de grosimi extrem de reduse (vezi Figura 18.). S presupunem, de asemenea, introducerea la unul dintre capetele sistemului cromatografic astfel generat a unui amestec bicomponent (A + B). S considerm, de asemenea, c valoarea constantei de distribu ie ce caracterizeaz compusul A este KA=4, iar pentru cazul compusului B, KB=0,25. Este echivalent cu a spune c, la echilibru, concentra ia compusului A n faza
27

sta ionar este de 4 ori mai mare dect concentra ia compusului A n faza mobil, iar n cazul compusului B, situa ia este invers. Pentru simplificare, s considerm amestecul binar A +B echimolecular i c prin injec ie introducem n sistemul cromatografic cte 3125 molecule din fiecare component. S urmrim etapele descrise n Figura 18. In momentul injec iei, ambii componen i se gsesc n faza mobil (Figura 18.a). Constantele de distribu ie nu sunt atinse, deci sistemul se gsete ntr-o stare de neechilibru i va evolua n sensul atingerii acesteia (Figura 18.b). Echilibrul (n conformitate cu valorile constantelor de distribu ie) a fost atins pentru o por iune de coloan de lungime H. Dar faza mobil se deplaseaz n permanen i la un moment de timp imediat ulterior, se va atinge din nou o stare de neechilibru (Figura 18.c). Din nou, sistemul va evolua ctre o stare stabil, prin reparti ie n raport cu valorile KA i KB ale moleculelor compuilor A,respectiv B, ntre cele dou faze, ntr-o por iune de coloan, de lungime 2H. Echilibrul va fi nc o dat alterat, prin deplasarea fazei mobile (Fig. 18.d) i tot aa mai departe, strile de echilibru i neechilibru vor alterna. Por iunea din coloana cromatografic n care se realizeaz un proces elementar de reparti ie la echilibru poart numele de taler teoretic. Lungimea de coloan pentru care o astfel de stare de echilibru este atins poart denumirea de nl ime a talerului teoretic (H). Intre lungimea total a coloanei cromatografice (L) i nl imea talerului teoretic (H) se stabilete rela ia:
L = HN

(4)

unde: N reprezint numrul de talere teoretice ale unei coloane cromatografice;este practic echivalent cu numrul de stri consecutive de echilibruatinse pe parcursul separrii cromatografice n acea coloan. Aa cum se poate observa n Figura 18.k i l, distribu ia moleculelor de component A i B n faza mobil, respectiv sta ionar, este de aa natur nct separarea celor 2 compui apare dup numai 5 stri de echilibru de distribu ie ntre faze. Numrul de stri de echilibru atinse pe parcursul unei separri cromatografice depinde de tipul coloanei, natura fazelor i a proceselor intime de distribu ie a anali ilor ntre aceste faze i poate varia sub aspect valoric ntre cteva sute i respectiv cteva milioane.

5. Cromatograma
Cromatograma reprezint rezultatul unei separri cromatografice i este generat de procesul de detec ie a anali ilor, n ordinea elu iei acestora.
N= 1 h 2 3 4 5 6

28

injec ie - stare de neechilibru (o) a)

3125A+3125B

F.M. F.S. reparti ie 1 - stare de echilibru F.M. F.S.

625A +2500B

b)

625A +2500B 2500A + 625B

deplasarea fazei mobile genereaz starea de neechilibru (1) c)

2500A + 625B

F.M. F.S. F.M. F.S. F.M. F.S. F.M. F.S. F.M. F.S. F.M. F.S. F.M. F.S. F.M. F.S.

reparti ie 2 - stare de echilibru d) 500A + 500B

2000A + 125B 125A + 2000B

e)

f)

g)

h)

i)

j)

500A + 500B deplasarea fazei mobile genereaz starea de neechilibru (2) 500A + 500B 125A + 2000B 2000A + 125B 500A + 500B reparti ie 3 - stare de echilibru 400A + 100B 200A + 800B 25A + 1600B 1600A + 25B 800A + 200B 100A + 400B deplasarea fazei mobile genereaz starea de neechilibru (3) 400A + 100B 200A + 800B 25A + 1600B 1600A + 25B 800A + 200B 100A + 400B reparti ie 4 - stare de echilibru 320A + 20B 240A + 240B 60A + 960B 5A + 1280B 1280A + 5B 960A + 60B 240A + 240B 20A + 320B deplasarea fazei mobile genereaz starea de neechilibru (4) 320A + 20B 240A + 240B 60A + 960B 5A + 1280B 1280A + 5B 960A + 60B 240A + 240B 20A + 320B reparti ie 4 - stare de echilibru 256A + 4B 256A + 64B 96A + 384B 16A + 1024B 1A + 1024B 1024A + 1B 1024A + 16B 384A + 96B 64A + 256B 4A + 256B
1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 n

Faza Mobil

1100 1000 900 800 700 600 500

Faza staionar A

A N
0 1 2 3 4 5 6

400 300 200 100 0 0 1 2 3 4 5

N
6

k) F.M. = faz mobil; F.S. = faz sta ionar

l)

Figura 18. Procesul de separare cromatografic (modelare simplificat). Procesul de detec ie const n msurarea continu, n timp, a unei propriet i care caracterizeaz, dup caz, totalitatea sau numai anumite specii de anali i, separate n procesul cromatografic.

29

Considerm un proces de detec ie ca fiind universal (nespecific) atunci cnd proprietatea monitorizat reprezint o caracteristic general a tuturor compuilor separa i n procesul cromatografic, corelabil prin intermediul aceluiai factor de propor ionalitate constant, cu masa sau concentra ia fiecruia dintre anali i. Un proces de detec ie selectiv (specific) se realizeaz prin monitorizarea unei propriet i caracteristice numai unora dintre speciile separate n procesul cromatografic, corelabil prin intermediul unor factori de propor ionalitate proprii fiecruia dintre anali i cu masa sau concentra ia acestuia. Cromatograma reprezint, deci, o dependen func ional reprezentabil ntr-un sistem bidimensional de coordonate. Pe abscis este reprezentat timpul scurs din momentul injec iei amestecului de compui n sistemul cromatografic i pn n momentul elu iei ultimei specii de anali i (cea mai puternic re inut n faza sta ionar). Pe ordonat se va figura proprietatea msurat prin intermediul sistemului de detec ie, proprietate corelabil cu masa sau concentra ia speciei de analit eluat la un moment dat. Se poate spune, pentru simplificare, c, pe ordonat, se reprezint rspunsul detectorului. In cazul sistemelor de detec ie moderne, pe lng informa ia cantitativ (masa sau concentra ia speciilor de anali i separate n procesul cromatografic) va fi produs, simultan, o informa ie calitativ (corelabil cu structura chimic a speciilor separate). Cromatograma va fi n acest caz o dependen func ional tridimensional. Cea de-a treia dimensiune (axa Oz) va corespunde unui parametru (altul dect timpul) n raport cu care proprietatea detectat este propor ional. Varia ia propriet ii detectate n raport cu acest parametru suplimentar poate s aduc informa ii corelabile cu structura chimic ce caracterizeaz fiecare dintre speciile separate. De exemplu, dac proprietatea monitorizat de sistemul de detec ie este absorban a n domeniul spectral ultraviolet, parametrul suplimentar corelabil cu structura speciei detectate este lungimea de und. Momentul elu iei unei specii de analit din sistemul cromatografic corespunde unei varia ii a rspunsului generat de sistemul de detec ie, propor ional cu masa sau concentra ia compusului n cauz. Un astfel de semnal produs de ctre detector, n momentul elu iei unui anumit compus, este cunoscut sub numele de pic cromatografic. Deoarece injec ia amestecului de separat n sistemul cromatografic se face sub forma unei benzi extrem de nguste, ar fi de ateptat ca i picul cromatografic s se prezinte sub forma unui semnal de tip ptratic (vezi Fig. 19.a). In realitate, picul cromatografic corespunde unei reparti ii Gauss n jurul unei valori maxime, fapt datorat proceselor cinetice care au loc n momentul distribu iei moleculelor de analit ntre cele 2 faze (vezi Fig. 19b). Aceste particularit i cinetice vor fi detaliate ulterior. 30

R.D.

R.D.

t(min)

t(min)

Figura 19. Forma real a picului cromatografic.

Picul cromatografic corespunde n consecin unei distribu ii gaussiene de valori, reprezentat n sistemul de coordonate P=f(t). Picul cromatografic poate fi caracterizat prin 2 tipuri de parametri: calitativi i cantitativi. Parametrii calitativi, care definesc picul cromatografic sunt corelabili cu anumite propriet i ale anali ilor i cu anumite particularit i ale proceselor de distribu ie ale acestora ntre cele 2 faze: 1. Timpul de reten ie absolut (tR) reprezint timpul scurs de la injec ia amestecului n sistemul cromatografic i pn n momentul detec iei unui rspuns maxim, la elu ia uneia dintre speciile separate (vezi Figura 20.). Un timp de reten ie absolut foarte lung corespunde unui echilibru de reparti ie al solutului deplasat preferen ial ctre faza sta ionar. Un timp de reten ie scurt corespunde unui echilibru de reparti ie al solutului deplasat preferen ial ctre faza mobil. 2. Timpul de reten ie relativ (sau corectat) (tR) corespunde timpului pe care o specie de anali i l petrece n faza sta ionar. Diferen a ntre timpul de reten ie absolut i timpul de reten ie relativ (sau corectat) corespunde perioadei de timp pe care solutul a petrecut-o n faza mobil. Timpul necesar frontului de faz mobil pentru a parcurge coloana cromatografic se definete ca fiind timpul mort (tM), ce caracterizeaz coloana n cauz. Ca defini ie alternativ, timpul mort poate fi considerat timpul de reten ie absolut al unui compus care nu se distribuie deloc n faza sta ionar (constanta sa de distribu ie K fiind nul). Se stabilete n acest mod rela ia: 31

tR = t + t M R

(5)

R. D.

h wi w h 0.044 h tM tR1
tR2 t' R1

w o

0.5 h

0.607 h

' tR2

timp (min)

Figura 20. Parametrii care definesc picul cromatografic.

Mrimilor tR, respectiv tR li se pot asocia valorile VR, respectiv VR, cunoscute sub numele de volum de reten ie absolut, respectiv volum de reten ie relativ (sau corectat). Reten ia matematic care coreleaz cele dou mrimi este: VR = t R D (6)

unde: D, reprezint debitul fazei mobile. Debitul fazei mobile este propor ional cu viteza acesteia, cu sec iunea coloanei i cu porozitatea umpluturii: VR = t R u s (7)

unde: u, reprezint viteza fazei mobile; s, reprezint sec iunea coloanei; , reprezint porozitatea umpluturii coloanei. Sec iunea circular a coloanei cromatografice este dat de rela ia:

32

s=

(i . d .) 2
4

(8)

unde i.d. este diametrul interior al coloanei. Porozitatea umpluturii se definete ca fiind raportul dintre volumul interior al coloanei ocupat de faza mobil i volumul interior total:

VM Vi + Vp = Vt Vt

(9)

unde VM, reprezint volumul ocupat de faza mobil; Vt, repezint volumul interior total al coloanei; Vi, reprezint volumul intersti ial (volumul existent ntre granulele de suport inert sau de faz sta ionar); Vp, reprezint volumul porilor. In cazul coloanelor deschise, porozitatea este egal cu unitatea, iar n ceea ce privete sec iunea coloanei se va face corec ia: s=

[2(rc - d f )]2
4

= (rc d f ) 2

(10)

unde: rc, reprezint raza interioar a coloanei (i.d./2); df, reprezint grosimea filmului de faz sta ionar depus pe peretele coloanei. 3. Deoarece timpul de reten ie, fie el i n valoare relativ, nu depinde exclusiv de natura fazei sta ionare, ci i de dimensiunile constructive ale coloanei cromatografice, s-a ncercat exprimarea reten iei unei anumite specii de analit sub forma unei mrimi adimensionale, factorul de capacitate, (k). Factorul de capacitate (k), poate fi definit ca mrimea care indic de cte ori timpul de reparti ie a speciei de analit n faza sta ionar este mai mare dect timpul ct acesta se gsete n faza mobil. k = t t tM R = R tM tM (11)

Rela ia (12) reprezint o modalitate alternativ de definire a factorului de capacitate, n raport cu rela ia (3). Factorul de capacitate prezint i o conota ie termodinamic, deoarece: G 0 ln K = (12) RT

33

unde: G0 reprezint entropia liber de distribu ie a solutului ntre faze. In consecin , au loc rela iile:

G 0 ln K = lnk - ln = RT

(13)

k = e

ln -

G 0 RT

= Ce

G 0 RT

TS0 H RT Ce

(14)

Rela ia (14) demonstreaz faptul c, prin intermediul mrimilor msurabile ntr-o cromatogram, se pot ob ine valorile termodinamice care caracterizeaz distribu ia analitului ntre faze. 4. Lrgimea picului cromatografic. O alt caracteristic a picului cromatografic este lrgimea acestuia, putnd furniza informa ii asupra cineticii de distribu ie a analitului nte faze, cci reprezint o msur a modificrii lrgimii benzii ini iale n care s-a efectuat injec ia analitului n coloana cromatografic. In cazul distribu iei gaussiene n sistemul de coordonate P=f(t), forma analitic a func iei este:
t 2 2

P = Pmax e

(15)

unde: P reprezint mrimea propriet ii detectate la un moment de timp t cuprins ntre momentul de nceput i cel final, n elu ia picului cromatografic; Pmax reprezint mrimea propriet ii detectate la momentul de timp tR; t = tR - ti; ti[nceputul elu iei picului, sfritul elu iei picului]; , reprezint devia ia standard. Lrgimea picului cromatografic poate fi deci descris prin intermediul devia iei standard ce caracterizeaz distribu ia gaussian a valorilor propriet ii msurate de ctre sistemul de detec ie n raport cu timpul necesar elu iei frontului de analit separat n coloana cromatografic. Aa cum reiese din Figura 20. lrgimea picului cromatografic poate fi msurat la baza sa - Wb (intersec ia tangentelor duse n punctele de inflexiune ale curbei Gauss cu axa Ox, sau 0,044 din nl imea sa), la jumtate din nl imea sa - Wh, sau la 0,607 din nl imea sa - Wi. Rela iile care se stabilesc ntre Wb, Wh i Wi n raport cu , sunt formulate mai jos: Wb = 4 (16) Wh = 2,354 (17) Wi = 2 (18)
34

Msurarea exact a lrgimii picului cromatografic (i deci, determinarea valorii - abaterea standard, ce caracterizeaz distribu ia gaussian a valorilor propriet ii detectate) se realizeaz cu ajutorul unei lupe cu scar micrometric gradat, n general, cu precizia de 100 m. Modul corect de msurare este reprezentat n Fig. 21. O alt mrime ce caracterizeaz picul cromatografic este gradul de asimetrie. Distribu ia Gaussian a valorilor propriet ii detectate n momentul elu iei compusului i trebuie s fie, teoretic vorbind, simetric. Este echivalent cu

R.D. w h = 1,7 mm = 2,354 =1,7 / 2,354 = 0,722 mm

0 1 2

wh wh h h/2 0.607 h

t (min)

Figura 21. Modul de msurare corect a abaterii standard ce caracterizeaz picul cromatografic, cu ajutorul unei lupe cu scar micrometric.
a spune c segmentele determinate ntre laturile ascendent i descendent ale picului, la 0.1 din nl imea sa, sunt egale. Exist ns situa ii practice n care picul corespunztor speciei de analit i, n cromatogram nu este simetric. In general, un pic cromatografic asimetric, cu tren posterioar (tailing, b>a) corespunde cazului n care interac ia ntre faza sta ionar i analit este prea puternic. O tren anterioar (fronting, a>b) corespunde cazului n care apar procese de descompunere (degradare) a analitului i n coloana cromatografic. De asemenea, asimetria picului cromatografic se manifest n momentul n care cantitatea de analit injectat n coloan este extrem de mare n raport cu volumul fazelor n contact. Cazurile detaliate anterior sunt sintetic prezentate n schema urmtoare:

35

R.D.

R.D.

R.D.

h 0,1 h a b t R(min) 0,1 h

h 0,1 h a b t R(min)

a b t R(min)

As = a/b = 1

As = a/b > 1

As = a/b < 1

Parametrii cantitativi (care definesc cantitativ picul cromatografic) sunt nl imea i aria sa, fiind corelabile, prin intermediul unor rela ii simple, cu masa sau concentra ia de analit separat. Inl imea picului cromatografic corespunde distan ei msurate ntre linia 1. de baz i valoarea maxim (Pmax) detectat, la momentul de timp tR:
h = c m i , sau h = c ci (19)

unde: c reprezint o constant de propor ionalitate; ci reprezint concentra ia maxim a compusului i n faza mobil, n momentul elu iei analitului din coloan; mi reprezint cantitatea de analit i existent n faza mobil la momentul de timp tR. 2. Pentru o determinare cantitativ mai precis este preferabil de utilizat aria picului cromatografic: A = c mi , sau A = c ci (20)

unde: c' reprezint o constant de propor ionalitate; mi reprezint cantitatea medie de analit i existent n faza mobil pe toat durata elu iei picului cromatografic corespunztor; c i reprezint concentra ia medie de analit i existent n faza mobil pe toat durata elu iei frontului de analit i din coloan. Aria picului este dat de rela ia: A = h 2 (21) Atunci cnd msurarea se efectueaz manual se poate aproxima aria picului cromatografic prin rela ia:

36

A = h Wh cu precizarea c, n fapt: A = 0,94 A

(22)

(23)

6.

Mrimi ce caracterizeaz separarea cromatografic

6.1. Eficien a separrii cromatografice Prin termenul de eficien este redat capacitatea sitemului cromatografic de a elua anali ii supui separrii sub forma unor picuri extrem de nguste. Termenul de eficien nu este corelabil cu puterea de separare a ststemului considerat. Astfel, dac n urma injec iei n coloan a unui amestec de 10 anali i se ob ine o cromatogram compus din 7 picuri, rezult clar c separarea a 3 perechi de anali i nu a putut fi efectuat. 3 picuri cromatografice vor corespunde, n consecin , coelu iei (elu iei simultane) a cte cel pu in 2 anali i. In aceste condi ii, indiferent de capacitatea intrinsec de separare, dac picurile cromatografice sunt extrem de nguste, vom spune c procesul n cauz a avut loc cu eficien sporit. Eficien a unei separri cromatografice este corelabil cu numrul de echilibre de reparti ie ntre faze, care se realizeaz pe toat durata procesului. Putem afirma c eficien a unei separri este cu att mai accentuat cu ct numrul de echilibre de reparti ie este mai mare, deci por iunea corespunztoare de coloan n care se realizeaz un proces elementar de echilibru este mai mic. Eficien a unei separri se msoar n numrul de echilibre de reparti ie a fiecrui analit ntre cele 2 faze, deci este echivalent cu numrul de talere teoretice ce caracterizeaz o coloan cromatografic. Numrul de talere teoretice (N) poate fi calculat cu ajutorul mrimilor ce caracterizeaz picul cromatografic. N este propor ional cu ptratul timpului de reten ie absolut i invers propor ional cu ptratul abaterii standard ce caracterizeaz dispersia gaussian a valorilor rspunsului detectorului, nregistrate pe durata elu iei analitului din coloana cromatografic. In consecin , oricare din rela iile urmtoare sunt valabile:

N=

t2 R

= 16

t2 R
2 Wb

= 5,545

t2 R
2 Wh

=4

t2 R Wi2

(24)

Por iunea din coloana cromatografic pe care se realizeaz un proces elementar de reparti ie la echilibru analitului ntre faze, definit ca nl imea

37