hemolytic uremic syndrome (HUS)

Proteinele (toxinele) Shiga

reprezint o familie de toxine nrudite,
aparinnd la dou grupe majore, Stx1 si
Stx2, exprimate de gene considerate a fi o
parte a genomului profagilor lambda.
Toxinele sunt denumite dup
Kiyoshi Shiga (1871-1957), primul care a
descris originea bacterian a dizenteriei
cauzate de Shigella dysenteriae. Cele mai
frecvente surse de toxina Shiga sunt
bacteriile S. dysenteriae i grupul toxigen
Shiga a Escherichia coli (STEC), care
include serotipurile O157:H7, O104:H4,
precum i alte tulpini de E. coli
enterohemoragice.
Toxinele Shiga acioneaz prin inhibiia
sinteza proteinelor n interiorul celulelor int
printr-un mecanism similar cu cel prezentat
de toxina din ricin. Astfel, dup ptrunderea
n celul prin intermediul unui
macropinozom, proteina scindeaz o
nucleobaz adenina specific din ARN 28S
al subunitii 60S ribosomale, ceea ce
conduce la stoparea (blocarea) sintezei
proteinelor.
 E. coliO157:H7isafoodbornepathogenthatcausesfood
poisoning.

Electroforeza pe gel de agaroz n cmp electric pulsator (Pulsed-field

gel electrophoresis , PFGE), este utilizat la identificarea tulpinilor E.
coli O157: H7 izolate. O alt tehnic denumit multilocus variable
number of tandem repeats analysis (MLVA) este de asemenea utilizat
pentru a clasifica precis atunci cnd este dificil s se diferenieze ntre
ele tulpinile de E coli izolate prin PFGE.
Imunotestele/analizele enzimatice
(enzyme immunoassays, EIA),
sunt teste concepute pentru a
detecta antigeni sau anticorpi prin
intermediul unei enzime care
declaneaz o schimbare de
culoare. Toate imunotestele
enzimatice utilizate n diagnosticul
serologic sunt cunoscute sub
numele de teste imunoenzimatice
n faz solid. Aceste teste
presupun imobilizarea antigenelor
sau anticorpilor pe suprafee
solide, cum ar fi granule din
plastic sau cavitile plcilor de
microtitrare.

Direct Antigen EIA

 CompetitiveEIA
NoncompetitiveEIA
CaptureEIA
Biochimie analitic
PREGTIREA PROBEI
 Metode de separare

de atingere a s tarii de echilibru

Cromatografia Elec tro foreza (steady state, displacement electrophoresis)
frontal, liber, de migrare n s olutii (tampon)
moving boundary electrophoresis is otachophoreza
focus are (focalizare) is oelectrica
n medii s tabilizate, zonalisoelectric focusing
(zone electrophoresis)
suportul stabilizeaz zonele de migrare
si permite o mai bun separare
suporturi chimic active
medii suport cu structur capilar
medii suport cu structur reticular imunoelectroforeza
pe strat subtire electroforeza de afinitate
pe hrtie
pe folii de acetat de celuloz pe poliacrilamid
pe agar, agaroz
pe amidon
 Cromatografia

n 1906 Tswett a publicat un articol,

n revista de specialitate Berichte
der deutschen botanischen
Gesellschaft n care descrie
separarea unor pigmeni vegetali pe
un tub ngust de sticl, umplut cu
carbonat de calciu. Pigmenii de
diferite culori au fost astfel separai
de pe carbonat prin eluie cu eter de
petrol.

MihailSemenoviciTsvett (1872-1919)
 Istoric

Plinius cel Btrn (23-79 dup Cristos) n

Historia Naturalis, descrie un proces
egiptean (ca. 500 nainte de Cristos) de
separare a unor pigmeni prin depunerea
soluiei lor pe un material celulozic,
precum papirusul. Aceast tehnic poate fi
considerat a fi foarte aproape de
cromatografia pe hrtie.
 n 1855 chimistul german F. F. Runge descrie cromatografia pe hrtie i include
ilustraii ale cromatogramelor n lucrarea sa, Der Bildunystrieb der Stoffe.
Richard Kuhn i Edgar Lederer (1931, separarea a dou componente din
carotenul cristalizat, privit pn n acel moment drept un singur compus chimic,
prin cromatografie de adsorbie.
Martin i Synge ( 1941, publicarea teoriei cromatografiei de partiie)
Consden,Gordon,iMartin(descrierea cromatografiei pe hrtie).
1950 dezvoltarea cromatografiei gaz-lichide (GLC), prin care se separ
compui gazoi sau volatili pe o coloan ngust umplut cu un adsorbent.
Cromatografia n strat subire (thin-layer chromatography, TLC), prin care se
separ compui prin trecerea unui solvent printr-un strat subire de o grosime
submilimetric, ntins pe un suport precum placa de sticl a fost dezvoltat n
anii 60.
Cromatografia lichid de nalt performan (high performance liquid
chromatography, HPLC), tehnic care se separ compui prin
introducerea probei ntr-o coloan ngust ncrcat cu adsorbent i
forarea eluiei sale prin presiune a fost dezvoltat n deceniul al
aptelea.
Cromatografia pe hrtie i mai ales cea n strat subire sunt nc
utilizate, fiind deseori preferate cromatografiei gaz-lichid i
cromatografiei lichide de nalt performan din cauza marii lor puteri
n separarea efectiv, cu echipamente ieftine i costuri sczute.
 Principala aplicaie a cromatografiei este cea de
separare a unor amestecuri de compui n scopuri
analiticesaupreparative.
Procesul de cromatografie poate de asemenea servi la
identificarea, izolarea, purificarea i cuantificarea
unorcompuiindividualseparai.
n plus, aceste procese cromatografice pot fi aplicate n
determinarea omogenitii unor substane chimice,
determinarea structurii moleculare, determinarea
produilor de reacie i a proceselor care le
nsoesc.
 Cromatografia cuprinde un grup important i diversificat de
metode care permit cercettorului separarea unor
componeni foarte apropiai (nrudii) dintr-un amestec
complex de substane (de componente), multe dintre aceste
separri nefiind posibile prin alte tehnici.

n toate separrile cromatografice probaestetransportat

ntr-o faz mobil, care poate fi un gaz, un lichid sau un fluid n
staresupercritic. Aceast faz mobil este forat s traverseze o
faz nemiscibil, faz staionar, care se gsete ntr-o coloan sau
pe o suprafa solid.
Cele dou faze sunt alese n aa fel nct proba s se
distribuie ntre faza mobil i cea staionar n proporii diferite.
Componentele care sunt mai puternic reinute de ctre faza
staionar se vor mica i vor curge mai lent cu faza mobil. Din
contr, componentele mai uor (mai puin) legate de ctre faza
staionar o vor traversa (pe aceast faz) mai rapid. Drept
consecin a acestor diferene n mobilitate, componentele probei
se vor separa n benzi ori zone discrete, care pot fi analizate
calitativi/saucantitativ.

Termenul de migrare utilizat n

cromatografie reprezint o descriere
generic a micrii moleculelor n
cromatografie i el nu trebuie confundat cu
migrarea unei specii ionice sub aciunea
unui cmp electric.
 Clasificareametodelordecromatografiepecoloan
Metodele cromatografice pot fi clasificate innd cont de dou
criterii.
Prima clasificare este bazat pe metoda fizic prin care fazele
mobil i staionar vin n contact.
Astfel, n cromatografia pe coloan, faza staionar este
reinut ntr-un tub ngust, prin care faza mobil este forat
s treac.
n cromatografia planar, faza staionar este depus pe un
suport, n interstiiile unui material poros (de tipul hrtiei de
filtru, ca exemplu). n acest caz, faza mobil se mic prin
faza staionar datorit forei capilare, sub influena forei
gravitaionale.
Se poate remarca c echilibrele care apar n cazul celor
dou tipuri de cromatografii au baze teoretice apropiate,
teoriile dezvoltate n cazul uneia dintre cele dou metode
putnd fi formalizate asemntor i uor adaptate la cealalt
tehnic cromatografic.
O clasificare mult mai specific (mai fundamentat) a metodelor cromatografice se
bazeaz pe TIPUL FAZELOR MOBILE I STAIONARE i TIPUL DE ECHILIBRU
stabilit n transferul soluturilor ntre cele dou faze.
 ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE ELUIE PE COLOAN

Prezentarea schematic a
modului prin care dou
substane, notate A i B
sunt separate prin
cromatografie de eluie pe o
coloan, cu faz mobil
lichid. Eluia implic
splarea, trecerea
speciilor (substanelor A
i B, n spe) prin
coloan, la adugarea
continu de solvent (faz
mobil)proaspt(a).
O poriune unic de prob este
introdus la captul superior al coloanei
(timpul to), dup care componentele probei
se distribuie independent, ntre cele dou
faze.
(b)Semnalulnregistratdectreundetectornfunciedeevoluiaeluiei
princoloanaprezentatn(a).
Introducerea unui volum adiional de
faz mobil (de eluent) foreaz
volumul de solvent care conine o parte
a probei s coboare prin coloan,
unde, se stabilete o nou partiie ntre
faza mobil i cea staionar (timpul t1).
Simultan cu aceasta se stabilete un
nou echilibru i o nou partiie ntre
solventul proaspt (faza mobil nou
adugat) i faza staionar la locul
iniial de adugare a probei.
Adugarea unor noi volume de solvent va
avea ca efect coborrea moleculelor de solut
spre captul de jos al coloanei printr-o serie
continu de transferuri ntre faza mobil i cea
staionar. Cum micarea solutului se poate
realiza numai prin intermediul fazei mobile,
viteza medie cu care zona (banda) solutului
migreaz n josul coloanei depinde de fracia
de timp n care solutul este reinut de ctre
aceast faz. Aceast fracie este mic pentru
componenta mai puternic reinut de ctre
faza staionar (compusul B, din figur) i
este mare n cazul n care retenia n faza
mobil este mai adecvat (componenta A).
n mod ideal, diferenele rezultate n
vitezele diferite conduc la separarea
componentelor dintr-un amestec n benzi
sau zone localizate de-a lungul coloanei
(timpul t3 din figur). Izolarea i deci
separarea speciilorAi B este urmarea
trecerii unei cantiti suficiente de faz
mobil prin coloan i care conduce la
o separare individual de zone clar
distribuite ce pot fi colectate ori
detectate(timpii t3 i t4 din figur).
 DILUIAANALITULUI
Figura alturat ilustreaz o
caracteristic important a procesului de
separare, denumit diluia analitului
fenomen care nsoete aproape
ntotdeauna separrile cromatografice.
Astfel, mrimea zonei originale care
conine analiii din figur este notabil mai
mic dect cele dou zone care conin
componentele A i B i care ajung n
zona detectorului. Acest fenomen
semnificativ de diluare se manifest
odat cu separarea componentelor i
din aceast cauz, detectorii utilizai
pentru separarea analiilor trebuie
adeseasprezinteosensibilitatemai
mare dect cea care ar fi dorit dac
procesuldesepararenuarfinecesar.
 CROMATOGRAMELE
Dac un detector care rspunde la o modificare
de concentraie a solutului este plasat la captul
terminal al coloanei iar semnalul su este
reprezentat grafic n funcie de timp (sau de
volumul de faz mobil adugat) se obin o serie
de peak-uri, prezentate n figur(b).
Asemenea reprezentri grafice poart
numele de cromatograme, care sunt
utilizateattncromatografiaanaliticct
inceapreparativ.

Poziia peak-urilor pe axa timpului poate servi

la identificarea componentelor din prob, aria
fiecruia conducnd la determinarea
cantitativ a fiecrui component.
 EFECTELE VITEZELOR DE MIGRARE I A LIMII ZONEI ASUPRA
REZOLUIEI CROMATOGRAFICE

Figura alturat prezint

profilurile concentraiilor
soluilor A i B la dou etape
diferitedeeluie: o etap timpurie
(momentul t1) i o etap spre final
(momentul t2).

Se poate spune ca specia B este mai puternic reinut i din aceast

cauz componentul B ntrzie mai mult pe coloan pe parcursul migrrii.
Aceast ntrziere n coborre conduce la creterea distanei dintre cele dou
zone. La acelai interval de timp, are loc lrgirea zonelor celor dou
componente, fenomen ce scade eficiena coloanei cromatografice. Cum
lrgirea zonei este inevitabil, se pot alege condiiile n aa fel ca acest
fenomenssemanifestectmailentodatcuseparareabenzilor.Astfel,
oseparare complet i de aici o rezoluie bun, se realizeaz adesean
condiiilencarelungimeacoloaneiestesuficientdemare.
 dou metode de mbuntire a separrii n cazul unui amestec
ipotetic de dou componente (figur, panel a).

n figuraalturat(b) condiiile
au fost modificate astfel nct
primul component se
deplaseaz mai repede n josul
coloanei cu vitez mai mare n
timp ce al doilea se deplaseaz
mai ncet.
(c): vitezele de mprtiere a celor dou
zone au fost micorate. Ambele metode
conduc la o separare mai distinct a celor
dou componente
(a) cromatograma original cu cele
Ambele metode conduc la o separare mai dou peak-uri suprapuse;
distinct a celor dou componente mbuntirea separrii prin (b)
creterea separrii benzilor
cromatografice i (c) prin scderea
mprtieriibenziicromatografice.
 Viteza de migrare a soluilor

Eficienauneicoloanecromatograficen
separarea a doi solui depinde, n parte, de
vitezelerelativecucareceidoicompui
sunt eluai. Aceste viteze sunt
determinate de magnitudinea
constantelor de echilibru ale procesului
prin care soluii se distribuie independent
ntre faza mobil i cea staionar.
 CONSTANTELEDEDISTRIBUIE

Adeseori, echilibrele de distribuie implicate n cromatografie sunt descrise prin

ecuaii care implic transferul unui analit ntre fazele mobil i staionar. Astfel,
pentru speciile A de solut se poate scrie urmtorul echilibru al procesului de
adsorbie-desorbie:

Constanta de echilibru,K, pentru aceast reacie este numit constant

de distribuie, raport de partiie sau coeficient de partiie Comisia de
Nomenclatur Analitic a IUPAC pentru cromatografie recomand utilizarea
termenului de constant de distribuie, Kc n loc de vechiul termen n loc de
vechiul termen de coeficient de partiie sau raport de partiie, K. Totui, n
literatura de specialitate ambii termeni sunt nc utilizai. Constanta K este
definit conform formulei:
MP= faza mobil

SP= faza staionar

 CS reprezint concentraia
molar a solutului din faza
staionar iar CM este concentraia
molar din faza mobil; n mod
ideal, K este constant n tot
domeniul de concentraii a
solutului, iar CS este proporional
cu CM.
Tipul de cromatografie n
care se aplic ecuaia poart
denumirea de cromatografie
linear iar rezultanta ei este
caracterizat printr-o simetrie de tip
Gauss a peak-urilor i a timpilor de
retenie, parametrii care sunt
independeni de cantitatea de
analit supus analizei.
n general, studiile
teoretice se limiteaz la o astfel de
cromatografie linear.
 TIMPULDERETENIE
Figura alturat reprezint
generic o cromatogram pentru o
prob ce conine un singur analit.
Timpulnecesarprobeipentrua
parcurge distana dintre
momentul inoculrii (injectrii)
pn la evidenierea
semnalului su de ctre
detector este numit timp de
retenie, fiind simbolizat prin
tR.
Peak-ul prezentat n partea
din stnga cromatogramei
(primul peak) este dat de speciile
care nu sunt reinute de ctre
coloan.
Adesea, proba sau faza
mobil conine specii ce nu sunt
reinute pe parcursul migrrii pe
coloan. Astfel de specii care nu
interacioneaz cu faza
staionar sunt de real folos n
identificarea peak-ului analitului
de interes.
Peak-ulmicdinstngareprezintospeciecarenuestereinutpe
coloaniacreisemnalapareladetectoraproapeimediatdupce
eluia a fost nceput. Astfel, timpul su de eluie (t M) este
aproximativ egal cu timpul necesar fazei mobile s treac prin
coloan.

Timpul necesar speciilor nereinute s ajung la detector se

noteaz cu tM i se numete timp mort. Viteza de migrare a
speciilor nereinute este n acelai domeniu cu viteza de micare
a moleculelor fazei mobile.
 De exemplu, dac o coloan are un volum total de 100
ml iar faza staionar ocup 40 ml, rezult c faza
mobil ocup un volum de 60 ml. Dac faza mobil
curge cu o vitez de 5 ml/min, se poate calcula c sunt
necesare 12 minute pentru ca faza mobil s traverseze
coloana, de la injector la detectorul situat la captul
terminal al coloanei.
Uneori, tM poate fi determinat prin
identificarea unui mic peak la nceputul
cromatogramei, rezultat dintr-o uoar
diferen dat de solventul care provine din
faza mobil ce conine proba adugat. De
asemenea tM poate fi determinat prin
msurarea timpului de eluie a unei probe
care nu este reinut absolut de loc de
ctre faza staionar. n cazul unei rini
schimbtoare de ioni cationice, pentru a se
determina tM, se poate utiliza o protein cu
sarcin negativ.
 Exist i ali factori precum
lungimea i diametrul tubului
care conecteaz injectorul i
detectorul la coloan care pot
afecta valorile tM.
Practic, considernd o coloan
mpachetat de 25 cm lungime,
cu un diametru interior de 1 cm,
volumul total al coloanei este de
19,6 ml (V= r2 L = 3,14 0,52
25cm).
Dac faza mobil ocup 60% din
volumul coloanei, volumul
spaiului gol, care definete
timpul mort este egal cu 11,8
ml i este denumit void volume
= V0
 RELAIADINTRETIMPULDERETENIEICONSTANTADE
DISTRIBUIE
Viteza linear medie de migrare a solutului ( u ) este dat de relaia:

unde tM reprezint timpul mort, timpul

necesar pentru ca o molecul medie de
faz mobil s treac prin coloan.

n mod similar, viteza medie linear de

micare a unei molecule de faz mobil
()este dat de relaia:
unde L este lungimea coloanei
mpachetate.
 n scopul prezentrii relaiei dintre timpul de retenie al solutului i
constanta sa de distribuie, se poate exprima viteza de migrare drept o
fracie a vitezei fazei mobile:

Aceast fracie este egal cu numrul mediu de moli de solut din

faza mobil, la un moment dat, raportat la numrul de moli totali de solut
din coloan, conform urmtoarei relaii:
 Numrul total de moli de solut din faza mobil este egal cu
concentraia molar a solutului din faza mobil, cM, multiplicat cu
volumul acestei faze, VM.
n mod similar, numrul de moli de solut din faza staionar este
dat de produsul concentraiei cS de solut din faza staionar, multiplicat
cu volumul su din aceeai faz, VS.
Astfel se poate scrie:
 Prin substituirea ecuaiei constantei
dedistribuie n aceast ecuaie se obine
viteza de migrare a solutului ca funcie de
constanta de distribuie i ca funcie de
volumele fazelor staionare i mobile:

Cele dou volume pot fi estimate prin metode specifice fiecrui tip
de cromatografie.
 VITEZADEMIGRAREASOLUTULUI:FACTORULDERETENIE
Factorul de retenie, sau factorul de capacitate reprezint un
parametru important care este general utilizat n descrierea vitezelor
de migrare a soluturilor pe coloan. Pentru un solut A, factorul de
retenie kA este definit ca:

unde KA reprezint constanta de distribuie a speciei A.

Comisia IUPAC de Nomenclatur Analitic recomand denumirea de

factor de retenie k', ns denumirea de factor de capacitate este nc
utilizatnliteraturadespecialitate.

Prin substituia ecuaiei 5 n ecuaia 4 rezult:

 n scopul de a defini modalitatea prin care se poate determina kA dintr-o
cromatogram,sevorsubstituiecuaiile2i3necuaia6,

= L
tR (2 )

ceea ce conduce la:

rearanjareaacesteiecuaii

Dup cum se observ n figur, tR i

tM sunt uor de obinut dintr-o
cromatogram. n condiiile unui factor
de retenie pentru un solut mult mai mic
dect unitatea, eluia se realizeaz mai
rapid i din aceast este dificil a se
determina timpii de retenie cu acuratee.
n condiiile n care factorul de retenie
este de ordinul zecilor (de exemplu 20
sau 30), timpii de eluie devin anormal de
mari.
Ideal, separarea se efectueaz n condiiile
unor factori de retenie cuprini ntre 2 i
10.
 VITEZELERELATIVEDEMIGRARE.FACTORULDE
SELECTIVITATE

Factorul de selectivitate (9)

al unei coloane () pentru
dou specii, A i B este
definit prin formula:
unde KB reprezint constanta de
distribuie a speciei B, mai puternic
reinut pe coloan, n timp ce KA
reprezint constanta de distribuie a
speciei A, mai puin reinut pe coloan, i
astfel mai rapid eluat de pe aceasta.

Prin definiie, este ntotdeauna mai mare

dect unitatea.
 Prin substituirea ecuaiei 5 i a
ecuaiei analoage pentru
solutul B n ecuaia 9 se obine,
dup la rearanjare, relaia de
legtur ntre factorul de (10)
selectivitate pentru cei doi
solui i factorii lor de retenie:
unde k'B i k'A reprezint factorii de retenie
ai solutului B, respectiv A.

Substituia n ecuaia 8 pentru cei doi solui din ecuaia 10 conduce la o expresie ce
permite determinarea experimental lui dintr-o cromatogram:

factorii de selectivitate i retenie se utilizeaz, la

rezolvarea problemelor referitoare la caracterizarea
unei coloane cromatografice
 mprtierea zonei i eficiena
coloanei
Teoria dinamic, sau teoria cinetic a cromatografiei
explic cu succes n termeni cantitativi formele peak-
urilor cromatografice i efectele diverselor variabile
implicate n lirea acestor peak-uri. O discuie
detailat a acestei teorii se bazeaz pe mecanismul de
repartiie aleatorie, putndu-se da o imagine calitativ
a zonelor cromatografice i care conduce la analiza
modului de mprtiere a zonelor n condiiile deplasrii
moleculelor de solut de-a lungul unei coloane.
nelegerea acestor fenomene au ca rezultat
identificarea variabilelor ce conduc la creterea
eficienei coloanei i la reducerea mprtierii zonelor
cromatografice.
 FORMAPEAK-URILORCROMATOGRAFICE

Figura 4

Figura 1
Figura 2
 Examinarea peak-urilor dintr-o cromatogram sau a benzilor pe
coloan (figurile de mai jos) relev o similaritate a erorilor normale,
repartiia realizndu-se dup un profil Gaussian, care sunt obinute
n condiiile reprezentrii grafice a valorilor determinate funcie de
frecvena repartiiei a acestora.
n unele cazuri, peak-urile cromatografice nu sunt lineare, manifestnd o
coad (tren) sau un front (figurademaijos).
n unele cazuri, trena peak-ului care apare n dreapta
cromatogramei este prelung, n timp ce frontul acestuia este abrupt, n timp
ce n alte cazuri forma cromatogramei este inversat, adic frontul este
prelung n timp ce trena este extrem de scurt.
Cauza comun a apariiei frontului sau a trenei o reprezint
existena unei constante de distribuie neliniare.
Frontul apare de asemenea n cazul elurii unei cantiti mari
de prob pe coloan. Distorsiunile de acest fel sunt nedorite deoarece
conduc la separri de proast calitate i la timpi de eluie cu
reproductibilitate sczut.
De altfel, n abordarea teoretic, se consider ca fenomenul de
front sau coad cromatografic este absent sau minim.
 n abordarea statistic, curbele de erori normale pot fi
raionalizate prin asumarea faptului c incertitudinea
asociat cu orice msurtoare singular reprezint
nsumarea unui numr mult mai mare de erori mici,
individuale nedetectabile i de repartiii ntmpltoare,
fiecare dintre acesta avnd o probabilitate egal, pozitiv
sau negativ. Cea mai comun manifestare a acestor
incertitudini este reprezentat de anularea uneia de ctre
cealalt, ceea ce conduce la o valoaremedie. Cu o mic
probabilitate, nsumarea poate conduce la un rezultat mai
mare sau mai mic dect media. Drept consecin,
distribuia valorilor este simetric, n jurul valorii medii.
n mod similar, forma Gaussian a unei zone
cromatografice ideale poate fi atribuit combinrii aditive
a micrilor ntmpltoare a moleculelor de solut n zona
cromatografic.
 S considerm comportamentuluneimoleculedesolut, care n
timpul migrrii, trece prin mii de transferuri ntre faza staionar i cea
mobil. Timpul petrecut n fiecare faz de transfer este deosebit de
neuniform, depinznd de ctigul accidental de energie termic din
mediul nconjurtor pentru a realiza un transfer reversibil, n cealalt
faz. Astfel, n unele cazuri, timpul de edere ntr-o faz dat, poate fi
tranzitoriu, n timp ce n alte faze perioada poate fi relativ mai lung.
Cum molecula este eluat numai n timpul ederii sale n faza mobil,
are ca rezultat, migrarea sa total neuniform n josul coloanei. Din
cauza timpilor variabili de edere, viteza medie cu care moleculele
individuale se mic relativ n faza mobil variaz n mod considerabil.
Anumite particule individuale traverseaz mai rapid n virtutea includerii
lor accidentale n faza mobil, majoritatea timpului de eluie. Altele, din
contr, pot prezenta ntrzieri datorit includerii lor n faza staionar,
timp mai ndelungat dect timpul mediu de eluie.
 Consecina acestor procese aleatoare este o
mprtiere simetric a vitezelor n jurul valorii
medii, iar acesta reprezint comportamentul
mediu al moleculei.
Limea benzii componentului separat
crete odat cu coborrea lui de-a lungul
coloanei, datorit faptului c o cretere a
timpului de eluie permite manifestarea unei
maimarimprtieri.

Astfel, limea zonei este n relaie direct cu timpul

de edere n coloan i n relaie invers cu viteza de
curgere a fazei mobile.
 METODEDEDESCRIEREAEFICIENEICOLOANEI
n msurarea cantitativ a
eficienei unei coloane
N = L/H (1.12)
L, lungimea coloanei mpachetate
cromatografice n general (dat de obicei n centimetrii)
sunt utilizai doi termeni
nrudii:
(1) nlimea talerului
teoretic, H i
(2) numrul de talere
teoretice, N. Cei doi
parametrii sunt asociai
prin ecuaia:
 Eficiena coloanelor
cromatografice crete cu numrul de talere
teoretice: cu ct numrul de talere teoretice
este mai mare i nlimea talerului teoretic
devine mai mic.
Sunt ntlnite diferene enorme n
eficiena unei coloane, datorit diferenelor
dintre tipul de coloan i fazele mobil,
respectiv staionar, utilizate.
n mod curent, eficiena unei
coloane n termen de numr de talere
teoretice, poate varia ntre cteva sute
pn la mii, iar domeniul nlimii talerelor
s varieze ntre zecimi pn la miimi de
centimetrii sau mai mici.
 Introducerea termenilor de nlime a talerului i a numrului de talere
este datorat studiilor teoretice ale lui Martin i Synge care au tratat
coloana cromatografic similar coloanei de distilare, unde au loc o
multitudine de procese discrete dar continue, n straturi nguste,
denumite talere teoretice. S-a considerat c la nivelul fiecrui taler, are
loc un echilibru ntre faza mobil i cea staionar. Micarea solutului n
josul coloanei a fost apoi tratat ca o treapt de transfer ntre faza
mobil n echilibru i urmtorul taler situat mai jos.

Teoria talerului teoretic a fost aplicat cu succes la forma Gaussian a peak-urilor

cromatografice i la viteza de migrare a solutului de-a lungul coloanei cromatografice.
Ea a fost n final abandonat totui, deoarece nuareuitsarspundlaexplicarea
modului de mprtiere a zonei. Cu toate acestea, termenii originali utilizai la
descrierea eficienei unei coloane au fost pstrai n teoria vitezei de migrare. Aceast
nomenclatur este uneori neadecvat din cauza tendinei de a perpetua mitul
prezenei unor talere n coloana cromatografic, la nivelul crora se realizeaz
echilibrul ntre faze. De fapt, starea de echilibru, nu se realizeaz niciodat
deoarece faza mobil este ntr-o permanent i constant micare.
 DEFINIIA NLIMII
TALERULUI
Dup cum se cunoate, limea curbei Gaussiene este ntr-o relaie
direct cu variana 2, sau cu deviaia standard , a unei
msurtori. Cum benzile cromatografice sunt n general
considerate a avea astfel de form, este convenabil s definim
eficiena unei coloane n termen de varian pe unitate de
lungime a coloanei. Astfel, nlimea talerului, H, este dat de
relaia:
 DEFINIIANLIMIITALERULUI

Definiiataleruluiteoretic.H= 2/ L
 EVALUAREAEXPERIMENTALALUIHIALUIN

Determinareadeviaieistandarddinpeak-ulcromatografic:
W=4(=deviaiastandardatimpului).
 Aceast definiie a nlimii talerului este ilustrat n figura de mai jos. Dup
cum se observ, coloana este mpachetat pe o distan de L centimetrii, n
lungime (panelul a).

Reprezentarea
graficadefiniiei
taleruluiteoretic.
H= 2/ L

n partea superioar a figurii (panelul b) este reprezentat schematic, distribuia

moleculelor de-a lungul colanei cromatografice mpachetate, n momentul n care
analitul prsete coloana (acesta este din punct de vedere al timpului, timpul de
retenie, tR). Modelul curbei este Gaussian, iar localizrile parametrilor L-l i L + l
sunt indicate prin linie punctat vertical.

De notat faptul c L este dat
n centimetrii, iar variana, 2, este
explicitat n centimetrii ptrai; H
reprezint o distan linear,
exprimat n centimetrii (ecuaia
din slide-ul anterior).
nlimea talerului poate fi
gndit ca o poriune de
coloan, situat la captul
terminal care conine fracia de
analit situat ntre L-l i L.
Cum aria, n domeniul normal
de eroare a curbei este limitat
de , fiind de aproximativ
68% din aria total, nlimea
talerului prin definiie conine
aproximativ 32% din analit.
 Evaluarea experimental a lui H i N

Figura alturat
reprezint o cromatogram
obinuit n funcie de timp.
Variana peak-ului de solut poate
fi obinut printr-un procedeu
grafic simplu, i are ca unitate de
msur secunde la ptrat, fiind n
mod uzual notat cu 2, pentru a
o distinge de 2, care are ca
unitate de msur centimetrii
ptrai. Cele dou deviaii unde L/tR reprezint viteza linear medie a
standard, i sunt legate prin solutului, exprimat n centimetrii pe
relaia: secund
Determinareadeviaieistandard,,
dinpeak-ulcromatografic:W=4.

N = L/H (1.12)
 Figura ilustreaz modul simplu de
aproximare al lui i dintr-o
cromatogram obinut experimental.
Tangentele punctelor de inflexiune de pe
cele dou pri ale peak-ului
cromatografic sunt prelungite pn la
intersectarea lor i se formeaz astfel un
triunghi cu baza pe axa timpului a
cromatogramei. Aria acestui triunghi
reprezint aproximativ 96% din aria
total a peak-ului.
n evaluarea statistic, se consider c aproximativ
96% din aria peak-ului Gaussian este inclus n interiorul
suprafeei cu o aproximaie de plus sau minus dou deviaii
standard (2) din valoarea sa maxim. Astfel, intercepiile
artate n figur se manifest la aproximativ 2 din
maximum, iar W = 4, unde W este mrimea bazei
triunghiului. Substituind aceast relaie n ecuaia 1.14 i
rearanjnd termenii, rezult:

Substituia acestei ecuaii de deviaie

standard () n ecuaia nlimii talerului
(ecuaia1.13) conduce la:
 formula de calcul al numrului
de talere teoretice, N:
Prin substituia formulei 1.16 n formula 1.12 urmat de rearanjarea termenilor,
se obine formula de calcul al numrului de talere teoretice, N:

N = L/H (1.12)

n continuare, N
poate fi calculat din
msurarea, la dou
momente de timp, tR i W;
iar pentru a obine H,
lungimea coloanei
mpachetate trebuie s fie
de asemenea cunoscut.
 O alt metod de aproximare a lui N, i care este
considerat de ctre unii practicieni mai sigur, necesit
determinarea a W1/2 (jumtate din limea bazei peak-ului),
Iar numrul de talere este dat de formula:

Numrul de talere i nlimea talerului sunt general

utilizate n literatur i n caracterizarea unor coloane
produse de ctre firmele de specialitate, ca msur a
performanei acestora. Din cauza faptului c aceti
parametrii sunt semnificativi n compararea a dou coloane,
este esenial ca ei s fie determinai pentru acelai compus.
 VARIABILELE CINETICE CARE AFECTEAZ MPRTIEREA ZONEI
CROMATOGRAFICE

mprtierea zonei cromatografice este consecina unei rate finite de procese de

transfer de mas care se produc n timpul migrrii solutului, de-a lungul unei
coloane cromatografice. O parte dintre aceste viteze sunt controlabile, prin
ajustarea unor variabile experimentale, care permit astfel creterea calitii
separrii.

Tabelul prezint parametrii cei mai importani care concur la rezoluia cromatografic.
 EFECTULVITEZEI DE CURGERE A FAZEI
MOBILE

Magnitudinea efectelor cinetice

asupra eficienei coloanei depinde n
mod clar de lungimea timpului n care
faza mobil este n contact cu faza
staionar, care, la rndul ei, este
depinde de viteza de curgere a fazei
mobile. Din aceast cauz, studiile
referitoare la eficiena unor coloane
sunt n general axate pe
determinarea lui H ca funcie de
viteza fazei mobile, u. Aceste date
sunt exemplificate de cele dou
curbe din figura alturat, una
caracteriznd cromatografia de
lichide, n timp ce a doua este
reprezentativ cromatografiei de
gaze.
 Ambele curbe prezint un
minim al nlimii talerului
teoretic, H (ceea ce semnific o
eficien maxim) la viteze mici
de curgere. Aceast valoare
minim din cromatografia lichid
se manifest n general la viteze
de curgere care sunt
asemntoare celei de
cromatografie de gaze i Efectul vitezei de curgere a fazei
deseori sunt att de mici nct mobile asupra nlimii talerului
teoreticncazul
nu sunt sesizabile n condiiile (a) cromatografiei de lichide i (b)
normale de operare. gazcromatografiei.
 Teoria vitezei de mprtiere a zonei cromatografice
descrie cu acuratee i predicioneaz forma diagramei
H n funcie de u, grafic denumit adesea diagrama van
Deemter dup numele descoperitorului ei. Dup cum se
observ n figura alturat, vitezele de curgere pentru
cromatografia lichid sunt semnificativ mai mici dect
cele utilizate n cazul celei gazoase.
Din aceast cauz, separrile n gaz cromatografie
sunt mai rapide dect cele de cromatografie lichid. Mai
mult, dup cum arat figura, nlimea talerului teoretic
a unei coloane de cromatografie lichid are un alt ordin
de magnitudine fiind mult mai mic fa de cel ntlnit n
cazul coloanelor utilizate n cromatografia de gaze. Din
aceast cauz, nu este practic a se utiliza coloane de
cromatografie lichid care sunt mai lungi de 25-50 cm
(datorat presiunii picturilor), n timp ce coloanele de
gaz cromatografie pot fi de 50 de metrii sau mai lungi.
 n consecin, numrul total de talere i
astfel eficiena total a coloanei sunt n
general superioare n cazul coloanelor de
gaz cromatografie. n acest fel, o prim
comparaie ntre gaz cromatografie i cea
lichid arat c prima metod este
capabil de separri mai rapide i de mai
mare eficien.
 RELAIADINTRENLIMEATALERULUIIVARIABILELE
COLOANEI

n cursul ultimilor ani, au fost elaborate nenumrate studii teoretice

i experimentale avnd ca scop dezvoltarea relaiilor cantitative care
descriu efectul variabilelor prezentate n tabel, asupra nlimii
talerului pe diverse tipuri de coloane. Au fost astfel elaborate o serie
de expresii matematice referitoare la relaia dintre nlimea talerului
i parametrii variabili ai coloanei care, aplicate practic, au avut
grade diferite de succes. Aparent nici una dintre ele nu a rezolvat n
totalitate i nu au putut s explice interaciile fizice complexe care
conduc la lirea zonei cromatografice. O serie dintre aceste teorii,
cu toat imperfeciunile lor au fost des utilizate i au condus la
creterea performanei coloanelor cromatografice.
 O astfel aproximare matematic a comportamentului coloanelor
cromatografice este ecuaia van Deemter, care poate fi scris n
forma:

H=A+B/u+Cu =A+B/u+(CS + CM)u (1.19)

unde:
H este nlimea talerului dat n centimetrii,
u este viteza linear a fazei mobile dat n centimetrii pe secund,
n timp ce
A, B, i C sunt coeficieni referitori la fenomenele de
curgere pe multiple ci,
difuzie longitudinal i
transfer de mas ntre faze.
 Dup cum se observ n ecuaia 1.19, coeficientul C
poate fi desfcut n doi coeficieni: unul (C S), n relaie
cu faza staionar, iar cellalt, (CM), relativ la faza
mobil.
Studii teoretice ulterioare au artat c ecuaia van Deemter
este destul de exact n explicarea eficienei coloanei
cromatografice.
Ecuaia van Deemter conine termeni direct i invers
proporionali precum i termeni independeni fa de viteza
fazei mobile.
 TERMENUL(A)

mprtierea zonei se manifest n

parte datorit multitudinii de ci de curgere
pe care moleculele (sau ionii) le pot gsi i
urma prin coloana mpachetat. Dup cum
se observ n figura alturat, lungimea
acestor ci pot diferi semnificativ, astfel,
timpul de reziden n coloan pentru
moleculele aceleai specii este de
asemenea variabil. Moleculele de solut pot
astfel atinge captul colanei ntr-un
interval de timp care conduce la
mprtierea zonei. Acest efect, denumit n
acelai timp difuzie n vrtej este direct
proporional cu diametrul particulelor cu
care se mpacheteaz coloana
cromatografic i este prezentat n Modalitatea de eluie a dou molecule printr-o
coloan cromatografic. Se poate nota c distana
coloana a treia din tabelul de mai sus. parcurs de molecula 2 este mai mare dect cea
parcurs de ctre molecula 1. Astfel, molecula 2 va
ajungelapunctulBmaitrziudectmolecula1.
 mprtierea prin curgere pe canale multiple poate fi parial
compensat de difuziunea ordinar, care rezult n condiiile n care
moleculele sunt transferate printr-un curent ce urmeaz o cale sau alta.
Dac viteza de curgere este foarte mic, un numr mare de asemenea
transferuri se realizeaz iar fiecare molecul n micarea sa n josul
coloanei urmeaz o alt cale de curgere, pierznd timpi diferii pe fiecare
direcie de curgere.
Drept consecin, viteza cu care fiecare dintre molecule se mic n
josul coloanei tinde s se apropie de medie. Se poate spune c, la
viteze mici ale fazei mobile, moleculele nu sunt semnificativ dispersate
prin natura cilor multiple a mpachetrii.

La viteze moderate sau mari, nu este timp

suficient pentru ca difuzia medie s se realizeze iar
mprtierea zonei se manifest datorit lungimilor
diferite ale cilor de curgere.
 TERMENULDEDIFUZIELONGITUDINAL(B/u)
Difuzia longitudinal n cromatografia pe coloan
este un proces de mprtiere a benzii n care soluii
difuzeaz dintr-un centru de concentrare spre zone mai
diluate, n faa i n spatele zonei cromatografice, unde se
manifest n sensul i n contra direciei de curgere a fazei
mobile. Dup cum se observ n a doua ecuaie din tabelul
1.3, termenul de difuzie longitudinal este direct
proporional cu coeficientul fazei mobile DM, constant
egal cu viteza de migrare sub un gradient egal cu o
unitate. Constanta este denumit factor obstructiv fiind
n relaie cu mpiedicarea difuziei longitudinale de ctre
modul de mpachetare al coloanei. Astfel, n cazul
coloanelor mpachetate valoarea aceste constante este de
aproximativ 0,6 n timp ce pentru coloane nempachetate
valoarea sa este egal cu unitatea.
 Contribuia difuziei longitudinale este
invers proporional cu viteza fazei mobile.
Aceast relaie nu este surprinztoare dac avem
n vedere c analitul este n coloan pentru o
perioad mai mic la viteze de curgere nalte. n
cazul unor viteze mari de curgere, difuzia de la
centru bandei spre margini se manifest mai redus
cu ct timpul de staionare este mai mic. Pantele
negative la viteze de curgere sczute prezentate n
cele dou grafice din figura alturat i sunt
consecine ale difuziei longitudinale. Se poate
nota c efectul este mai puin pronunat n
cromatografia de lichide din cauza faptului c
aceti coeficieni de difuzie n lichide au ordine
de magnitudine mai mici dect cei gsii n cazul
gazelor. De fapt, pentru cele mai multe lichide,
factorul B/u se apropie de zero n relaie cu
ceilali termeni din ecuaia 1.19. Astfel, minimul
artat n figura alturat nu este uneori observat.
 COEFICIENIIDETRANSFERDEMAS(CS i CM).

Necesitatea celor doi coeficieni de transfer de mas CS i CM din

ecuaia1.19 apare datorit faptului c echilibrul dintre fazele mobil i
staionar se stabilete deosebit de lent n coloana cromatografic
deoarece ea opereaz ntotdeauna n condiii de neechilibru. n
consecin, moleculele de analit aflate n partea frontal a benzii
cromatografice sunt preluate n fa, nainte de a avea timp pentru a se
echilibra n faza staionar i astfel s fie reinute de aceast faz. n
mod similar echilibrul nu se stabilete la marginea situat la trena benzii
iar moleculele de analit sunt prsite ndrtul fazei staionare, datorit
micrii rapide a fazei mobile.
 mprtierea benzii din cauza efectelor de transfer de
masa se manifest din cauza faptului c o multitudine de
cureni de curgere ai fazei mobile din coloan i stratul
care nconjoar faza staionar au dimensiuni finite. n
consecin, este necesar un timp pentru ca moleculele
de solut aflate la interfa s difuzeze dintr-o faz n
interiorul celelalte faze. Acest timp de lag rezult din
persistena condiiilor de neechilibru de-a lungul coloanei
cromatografice. De altfel, dac vitezele de transfer de
mas dintre cele dou faze ar fi infinite, fenomenul de
mprtiere a zonelor cromatografice nu s-ar manifesta.
 Se poate nota c extensia benzii cromatografice produs
att de mprtierea longitudinal ct i de transferul de mas
depinde de viteza de difuzie a moleculelor de analitul n
timp ce direcia difuziei n cele dou cazuri este diferit.
mprtierea longitudinal apare din tendina moleculelor
de a se ndrepta ntr-o direcie paralel curgerii, n timp ce
mprtierea datorat transferului de mas se manifest
din tendina moleculelor de a difuza ntr-un plan
perpendicular cu direcia de curgere. Drept consecin,
gradul de mprtiere longitudinal este n relaie invers cu
viteza de curgere. Pentru mprtierea datorat transferului de
mas, din contr, cu ct faza mobil se mic mai repede, cu
att timpul necesar ajungerii la echilibru este mai redus. Astfel,
dup cum arat ultimii doi termeni ai ecuaiei 1.19, efectul
transferului de mas asupra nlimii talerului este direct
proporional cu viteza linear, u, de micare a fazei mobile.
 TERMENULDETRANSFERDEMASNFAZASTAIONAR(CSU).

Ecuaia a treia din tabelul 1.3, arat c n condiiile n care faza staionar este un lichid imobilizat,
coeficientul de transfer de mas este proporional cu o funcie complex, fs(k') a factorului de retenie k', este
direct proporional cu ptratul grosimii filmului de pe particulele suport df i este invers proporional cu
coeficientul de difuzie, DS a solutului n film. Efectele acestei relaii pot fi nelese prin imaginarea modului prin
care aceti factori influeneaz frecvena medie prin care moleculele de analit care ajung la interfa sunt
transferate n faza mobil. De exemplu, n funcie de grosimea filmelor, moleculele trebuie s traverseze n medie
o distan mai mare sau mai mic pentru a atinge suprafaa; n cazul coeficienilor de difuzie mai mici, ele vor
traversa mai ncet. Consecina ambilor factori este o vitez sczut de transfer de mas i o cretere a nlimii
talerului.
 Efectele acestei relaii pot fi nelese prin imaginarea modului prin care aceti
factori influeneaz frecvena medie prin care moleculele de analit care ajung la
interfa sunt transferate n faza mobil. De exemplu, n funcie de grosimea
filmelor, moleculele trebuie s traverseze n medie o distan mai mare sau mai
mic pentru a atinge suprafaa; n cazul coeficienilor de difuzie mai mici, ele vor
traversa mai ncet. Consecina ambilor factori este o vitez sczut de transfer de
mas i o cretere a nlimii talerului.

Termenul de transfer de mas n faza mobil (CMu).

Dup cum arat ecuaia a patra din tabelul1.3, coeficientul de transfer

din faza mobil CM este o funcie complex, f(k') a factorilor de retenie k',
fiind proporional cu ptratul diametrului particulelor din coloana
mpachetat dp i invers proporional cu coeficientul de difuzie din faza
mobil, DM.
 EFECTUL VITEZEI FAZEI MOBILE ASUPRA TERMENILOR ECUAIEI
VAN DEEMTER

n figura alturat este nfiat modul de

reprezentare a ecuaiei van Deemter n cazul unui
set de date experimentale. n acest experiment,
analitul eluat a fost reprezentat de acetatul de
benzil aflat ntr-o soluie de hexan, care conine
acetat de etil. Punctele situate pe curba de
deasupra reprezint valorile experimentale n timp
ce curba cu linie continu este reprezentarea
grafic a ecuaiei van Deemter.
Diagrama van Deemter pentru o coloan de
cromatografielichid,mpachetat.Punctelede
pe curba superioar sunt date experimentale.
Contribuiile diverilor termeni de viteze sunt
artai pe curbele situate mai jos: A, efectul
datorat cilor multicanal de curgere; B/u,
difuzia longitudinal; Cu, transferul de mas
dintreceledoufaze.
Curbele de sub aceast reprezentare arat contribuia
efectului de curgere prin canale multiple, difuzia longitudinal i
efectele combinate ale transferului de mas.
 METODE DE REDUCERE A MPRTIERII ZONEI CROMATOGRAFICE

Diametrul particulelor care compun coloana i

diametrul coloanei reprezint dou variabile
importante controlabile care afecteaz eficiena
unei coloane cromatografice. Efectul diametrului
particulelor este demonstrat prin datele
experimentale prezentate n figura alturat n
timp ce pentru a beneficia de avantajul datorat
diametrului coloanei, n ultimii ani au fost introduse
n practica cromatografic coloane din ce n ce mai
nguste.
n condiiile n care faza mobil este gazoas,
viteza de difuziune lateral poate fi redus
apreciabil prin scderea temperaturii i astfel a
coeficientului de difuzie DM. n consecin,
scderea nlimii talerului este dependent de
temperaturi joase. Acest efect este n general
nesemnificativ n cazul cromatografiei lichide din La fazele staionare lichide,
cauza faptului c difuzia este lent, astfel c grosimea stratului de lichid adsorbit poate
termenul de difuzie longitudinal are un efect mic fi minimalizat deoarece CS din ecuaia
asupra nlimii talerului. 1.19 este proporional cu ptratul acestei
variabile, df (ecuaia a treia din tabelul
1.3).
 OPTIMIZAREAPERFORMANELORCOLOANEICROMATOGRAFICE

O coloan cromatografic este optimizat prin variaia experimental a

condiiilor, pn cnd componentele amestecului sunt separate n mod clar,
ntr-un timp minim. Optimizarea experimentelor are ca scop
(1) reducerea mprtierii zonei cromatografice ori
(2) alterarea vitezelor de migrare ale componentelor din amestecul
de separat.
Dup cum s-a artat, mprtierea zonei este crescut prin aceleai
variabile cinetice care conduc la creterea nlimii talerelor coloanei
cromatografice. Pe de alt parte, vitezele de migrare, pot fi modificate prin
schimbarea acelor variabile care afecteaz factorii de retenie i selectivitate
ai soluilor.
 1.REZOLUIACOLOANEI

Rezoluia, RS a unei coloane

cromatografice conduce la
msurarea cantitativ a abilitii
sale n separarea a doi analii.
Semnificaia acestui termen este
ilustrat n figura alturat, care
prezint cromatogramele a dou
specii moleculare, A i B, pe trei
coloane ce posed rezoluii
diferite. Rezoluia unei coloane
este definit ca:
o rezoluie de 1,5 conduce la o
separare practic complet a
celor dou componente, n timp
ce o rezoluie de 0,75 nu. La o
rezoluie de 1, zona A conine
aproximativ 4% din specia B, iar
zona B conine o cantitate
similar din solutul A. La o
rezoluie de 1,5, suprapunerea
este de aproximativ 0,3%.

Rezoluia pentru o faz

staionar dat poate fi crescut
prin lungirea coloanei, astfel
crescnd numrul de talere.
Consecina nefavorabil la
adugarea de talere o
reprezint creterea timpului
necesar separrii
cromatografice.
 Efectulfactorilorderetenieiselectivitateasuprarezoluieicromatografice

Este foarte util a se dezvolta o relaie matematic ntre rezoluia unei coloane i
factorii de retenie, kA i kB, a factorului de selectivitate , i numrul de talere, N,
care alctuiesc o coloan cromatografic n cazul a doi solui.
Considernd c cei doi solui, A i B au timpi de retenie apropiai unul de cellalt,
se poate aproxima c: W =W W A B

ecuaia 1.20 poate fi

scris sub forma:

Ecuaia 1.17 permite

exprimarea lui W n termeni de
(tR)B i N, care pot astfel
substituii n ecuaia anterioar,
rezultnd:
 Substituind ecuaia 1.8 i rearanjnd-o, se obine exprimarea lui RS n termeni de factori de
retenie pentru A i B, dup cum urmeaz:

n continuare prin eliminarea kA din aceast ecuaie prin

substituia ecuaiei1.10, rezult:

Adesea este necesar a se calcula numrul de talere teoretice necesare pentru a

atinge o rezoluie dorit. O exprimare a acestei cantiti este obinut prin
rearanjarea ecuaiei1.21 ceea ce conduce la:
 Formele simplificate ale ecuaiilor1.21 i 1.22 sunt uneori ntlnite n
condiiile n care acestea se aplic unor perechi de solui ale cror constante
de distribuie sunt aproape similare

unde k' reprezint media dintre kA i kB.

 Efectulrezoluieiasupratimpuluideretenie
nainte de a considera n detaliu semnificaia ecuaiilor derivate mai sus, este util s
se dezvolte o ecuaie care s prezinte caracteristicile de performan a unei coloane,
adic timpul necesar pentru o complet separare a solutului A de solutul B.
n mod clar, ceea ce este dorit n cromatografie este o rezoluie posibil nalt n cel
mai scurt timp posibil. Din nefericire, aceste dou proprieti nu pot fi maximalizate n
aceleai condiii, motiv pentru care totdeauna trebuie gsit un compromis.
Timpul pentru desvrirea separrii este determnat de viteza vB
a solutului care se mic mai lent este dat de ecuaia2.
Aceasta este:

Combinnd aceast expresie cu ecuaiile

1.6i1.12, rezult, dup rearanjare: N = L/H (1.12)

unde (tR)B este timpul necesar pentru a aduce peak-

ul B la captul coloanei n condiiile n care viteza
fazei mobile este u.
n cazul n care ecuaia de mai sus este
combinat cu ecuaia1.22i rearanjnd termenii,
rezult:
Variabilelecareafecteazperformaneleuneicoloanecromatografice
Ecuaiile alturate sunt semnificative deoarece
servesc drept ghid n alegerea condiiilor care
sunt potrivite pentru a fi urmate de utilizatorul
cromatografiei pentru a atinge ntr-un timp
determinat scopul propus cu rezultate clare.

n cercetarea condiiilor optime pentru o separare dorit trebuie avut n vedere c

parametrii fundamentali, , k' i N (sau H) pot fi ajustai mai mult sau mai puin
independent. Astfel, parametrii i k' pot fi variai mai simplu prin varierea
temperaturii sau a compoziiei fazei mobile. Utilizarea unui alt tip de mpachetare a
coloanei reprezint o modalitate mai puin convenabil.
Dup cum s-a artat, este posibil a se modifica N prin schimbarea lungimii coloanei
ori de a modifica H prin modificarea vitezei de curgere a fazei mobile, a mrimii
dimensiunilor particulelor de mpachetare, a vscozitii fazei mobile (prin modificarea DM
sau DS), i a grosimii filmului de lichid adsorbit coninut n faza staionar .

Variaia n numrul de talere, N

O cale evident de cretere a rezoluiei o reprezint creterea numrului de talere din

coloan (ecuaia 1.21). Totui urmnd aceast cale, metoda este mai puin economic din
punct de vedere al timpului necesar pentru a finaliza separarea n afara cazului n care
creterea n N este realizat mai degrab prin reducerea n H dect prin lungirea coloanei.
 Variaia n nlimea talerului, H
O mbuntire semnificativ a rezoluiei poate fi realizat fr nici un cost de timp suplimentar
dac nlimea talerului se reduce.
Se poate nota c scderea mrimii particulelor de mpachetare a coloanei conduce la o
mbuntire marcant a lui H.
Pentru faze mobile lichide, unde B/u este neglijabil, reducerea nlimii talerului poate fi de
asemenea realizat prin reducerea vscozitii solventului, mrindu-se astfel coeficientul fazei
mobile.
Variaia n factorul de retenie
Adesea, o separare poate fi mbuntit semnificativ prin manipularea factorului de retenie,
kB. Creterea lui kB crete n general rezoluia (crescnd ns timpul de eluie). Pentru a determina
domeniul optim al valorilor pentru kB, este necesar a scrie ecuaiile 1.21 i
n forma:

unde Q i Q' conin restul de termeni ai celor dou ecuaii.

Figura alturat este o
reprezentare grafic RS/Q ori
(tR)B/Q' n funcie de kB,
considernd c Q i Q' rmn
aproximativ constante. Se
vede clar c valorile lui kB
mai mari de 10 nu trebuie
alese deoarece ele conduc la
o mic cretere n rezoluie
dar cu o cretere marcant a
timpului necesar separrii.
Valoarea minim a timpului
de eluie se manifest la o
valoare a kB de aproximativ 2.
Astfel, n multe cazuri,
valoarea optim a kB se
stabilete lund n calcul att
rezoluia ct i timpul necesar Efectulfactoruluideretenie kBasuprarezoluiei
separrii, adic ntr-un RSiatimpuluideeluie(tR)B.SeconsidercQ
domeniu cuprins ntre 1 pn
iQrmnconstantelavariaiafactoruluikB.
la 5.
 n mod uzual, cea mai simpl cale de cretere a rezoluiei de separare o reprezint
optimizarea lui k'. Pentru faze mobile gazoase, k' poate deseori crescut prin creterea
temperaturii.
Pentru fazele mobile lichide, schimbarea compoziiei solventului permite deseori
manipularea lui k' obinndu-se astfel separri superioare. Efectele dramatice produse
prin schimbarea solventului sunt ilustrate prin exemplul prezentat n figura de mai jos.

Efectul variaiei solventului asupra separrii

cromatografice. Analii: (1) 9,10-antraquinon;
(2) 2-metil-9,10-antraquinon; (3) 2-etil-9,10-
antraquinon; (4) 1,4-dimetil-9,10-
antraquinon;(5)2-t-butil-9,10-antraquinon.

Se observ c o mic modificare a

rapoartelor metanol/ap conduce de la
separri cromatografice nesatisfctoare
(a i b) la separri unde fiecare peak al
oricrui component este bine separat (c i
d). n multe scopuri, Cromatograma
artat n (c) pare a fi cea mai bun dup
cum arat raportul dintre rezoluia
adecvat n intervalul de timp.
 Variaia n factorul de selectivitate

n condiiile n care atinge unitatea, optimizarea lui k' i creterea lui N nu sunt
suficiente pentru a produce o separare satisfctoare a doi solui, ntr-un timp rezonabil.
Sub aceste circumstane, trebuie identificat o posibilitate de cretere a factorului
de selectivitate , cu meninerea factorului de retenie (k) ntr-un domeniu
optim de 1-10. n acest context sunt posibile o serie de opiuni de lucru. Astfel,
scderea oportunitii n perspectiva i avantajul (comoditii) aceste opiuni includ:
(1)schimbarea compoziiei fazei mobile, inclusiv schimbarea pH-ului;
(2)schimbarea temperaturii coloanei;
(3)schimbarea compoziiei fazei staionare;
(4)utilizarea unor efecte specifice, chimice.
Un exemplu de utilizare a opiunii (1) a fost raportat n cazul separrii anisolului
(C6H5OCH3), de benzen. Cu o faz mobil coninnd un amestec metanol:ap 50%, k'
pentru cei doi solui a fost raportat de 4,5 i respectiv 4,7, n timp ce a fost egal cu
numai 1,04. nlocuirea fazei apoase cu una care ca coninut 37% tetrahidrofuran a
condus la k' de 3,9 i 4,7 i la o valoare de 1,20. Dac suprapunerea celor dou peak-
uri a fost semnificativ n primul caz, n cel de al doilea caz suprapunerea a fost
neglijabil.
 Pentru separri care implic acizi sau baze ionizabile,
modificarea pH-ului fazei mobile conduce deseori la
manipularea valorilor fr a schimbare major n k'
ceea ce conduce la separri mai eficiente.
O metod mai puin convenabil dar deseori foarte
eficient n creterea simultan cu o meninere aproape
constant a valorilor lui k' n domeniul optim este cea de
alterare a compoziiei chimice a fazei staionare. Pentru
aceasta, cele mai multe laboratoare care realizeaz separri
cromatografice frecvente posed mai multe coloane care pot fi
interschimbabile cu un minim de efort.
 O cretere a temperaturii genereaz deseori o
cretere n k' dar aceast operaiune are un efect mic
asupra valorilor lui n cazul cromatografiei lichid-lichid
ori cromatografiei lichid-solid. n opoziie, n cazul
cromatografiei de schimb ionic, efectul temperaturii poate
fi suficient n cazul explorrii acestei opiuni, nainte de
schimbarea mpachetrii coloanei.
n fine, o alt metod de cretere a rezoluiei este
ncorporarea n faza staionar a unor specii care
complexeaz sau interacioneaz cu unul sau mai muli
componeni aflai n proba de separat. Un exemplu de
utilizare a acestei opiuni o reprezint impregnarea cu
sruri de argint a suportului adsorbent care conduce la o
mbuntire a separrii olefinelor ca o consecin a
formrii unor complexe ntre ionii de argint i compuii
organici nesaturai.
 Trena cromatografic

Formarea trenelor cromatografice reprezint o problem real i

inevitabil la majoritatea separrilor n cromatografia lichid. Cercettorii
din domeniu au depus eforturi n dezvoltarea unor noi materiale (suporturi
cromatografice) i dei acestea reduc formarea trenelor, rareori s-a putut
elimina acest fenomen. Procesul de formare a trenei cromatografice poate
cauza att probleme cantitative ct i calitative n procedurile de
cromatografie lichid, fiind important o monitorizare a formrii lor astfel
nct s nu se compromit rezultatul analizei.
Analiznd n detaliu o cromatogram se poate observa c aproape
toate peak-urile cromatografice au o oarecare tren mai mult sau mai puin
lung. Dei multe dintre coloanele de cromatografie lichid actuale sunt
mai puin problematice dect predecesoarele lor, totui aceasta problem
nu a fost nc eliminat.
 Se consider c un peak are trena sau ca este asimetric atunci cnd forma
sa deviaz de la cea ideala, Gaussian. A doua jumtate eluat a peak-ului
este mai larg dect prima, iar limea sa tinde sa se expandeze spre baza.
Dei pot aprea cozi ale peak-urilor si in jumtatea frontala a acestora, acestea
sunt totui rare in comparaie cu trenele. Deoarece trenele peak-urilor pot
influenta calitatea separrii este bine ca panta trenei sa fie cuantificata. Exista
doua mecanisme de msurare universale a peak-urilor. Lucrtorii din industria
farmaceutica folosesc factorul de trenare, USP Tf (Unided State Pharmacopeea
Tail factor), conform formulei1.26.

unde a si b reprezint limea jumtii frontale si

respectiv jumtii posterioare msurate la 5% din
nlimea peak-ului (figura alturat).
Majoritatea celorlali practicieni folosesc factorul
de asimetrie (As).

unde a si b sunt msurate la 10% din nlimea peak-ului cromatografic din figura alturat.
 Pentru valori mai mici de 2, As i USP Tf sunt aproximativ aceleai, precum se poate
observa i in tabelul de mai jos. ce reprezint msurtorile factorului de asimetrie i ale
factorului de trenare USP pentru acelai peak, n cazul figuriidemaijos.

Msurtorile factorului de asimetrie (As)

ialefactoruluidetrenareUSP(Tf)pentru
acelaipeak.

Valoarea msurat
Peak-ul din figura alturat
As Tf

1,0 1,0 1,0

1,2 1,3 1,2

1,5 1,7 1,4

2,0 2,5 1,9

3,0 3,8 2,9 Exempledepeak-uriasimetricei

4,0 5,5 3,5 factoruldeasimetriecalculatpentru
fiecare.
n condiiile n care coloana cromatografic este nou,
majoritatea productorilor prezint criterii de trenare (factorul As)
cuprinse ntre valorile 0,9 (puin frontal) i 1,2 (puin trenat).
Majoritatea utilizatorilor care folosesc probe reale ncearc s obin un
factor de asimetrie, nu mai mare de 1,5- 2. n general, cnd As este mai
mare dect 2, exist probleme de separare, i se cerceteaz cauza
acestora.
 Figuraalturat ne furnizeaz o serie de indicii
asupra potenialelor probleme create de trena peak-
urilor, prin comparaia unui peak ce are As = 1 cu un
altul ce posed As = 4. Astfel, comparnd aria peak-
urilor, se observ o diferen elocvent; dei ea este
aceeai nlimea peak-ului cu As = 4 este de trei ori
mai mic comparativ cu nlimea primului peak. n
condiiile analizelor de urme, nlimea peak-ului
devine un factor critic n determinarea limitei minime
de cuantificare, iar trenarea peak-ului conduce la
rezultate clar inferioare.
Formarea trenelor este de asemenea
problematic n cazul in care peak-urile minore se
ascund n cele majore. Acest fenomen este nedorit n
condiiile analizei unor metabolii ori n identificarea
unor impuriti.
 Modelele de cromatografe lichide folosite pentru analizele de
rutin, trebuie de obicei s asigure o bun rezoluie a liniei de
baz a tuturor peak-urilor iar timpul de rulare s fie ct mai mic
posibil. Figura de mai jos arat c rezoluia liniei de baza a
peak-urilor cu tren necesit un timp mai lung de rulare
comparativ cu peak-urile ce nu au tren sau care au o tren
scurt. Aadar, peak-urile cu tren nu doar reduc calitatea
cromatogramei, dar ele reduc de asemenea abilitatea de a
cuantifica componente prezente n prob.
 Cauzele apariiei trenei cromatografice se datoreaz
mai ales faptului existenei mai multor mecanisme de
separare, unul dintre acestea fiind supra-implicat. O serie
dintre practicieni au tendina de a considera separrile n
faz invers, pe coloane C18, de exemplu drept procese
pure de retenie hidrofob. Aceast consideraie poate fi
adevrat dac faza staionar ar fi constituit numai din
grupri C18. totui, aproximativ jumtate din suprafaa de
silice este nelegat ceea ce conduce la permisiunea de
expunere a gruprilor silanol (SiOH) care pot
interaciona cu proba.
 Particulele de silice care formeaz suportul solid
sunt realizate din polimer de siliciu i oxigen. Ca i
carbonul, siliciul este tetravalent, deci structura
intern a lui cuprinde patru atomi de oxigen ataai
la fiecare atom de siliciu n structura polimerului
tridimensional.
OH OH OH OH
O O O
Si Si Si Si
 La suprafa, polimerul se termin cu
grupri de silanol. Figura de mai jos
prezint diferitele configuraii posibile ale
gruprilor silanolice.
 Interaciiposibilelasuprafaasuportuluidesilice

Practicienii descriu n mod curent suprafaa ca posednd grupri libere silanolice (a)
dar sunt de altfel prezeni atomi de siliciu cu dou grupri hidroxil n configuraie
geminal (b).
Dac gruprile silanolice sunt poziionate una, alturi de alta, se pot realiza legturi
de hidrogen cu o grupare adiacent (c). Gruprile libere de silanol sunt mai acide dect
gruprile geminale ori asociate ele interacionnd mai puternic cu solui bazici avnd ca
rezultat formarea unei trene deseori asociat cu separarea unor solui bazici. n alte
cazuri, urme de metale (deseori fier ori aluminiu) pot fi prezente in matrixul de silicagel
(d). Ionii metalici pot aciona ca situsuri schimbtoare de ioni sau, cnd gruprile silanol
libere sunt adiacente, ei pot atrage electroni, care fac ca silanolul sa fie i mai acid (e).
 In trecut, coloanele mpachetate cu silice tip A conineau toate aceste forme de silanol
prezentate n figur, totui, n ultimii ani s-a pus la punct tehnologii de obinere de suporturi de
silice de puritate nalt (silicea de tip B), ce conine un numr redus de grupri silanol libere la
suprafa i sunt lipsite de urme de metale, fiind astfel mai puin acide. Astfel de coloane ce conin
silice de tip B au o tendin mult mai mic de a genera peak-uri cu tren.
 Reducerea formrii trenelor n coloane
de tip A, nseamn de obicei modificarea
fazei mobile pentru a include componente
ce concur la suprimarea trenei.
Adugarea de trietilamin n faza
mobil reprezint o metod curent n
reducerea formrii trenelor cromatografice.
Folosit la o concentraie de 20mM sau
mai mare n faza mobil, trietilamina poate
reduce semnificativ trenarea picurilor n
coloane de tip A. n cazul utilizrii de silice
de tip B trenarea peak-urilor reprezint o
problem mult mai rar.
n condiiile utilizrii exclusiv de
coloane de tip B, rareori se adaug
trietilamin la faza mobil.
Ca regul general, pH-ul sczut al
fazei mobile (pH < 3) acioneaz de
asemenea ca un supresor al ionizrii
silanolului, care mai departe conduce la
reducerea formrii trenelor cromatografice.
 Problema general a eluiei

Figura alturat ilustreaz o

cromatogram ipotetic a unui amestec de
ase componeni separai teoretic n trei
perechi de componente care au constante de
distribuie i factori de retenie net diferii. n
cromatograma (a), condiiile au fost ajustate
astfel nct factorii de retenie pentru
componentele 1 i 2 (k'1 i k'2 ) sunt n
domeniul optim, de cuprins ntre 2 i 5.
Factorii corespunztori pentru ai celorlalte
componente sunt, totui, departe de valorile
optime. Astfel, pentru peak-urile 5 i 6 care
apar numai dup un interval de timp extrem
de mare i de asemenea care sunt difuzate,
este dificil de a fi identificate cu certitudine.
Dup cum se observ n cromatograma (b), schimbarea condiiilor pentru optimizarea
separrii componentelor 5 i 6, ngrmdesc peak-urile primelor patru componente n zone
cu o rezoluie nesatisfctoare. Totui, n acest caz timpul de eluie este ideal.
n cromatograma (c) este prezentat un al treilea set de condiii n care valorile lui k'
pentru componentele 3 i 4 au valori optime. Separarea celorlalte dou perechi, din nou, nu
este complet satisfctoare.
 Fenomenul ilustrat n figur este ntlnit
aproape permanent, din acest motiv s-a denumit
problema general a eluiei. O soluie comun n
rezolvarea acestei probleme este cea de schimbare a
valorilor ale k' dup cum a fost prezentat mai nainte.

Aceste modificri pot fi realizate ntr-o manier n trepte ori continu. Astfel, pentru
amestecul prezentat n figur, condiiile de la nceput pot fi cele care conduc la
cromatograma (a). Imediat dup eluia componentelor 1 i 2, este necesar schimbarea
condiiilor astfel nct s se ajung la cele optime pentru separarea compuilor 3 i 4 (dup
cum se observ n cromatograma c). Odat cu apariia peak-urilor acestor compui, eluia
poate fi realizat n condiiile utilizate n cazul cromatogramei (b). Deseori, astfel de
proceduri conduc la rezolvarea satisfctoare a peak-urilor tuturor componenilor din
amestec ntr-un interval minim de timp.
n cazul cromatografiei lichide, variaiile n k' sunt produse prin variaia n compoziie a
fazei mobile n timpul eluiei (eluie n gradient sau programarea solventului).
Pentru gaz cromatografie, creterea temperaturii (programarea temperaturii) servete
la atingerea condiiilor optime necesare separrii.
relaiidelegturntreparametriidesepararecromatografic(1)
relaiidelegturntreparametriidesepararecromatografic(2)
 APLICAIILE CROMATOGRAFIEI

Cromatografia a reprezentat i reprezint o prim metod de separare intim

legat de specii moleculare nrudite chimic, ce poate fi utilizat n identificri calitative
i determinri cantitative ale speciilor separate. n continuare vor fi prezentate
caracteristicile generale ale cromatografiei, ca metod de realizare a unei analize.
Analize calitative
O cromatogram furnizeaz numai o singur parte de informaie cantitativ despre
fiecare specie din prob, adic timpul su de retenie ori poziia pe faza staionar dup o
anumit perioad de eluie. n plus, datele pot de asemenea s fie derivate din cromatograme
proces implicnd faze mobile i staionare diferite ori diverse temperaturi de eluie. Pn
acum cantitatea de informaii oferite de prin cromatografie sunt mici comparativ cu cea
obinut prin tehnici precum IR, RMN sau spectrometria de mas. n plus, datele spectrale,
lungime de und sau de frecven pot fi mult mai nalt specifice care pot reprezenta un
omolog al cromatografiei (tR).Cele mai sus prezentate nu trebuiesc interpretate n sensul c
metodele cromatografice i pierd din importan n cazul aplicaiilor calitative.
 Cromatografia este o metod deseori utilizat n recunoaterea
prezenei sau absenei unor componente din amestecuri care conin un
numr limitat de specii posibile a cror identitate este cunoscut. De
exemplu, 30 sau mai muli aminoacizi dintr-un hidrolizat proteic pot fi
detectai cu un mare grad de certitudine prin metoda cromatografic. Totui
pentru a confirma identitatea este necesar o investigaie chimic sau
spectroscopic a compuilor izolai.
Se poate nota c totui, o identificare pozitiv spectroscopic a
speciei prezente ntr-un complex de compui ar fi imposibil fr o
separare cromatografic anterioar. Astfel, cromatografia este deseori o
metod precursoare n analizele spectroscopice calitative.
Este important a se nota ns c o cromatogram nu poate conduce
la o identificare pozitiv a speciilor prezente n probe, dar poate da indicaii
sigure asupra absenei unei serii de compui din respectivul analit. Astfel
dac proba nu produce un peak cu un timp de retenie asemntor
unui standard analizat n aceleai condiii se poate spune c acel
compus luat n analiz este absent (sau este prezent la concentraii
sublimitadedetecieametodei).
 Analize cantitative

Cromatografia i datoreaz n principal dezvoltarea de-a lungul

timpului, n parte,
vitezei sale,
simplicitii i
preului su relativ sczut, aplicabilitii aproape generalizate ca o
metod de separare.
Nu se poate totui afirma c ea va deveni general dect n
condiiile n care ar fi utilizat la obinerea de informaii utile cantitative
asupra speciilor separate. Este important totui a se discuta despre o
serie de aspecte cantitative care se aplic la toate tipurile de
cromatografie.
 Cromatografia cantitativ pe coloan se
bazeaz pe compararea nlimii sau ariei
peak-ului de analit i prin compararea
acestuia cu unul sau mai multe standarde.
n cazul cromatografiei planare, aria
acoperit de speciile separate servete ca i
un parametru analitic iar dac condiiile sunt
corect controlate, acest parametru va varia
linear cu concentraia.
 Analizebazatepenlimeapeak-ului

nlimea peak-ului cromatografic este obinut prin

msurarea liniei de baz pe de o parte i a perpendicularei
peak-ului, cobort prin vrf. Acest tip de msurare se
realizeaz,ntr-un timp rezonabil i cu o precizie de msurare
bun. Este important a se nota c, totui nlimile peak-urilor
sunt invers proporionale cu limile lor. Astfel, acurateea
rezultatelor obinute din msurarea nlimii este obinut numai
dac nu apar variaii n condiiile de eluie a coloanei, care s
nu altereze limea peak-ului n perioada de eluie a probei i a
standardelor.
 Variabilele care trebuiesc urmrite
cu grij sunt
temperatura coloanei,
viteza de curgere a eluentului prin
coloan i
viteza de ncrcare (injecie) a
probei. Efectul injeciei probei este n
mod particular critic n cazul primelor
peak-uri ale cromatogramei. Injecia
neadecvat a probei conduce la erorile
relative de 5% pn la 10%.
n plus, trebuie avut grij s se
evite a suprancrcarea coloanei.
 Analizebazatepeariapeak-ului

Ariile peak-urilor sunt independente de efectele de mprtiere

date de variabilele menionate mai sus. Din acest punct de vedere,
totui, valorile ariilor sunt variabile analitice mult mai satisfctoare
comparativ cu nlimile peak-urilor. Pe de alt parte, nlimile
peak-urilor sunt mult mai uor de msurat n cazul peak-urilor
nguste.
 Majoritatea instrumentelor moderne
sunt echipate cu integratoare electronice
digitale care permit estimarea cu precizie a
ariei peak-ului cromatografic. Dac
asemenea instrumente nu sunt disponibile,
se poate apela la metoda manual, metod
simpl care permite o bun estimare a
peak-urilor simetrice. Aceasta implic
calcularea ariei prin nmulirea nlimii
peak-ului cu valoarea limii determinat la
jumtate din nlimea lui. Alte metode
implic utilizarea unui planimetru sau
decuparea peak-ului cromatografic i
cntrirea lui, determinnd astfel greutatea
lui n relaie cu o arie cunoscut de hrtie
de nregistrare. n general, tehnicile de
integrare manual conduc la erori de 2-5%,
pe cnd integrrile digitale sunt de un ordin
de magnitudine mai precise.
 Calibrriistandarde
Cea mai sigur metod de analiz cromatografic cantitativ implic
prepararea unei serii de standarde prin diluia unei soluii stoc ce posed
o compoziie aproximativ asemntoare cu cea a probei necunoscute.
Cromatogramele pentru standarde obinute astfel sunt apoi reprezentate
n funcie de concentraia lor. Curba rezultat care obligatoriu trece prin
origine este utilizat la determinrile de concentraie a compusului care
se dozeaz. n mod frecvent se recurge la restandardizare pentru a
obine rezultate cu o mai mare acuratee.
Cea mai important surs de erori n analize efectuate prin metoda
mai sus menionat este dat de incertitudinea legat de volumul probei;
uneori, viteza de injecie, reprezint de asemenea un factor de eroare. n
mod curent probele sunt mici (de aproximativ 1 l), iar incertitudinile
legate de injectarea n condiii reproductive a unui volum cu o sering de
aceleai mrime poate conduce la scderea cu procente semnificative a
erorilor. Aceast situaie este des-ntlnit n cromatografia gaz-lichid,
unde proba trebuie sa fie injectat ntr-un dispozitiv special nclzit, unde
fenomenul de evaporare care apare la nivelul acului seringii poate fi
deosebit de crescut, conducnd astfel la variaii mari ale volumului
injectat. Erorile volumului de prob pot fi reduse, cu probabil 1-2% din
medie, prin utilizarea unei valve rotative.
 Metodacustandardintern

Precizia cea mai mare n cromatografia cantitativ este obinut prin utilizarea
standardelor interne deoarece incertitudinile introduse prin injectarea probei sunt evitate.
n aceast procedur, se msoar cu atenie o substan, denumit standard intern,
care este introdus n fiecare standard sau prob, raportul dintre ariile (ori nlimea)
peak-urilor analitului i a standardului intern servind drept parametru analitic. Pentru ca
aceast metod sa aib succes, peak-ul standardului intern trebuie s fie bine separat
de peak-urile celorlalte componente din prob (Rs > 1,25); peak-ul standard trebuie, pe
de alt parte, sa apar n apropierea peak-ului analitului. Cu un standard intern adecvat,
se poate crete precizia fa de alte metode, utilizate frecvent.

Metodadenormalizareaariei

O alt abordare care conduce la scderea incertitudinilor legate de injectarea probei

este metoda de normalizare a ariei. n acest caz, este necesar eluia complet a tuturor
componentelor probei. n metoda de normalizare, ariile tuturor peak-urilor sunt calculate,
dup corecia tuturor acestor arii cu diferenele dintre rspunsul detectorului la tipurile
diferite de compui, n timp de concentraia analitului este determinat din raportul
acestor arii la aria total a tuturor peak-urilor.
Din nefericire, adesea nu este practic a aranja condiiile n aa fel ca toi compuii
din amestec s fie eluai din coloan ntr-o perioad de timp rezonabil, motiv pentru
care metoda de normalizare are aplicaii limitate.
 CROMATOGRAFIADE
PARTIIE

Dintre toate tipurile de procedee cromatografice lichide,

cromatografia de partiie este cea mai utilizat tehnic de
separare. Dac n trecut cele mai multe aplicaii se adresau
compuilor neionici, celor polari cu mas molecular moderat
(de obicei mai mic de 3000) astzi dezvoltarea unor metode
(procedee de derivatizare ori de tehnicile bazate pe perechi de
ioni) au extins separrile prin partiie i la compui ionici.
 Cromatografia de partiie poate fi subdivizat n
-cromatografie lichid-lichid i
-cromatografie cu faz legat.
Diferena ntre cele dou tehnici constau n metoda prin
care faza staionar intr n interacie cu particulele suport,
mpachetate.
n cromatografia lichid-lichid, faza lichid staionar este
reinut pe suprafaa particulelor mpachetate prin adsorbie fizic.
n schimb, n cazul cromatografiei de faz legat, faza
staionar este legat chimic la suprafaa particulelor de suport.
Primele tipuri de cromatografie de partiie au fost exclusiv de tip
lichid-lichid; datorit multor dezavantaje ale sistemelor lichid-lichid,
n pezent metoda cu faz legat a devenit predominant. Unul
dintre aceste dezavantaje l reprezint pierderea fazei staionare
prin disoluia ei n faza mobil, care astfel necesit reacoperirea
periodic a particulelor suport. n plus, problemele de solubilitate
ale fazei staionare interzic utilizarea fazei lichide mpachetate n
cazul eluiei n gradient.
 Cromatografia de partiie cu
faz legat
Suporturile pentru majoritatea tehnicilor de cromatografie de partiie cu
faz legat sunt preparate din silice rigid ori au o compoziie pe baz de
silice. Aceste solide sunt formate din particule uniforme, poroase, cu
consisten mecanic de gel, cu diametru de 3, 5, ori 10 m. Suprafaa
acestora este format din silice total hidrolizat (proces realizat prin fierberea
silicei n HCl, 0,1 M timp de una-dou zile, proces prin care rezult grupri
silanol, chimic reactive, de forma:

OH OH OH OH
O O O
Si Si Si Si

Structurasuprafeeidesilice.
 n mod caracteristic, suprafeele de silice activat, conin aproximativ 8
moli/m2 de grupri hidroxilice. O structur mult utilizat n cromatografia cu
faz legat o reprezint siloxanii, compui rezultai prin reacia dintre suprafaa
hidroxilat cu un organoclorosilan, dup reacia:

Modalitateadesintezaunuisiloxan;
R reprezint o grupare alchil ori o
gruparealchil-substituit.
Din cauza efectelor sterice suprafaa acoperit prin silanizare este
limitat la cel mult 4 moli/m2 dup cum se observ n figurademaijos.

Structuratridimensionalaunuiderivat
siloxanic.

Gruprile Si-OH nereacionate conduc din pcate la o polarizare nedorit a

suprafeei, care are ca efect apariia trenei peak-ului cromatografic, mai ales n cazul
soluilor bazici. Scderea acestui efect se realizeaz prin dezactivare cu clortrimetilsilan,
care, avnd o mas molecular mai mic, se poate lega la gruprile libere hidroxilice ale
silanolului.
 TIPURI DE SUPORTURI UTILIZATE N CROMATOGRAFIA CU FAZ LEGAT

n funcie de polaritatea relativ a fazelor mobil i staionar, se pot distinge dou

tipuri de cromatografii cu faz legat. Primele lucrri de cromatografie lichid s-au bazat
pe faze staionare puternic polare precum apa ori trietilenglicolul, legate de particule de
silice ori de alumin; n continuare, un solvent relativ nepolar precum hexanul ori iso-
propil eterul, servesc apoi drept faz mobil. Fiind raportat prima, aceast tehnic
cromatografic de partiie a fost denumit cromatografie cu faz normal. n
cromatografia cu faz invers, faza staionar este nepolar, deseori o hidrocarbur, n
timp ce faza mobil este relativ polar (ap, metanol, acetonitril, etc.).

Relaiile dintre polaritate i timpii de

eluie n cazul cromatografiei cu faz
normal(a,b)iceacufazinvers(c,
d) n cazul a trei componeni. a)
polaritate sczut a fazei mobile; b)
polaritate medie fazei mobile; c)
polaritate nalt a fazei mobile; d)
polaritatemediefazeimobile.
n cromatografia cu faz normal, componentul cel mai puin polar este eluat
primul, deoarece, n sens relativ, este cel mai solubil n faza mobil; creterea
polaritii fazei mobile va avea ca efect scderea timpului de eluie. n opoziie, n
metoda cu faz invers, componentul cel mai polar apare primul, iar creterea
polaritii fazei mobile crete timpul de eluie. Aceste relaii sunt ilustrate n de mai
sus.
 Suporturile cromatografice cu faz
legat sunt clasificate drept cu faz
invers dac structura de suprafa a
suportului are un caracter nepolar, i
drept cu faz normal n condiiile n
care suportul conine grupri funcionale
polare. n cromatografia de nalt
presiune cel puin trei sferturi din
Structurachimicagruprilororganice
experimente se realizeaz pe coloane
sililprezentenstructurafazelor
mpachetate cu faz invers.
staionare,utilizatencromatografia
Structura gruprilor organice silil
planarcufazlegat.Simbolurilesunt
ale fazei staionare difer prin mrime,
explicitatemaijos.
rigiditate planaritate i grad de
nesaturare dup cum se observ n
figura alturat.

Acestea includ trimetilsilil (C1), n-octildimetilsilil (C8), n-octadecildimethilsilil

(C18), 2-ciclohexiletildimetilsilil (CHE), 2-(3-ciclohexenl)etildimetilsilil (CHNE),
fenildimetilsilil (Ph), 2-feniletildimetilsilil (PE), 2-(2-naftil)etildimetilsilil (NE) i 2-(3-
pirenil)etildimetilsilil (PYE). Cele mai comune grupri radicalice care mbrac
suportul de siloxan este catena C8 (n-octil) ori catena C18 (n-octildecil).
 DEVELOPAREANCROMATOGRAFIADE
PARTIIE
Procesul de eluie a componentelor probei de pe suportul
cromatografic de ctre faza mobil (solvent) este denumit
developare. Aceast metod tinde a fi mai complex n
cromatografia lichid dect n cea gazoas deoarece n faza mobil
lichid componentele interacioneaz att cu faza staionar, ct i
cu cea mobil, n contrast cu gaz cromatografia unde faza mobil se
comport ca i un gaz ideal, necontribuind n procesul de separare;
ea servete numai transportului componentelor probei prin faza
staionar. n acest fel, n gaz-cromatografie, separrile nu sunt
semnificativ afectate de ctre faza mobil, indiferent dac aceasta
este reprezentat de heliu, azot, ori hidrogen. n contrast evident cu
fenomenul ntlnit n cazul gaz-cromatografiei, succesul unei separri
prin partiie lichid este adesea profund dependent de compoziia
fazei mobile.
 SELECIA COLOANEI N SEPARRILE PRIN
CROMATOGRAFIE DE PARTIIE

Succesul cromatografiei cu faz mobil interactiv, necesit o balan

optim a forelor intermoleculare care implic cei trei participani activi n
procesul de separare: faza mobil, faza staionar i solutul. Aceste fore
intermoleculare sunt descrise calitativ n termeni de polaritate relativ a
fiecruia dintre cei trei reactani.
Polaritile diverselor grupe funcionale cresc n ordinea: hidrocarburi
< eteri < esteri < cetone < aldehide < amide < amine < alcooli. Apa este cel
mai polar compus dintre toi compuii care conin gruprile funcionale
prezentate mai sus.
Deseori, n alegerea unei coloane pentru separri cromatografice de
partiie, polaritatea fazei staionare este aproximativ aleas, n concordan cu
cea a analitului, n timp ce faza mobil aleas pentru eluie prezint o diferen
considerabil din punct de vedere al polaritii. Aceast abordare este n
general mai de succes dect cea n care polaritile solutului i a fazei mobile
sunt alese diferit de faza staionar. n acest caz, faza staionar deseori nu
poate competiiona eficient pentru componentele probei, timpii de retenie
devenind prea scuri n aplicaiile practice.
 O alt extrem o reprezint situaia n care polaritile solutului
i a fazei staionare sunt prea similare i total diferite de cea a
fazei mobile. n aceast situaie timpii de eluie devin deosebit de
mari.
Se poate concluziona c polaritile solutului, fazei mobile i
fazei staionare trebuiesc cunoscute i selectate cu grij pentru a
conduce la o separare de partiie eficient, ntr-un interval de timp
rezonabil. Din nefericire, teoriile interaciilor dintre faza mobil i
cea staionar pentru oricare component sunt imperfecte motiv
pentru care acestea pot doar ghida analistul n alegerea fazei
staionare pentru un tip general, dup care, este necesar a se
realiza o serie de experimente preliminarii, de identificare a fazei
optime pn la obinerea unei separri satisfctoare. Dac se
constat c rezoluia tuturor componentelor ale amestecului este
imposibil, se alege un alt tip de coloan.
 Selecia fazei mobile n cromatografia de partiie

n prezentarea teoretic au fost descrise trei metode de cretere a rezoluiei de

separare n cromatografia pe coloan, fiecare fiind bazat pe varierea unuia dintre cei
trei parametrii (N, k', i ) prezentai n ecuaia 1.21. n cromatografia lichid, factorul
de retenie, k', este experimental, cel mai uor de manipulat dintre toi aceti trei
factori deoarece exist o dependen puternic ntre a acestei constante funcie de
compoziia fazei mobile. Performanele optime ale factorului de retenie, k', trebuie s
fie cuprinse ntr-un domeniu ideal cuprins ntre 2 i 5, totui, pentru amestecuri
complexe acest domeniu este extins la 0,5 - 20 n scopul de a furniza timp suficient
oricrui component din amestec s fie eluat.
Uneori, ajustarea lui k' singur, nu este suficient pentru a produce o separare
clar a peak-urilor, fr suprapunere; n acest caz trebuie s se recurg la variaia
factorilor de selectivitate . n acest caz modul cel mai simplu de modificare a
factorului de selectivitate l reprezint alterarea cu grij a compoziiei fazei mobile,
pentru a pstra factorul de retenie, k' ntr-un domeniu rezonabil. Un alt mod alternativ
de schimbare a factorului de selectivitate l reprezint alegerea unui suport
cromatografic diferit.
 EFECTUL TRIEI SOLVENTULUI ASUPRA FACTORILOR DE RETENIE
Solvenii care interacioneaz puternic cu soluii sunt deseori numii solveni
tari ori solveni polari. n scopul descrierii cantitative a polaritii solvenilor au
fost introdui o serie de indeci.
Dintre acetia, cel mai utilizat index n cromatografia de partiie l reprezint
P', indexul de polaritate, introdus de ctre Snyder n 1978. Parametrul P' se
bazeaz pe msurtori de solubilitate a substanei de interes n trei solveni:
dioxan (un dipol proton acceptor slab), nitrometan (un dipol proton acceptor tare)
i alcool etilic (un dipol proton donor foarte tare). Indexul de polaritate este o
msur numeric a polaritii relative a unui numr divers de solveni. Tabelul
urmtor prezint o list de indeci de polaritate, alturi de alte proprieti fizico-
chimice pentru un numr de solveni care sunt utilizai n cromatografia de
partiie.
Se poate nota c acest index poate varia de la 10,2 pentru solventul cel mai
polar, apa, la -2 pentru compuii nalt nepolari de tipul fluoroalcanilor. Orice alt
index de polaritate dorit se va ncadra ntre aceste limite, fiind realizat prin
amestecul a doi solveni adecvai. n acest fel se obine indexul de polaritate P'AB
a amestecului format din solvenii A i B. Acesta este dat de relaia:
P'AB=AP'A+B P'B
unde P'A i P'B reprezint indecii de polaritate ai celor doi solveni, iar , fracia volumetric a
fiecrui solvent.
 Proprietilecelormaiutilizatefazemobilecromatografice.

Index de Punct de Index de polaritate,

Solvent Vscozitate [cP] b Tria eluentului c, [o]
refracie a fierbere [oC] P'

Fluoroalcani 1,27-1,29 0,4-2,6 50-174 <-2 -0,25

Ciclohexan 1,423 0,90 81 0,04 -0,2
n-Hexan 1,372 0,30 69 0,1 0,01
1-Clorbutan 1,400 0,42 78 1,0 0,26
Tetraclorur de carbon 1,457 0,90 77 1,6 0,18
Eter i-propilic 1,365 0,38 68 2,4 0,28
Toluen 1,494 0,55 110 2,4 0,29
Eter etilic 1,350 0,24 35 2,8 0,38
Tetrahdrofuran 1,405 0,46 66 4,0 0,57
Cloroform 1,443 0,53 61 4,1 0,40
Etanol 1,359 1,08 78 4,3 0,88
Acetat de etil 1,370 0,43 77 4,4 0,58
Dioxan 1,420 1,2 101 4,8 0,56
Metanol 1,326 0,54 65 5,1 0,95
Acetonitril 1,341 0,34 82 5,8 0,65
Nitrometan 1,380 0,61 101 6,0 0,64
Etilenglicol 1,431 16,5 182 6,9 1,11
Ap 1,333 0,89 100 10,2 mare

a
valoarea este calculat la o temperatur de 25 oC
b
centipoid-ul este unitatea de msur, comun, a vscozitii n sistem internaional, 1 cP = 1 mN s m -2.
c
valorile triei solventului sunt calculate pe suport de alumin, Al 203; pentru silice, SiO2 valoarea o se multiplic
cu un factor de 0.8.
 S-a artat anterior c cea mai simpl cale de cretere a rezoluiei cromatografice a
dou specii o reprezint manipularea factorului de retenie k', care poate fi variat prin
schimbarea indexului de polaritate a solventului. n cazul prezentat mai sus, ajustarea lui
P' este realizat prin utilizarea unei faze mobile ce conine un amestec format din doi
solveni. De obicei, o schimbare grosier cu dou uniti a indexului de polaritate P'
conduce la o cretere de zece ori a factorului de retenie k'. n cazul separrii prin
cromatografie de faz normal se poate scrie relaia:

unde k'2 i k'1 reprezint valorile iniiale i finale pentru un solut, n timp ce P'1 i P'2
sunt valorile corespunztoare ale lui P'.
n cazul coloanelor cromatografice cu faz invers relaia este:

Se poate accentua c dei aceste ecuaii sunt aproximative, ele pot fi

utilizate cu succes.
 . APLICAII ALE CROMATOGRAFIEI DE PARTIIE
Suporturile cu faz invers cnd se utilizeaz n conjuncie cu solvenii foarte polari (deseori apoi), se
apropie de sistemul ideal, universal, pentru cromatografia lichid. Datorit aplicabilitii mari, avantajoase i
uoare, n condiiile n care factorul de retenie k' poate fi alterat prin modificarea fazelor apoase mobile, ele sunt
frecvent aplicate naintea altor separri exploratorii n cazul utilizrii unor noi tipuri de probe.
Figura de mai jos ilustreaz dou dintre miile de aplicaii ale cromatografiei cu faz legat.

Abordarea sistematic a separrii a ase steroizi. (a) i (b) utilizarea apei pentru a ajusta
valoareafactoruluidereteniek'.Efectelevariaieifactoruldeselectivitatesuntartaten
(b), (c), (d), i (e). Coloan: 0,4 x 150 mm mpachetat cu suport C 8, particule de faz
invers, 5 m. Temperatura: 50C. Viteza de curgere: 3.0 cm 3/min. Detector: UV 254 nm.
Compui: (1) prednison, (2) cortizon (3) hidrocortizon, (4) dexametazon, (5)
corticosteron;(6)cortoexolon.
Dou aplicaii ale
cromatografiei de partiie cu
faz legat. a) Analiza unor
aditivi ntr-o butur
nealcoolic. Coloan cu suport
polar legat (nitril). Eluie
izocratic. b) Analiza unor
insecticide organofosforice.
Coloan cu faz legat C8,
eluie n gradient. Detecie UV,
254nm.
 Formarea unor derivai ai probei

n unele cazuri este util a se converti componenii probei n derivai naintea

sau uneori cnd se ntreprinde o separare cromatografic. Acest tratament este
de dorit n condiiile n care se dorete
(1)reducerea polaritii speciilor astfel c se poate utiliza mai degrab
cromatografia de partiie dect cea de adsorbie ori de schimb ionic,
(2)creterea rspunsului detectorului i astfel creterea sensibilitii pentru
toate ori pentru o serie de componente ale probei i
(3)intensificarea selectiv a rspunsului la detector pentru o serie de
componente ale probei.

Cromatograma derivailor
ortoftalaldehidici ai 30 de
aminoacizi de importan
fiziologic. Coloan: C18, 5
m de faz invers. Solvent
A: Na2HP04, 0,05 M, pH 7,4,
CH30H/Tetrahidrofuran/H20.
Detector de fluorescen:
excitaie 334 nm; emisie 425
nm.
 CROMATOGRAFIADEEXCLUZIUNE
MOLECULAR
Cromatografia de excluziune steric, denumit de asemenea
cromatografie de gel premeaie, cromatografie de sitare molecular
sau gel filtrare reprezint o tehnic de separare de real folos n
laborator, fiind aplicat n particular la separarea speciilor cu mas
molecular mare.
Suportul cromatografic mpachetat utilizat n cromatografia de
excluziune steric este alctuit din particule mici, de aproximativ 10 m
de silicat ori particule de polimeri care conin reele de pori uniformi ntr-
un solut i molecule de solvent difuzate n interiorul acestor pori.
n interiorul porilor moleculele sunt efectiv blocate, fiind micate
prin curgerea fazei mobile.
Domeniul de timp de reziden n interiorul porilor depinde de
mrimea efectiv a moleculelor de analit.
 Moleculele care sunt mai mari dect media mrimii
porilor suportului cromatografic sunt excluse i astfel ele nu vor fi
reinute, aceste specii fiind primele eluate.
Moleculele care au un diametru semnificativ mai mic
dect dimensiunile porilor pot penetra (permea) n labirintul de
pori din interiorul suportului cromatografic, fiind astfel captate,
pentru un timp mult mai ndelungat, fiind ultimele eluate. ntre cele
dou extreme sunt moleculele intermediare a cror domeniu de
permeare n pori depinde de diametrele lor. Fa de acest grup de
molecule are loc fracionarea, fenomen direct legat de diametrul
lor i n unele cazuri de forma molecular a lor.
Se poate spune c separrile prin gel permeaie, de
excluziune pe baza masei moleculare difer de alte procese de
separare prin considerentul c nu exist interacii fizice sau
chimice ntre analit i faza staionar.
Din aceast cauz, este necesar eliminarea oricrei
interacii deoarece acestea conduc la scderea eficienei
cromatografice.
 De asemenea trebuie notat c n cazul acestui proces de separare exist
o limit superioar a timpului de retenie din cauza faptului c nici o specie de
analit nu se reine mai mult dect cel care permeaz total faza staionar. De
reinut c n cazul separrii biomoleculelor n sisteme apoase,
cromatografiadeexcluziunededenumetecromatografiedegelfiltrare,
n timp ce separarea compuilor n sisteme neapoase este denumit
cromatografiedegelpermeaie.
Metoda cromatografic de excluziune din gel exploateaz masa
molecular ca proprietatea fizic n scopul realizrii separrii. Astfel pot fi
separate molecule din domeniul a 100 pn la cele de mai multe milioane de
daltoni.
Fiind o tehnic prin care se separ n general molecule cu mas
molecular cuprins ntre 10000 i 100000 este deosebit de popular printre
cercettorii biochimiti.
Gel cromatografia a avut i are o importan
major n purificarea a mii de proteine, acizi nucleici,
enzime, polizaharide ori a altor biomolecule.
Tehnica poate fi aplicat la determinri de mase
moleculare ori la analize cantitative ale interaciilor
moleculare.
 Suporturi utilizate n cromatografia de gel filtrare

Faza staionar este constituit din particule inerte care conin pori mici cu
dimensiuni controlate. Examinarea microscopic a acestor particule arat un interior
spongios.
O soluie care conine molecule cu diferite mase moleculare este trecut prin
coloan sub influena unui solvent n continu curgere. Moleculele de solut care sunt mai
mari dect porii nu vor putea ptrunde n interiorul sferelor de gel din cauza
mpiedicrilor sterice datorate dimensiunii acestora n comparaie cu spaiul din interiorul
sferelor.
Volumul coloanei care este accesibil moleculelor foarte mari este astfel semnificativ
redus. Ca rezultat, ele nu vor fi ncetinite n curgerea lor prin coloan i vor fi eluate
astfel ca o singur band (zon). Moleculele mici sunt capabile s difuzeze n i n afara
sferelor de gel, fiind necesare volume mai mari de solvent pentru a fi eluate, astfel ele
staionnd un timp ndelungat n interiorul sferelor, n consecin fiind ntrziat eluia lor
din coloan.
Moleculele cu dimensiuni intermediare migreaz prin coloan cu vitez cuprins
ntre cea a moleculelor mari i cele mici. Astfel, ordinea de eluie a diverselor molecule
de solut este oarecum n relaie direct cu dimensiunile lor moleculare.
 Au fost elaborate dou tipuri de suporturi pentru cromatografia de
excluziune pe baza mrimii moleculelor:
microsfere de polimer i
particule ce au la baz silice, ambele avnd diametre cuprinse ntre 5
i 10 m. Ultimele au avantajul unei rigiditi crescute ceea ce conduce la o
mpachetare mai uoar, permind utilizarea lor la presiuni crescute,
stabilitate deosebit de mare, care permite utilizarea lor mpreun cu un
mare numr de solveni, inclusiv cu apa, o echilibrare mai rapid ntr-un
nou solvent i o stabilitate nalt la temperaturi ridicate.
 Cele mai timpurii separri efectuate prin tehnica de cromatografie de
excluziune molecular s-au realizat pe copolimer reticulat de stiren-divinil
benzen, similar n structur cu copolimerii sulfonici ai acestor copolimeri.

Mrimea porilor acestor polimeri e controlat prin cantitatea de agent de

reticulare, n spe de cantitatea de divinilbenzen utilizat n reacia de polimerizare.
Drept consecin, au fot creai o serie de copolimeri cu diferite domenii ale porilor,
sub form comercial. Dac la nceput gelurile de stiren-divinilbenzen erau
hidrofobe, i astfel neutilizabile n prezena unei faze mobile apoase, astzi sunt
disponibile geluri hidrofile, ceea ce face posibil utilizarea lor n solveni apoi
pentru separarea unor molecule mari, hidrosolubile precum zaharurile.
Aceste geluri hidrofile sunt derivai sulfonai ai divinibenzenului ori sunt
poliacrilamidice.
 n acest moment, n tehnicile de nalt performan (presiune)
sunt disponibile comercial suporturi pe baz de sticl poroas ori
particulele de silice ce au domeniu de mrime al porilor cuprins
ntre 40 i 2500 . n scopul reducerii absorbiei nespecifice,
suprafeele acestor particule sunt deseori modificate prin reacii cu
substitueni organici. De exemplu, suprafaa unui suport hidrofil
prezint structura urmtoare:

Structuraunuisuporthidrofil,pebazdesilice
 Proprietile unor matrix-uri pe baz de polistiren-divinilbenzen i silice utilizate n
cromatografiadeexcluziunepebazamrimiimaseimoleculare.Limitadeexcluziunea
maseimolecularesereferladomeniullacarenusemanifestnicioreinere.

Tipul de suport Mrimea Domeniul de limit Limita de excluziune a

cromatografic pariculei, m al porilor, masei moleculare
polistiren-divinilbenzen 10 102 700
103 (de la 0,1 la 20) x 104
104 (de la 1 la 20) x 104
105 (de la 1 la 20) x 105
106 (de la 5 >20) x 106
Silice 10 125 (de la 0,2 la 5) x 104
300 (de la 0,03 la 1) x 105
500 (de la 0,05 la 5) x 105
1000 (de la 5 la 20) x 105

n practica biochimic de separare analitic, sunt utilizate cu

preponderen geluri bazate pe patru tipuri de baz: dextran, poliacrilamid,
agaroz i amestecuri de poliacrilamid cu dextran.
Primele geluri dezvoltate
au fost pe baz de
dextran, un polizaharid
natural reticulat cu
epiclorhidrin,
comercializat sub
denumirea de Sephadex
 Dextranul este un polizaharid compus din resturi de glucoz legate
prin legturi (-1 -6) i legturi -1,3 care confer legturi ramificate. El
este biosintetizat de ctre o enzim produs de ctre bacteria
Leuconostoc mesenteroides, tulpina B-512F.

Dextranul este reticulat la multiplele sale extremiti printr-o reacie

cu epiclorhidrin, ceea ce conduce la obinerea unor sfere de gel
cu poroziti diferite.
 Numrul dat fiecrui tip de gel se refer la
capacitatea de mbibare cu soluie apoas (water
regain) multiplicat cu 10. Sephadex-ul este oferit n
diverse mrimi ale particulelor denumite coarse,
medium, fine i superfine. Gelurile pe baz de dextran
nu pot fi preparate dect pentru limite de excluziune mai
mici de 600000 daltoni, deoarece mica reticulare
existent n structura lor nu este suficient pentru a
preveni colapsul particulelor. n schimb, prin reticularea
dextranului cu NN'- metilen bisacrilamid, este posibil
utilizarea acestor geluri la fracionri cu domenii mai
mari. Aceste geluri sunt denumite Sephacryl.
 Gelurile pe baz de poliacrilamid sunt produse prin copolimerizarea
acrilamidei cu NN'- metilen bisacrilamid, ultimul fiind i agent de reticulare.
Denumirea comercial a acestor geluri este Bio-Gel P. Mediile pe baz de Bio-
Gel sunt media sunt disponibile n 10 limite de excluziune, n domeniul 1800 la
400000 daltoni.
Gelurile pe baz de agaroz prezint avantajul unor deosebit de mari
limite de excluziune. Agaroza, componentul polizaharidic neutru al agarului,
este compus din uniti alternative de galactoz i anhidro-galactoz (Figura
urmtoare).
 Agaroza este un material gelificant a cror mrime a porilor este mai mare
dect cei ai dextranului reticulat ori ai poliacrilamidei. Agaroza este un polizaharid
neutru, fracie de agar.
Ea este compus din polimer linear de D-galactopiranoz legate -14 la 3,6
anhidro-L-galactopiranoz, care este legat -13. n condiiile n care
polizaharidul este dizolvat prin fierbere i apoi este rcit, el formeaz legturi de
hidrogen inter- i intramoleculare. Mrimea porilor este controlat prin concentraia
de agaroz. Structura gelului este stabilizat mai mult prin legturi de hidrogen
dect prin legturi ncruciate covalente.
 Gelurile pe baz de agaroz sunt furnizate sub denumirea
comercial de Bio-Gel A i Sepharose ori Superose. Sepharose CL
este o Sepharose reticulat prin reacia dextranului cu 2,3-
dibromopropanol n condiii alcaline, ceea ce conduce la obinerea unui
gel de agaroz cu o stabilitate termic i chimic crescut.
 Un pas nainte n tehnologia de gel filtrare s-a realizat n momentul introducerii gelurilor
compozite, prin grefarea unui polimer secundar pe un suport de gel preformat, precum de
exemplu Sephacryl (figura de mai jos), unde reticularea se realizeaz ntre alil dextran i
N,N'-metilen bisacrilamid ori mai recent, Superdex.

StructuraprobabilapolimeruluiSephacrylHR
 StructuraSuperdex-ului
Gelurile combinate de poliacrilamid i agaroz sunt furnizate sub denumirea
comercial de Ultragel. Acestea sunt compuse din poliacrilamid reticulat n ochiurile
creia se afl agaroz. Ca i n cazul Superdex, gelul de poliacrilamid confer un
grad nalt de separare n timp ce agaroza menine rigiditatea gelului ceea ce conduce
la marele avantaj al creterii vitezelor de curgere.
n definirea performanelor unui gel i a comportamentului unui
solut este necesar cunoaterea unor proprieti fizice ale
acestora.
Limita de excluziune. Ea este definit ca
masa molecularaceleimaimicimolecule
carenupoatedifuzaninteriorulvolumului
dematrixdegel.Toatemoleculelemaimari
dectaceastmasvorfieluaterapid,ntr-
o singur zon. Limita de excluziune a unui
gel tipic, Sephadex G-50, este de 30000 Da.
Toate moleculele din solut care posed mase
moleculare mai mari de aceast valoare vor
trece prin coloan direct, fr a fi reinute n
porii sferelor de gel.
Domeniul de fracionare. n cazul
Sephadex G-50 domeniul de fracionare este
cuprins ntre 1500 i 30000 Da. Moleculele de
solut din acest domeniu, se vor separa
oarecum ntr-o relaie linear, n funcie de
masa lor molecular.
Capacitatea de mbibare(water regain i bed volume). Mediile
de gel cromatografie sunt oferite cel mai adesea n form
deshidratate fiind umflate apoi n solvent, de obicei ap, nainte de
utilizare. Cantitatea de ap necesar obinerii unui gram de gel este
cunoscut sub denumirea de water regain. n cazul Sephadex G-
50, aceast valoare este de 5 pentru 0,3 g.
Valoarea nu include apa din jurul particulelor de gel i astfel nu
poate fi utilizat la o estimare exact a volumului final al coloanei
mpachetate de gel. Cele mai multe companii care comercializeaz
astfel de produse furnizeaz, n plus la water regain, valoarea
volumului particulelor, bed volume. Aceast valoare reprezint
volumul final de gel n condiiile umflrii (mbibrii) a unui gram de
gel uscat n ap.
Pentru Sephadex G-50, bed volume-ul este de 9 pn la 11 ml/g
gel uscat. n seria Sephadex-ului, denumit seria G, numerele G
se refer la cantitatea de ap care este necesar pentru
nmuierea gelului, avnd grade diferite de reticulare, deci diferite
mrimi ale porilor. Sephadex G-10, cel mai reticulat dextran,
posed un water regain de aproximativ 1 ml/g de gel uscat n
timp ce Sephadex G-200, cel mai ieftin dextran reticulat are un
water regain de aproximativ 20 ml/g de gel uscat.
Forma i mrimea particulei de gel. n condiii ideale,
particulele de gel sunt sferice, pentru a furniza un strat
uniform de gel, cu o mare densitate a porilor. Mrimea
particulelor este definit prin mrimea ochiurilor
acesteia (mesh) ori prin diametrul sferei particulei.
Gradul de rezoluie oferit de viteza de curgere prin coloan
depinde de dimensiunile particulelor de gel.
Particulele cele mai mari (50 la100 mesh, 100 la 300
m) ofer viteze de curgere nalte dar o separare
cromatografic cu rezoluie sczut.
n caz opus se afl particulele de gel cu dimensiuni
foarte mici ("superfine," 400 mesh, 10 la 40 m).
Cele mai utilizate mrimi de particule reprezint un
compromis ntre rezoluie i vitez de curgere fiind de 100
la 200 mesh (50 la 150 m).
Volumul spaiului gol (void volume). Acesta
reprezint spaiul total din jurul particulelor de gel ntr-o
coloan mpachetat. Valoarea volumului spaiului gol
se determin prin msurarea volumului de solvent
necesar elurii unui solut care este complet exclus din
matricea gelului. Cele mai multe coloane pot fi
calibrate n scopul determinrii acestui parametru prin
eluia a unui colorant, blue dextran 2000, care are o
mas molecular medie de 2000000 daltoni.
Volumul de eluie. Acest volum reprezint volumul
de tampon de eluie necesar ndeprtrii unui anumit
solut, particular, dintr-o coloan mpachetat.
 Pentru a realiza o separare prin gel filtrare mediul suportul (mediul) este mpachetat ntr-o
coloan sub form de perle n strat mpachetat (packed bed). Mediul este reprezentat de un matrix
poros n form de particule sferice care trebuie a fi alese n funcie de stabilitatea lor chimic i
fizic ori pe baza proprietii de a fi inerte (prin pierderea proprietilor de reactivitate sau
adsorptivitate). Coloana mpachetat este echilibrat cu tampon cu rolul de a se distribui n porii
matrix-ului i n spaiul dintre particule. Lichidul situat n interiorul porilor este uneori definit drept
faz staionar care se afl n echilibru cu lichidul din afara particulelor denumit faz mobil. Se
poate nota cprobeleseelueazncondiiiisocratice, nefiind necesar utilizarea tampoanelor
diferite n timpul separrii. n mod normal, o treapt de splare se realizeaz prin trecerea unui
tampon la sfritul oricrei separri pentru a facilita ndeprtarea oricrei molecule care ar fi putut fi
reinute pe coloan i pentru a pregti coloana pentru o nou separare. Figura de mai jos prezint
cei mai utilizai termeni utilizai n descrierea unei separri cromatografice prin gel filtrare.

Termeniuzualiutilizaingelfiltrare.
Ilustrareatermenilorutilizaingelfiltrare
 Pentru a caracteriza comportamentul unui solut fr a avea o referin la
dimensiunile geometrice ale coloanei sunt utilizate frecvent o serie de variabile.
Ve
Volumul relativ de eluie, , unde
Vo Vo reprezint volumul spaiului gol (denumit
i volumul mort), reprezint volumul de eluie pentru o substan care este
complet exclus din gel Vo este identic cu volumul lichidului interstiial dintre
sferele de suport cromatografic. n unele cazuri inversul volumului relativ de
eluie, R, constanta de retenie este de asemenea utilizat n caracterizarea
unei substane. Constanta de retenie, R este un parametru interesant,
deoarece ea este apropiat de viteza relativ de migrare utilizat n
cromatografia pe strat subire.

Msurareavolumuluideeluie,Ve.
 Ve
Valoarea este uor de calculat. Ea este oarecum
Vo

dependent de modul de mpachetare al coloanei. O

operare la presiune nalt care conduce la un void
volume mic poate s creasc uneori valoarea acestui
parametru. Aceast variaie are totui o importan
minor.
Ve
Raportul Vt (unde Vt reprezint volumul total al patului de
gel), este de asemenea uor de determinat.
Msurtoarea volumului total a patului de gel se
realizeaz, prin umplerea tubului pn la nivelul original
al stratului de gel mpachetat cu ap, determinndu-se
astfel acest volum. Se poate aduga c, n comparaie
cu raportul Ve, variaia raportului Vteste mai mic.
Ve

Vo
 Ilustrarea fenomenului de separare prin gel filtrare.

Astfel, dup mpachetarea coloanei cu mediu

suport ce este alctuit din particule sferice de gel [1],
proba este aplicat pe coloan [2].
Tamponul (faza mobil) i proba se mic de-a
lungul coloanei [3]. Moleculele difuzeaz n i n
afara porilor matrix-ului (fenomen descris de
asemenea drept partiia probei ntre faza mobil i
cea staionar). Moleculele mai mici se vor dispersa
mai mult in interiorul porilor matrix-ului i vor rmne
un timp mai ndelungat pe coloan. Cum tamponul
trece continuu prin coloan, moleculele mai mari
dect porii matrix-ului sunt incapabile s difuzeze n
interiorul acestora, trecnd astfel prin coloan, fr a
fi reinute. Moleculele mai mici difuzeaz n interiorul
porilor i sunt astfel ntrziate n trecerea lor de-a
lungul coloanei [4]. Moleculele mai mari prsesc
primele coloana, urmate de moleculele mai mici, n
ordinea mrimii lor [5]. ntregul proces de separare
are loc la un volum total al tamponului care trece prin
coloan (echivalent cu volumul de suport
mpachetat).
 ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE
EXCLUZIUNE MOLECULAR

n abordarea teoretic a procesului de cromatografie se ia n considerare

faptul c solutul trece printr-un strat cromatografic prin intermediul fazei mobile.
Faza staionar acioneaz n sensul ntrzierii deplasrii solutului prin strat.
Solui diferii sunt ntrziai cu timpi diferii. n cromatografia de partiie, aceast
ntrziere este datorat partiionrii solutului ntre faza mobil i cea staionar.
Viteza cu care solutul traverseaz stratul cromatografic este
proporional cu o fracie de timp, calculat pe baz statistic, n care
moleculele sunt reinute n faza mobil. Aceast fracie de timp pierdut n
faza mobil este determinat ca raportul volumelor de faz mobil
respectiv staionar, alturi de un coeficient de partiie.
Coeficientul de partiie a solutului ntre faza mobil i cea staionar
guverneaz comportamentul cromatografic al solutului, prin ecuaia
fundamental a cromatografiei de partiie. O multitudine de teorii au fost
emise n ncercarea de caracterizare a acestui coeficient de partiie n cazul gel
filtrrii.
 Prima abordare teoretic a comportrii gelurilor n
cromatografie este cea realizat, n anul 1961 de ctre P. Flodin.
El a considerat c partiia moleculelor de solut ntre particulele de
gel i lichidul interstiial este eminamente un efect steric i a
punctat c n mediul nconjurtor imediat apropiat de catene
reticulate de gel suport matrix-ul de gel ocup cea mai mare
parte a spaiului. n aceste condiii, moleculele mari nu pot
penetra n aceste regiuni, n timp ce moleculele mici pot trece
bariera reticulat i astfel se pot apropia mult mai intim. Aceste
restriciisterice, dup Flodin, mpart gelul n regiuni permise i
regiuni interzise moleculelor de solut. Cu ct moleculele de solut
sunt mai mari n dimensiuni, cu att numrul de regiuni interzise
din reeaua matrix-ului este mai mare. n regiunile permise,
concentraia de solut este considerat a fi identic cu cea din
lichidul interstiial. Aceast teorie conduce la definirea constantei
K drept un volum disponibil la o specie molecular dat.
 CURBELE DE SELECTIVITATE

Utilizarea domeniului de mas molecular

pentru mpachetare n cazul cromatografiei de
excluziune molecular este convenional
reprezentat n figura alturat, unde n panelul
(a) e prezentat o curb de calibrare.
n acest caz, masa molecular, care este
ntr-o relaie direct cu mrimea moleculelor de
solut, este plotat (reprezentat) n funcie de
volumul de retenie VR, unde VR este produsul
dintre timpul de retenie i viteza de curgere
volumetric. Se poate nota c scara este
logaritmic. Limita de excluziune definete
masa molecular a speciilor care depesc
domeniulderetenieilacarenusemanifest
nici o reinere pe coloana cromatografic.
Toate speciile care au o mas molecular mai
mare dect limita de excluziune nu sunt
reinute de suport i vor fi eluate mpreun,
rezultndastfelunpeakcomun,peak-ulA,din Odatcuscdereamaseimolecularecomparativcu
panelul (b). limita de permeaie reprezint limitadeexcluziune,moleculelede solutvorstaionadin
astfelmasamolecularsubcaremoleculelede cencemaimult,nmedie,ninteriorulporiloriapoise
solut pot penetra complet n interiorul porilor vor deplasa mai lent. Aceast situaie se manifest n
de gel. Totalitatea moleculelor sub aceast regiuneadepermeaieselectiv,undearelocfracionarea
solutului, ceea ce conduce la separarea pe benzi
masmolecularsuntattdemicinctelevor
individuale a componentelor acestuia. Acest caz este
fieluatecaosingurband,D,dinpanelul(b). prezentatnpanelul(b),peak-urileBiC.
 Coeficientul de partiie (disponibilitate) ntre faza lichid i faza de gel este o
variabil independent n ceea ce privete compactarea stratului de gel.
n practic valorile Vs (volumul fazei staionare) ori Vi (volumul de tampon aflat n
interiorul matrix-ului care este disponibil moleculelor mici, mai bine spus volumul de
eluie a moleculelor care sunt distribuite liber ntre fazele mobil i staionar minus
volumul spaiului gol) sunt dificil de determinat, din aceast cauz este mai
convenabil a se nlocui cu termenul (Vt Vo). Volumul estimat al fazei staionare va
include prin urmare volumul de material solid care formeaz matrix-ul.
Deoarece Kd reprezint fracia de faz staionar disponibil pentru difuziunea
moleculelor date, faza staionar poate fi substituit prin termenul (Vt Vo), n
scopul de a obine valoarea constantei de disponibilitate, Kav.

Ve - Vo
Kav =
Vt - Vo
 Curbele de calibrare experimentale
similare celei ipotetice prezentate n figur
sunt uor de obinut prin utilizarea unor
standarde. Deseori, asemenea curbe sunt
livrate de ctre productorii de suporturi
cromatografice.
Coeficientul de partiie Kav este de
asemenea n relaie cu mrimea
moleculelor ce urmeaz a fi separate.
Moleculele cu forme i densitate similare
demonstreaz o relaie sigmoid ntre
valorile Kav i logaritmul masei lor
moleculare.

Curbelede selectivitate pentru Superdex 30 prep grade, Superdex 75 prep grade

iSuperdex 200 prep grade.
 REZOLUIA DE SEPARARE N CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE MOLECULAR

Succesul unei separri prin cromatografie de excluziune steric depinde n primul

rnd de alegerea condiiilor care conduc la o selectivitate suficient i la o contracarare a
lirii peak-ului, fenomen ce se manifest n timpul separrii. Dup selecia mediului de gel
filtrare cu o selectivitate corect, volumul probei i dimensiunile coloanei devin parametrii
critici ce afecteaz rezoluia de separare.
Rezoluia final, gradul de separare ntre peak-uri este influenat de o multitudine de
factori: raportul dintre volumul probei i volumul coloanei, viteza de curgere, dimensiunile
coloanei, mrimea particulelor suportului cromatografic, distribuia mrimii particulelor,
densitatea de mpachetare, porozitatea particulelor i vscozitatea fazei mobile. Succesul
undi separri prin cromatografie de excluziune molecular depinde n cea mai mare
msur de alegerea condiiilor care s conduc la o selectivitate suficient alturi de
contracararea efectelor de mprtiere a peak-ului n timpul separrii.
Rezoluia este funcie de selectivitatea mediului
suport cromatografic i de eficiena acestuia n
producerea unor peak-uri ct mai nguste (cu o
mprtiere minim a peak-ului) dup cum este ilustrat
n figura alturat.
Eficiena unei coloane mpachetate este definit
drept capacitatea acesteia de a produce peak-uri
nguste i simetrice n timpul eluiei. Eficiena este un
parametru deosebit de important n mod particular n
cromatografia de excluziune molecular deoarece
separarea are loc numai ntr-un volum de tampon egal
cu volumul coloanei, tampon ce traverseaz coloana.
 VOLUMUL PROBEI I DIMENSIUNILE COLOANEI

Volumul probei este exprimat ca procente din volumul total al coloanei

mpachetate. Utilizarea unor probe ct mai mici conduce la evitarea suprapunerii
dac peak-urile sunt prea apropiate. Figura de mai jos arat cum influeneaz
volumul probei n cazul fracionrii de rezoluie nalt
 n mod curent, pentru fracionri este recomandat un volum de
probegalcu0,54%din volumul total al coloanei, acesta depinznd de tipul
de mediu utilizat. Pentru cele mai multe aplicaii, este preferabil ca volumul
probei s nu depeasc 2% pentru a avea o rezoluie maxim. Funcie
specificitatea probei este posibil s se introduc un volum mai mare de prob,
n particular cnd peak-urile de interes sunt bine rezolvate. Din aceast cauz,
volumul probei poate fi determinat numai pe cale experimental.
n cazul separrilor analitice ori n cazul separrii unor probe complexe
este avantajos a se ncepe cu un volum egal cu 0,5% din volumul total al
coloanei. Un volum al probei mai mic de 0.5% nu crete n mod normal
rezoluia. Pentru a crete capacitatea de separare prin gel filtrare, proba poate
fi concentrat. Este preferabil a nu utiliza probe cu o concentraie mai mare de
70mg/mlprotein, datorit efectelor de vscozitate care astfel s conduc la
interferene n separare. Diluia probei este inevitabil datorit fenomenului de
diluie care se manifest la trecerea probei prin coloan. n scopul de a
minimaliza diluia probei, este preferabil a utiliza maximul volum al acesteia
pentru a obine rezoluia maxim necesar ntre peak-urile de interes.
 nlimea patului cromatografic, mpachetat n coloan afecteaz
att rezoluia ct i timpul necesar eluiei. Rezoluia n gel filtrare crete
cu ptratul rdcinii nlimii patului cromatografic. O dublare a nlimii
stratului cromatografic conduce la o cretere a rezoluiei cu un
echivalent de = 1,4 (40%).
n cazul fracionrilor de nalt rezoluie, sunt de preferat coloanele
lungi care vor da cele mai bune rezultate n timp ce o nlime a2 patului
de gel cuprins ntre 3060 cm va conduce la rezoluii satisfctoare. O
nlime suficient a stratului de gel alturi de o vitez sczut de
curgere dau suficient timp tuturor moleculelor intermediare s
difuzezen inafaraporilormatrix-uluicromatograficconducnd
astfel la rezoluii bune. Dac este necesar o coloana este foarte
lung, nlimea efectiv a patului de gel poate fi crescut prin utilizarea
mai multor coloane care conin aceleai suport cromatografic, cuplate n
serie.
 SELECIA SUPORTULUI CROMATOGRAFIC

Selecia corect a gelului suport reprezint o etap critic n

succesuluneiseparrigelcromatografice.Cele mai multe experimente
de excluziune molecular pot fi clasificate n separri de grup i n
fracionri de nalt rezoluie.
Separrile de grup pot fi divizate, funcie de solut, n dou grupe:
fracionri se solui cu mas molecular relativ mic i fracionri se solui
cu mas molecular relativ mare. Exemplele specifice ale acestora sunt
desalifierea soluiilor de proteine sau ndeprtarea unor molecule mici de
contaminani din extracte de proteine sau acizi nucleici.
Pentru separrile de grup, gelul trebuie ales astfel nct s conduc la
o excluziune complet a moleculelor cu mas molecular mare n void
volume. n acest scop sunt recomandate Sephadex G-25, Bio-Gel P-6, i
Sephacryl S-100HR pentru cele mai multe separri de grup. Mrimea
recomandat a particulelor este de 100 - 200 mesh ori particule cu un
diametru de 50 - 150 m.
 Fracionarea implic separarea gupelor de solui cu mase moleculare similare
dintr-un amestec multicomponent. n acest caz, gel trebuie ales astfel ca domeniul
de fracionare s includ masele moleculare dorite a se separa din solut. Dac
amestecul de solut conine macromolecule cu mase moleculare de pn la 120000,
cele mai potrivite suporturi cromatografice sunt
Bio-Gel P- 150,
Sephacryl S-200 HR ori
Sephadex G-150.
n cazul utilizrii Bio-Gel P-100, Sephadex G- 100 sau Sephacryl S- 100 HR o
serie de proteine din prob cu mas molecular mai mare vor elua n void volume.
Pe de alt parte, dac se utilizeaz dac se utilizeaz Bio-Gel P-200, Bio-Gel P-
300 ori Sephadex G-200 acestea vor scdea att rezoluia ct i viteza de curgere.
n cazul n care domeniul de mas molecular a amestecului de solut este
necunoscut, este necesar o selecie empiric a suportului cromatografic. n cazul
celor mai multe fracionri se recomand utilizarea suporturilor cromatografice de
100-200 ori 200-400 mesh (20-80 m ori 10-40 m). n cazul gelurile celor mai fine
este recomandabil a se selecta o vitez de curgere optim. Pentru separri critice,
gradele superfine ofer cea mai bun rezoluie dar vitezele de curgere sunt foarte
sczute.
 APLICAII ALE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUZIUNE MOLECULAR

Cromatografia de excluziune molecular este subdivizat n gel filtrare i n

cromatografie de gel permeaie. Prima utilizeaz solveni apoi suporturi cromatografice
hidrofile. Cel de al doilea tip de cromatografie este bazat pe solveni organici neapoi i
suporturi cromatografice hidrofobe. Aceste metode sunt complementare n sensul c una
este aplicabil pentru probe solubile n ap, n timp ce a doua este aplicabil substanelor
solubile n solveni mai puin polari.
Una dintre cele mai utilizate aplicaii ale excluziune pe baza mesei moleculare este
separarea unor molecule cu mas molecular mare, produi naturali, de speciile de
molecule cu mas molecular mic ori de separarea lor de sruri.

De exemplu, un gel cu o limit de excluziune de cteva mii, poate separa clar, proteine
de aminoacizi i de peptide cu mas molecular mic.
O alt aplicaie a cromatografiei de gel permeaie o reprezint separarea unor omologi ori
a unor oligomeri. Aceast aplicaie este ilustrat n figura de mai jos, unde este prezentat
separarea unor acizilor grai din domeniul de mas molecular 116 - 344 pe un suport pe
baz de polistiren, mpachetat, cu o limit de excluziune de 1000.
 Sephadex-ul poate fi utilizat de asemenea n cromatografia de
excluziune molecular pentru separare n prezena unor solveni
organici precum dimetilformamida, n cazul Sephadex G-10 ori a unor
amestecuri de ap cu alcooli cu caten scurt, n cazul Sephadex G-
10, G-25 i G-50.
Sephadex LH-20 este un suport special conceput pentru
separrile compuilor naturali care necesit prezena unor solveni
organici pentru a le menine solubilitatea. El este utilizat de asemenea
la separarea unor molecule precum sterolii, terpenoidele, lipidele i
peptidele cu mas molecular mic (pn la 35 resturi de aminoacizi).
Toi aceti compui sunt uzual separai prin cromatografie de partiie
lichid-lichid sau prin cromatografie de absorbie. Funcie de solvenii
alei, acest mediu suport poate separa de asemenea componente prin
partiie ntre faza staionar i faza mobil.
Sephadex LH-20 poate prezenta o selectivitate nalt pentru
compui aromatici ntr-o serie de solveni i poate fi utilizat att n
scopuri analitice ct i n cele industriale. El este utilizat att n scopuri
analitice ct i n cele industriale, la separarea unor specii moleculare
nrudite. Datorit proprietilor sale unice acest mediu suport poate fi
utilizat att n timpul purificrii iniiale ct i n faza final de finalizare a
purificrii, de exemplu la separarea diastereomerilor. Funcie de
solvenii alei, Sephadex LH-20 poate de asemenea separa
componente prin partiie ntre matrix i solvent organic. Sephadex LH-
20 manifest att proprieti hidrofilie ct i hidrofobe, ceea ce-i ofer
selectivitate special i astfel are cu o multitudine de aplicaii.
Separrile de grup: componentele probei sunt separate n dou grupuri majore, funcie de
domeniul mrimii lor. O separare de grup poate fi utilizat la ndeprtarea contaminanilor cu
mas molecular mare sau mic (cum ar fi ndeprtarea roului de fenol din fluidele, mediile,
de cultur, desalifiere sau la schimbare a tampoanelor de lucru.
Fracionarea de nalt rezoluie a biomoleculelor: componentele probei sunt separate n
funcie de diferenele n mas molecular. Fracionarea de nalt rezoluie poate fi utilizat n
izolarea unuia sau mai multor componente, la separarea monomerilor din agregate, la
determinarea masei moleculare ori la realizarea analizelor de distribuie a masei.
Gel filtrarea poate fi de asemenea utilizat la facilitarea rempachetrii proteinelor
denaturate prin controlul intim (atent) n schimbarea condiiilor de tamponare.

O cromatogram care ilustreaz o

separare de grup. Proba: =
hemoglobin,x=NaCl.Volumulprobei:
a) = 10 ml, b) = 400 ml. Hemoglobina
esteelutatnvoidvolumulcoloanei(de
exemplu, 370 ml) n timp ce clorura de
sodiu este eluat cu un volum total de
lichid (860 ml). Aproape tot volumul de
pori este utilizat n desalifiere. Coloana
de 85 X 4 cm diametru interior este
mpachetatcuSephadexG-25Medium.
 FRACIONAREA CU REZOLUIE NALT A
MACROMOLECULELOR

DETERMINAREA MASEI MOLECULARE PRIN

ANALIZE DE DISTRIBUIE

Curbdecalibrarepentrudeterminareamaseimoleculareaproteinelorprin
cromatografiedeexcluderesteric.SuportulcromatograficesteSephadex G-100.
 CROMATOGRAFIAPLANARLICHID-LICHID

Principial, n cromatografia de partiie lichid-lichid sunt utilizate dou faze

lichide, o faz legat la un suport inert, denumit faz staionar i o alt faz
lichid, denumit faz mobil care traverseaz faza staionar i care distribuie
componente solutului, n aceste dou faze.
Componentele solutului prezint solubilitate n cele faze.
Procesul care se produce este deseori complicat de apariia
unor fenomene de adsorbie a substanelor i a fazei mobile de ctre suportul
inert.
Cromatografia de partiie se poate realiza pe coloane de pudr
de celuloz, dar cele mai comune i utilizate metode sunt cele care utilizeaz
ca suport hrtia (cromatografia pe hrtie) ori un strat subire de silicagel sau
alumin depus pe un suport solid de tipul sticlei, foliei de aluminiu sau din
material plastic (cromatografia pe strat subire, thin-layer chromatography,
TLC).
 Celuloza, ca i ali polimeri naturali ori sintetici, poate lega o
cantitate mare de ap. Astfel procesul de separare
cromatografic va implica partiia componenilor probei ntre
apa (solventul apos) legat de suportul inert (faza staionar)
i solventul de developare (faza mobil).

Frecvent, unul din componentele de developare l

reprezint apa.
n condiiile n care ntre ap i componentul organic
exist fenomenul de nemiscibilitate, este adugat un al treilea
component (solvent) care este capabil s se amestece att cu
apa ct i cu primul component organic, pentru a se crea o
singur faz organic de solvent. Este cazul etanolului din
sistemul ap:etanol:nitrometan, unde etanolul este capabil s
se dizolve att n ap ct i n solventul organic, de exemplu.
 Metodele de cromatografie planar includ:
cromatografia pe strat subire,
cromatografia pe hrtie i
electrocromatografia.
Oricare dintre aceste metode utilizeaz un strat subire relativ
plat care reprezint el nsui suportul cromatografic (de exemplu,
hrtia) ori pe suprafaa cruia se afl depus acest suport.
Faza mobil se deplaseaz prin faza staionar sub aciunea
forei de capilaritate, a forei gravitaionale ori sub un gradient de
potenial.
 Cromatografia pe strat subire

Din punct de vedere teoretic al tipurilor de faz mobil i staionar

utilizate n cromatografia pe strat subire, exist o similare deosebit cu
cromatografia lichid pe coloan. O caracteristic important a
cromatografiei pe strat subire (thin layer chromatography, TLC) o reprezint
faptul c ea servete drept ghid n dezvoltarea condiiilor optime de realizare
a separrii prin cromatografie lichid pe coloan. Avantajele utilizrii acestui
procedeu l reprezint viteza i preul sczut ale experimentelor exploratorii
pe strat subire.
O serie de experimentatori, de fapt, efectund experimente de
cromatografie pe strat subire i formeaz o opinie n efectuarea
experimentelor urmtoare pe coloan. n plus, la utilizarea acestei metode la
dezvoltarea metodelor cromatografice pe coloan, TLC a devenit o metod
comun n industria medicamentului, pentru determinarea puritii
produselor.
 Ea este rspndit chiar i n laboratoarele clinice i
reprezint baza multor studii biochimice i biologice. n plus,
metoda este larg utilizat n laboratoarele industriale. Drept
consecin a acestei largi arii de aplicare, s-a estimat c
numrul de analize efectuate prin cromatografie pe strat subire
este cel puin egal cu cel realizat prin cromatografie lichid de
nalt performan.
n mod clasic separrile prin cromatografie pe strat subire
sunt realizate pe suporturi din sticl, folie de aluminiu ori plastic
care sunt acoperite cu un strat subire i aderent de de particule
fine; acest strat reprezint suportul inert.
Particulele sunt similare celor utilizate n cromatografia de
adsorbie, partiie normal sau invers, cromatografie de
excluziune molecular. Fazele mobile sunt similare celor
utilizate n cromatografia lichid de presiune nalt.
Domeniileactualedeaplicarealecromatografieipestratsubire
Domenii de aplicare Tipul de analize
Aplicaii clinice Lipide
Studii metabolice
Screening-ul unor medicamente
Control antidrog (antidopping)
Aplicaii industriale Dezvoltarea proceselor i optimizarea lor
Monitorizarea unor procese
Validarea unor procese
Industrie alimentar Controlul calitii
Aditivi (de exemplu, vitamine)
Pesticide
Teste de stabilitate (expirare)
Medicin legal Detectarea unor documente false
Investigaii n otrviri
Analize de vopsele
Aplicaii farmaceutice Teste de control al uniformitii
Analiza identitii sau puritii
Teste de stabilitate
Analize de mediu Ap
Sol
Analize de reziduuri
 SUPORTURI CROMATOGRAFICE
Suporturile utilizate n cromatografia pe strat
subire sunt comercializate n dou forme, pentru
cromatografie pe strat subire convenional i
cromatografie pe strat subire de nalt performan.
Primele posed un strat subire de 200-250 m
nlime care conine particule cu o dimensiune de 20
m sau mai mari.
Suporturile de nalt performan posed un
suport cromatografic de 100 m nlime cu diametrul
particulelor de 5 m sau mai mici. Suporturile de
nalt performan, dup denumire, conduc la
separri precise, n interval de timp scurt. Astfel
suporturile cromatografice convenionale posed
2000 de talere teoretice pe o distan de 12 cm, ntr-
un timp de developare ce cca. 25 minute. Suporturile
cromatografice de nalt performan prezint 4000
de talere teoretice pe o distan de 3 cm. care
necesit circa 10 minute pentru dezvoltare, dar au
ns dezavantajul unei capaciti reduse n ceea ce
privete volumul probei adugate.
 n mod diferit de cromatografia lichid de presiune nalt i de gaz cromatografie unde faza
mobil reprezint un parametru ce poate fi uor meninut la o vitez specificat, n cromatografia pe
strat subire vitezafazeimobilenupoatefingeneralcontrolatnafardecazulncarese
utilizeaztehnicadedeveloparecucurgereforat.
Viteza de curgere este afectat de natura suportului cromatografic (porozitate, mpachetare,
mrimea particulelor, etc.) ct i de proprietile fazei mobile (vscozitate, tensiune de suprafa,
presiunile de vapori ale solvenilor, etc.). n general viteza scade n timpul dezvoltrii plcii
cromatografice (figura de mai jos).
Datorit fenomenului de cretere a rezistenei fazei staionare fa de curgerea fazei mobile, n
condiiile utilizrii unor suporturi de cromatografie pe strat subire de performan nalt, se pot
obine rezultate superioare numai n cazul unor distane scurte de developare.
n condiiile meninerii altor parametrii constani, rezoluia Rs a doi compui este mai
dependent de poziia lor relativ pe cromatogram (RF) dect de distana de migrare a frontului
(distana de developare).

Relaia dintre distana de

developare i timpul de
developare n condiiile utilizrii
unui suport de silicagel HPTLC
silicagel 60. Faza mobil:
toluen/acetat de etil (1) i acetat
deetil/metanol/ap/acidformic(2).
 PERFORMANELE SUPORTURILOR DE
CROMATOGRAFIE PE STRAT SUBIRE

Majoritatea termenilor i relaiilor care caracterizeaz cromatografia pe coloan, pot

fi adaptai, uor, cu mici modificri, cromatografiei pe strat subire. Un termen nou,
factorul de retardare, RF este necesar a se prezenta n contextul cromatografiei pe strat
subire.
Cromatografia pe strat subire pentru un singur
solut este prezentat n form de cromatogram
figura de mai jos. Factorul de retardare pentru un
singur solut este dat de relaia:

unde dR i dM reprezint distanele lineare msurate

de la linia de start pn la mijlocul spotului
respectiv pn la frontul de solvent. Valorile pentru
RF pot varia de la 1 pentru soluii care nu sunt
ntrziai i care migreaz odat cu frontul pn la
o valoare apropiat de 0, pentru soluii care nu
interacioneaz cu faza mobil. Trebuie notat c
dac spoturile nu sunt simetrice, cum de altfel se
ntmpl frecvent, msurarea dR se efectueaz de
la linia de start pn n punctul de maxim
intensitate al spotului.
 Variabilele care influeneaz factorul de retenie

Pentru a obine cele mai corecte valori ale RF, este nevoie de o
precizie mare i o mare reproductibilitate. Cei mai importani factori de
care depinde exactitatea (determinare magnitudinii RF), includ
grosimea stratului de suport, deci a fazei staionare, contaminarea
(coninutul n umiditate) a fazelor mobil i staionar, temperatura,
gradul de saturaie a camerei de developare cu vapori de faz mobil
ori mrimea probei. Un control complet al acestor factori variabili nu
sunt n general controlabili n condiii practice. Ameliorarea parial a
acestor efecte poate fi deseori realizat totui prin substituirea cu un
factor relativ de retenie RX a factorului de retardare, RF care reprezint
raportul dintre distana parcurs de analit i distana parcurs de o
substan standard.
 Aplicaii ale cromatografiei pe strat subire

Datele obinute dintr-o singur cromatogram de obicei nu

furnizeaz informaii suficiente pentru a permite identificarea
diverselor specii prezente ntr-un amestec din cauza variabilitii
valorilor RF cu mrimea probei, stratul subire cromatografic i
condiiile existente n timpul cromatografierii. n plus, ntotdeauna
exist posibilitatea ca doi solui diferii s manifeste proprieti
cromatografice asemntoare, cu valori RF identice sau foarte
apropiate n condiiile de separare date.
Autentificareauneisubstaneprinutilizareauneistandard.

O metod care deseori furnizeaz date importante n tentativa identificrii unor

componente din prob este cea de aplicare pe placa cromatografic a unui spot cu
conine un compus din specia cutat purificat ce este probabil prezent n cea
necunoscut. Se compar apoi valorile RF ntre spotul substanei necunoscute cu cel
al standardului. Valorile identice ale celor dou RF furnizeaz o dovad solid a
identitii celor dou componente ale probei (figura de mai jos). Totui, confirmarea
este ntotdeauna necesar. Un test uor de confirmare este de a repeta experimentul
cu faze mobile i staionare diferite ct i cu reactivi de vizualizare diferii.

Separarea unor derivai xantinici pe un

suport de cromatografie pe strat subire
tip C-18 de faz invers. Faza mobil:
metanol/ K2HPO4, 0,l M (55:45 v/v).
Detecie: vapori de iod. Timpul de
separare cromatografic: 1 or, valorile
RF: teobromin, 0,68; teofilin, 0,56;
cafein, 0,44; 3-izobutil-1-metil xantin,
0,21.
 Cromatografiaplanarbidimensional
Figura de mai jos ilustreaz separarea unor aminoacizi dintr-un amestec prin
cromatografiere n dou dimensiuni. Proba se plaseaz n colul unei plci cromatografice
de form ptrat. Cromatografierea se realizeaz n direcie ascendent, n solventul A.
Acest solvent este apoi ndeprtat prin evaporare iar placa cromatografic este rotit cu 90 o,
dup care se cromatografiaz ascendent cu solventul B.

Cromatogrambidimensionalpestrat
subire(silicagel)aunoraminoacizi.
SolventulA:toluen/2-cloretanol/piridin.
SolventB:cloroform/alcoolbenzilic/acid
acetic.Aminoacizi:(1)acidaspartic,(2)acid
glutamic,(3)serin,(4)-alanin,(5)glicine,
(6)alanin,(7)metionin,(8)valine,(9)
izoleucini(10)cistein.
 Analizecantitative

O estimare semicantitativ a cantitii de

component prezent poate fi obinut prin
compararea ariilor spoturilor cu cea a
standardelor. Date mai exacte pot fi obinute prin
rzuirea spotului de pe placa cromatografic,
urmat de extracia sa de pe aceasta dup care
se recurge la msurarea printr-o analiz fizico-
chimic convenabil. A treia metod este cea
care se realizeaz prin scanarea cu ajutorul unui
densitometru i care se preteaz la determinri
ale radiaiei emise de spot, prin fluorescen ori
prin reflecie
 Cromatografiaplanarnlaboratorulclinic

n laboratoarele clinice, estimarea acizilor

liberi n fluidele biologice i esuturi prin
cromatografiei n strat subire conduce la
AMINOACIZI punerea unor diagnostice n maladii
congenitale ale metabolismului
aminoacizilor, cistinuria clasic, cistinuria
heterozigot, aminoacidopatii, sindrom
Alport,.etc.

n scopuri clinice, msurarea acizilor biliari

ACIZI BILIARI din specimene biologice (bil, ser, coninut
duodenal i extracte fecale proaspete)
conduce la punerea unui diagnostic n
cazul unor maladii hepatice i intestinale
 Multe maladii sunt nsoite de intensificarea eliminrii unor diverse
CARBOHIDRAI zaharuri n probele biologice. Detecia i identificarea lor constituie o
etap important n stabilirea diagnosticului.
Profilurile lipidice se modific n diverse patologii, ceea ce conduce la
interesul crescut n determinarea lor n diagnosticul clinic.
Investigarea lipidelor serice, n special a esterilor de colesterol reprezint
LIPIDE o valoare mare n diagnosticul unor maladii hepato-funcionale ori n maladiile
legate de metabolismul lipidic. n maladiile legate de stocarea lipidelor,
acumularea de colesterol se manifest la nivelul sngelui i a esuturilor. O
hiperlipidemie este corelat cu factorii de risc n maladiile cardiovasculare.
Analiza lipidelor serice este de asemenea important n maladiile pielii.
FOSFOLIPIDE
 Porfirinele sunt derivai tetrapirolici cu o structur porfinic, fiind
intermediari chimici n sinteza hemoglobinei, mioglobinei ori a altor
pigmeni respiratori, precum citocromii. Detecia i identificarea
porfirinelor i ai precursorilor acestora n probele biologice sunt de o
PORFIRINE importan terapeutic uria. Ele sunt analizate n chimia clinic n
scopul diagnosticrii unui grup de maladii denumite porfirinemii,
rezultate ale alterrii biosintezei hemului. Acumularea i supraproducia
a acestor produi intermediari n esuturi, snge, urin ori n fecale
indic blocarea metabolic n sinteza hemului. Aceste maladii sunt
asociate cu manifestri acute i/sau cutanate.

Prostaglandine reprezint una dintre cele mai biologic active

familii de compui. Ele sunt acizi grai C20 nesaturai cu un
PROSTAGLANDINE
inel ciclopentan. Derivaii care conin aceast structur
(prostaglandine, prostacicline i tromboxani) sunt cunoscui
sub denumirea comun de prostanoizi.
Prostaglandine se manifest la concentraii de ordinul
nanogramelor pn la cel al picogramelor, n esutul uman i
n fluidele corporale. Ele au diverse aciuni biologice iar rolul
lor fiziologic complet nu este nc bine cunoscut.
Hormonii steroizi joac un rol vital n
organismul uman, fiind definii prin funcia
lor biologic. Nivelurile hormonilor steroizi
activi din ser i produii lor de eliminare din
urin sunt de mare semnificaie clinic.
Hormonii glucocorticoizi contribuie la activitatea adipogenic n
serul uman. Maladia Addisons este cauzat de deficien
glucocorticoidic n timp ce n sindromul Cushings se constat o
HORMONI secreie masiv.
STEROIZI Concentraiile de steroizi estrogenici din urina uman sunt
importante n analiz n timpul sarcinii. Progesterona este de
asemenea implicat n pregtirea i meninerea sarcinii. Niveluri
crescute ale pregnan-3, 20-diol i allopregnan-3, 20-diol
urinare au fost observate n sarcinile timpurii. Creterea 6-
hidroxicortizolului urinar este observat n timpul sarcinii ori n
cazuri de hiperadrenocorticism. Aldosterona urinar este analizat
n scopul identificrii pacienilor suferinzi de hiperaldosteronism.
Excreia urinar de metabolii andro- i glucocorticoizi este
studiat la pacieni suferinzi de cancer gastric n timp ce excreia
de dehidroepiandresteron, i n particular eticolanolon reprezint
un marker n cancerul de sn.
 ALI COMPUI DE INTERES CLINIC

Gangliozidele reprezint un grup variat de glicosfingolipide compuse dintr-

o caten lung de baz i acid gras, care mpreun formeaz partea
ceramidic (N-acilsfingozina). Aceasta este legat de un carbohidrat.
Gangliozidele sunt caracterizate de prezena uneia sau mai multor uniti de
acid sialic n catena oligozaharidic. Compuii de baz sunt acidul N-
acetilneuraminic (Neu5Ac) i acidul N-glicolilneuraminic (Neu5Gc), despre care
se cunoate c joac roluri cruciale n diverse funcii biologice. Gangliozidele
sunt localizate pe partea extern a membranei plasmatice, reprezentnd un
mic procent din lipidele totale. Ele au fost de asemenea identificate n asociere
cu organitele celulare. Gangliozidele au un rol important n recunoaterea
celul-celul, adeziune celular, modularea proliferrii i diferen ierii celulare,
fiind expresate la niveluri nalte pe suprafaa celulelor umane, cel mai adesea
n esuturile nervoase.
 STUDII DE BIODISPONIBILITATE

Exist o experien deosebit n utilizarea cromatografiei pe

stat subire n analiza medicamentelor ori a drogurilor din probe
biologice din medicin, toxicologie, farmacologie, medicin legal,
etc. Analizele de medicamente ori droguri se realizeaz n probe
biologice diverse: snge, urin, saliv, coninut gastric, esuturi,
etc. iar tipul i cantitatea de prob luat n analiz este funcie de
substana care se dorete a fi determinat. De exemplu, n
screening-ul abuzului de medicamente se utilizeaz urina
deoarece modalitatea de achiziie a specimenului este non-
invaziv iar cele mai multe medicamente pot fi detectate chiar
dup o durat rezonabil de timp de la ingestie.
 Analiza drogurilor n laboratoare clinice se realizeaz prin numeroase
tehnici precum imunoanaliza, metode cromatografice ori de spectrometrie de
mas; alegerea optim de analiz depinde de cost, efort uman ori tipul de
medicament. Dintre tehnicile cromatografice, cromatografia pe strat subire cu
suport de silicagel este deosebit de utilizat n cazul programelor de screening
pentru medicamente. Toate probele care se analizeaz, sunt supuse unei
trepte de pre-purificare, naintea trimiterii lor la analizele cromatografice. S-a
dezvoltat o metod computerizat de identificare a post cromatografic a
tipurilor de compui, procesul fiind utilizat la studiile de screening a unor noi
medicamente. Programul computerizat prelucreaz datele cromatografice
obinute experimental cu cele obinute pentru medicamente ori droguri
cunoscute ori a metaboliilor acestora regsii n ser, urin, ori alte specimene.

Cromatografia pe strat subire rmne cea mai utilizat tehnic n studiile de

toxicologie i n programele de screening de abuz de drog/medicament.
Sistemele de eluie recomandate sunt: acetat de etil/metanol/hidroxid de
amoniu pentru opioizi i droguri de baz, cloroform/aceton pentru
barbiturice i alte droguri acide, heptan/eter etilic/acid acetic i
cloroform/metanol/hidroxid de amoniu pentru canabinoizi.
 APLICAII MODERNE ALE CROMATOGRAFIEI PLANARE

Cromatografia pe strat subire reprezint metoda cea mai utilizat metod

de detecie, separare i monitorizare a fosfolipidelor i a glicosfingolipidelor
precum i a unor compui de sintez ori a unor metabolii ai acestora. n
particular, procedeul cromatografic pe strat subire acoperit cu anticorpi
monoclonali a contribuit la dezvoltarea analizelor structurale a
glicosfingolipidelor. Exist o serie de dificulti n extracia lipidelor prin
utilizarea suporturilor cromatografice pe strat subire de performan nalt
deoarece contaminarea silicagelului i datorit scurgerii stratului subire de
silicagel n timpul tratamentului. Dac glicosfingolipidele sunt transferate de pe
placa HPTLC pe o membran de plastic cu proprieti hidrofobe, aceast
dificultate este surmontat.
 Folosind avantajul
unei bune separri a
lipidelor pe un suport
HPTLC i de imobilizare a
acestora pe o membran
s-a dovedit c transferul
optim se realizeaz pe
membrane de difluorur
de poliviniliden (PVDF),
comparativ cu
membranele de
nitroceluloz, utilizate
iniial care s-au dovedit a
avea o eficien de
transfer sczut, fr
reproductibilitate.
Membranele de PVDF
sunt foarte stabile la
nclzire i la diferii
solveni organici iar n plus
Reprezentareaschematicametodeidetransfer
rein lipidele cu o eficien
depesuportulcromatograficpeomembran
deosebit.
sintetic,TLCblotting
 Aceast metod a fost de numit tehnica de transfer de pe suportul
cromatografic, pe membrane sintetice, TLC blotting. Procedeul este
utilizat n studiul complexelor lipidice i este aplicabil n cercetarea
biochimic a lipidelor. Printre utilizrile procedeului amintim:
Purificri de laborator a complexelor lipidice;
Analize de spectrometrie de mas a complexelor lipidice, pe
membrane PVDF;
Analize de legare a microorganismelor pe membrane cu un lipid
imobilizat;
Studiul interaciilor lipidprotein pe membrane, cu un lipid
imobilizat.
Analize TLC blotting/spectrometrie de mas
 IMUNOCOLORAREA MEMBRANELOR DE DIFLUORUR DE POLIVINILIDEN.

Antigenii lipidici pot fi imunocolorai, direct pe membran.

Dup transfer, membranele de difluorur de poliviniliden sunt
imersate ntr-o soluie de albumin seric bovin pentru a
bloca legarea nespacific a proteinelor dup care se
incubeaz peste noapte n soluia anticorpului primar.
Legarea primului anticorp la antigenul lipidic se detecteaz
prin reacia cu un al doilea anticorp (de obicei IgM anti-
oarece) ce este cuplat cu peroxidaz. Tratamentul cu
substrat al acestei enzime conduce la produi colorai care se
vor evidenia specific la locul de legare al primului anticorp.
Limita inferioar de detecie pe membrane de PVDF este de
aproximativ 1/5 din antigen, din cea de detectare pe placa
cromatografic ceea ce indic faptul c glicosfingolipidul este
concentrat numai pe o parte a membranei alturi de faptul c
nu se manifest nici un fenomen de natur chimic n timpul
procesului de transfer.
 TLC BLOTTING N PURIFICAREA COMPLEXELOR LIPIDIC

A fost dezvoltat o tehnic de purificare a glicosfingolipidelor i a

fosfolipidelor, care utilizeaz tehnica de TLC blotting de pe plcile de
cromatografie pe strat subire de performan nalt. Astfel, glicosfingopidele
sau fosfolipidele separate pe plci HPTLC sunt evideniate cu un reactiv pe
baz de primuline (C21H14N3NaO3S3, alte denumiri comerciale Direct Yellow 59,
Primuline Yellow, etc.) care permite detecia cu mare sensibilitate a
componentelor lipidice (figura de mai jos.). Primulinele sunt derivai de
dehidrotiotoluidin, formai printr-o reacie de fuziune cu para toluidin i sulf, la
temperatur nalt.
 Gel-filtrarea pe strat subire

Caracterizarea structural a prii carbohidrat a unei glicoproteine implic

determinarea a mrimii unitii zacharidice. Acest parameteru este uzual calculat din
compoziia i masa molecular a glicopeptidelor care sunt obinute dup degradarea
proteolitic a glicoproteinei intacte. Masa molecular este n mod obinuit estimat prin
metode precum echilibrul de sedimentare prin ultracentrifugare i cromatografia de gel
filtrare.
Tehnica de gel filtrare pe strat subire a devenit o alternativ atractibil de
determinare a maselor moleculare a glicopeptidelor datorit vitezei, adaptabilitii la
cantiti mici de prob, marii puteri de rezoolvare, posibilitii de utilizare a unor solveni
denaturani, i a utilizrii unei aparaturi ieftine. Aceast tehnic a fost dezvoltat pentru
estimarea masei moleculare a unor proteine (> 12.000 daltoni) utiliznd solveni
nedenaturani ori denaturani.
 CROMATOGRAFIACUFAZINVERSPECOLOANAPROTEINELOR

Cromatografia de nalt rezoluie cu faz invers reprezint o

tehnic bine stabilit de izolare, i de analiz a peptidelor i proteinelor.
Utilizarea sa n izolarea unei proteine ori de purificare a prezentat un
maximum de interes n purificarea acestora pn n momentul dezvoltrii
unor suporturi de cromatografie de schimb ionic ori de interacie
hidrofob de nalt eficien.
n prezent sunt realizate suporturi de cromatografie de schimb ionic
ori de interacie hidrofob apte a realiza nivele de rezoluie echivalente
cu cele obinute prin cromatografia de nalt rezoluie cu faz invers,
fr a prezenta riscul de denaturare a probei i astfel de pierdere a
activitii biologice.
Cu toate acestea exist o multitudine de aplicaii n care denaturarea
probei poate fi neglijat ori pot fi tolerate concentraii crescute de
modificator organic (este cazul analizelor de puritate, studii structurale
ori purificri micropreparative naintea microsecvenierii).
Tehnica este deseori utilizat n biotehnologie n monitorizarea unor
procese, studii de puritate sau de determinri ale stabilitii.
 Cromatografia de nalt rezoluie cu faz invers
Aplicarea unui gradient de solvent este n mare superioar eluiei izocratice
deoarece se realizeaz ntr-un cadru de timp rezonabil iar mprtierea peak-
ului este redus, ceea ce crete sensibilitatea metodei. n eluia n gradient n
cazul cromatografiei de nalt rezoluie cu faz invers, proteinele sunt reinute
esenial pe baza caracterului lor hidrofob. Mecanismul de retenie poate fi
considerat att un fenomen de adsorbie a solutului la suprafaa fazei
staionare hidrofobe ct i un proces de partiie ntre faza mobil i cea
staion.
n primul caz, retenia este legat de suprafaa total interfacial a
suportului mpachetat de faz invers, fiind exprimat prin coeficientul de
adsorbie, KA. Retenia se bazeaz pe asocierea hidrofob ntre solut i liganzii
hidrofobi de pe suprafa. Prin creterea triei solventului a fazei mobile, forele
de atracie sunt din ce n ce mai reduse proces ce conduce la eluia solutului.
Procesul poate fi privit ca fiind condus n mod entropic i endotermic, de
exemplu, att S ct i H sunt pozitive. Prin relaia dintre factorul de
capacitate a solutului k i proprietile fazelor mobil i staionar, teoria
solvofobic permite predicia efectulului modificatorului organic al fazei mobile,
tria ionic, reactivul de mperechere a ionului, tipul de ligand al suportului
mpachetat precum i alte variabile ce implic retenia cromatografic a
proteinelor.
 n al doilea caz se consider o partiionare a solutului ntre fazele
mobil i staionar, ultima fiind vzut ca o faz ncrcat hidrofob. Acest
sistem se aseamn cu un sistem bifazic n-octanol/ap a crui selectivitate
este exprimat prin coeficintul de partiie P a solutului. n esen, procesul
efectiv este n mare parte dependent de organizarea molecular a catenei n-
alchil a catenei legate n structura suportului de faz invers n stare
solvatat, de mrimea i conformaia solutului.
RETENIA PROTEINEI N CAZUL CROMATOGRAFIEI DE NALT
REZOLUIE CU FAZ INVERS ESTE GUVERNAT N PRINCIPAL DE
SUPRAFAA PROTEINEI I NU DE CHIMIA SUPRAFEEI SUPORT.

Dei o serie de proteine prezint o pierdere a activitii n timpul

cromatografiei de nalt rezoluie cu faz invers, altele i menin total
activitatea biologic. Astfel, forele hidrofobe necesare legrii de faza invers
competiioneaz cu cele necesare meninerii structurii secundare i teriare a
proteinei. Prin constrngeri sterice, hidrofobe i ionice aceste proprieti
structurale definesc o suprafa cromatografic sau o amprent a proteinei care
la rndul ei definete legarea de faza invers. Acest concept al atarii
multipunctuale a proteinei la suprafeele de adsorbent este consecvent cu o
amprent cromatografic relativ mare pentru o protein comparativ cu cea a unei
molecule mici.
 Componentul organic al fazei mobile
Cei mai populari solveni organici sunt acetonitrilul, 1-propanolul i
2-propanolul (alcoolul izopropilic). Propanolii sunt mult mai vscoi
dect acetonitrilul i de aceea se constat o mai mare presiune pe
coloan ns acest fenomen nu este important n condiiile n care se
utilizeaz viteze de curgere mici i coloane cromatografice scurte.
Concentraia de acetonitril necesar eluiei unei proteine este
considerabil mai mare dect concentraia echivalent de 2-propanol,
aproximativ jumtate fa de primul solvent.
S-a evideniat de asemenea c acetonitrilul este n mod intrinsec
mult mai denaturant dect alcoolii, procesul de recuperare fiind deseori
mai mare cnd se utilizeaz faze mobile care conin propanol, n special
n cazul n care se separ o serie de proteine precum ovalbumina.
Acetonitrilul i 2-propanolul pot fi ngheai n amestecuri ghea
carbonic/amestecuri de alcooli i astfel probele pot fi liofilizate.
n separri, toi solvenii trebuie s fie de cea mai nalt calitate
posibil.
 Aditivi minori la faza mobil
Componenii minori cei mai utilizai n cromatografia de nalt rezoluie
cu faz invers sunt acizii perfluoroalcanoici (acid trifluoroacetic - TFA i
acidul heptafluorobutiric, de exemplu). Acetia par a disocia - solubiliza
proteinele n majoritatea solvenilor organici utilizai n mod curent.
TFA este preferat n comparaie cu ali acizi disociatori deoarece este
complet volatil i nu va coroda coloana de oel.
TFA acioneaz de asemenea ca un agent de mperechere de ioni,
slab hidrofob. Cele mai multe coloane utilizate n cromatografia de nalt
rezoluie cu faz invers sunt pe baz de silice i pe lng supresia ionizrii
silanolului n condiii acide (i n consecin eliminarea interaciilor ionice)
ele sunt mult mai stabile la valori sczute de pH. Totui, trebuie avut n
vedere c multe polipeptide i vor pierde structura teriar la aceste pH-uri.
 Cromatografia cu faz invers ofer dou capabiliti importante n purificarea i izolarea unor
proteine sau peptide pentru analizele de proteomic, dup cum urmeaz:
nalt rezoluie.
Compatibilitate cu spectroscopia de mas.
Proteinele i peptidele ce difer printrun singur rest de aminoacid pot fi deseori separate prin
cromatografie de nalt performan cu faz invers (RP-HPLC), dup cum se observ nfigura de
mai jos.
Literatura tiinific conine multe exemple de separare a unor polipetide similare precum
separarea factorului insulin-like de cretere ce difer printr-o metionin oxidat de analogul
neoxidat ori a interleukin-2 muteinelor ce difer printr-o substituie la un singur aminoacid. n alt
caz, s-au separat variante de insulin care posed uoare diferene n secvena de aminoacizi.

Separarea variantelor de insulin (n ordinea

deeluie:pui,bovin,ovin,deiepure,deom,
porcin, de obolan tip I i de obolan tip II).
Insulina de iepure conine o reonin, iar cea
deomoserin,odiferendeogruparemetil
ntr-o protein de 5300 daltoni. Condiii de
separare prin RP-HPLC:coloanC4, separare
n gradient de acetonitril cuprins ntre 27% i
30% acetonilitril in H2O, n prezena a 0,1%
TFA,vitezdecurgere1,5ml/min.
 Mecanismul separrii polipeptidelor prin cromatografie cu faz invers

Cromatografia cu faz invers separ polipeptide printr-un mecanism complex, de

adsorbie, dei n cazul moleculelor mici, acestea sunt separate printr-un mecanism
de echilibru care distribuie moleculele ntre fazele staionar i mobil n timpul
trecerii lor prin coloan, n timp ce polipeptidele mici fiind prea mari pentru a
ptrunde n faza staionar hidrofob, sunt adsorbite de suprafa i desorbite odat
cu creterea concentraiilor (polaritilor) de faz mobil (figura de mai jos).

MecanismulretenieideproteineprinRPC.Proteineleptrundncoloanisuntadsorbitela
suprafaa hidrofob. Datorit mrimii lor, numai o poriune a acestor proteine braul
hidrofobseleaglaadsorbent.Laadugareaunorconcentraiiprecisedesolventorganic
proteinelesunteliberateiprsescsuprafaacoborndde-alungulcolonei.
 n momentul injectrii pe coloan, polipeptidele se leag la suprafaa
adsorbentului i se desorb numai cnd solventul organic atinge o concentraie
specific i unic. Odat desorbite, ele vor interaciona foarte slab cu suprafaa
adsorbentului fiind astfel eluate le-a lungul coloanei. Polipeptidele pot fi
imaginate ca o aluviune pe faza staionar, cu cea mai mare parte a moleculei
expus la faza mobil i numai o parte a moleculei, denumit picior hidrofob, n
contact cu suprafaa de faz invers.
Diferenele n braul hidrofob al polipeptidelor rezult din secvena de
amioacizi i din diferenele de conformaie (fenomen discutat n cazul
hidrofobicitii proteinelor). Desorbia are loc ntr-o fereastr ngust de
concentraie al unui modificator organic. Astfel, retenia polipeptidelor este
complet pn la atingerea unei concentraii critice de modificator organic cnd
acestea sunt rapid desorbite. Sensibilitatea desorbiei unui polipeptid la o
concentraie precis de modificator organic conduce la selectivitatea RPC n
separarea polipeptidelor, n peak-uri n general nguste. Peptidele mici se
desorb mai rapid odat cu schimbarea concentraiei de modificator organic
dect moleculele mici, totui, ele se desorb mai gradual dect proteinele ceea
ce sugereaz un mecanism hibrid de separare.
 CROMATOGRAFIACUPERECHIDEIONI

Cromatografia cu perechi de ioni este un tip de cromatografie de faz invers

utilizat la separarea i determinarea unor specii ionice. Faza mobil n cromatografia
cu perechi de ioni este constituit din tampoane apoase care conin un solvent organic
precum metanolul ori acetonitrilul i un compus ionic care conine un contraion cu
sarcin opus analitului. Contraionul este un ion care se combin cu ionii analitului
pentru a forma o pereche de ioni, neutr, specie care se reine pe un suport de faz
invers.

Sistemecromatograficecufazinverspentruperechideioni.

Tipul fazei
Proba Faza mobil Contraion
staionare
Amine HClO4, 0,1 M /H2O/acetonitril CIO4- FLa
H2O/CH3OH/H2SO4 C12H25SO3- FL
Acizi carboxilici pH 7,4 (C4H9)4N+ FL
pH 7,4 (C4H9)4N+ Lb

Acizi sulfonici H20/C3H7OH (C16H33)(CH3)3N+ FL

pH 7,4 (C4H9)4N+ Lb
pH 3,8 Bis-(2-etilhexil)fosfat Lc
Colorani pH 2-4;H20/CH3OH (C4H9)4N+ FL
 CROMATOGRAFIADEADSORBIE

Cromatografia de adsorbie, ori

cromatografia lichid-solid, reprezint
forma clasic a cromatografiei lichide, care
a fost introdus, pentru prima dat, de
ctre Tswett, la nceputul secolului
douzeci. n ultimii ani ea a fost adaptat,
devenind o metod important n
cromatografia lichid de nalt presiune
(HPLC).
 n cromatografia de adsorbie compuii ce se doresc separai sunt adsorbii pe
suprafaa unui material solid, fiind apoi desorbii din solidul adsorbent prin eluie cu un
solvent. Separarea compuilor depinde de balana relativ dintre afinitatea compuilor
pentru adsorbent i solubilitatea lor n solventul utilizat. Afinitile relative ale compuilor
ce se doresc separai sunt funcie de natura chimic a substanei, de natura solventului
i de natura adsorbentului.

Cromatografia de adsorbie:A= adsorbent, S

= prob, ES = solvent de eluie. (1) aplicarea
probei la captul superior al coloane
cromatografice; (2) adsorbia probei pe
suportul adsorbent. (3) adugarea de solvent
de eluie;. (4) i (5) fracionarea parial a
componentelor 2 si 3; (6) fracionarea
completaprobei;(7)i(8)Separareatuturor
celor trei componente la diverse stadii de
eluie; (9) eluia primului component de pe
coloan.
 Adsorbenii solizi utilizai n mod obinuit sunt alumina, silicagelul,
crbunele, celuloza, amidonul, gelurile de fosfat de calciu sau hidroxilapatit i
sucroza. n cromatografia modern fazelele staionare cel mai mult utilizate n sunt
silicea i alumina, ultima dintre acestea fiind cea mai preferat n cele mai multe
aplicaii datorit capacitii sale nalte de ncrcare cu prob i datorit domeniului
larg de forme utilizabile.
Solvenii obinuit utilizai sunt:
hexanul, benzenul, eterul de petrol, dietil eterul, cloroformul, clorura de
metilen, diveri alcooli (etil, propil, n-butil i t-butil alcooli), alturi de diferite
tampoane apoase i sruri, unele n combinaie cu solvenii organici.
Cu puine excepii, caracteristicile de adsorpie a dou substane se pot
compara, ordinea timpilor de retenie fiind: olefine < hidrocarburi aromatice <
halide, sulfuri <eteri < nitro-compui < esteri aldehide cetone < alcooli amine
< sulfone < suloxizi <amide <acizi carboxilici (suprafeele de silice i alumin sunt
nalt polare, eluiile efectundu-se n mod obinuit cu faze mobile oarecum mai
puin polare.
Astfel, o serie de cercettori trateaz cromatografia de adsorpie drept un
tip de cromatografie de faz normal.
 APLICAII ALE CROMATOGRAFIEI DE ADSORBIE

Tehnicacromatografiedeadsorbieesteceamaifezabilpentrucompuinepolari
careposedmasemolecularemaimicide5000.
Cutoatecexistosuprapunerentrecromatografiadeadsorbieiceadepartiie,
metodeletindaficomplementare.

O aplicaie caracteristic a
cromatografieideadsorbiensepararea
cis-itrans-pirazolinelor.Coloan:100x
0.3 cm, suport silice pelicular. Faz
mobil: clorur de metilen/izooctan
50%/50%.Temperatura:ambiant.Vitez
de curgere: 0,225 mL/min. Detector: UV,
254nm.
 CROMATOGRAFIA PE HIDROXIAPATIT

O condiie necesar n oricare strategie de purificare a

proteinelor o reprezint combinarea tehnicilor care
exploateaz diferite principii de separare n scopul
atingerii purificrii celei mai nalte utiliznd un numr
ct mai redus de trepte de purificare. n general,
combinri ale unor tehnici precum cromatografia de
schimb ionic, cromatografia de interacie hidrofob,
cromatografia de afinitate, cromatografia de afinitate cu
metal chelat, cromatografia de excluziune molecular i
cromatografia de faz invers ofer cele mai versatile
abordri n design-ul unui protocol de purificare a
proteinelor. Aceasta este datorat faptului c metodele de
separare au la baz principii bine caracterizate i
predictibile.
Pentru o multitudine de raiuni, cromatografia pe
hidroxilapatit (HAP) a cptat numai o popularitate
marginal ca metod de purificare a proteinelor. Ea prezint
comportament cromatografic nepredictibil, o capacitate
relativ mic de ncrcare a probei i proprieti de
manipulare relativ dificile. Pentru aceste raiuni, HAP este
deseori considerat drept ultima alegere in metodologia de
separare a proteinelor. Pe de alt parte, cum procesele de
adsorbie-desorbie a proteinelor difer semnificativ de alte
tehnici precum de exemplu cromatografia de schimb ionic,
uneori este posibil de a obine fracionri a cror calitate nu
poate fi realizat prin alte tehnici cromatografice, unde
deseori tehnicile cromatografice convenionale pot fi de
nefolosit.
 Fosfatul de calciu a fost deseori utilizat n purificarea
proteinelor i a enzimelor cu succese diferite nc de la
nceputul cercetrii tiinifice n domeniu, de ctre Brucke
(1861) n purificarea pepsinei. n anul 1956, Tiselius i
colaboratorii (1956) au artat c un suport cromatografic mai
adsorbent de proteine este realizat prin conversia brushitei,
Ca3(PO4)2, la hidroxiapatit, Ca5(PO4)3OH, (Ca10(PO4)6(OH)2)
prin fierbere ntr-o soluie de NaOH 1% timp de 1 or. n
continuare, cristalele fine de hidroxiapatit pot fi separate prin
decantare nainte de mpachetarea coloanei. Hidroxiapatita
leag mai puternic proteinele native, iar capacitatea de retenie
scade semnificativ n cazul proteinelor supuse procesului de
denaturare. Retenia proteinelor pe suportul de hidroxiapatit
nu este uor predictibil, precizabil.
 Dei hidroxiapatita leag att proteine acide
ct i pe cele bazice nu se poate vorbi de un
mecanism simplu de cromatografie prin schimb
ionic n comportamentul cromatografic observat.
Structura de suprafa a cristalelor de
hidroxiapatit este reprezentat de un mozaic de
situsuri de adsorbie pozitive (ionii de calciu) i
negative(ioniifosfat).
Adsorbia unor componeni anionic se realizeaz
la domeniul de sarcini pozitive reprezentat de ionii de
calciu (situs C), n timp ce domeniile de sarcini
negative ce cuprind ionii fosfat (situsurile P) pot fi
considerate drept schimbtoare de cationi. Se poate
considera astfel HAP drept o tehnic cromatografic
de "pseudo-afinitate" sau drept o metod de
cromatografie de schimb ionic de tip "mixt". La valori
de pH neutre i alcaline, suprafaa de hidroxiapatit
este ncrcat negativ datorit gruprilor fosfat.
 MECANISMUL LEGRII PROTEINELOR LA HIDROXIAPATIT
Mecanismul legrii proteinelor la hidroxiapatit i de eluie de pe aceasta a fost
explicitat de ctre Gorbunoff. El se manifest prin:
(1)complexarea specific a gruprilor carboxil proteice cu locii de calciu ale
cristalelor de hidroxiapatit (de exemplu complexe, [HACa-OOC-protein]) i prin
(2)atracia nespecific dintre gruprile amino ncrcate pozitiv ale proteinelor i
sarcinile negative ale hidroxiapatitei (complexe de tipul [HAPO3---H3+N-protein]).
Astfel, suprafaa cristalelor de hidroxiapatit prezint un mozaic de situsuri pozitive (de
calciu) i negative (de fosfat), suprafaa coloanei de hidroxiapatit poate fi vzut ca
negativ la un pH egal cu 6.8, la care coloanele de HAP se manipuleaz n general,
datorit neutralizrii pariale a locilor pozitivi de calciu de ctre ionii fosfat (figurademai
jos).

Legarea proteinei la hidroxiapatit. A reprezint o

protein bazic n timp ce B este o protein acid.
Parantezele duble indicat fenomenul de repulsie n
timp ce liniile punctate sunt legturile ionice. Sgeata
triunghiularindiclegturilecoordinati
 n aceste condiii, eluia de pe coloan poate fi afectat att ca rezultat
al interaciilor nespecifice ionice de (de tipul Debye-Huckel) ori ca rezultat
al dezlocuirii specifice ale gruprilor proteice de pe situsul C al
hidroxiapatitei cu care au fost complexate. Din aceste consideraii rezult
c:
Proteinele bazice pot fi eluate de pe mediile de hidroxiapatit cu
soluii cu molariti foarte sczute (de exemplu 0,005M) de sruri de Ca2+ i
de Mg2+,
Proteinele cu valori ale pI cuprinse ntre 5 i 8, cu soluii de MgCl2
1,0 M, i,
Proteinele acide cu soluii fosfat 0,3 M.

n general, HAP este realizat prin eluie n gradient linear (deseori creat n
domeniul 10 pn la 400 mM) tampon fosfat, la un de pH 6,8, alctuit din
amestecuri echimoleculare de fosfai sodiu ori potasiu mono i dibazici.
Deoarece hidroxiapatita este stabil numai la valori ale pH-ului mai mari de 5,
tampoanele de eluie cu pH acid nu trebuiesc s fie utilizate.
 APLICAII ALE CROMATOGRAFIEI PE HIDROXIAPATIT

n tehnicile de cromatografie pe hidroxiapatit, coloana este de obicei echilibrat, n timp ce

proba este aplicat la o concentraie mic de tampon fosfat la un pH de 6,8. Proba de pe coloan
este apoi developat cu un gradient de concentraie de tampon fosfat. n funcie de aplicaie, n
unele cazuri, un foarte ngust gradient (de exemplu ntre 0,02 la 0,05 M fosfat) conduce la rezultate
excelente, n timp ce n alte situaii este necesar un gradient mare, cuprins de exemplu ntre 0,02 i
0,35 M fosfat pentru a separare optim. Figura urmtoare. ilustreaz tehnica de purificare a
ovomucoidului comercial prin cromatografie pe coloan de HAP.

Purificarea ovomucoidului
comercial pe o coloan de
hidroxiapatit. Treapta I conine
material inactiv cu un maximum de
absorbie la 260 nm; pe parcursul
trepteiaIIaseseparovomucoidul
n form activ; volumul III conine
lizozim; ulima treapt - IV conduce
la separarea unor impuriti, de
tipultripsineiichimotripsinei.
 Ovomucoidul comercial
conine o multitudine de
impuriti precum lizozim,
ovoinhibitor, conalbumin i
ovalbumin. Profilul
cromatografic din figur arat
c la aplicarea a dou probe
de ovomucoid la o coloan
de HAP echilibrat cu 0,001
M NaCl, splarea coloanei cu
NaCl 0,001 M, urmat de
eluia n trepte cu 0.01 M
PO4, pH 6,8 (pentru a elua
ovomucoidul, o glicoprotein
cu o structur deschis), 0;5
M NaCl (pentru a elua
proteinele bazice precum
lizozimul i ovoinhibitororul) i
0,5 M PO4 (pentru a epuiza
coloana de alte proteine
acide) conduce la obinerea
ovomucoidului ntr-o form
nalt purificat.
 ghiddeutilizareaHAPncromatografie

n cazul amestecurilor de proteine n mare parte bazice sau dac se

dorete reinerea proteinelor bazice fr o pierdere a proteinelor acide,
coloanele se echilibreaz cu fosfat, 0,001 M, pH 6.8.
n scopul separrii unor amestecuri de proteine n general acide n
special n cazul glicoproteinelor (sau dac una din proteinele pe care dorim
a se reine este acid, n timp ce este posibil pierderea unor proteine
neutre i acide, se utilizeaz coloane echilibrate cu NaCl (NaCl 0,001 M
netamponat).
Se utilizeaz coloane echilibrate cu MgCl2 sau CaCl2 (MgCl2 0,001 M
sau CaCl2 netamponate) numai pentru proteinele acide care nu se leag la
coloane echilibrate cu NaCl.
Dac proba a fost ncrcat, coloana trebuie s se spele utiliznd
acelai tampon care a fost utilizat la echilibrarea coloanei. n general n
procedurile de eluie este necesar a se urmri separarea proteinelor n
ordinea: proteinele bazice se elueaz nti, apoi proteinele neutre i n final
cele acide.
 :
Dac se urmrete purificarea unor proteine individuale se utilizeaz n general
sistemul de tampon fosfat, la o concentraie potrivit (cu sau fr prezena unei alte
sruri). Deoarece NaCl nu reuete de multe ori s elueze multe proteine neutre ori
acide, este necesar deseori a se crea un gradient de NaCl, de obicei cuprins ntre 0,01 -
0,5 M NaCl, n cazul purificrii proteinelor bazice de pe HAP.
n unele cazuri, deoarece att NaCl ct i sulfatul de amoniu nu afecteaz eluie
proteinelor neutre sau acide pe HAP, o prob proteic provenit de pe o coloan de
schimb ionic developat cu un gradient de NaCl poate fi ncrcat direct pe o coloan de
HAP.
n acest context se poate exemplifica purificarea proteazelor din
microorganisme halofile prin cromatografie pe HAP n prezena unei soluii de NaCl
de o concentraie de 3,4 M. Alte exemple de purificare a proteinelor pe coloan de
HAP sunt reprezentate de izoformele ceruloplasminei umane, anticorpi monoclonali,
tubulin, histone din cromatin, fumarazele citosolice i mitocondriene din drojdia de
bere, etc.
Hidroxiapatita a fost utilizat cu succes n prezena detergenilor neionici (de
exemplu, Triton X-100) pentru purificarea proteinelor membranare precum i a proteinei
transportoare ADP/ATP, proteinei transportoare a ionului fosfat, a ubiquinol:citocrom c
reductazei ori a citocrom c oxidazei.
 CROMATOGRAFIA DE INTERACIE HIDROFOB.

Adsorbia proteinelor prin cromatografie de interacie hidrofob (Hydrophobic Interaction

chromatography, HIC) este favorizat de concentraii nalte de sruri care structureaz apa. n mod
echivalent, contribuia srurilor a fost aplicat i altor clase de adsorbeni amfifilici ce nu sunt
analogi direci HIC.
n 1990, Porath a introdus termenul de cromatografia de adsorbie promovat de condiiile
saline (salt-promoted adsorption chromatography, SPAC) pentru a regrupa aceste tehnici
cromatografice ce necesit concentraii nalte de sruri pentru a determina adsorbia unei proteine.
Cromatografiadeadsorbietiofilic(thiophilic adsorption chromatog-raphy, TAC), cromatografia
donoracceptor de electron (electron donoracceptor chromatography, EDAC) i cromatografia
de interacie hidrofob (HIC) au fost aadar incluse n aceast familie. Efectul srii asupra
adsorbiei proteinei a fost explicat ca fiind rezultatul unor creteri nefavorabile ale energiei libere,
G, pentru proteinele nelegate n prezena unor concentraii nalte de sruri. Consecina
termodinamic a acesteia o reprezint favorizarea legrii proteinei la un ligand din cauza unei arii
de suprafa mai mic a complexului expus solventului i a cosolventului, altfel spus, forma legat a
proteinei este termodinamic mai stabil. Eluia proteinei de pe matrice este apoi realizat simplu,
prin suprimarea srii din tamponul de adsorbie. n HIC, interaciile hidrofobe se manifest ntre
zone hidrofobe aflate pe suprafaa proteinei i liganzii hidrofobi, legai la suport.
 Primele geluri cu aplicaii practice
pentru HIC au prezentat un caracter mixt,
hidrofob. Adsorbenii neutrii (alchil i aril
eteri) au fost apoi preparai, ultimii
conducnd la introducerea suporturilor
octil- i fenil- activate, curent utilizate n
acest moment.

Porath i colaboratorii au descoperit

adsorbia tiofilic pe suporturi
mercaptoetanoldivinil sulfon agaroz
(geluri T). Mecanismul de adsorbie a fost
interpretat ca implicnd ataarea proteinei
n dou puncte, la -mercaptoetanol i la
braul de spaiere divinlsulfonic, posibil
printr-o interacie electron donoracceptor
tiofilic. Studii ulterioare au demonstrat
caracteristici similare de adsorbie la geluri
activate cu epiclorhidrin la care s-a cuplat
2-mercaptopiridin.
 S-a mai artat c adsorbia promovat de condiiile saline a fost eficient n
favorizarea adsorbiei proteinelor pe un gel cyanocarbon substitut,
tricyanoaminopropendivinil hidroxipropilsulfon agaroz (DVSTCP gel) prin intermediul
unor interacii electron donoracceptor.
Toate gelurile sus-menionate necesit concentraii mari de sruri structurale de ap
pentru a favoriza legarea proteinelor, cu toate c mecanismele de interacie sunt diferite:
adsorbie specific hidrofob, interacie tiofilic, respectiv interacie electron donor
acceptor.

Cromatografia de interacie hidrofob posed avantajul c hidrofobicitatea

proteinelor conduce la separarea lor pe baza interaciilor hidrofobe dintre liganzi
hidrofobi imobilizai i regiunile nepolare de pe suprafaa proteinelor. Adsorbia
crete odat cu creterea concentraiei de sare n faza mobil iar eluia se
realizeaz prin scderea concentraiei de sare a eluentului. Din acest motiv, se
poate utiliza i termenul de adsorbie dependent de sare pentru acest tip de
cromatografie.
 Diferitele tipuri de eluie pot fi utilizate pentru purificarea
amestecurilor complexe de proteine care ar fi dificil de separat utiliznd
alte tehnici cromatografice. De fapt, HIC a fost utilizat cu succes n
scopuri de separare pe baza existenei unor caracteristici
complementare de legare fa de alte tehnici de cromatografiere a
proteinelor.
Van Oss i colaboratorii au artat c forele van der Waals sunt
factorii majori ce contribuie la interaciile hidrofobe (fore interfaciale) n
ciuda mecanismului complex implicat. Astfel, alterarea structural a
biomoleculelor este minim i activitatea lor biologic este
meninut prin utilizarea HIC, dat interaciei mai slabe dect cea
regsit n cazul interaciei afine, schimbului de ioni sau a
cromatografieidefazinvers(RPC).
HIC reprezint o cale alternativ de exploatare a proprietilor
hidrofobe a proteinelor, realizat ntr-un mediu mai polar i mai puin
denaturant dect RPC, dup cum aceast tehnic necesit utilizarea
unor solveni nepolari pentru eluia proteinelor datorit legrii puternice
la adsorbent.
 Cromatografia de interacie hidrofob a fost descris
pentru prima dat de ctre Tiselius n 1948, care a notat
faptul c o serie de compui precum coloranii pot fi reinui
de ctre hrtia de filtru n prezena unor soluii de sulfat ori
de fosfat, fenomen denumit cu expresia de cromatografie de
extracie cu ajutorul srurilor (salting-out chromatography).
Dup cum i numele o sugereaz, HIC este o tehnic de
separare bazat pe interaciile dintre proteine i o faz
staionar insolubil, nepolar imobilizat. HIC este
complementar cromatografiei de schimb ionic i
cromatografiei de excludere molecular, iar mpreun
cu tehnicile de separare mai sus enumerate reprezint
cele trei mecanisme distincte i generale de retenie
disponibile unui biochimist pentru purificarea
proteinelor n aplicaiile proteomice. Cromatografia
lichid de nalt performan cu faz invers (RPC) poate fi
aplicat serial la fraciile colectate dup HIC i cromatografia
de schimb ionic pentru purificarea ulterioar sau de
ndeprtare a srurilor.
 Cu toate c att HIC ct i cromatografia cu faz invers sunt metode de separare bazate pe
interacia proteinelor cu gruprile hidrofobe ale fazei staionare sunt bine de cunoscut diferenele
fundamentale ce exist ntre ele. n HIC, interaciile slabe hidrofobe dintre proteine i faza nepolar
staionar sunt mediate prin concentraii mari de sruri antichaotrope (Figurademaijos) n timp
ce n cromatografia de faz invers (RPC) aceste interacii sunt mediate prin intermediul
modificatorilor organici.

Reprezentarea schematic a principiului de

separare prin HIC. Dup cum srurile neutre conduc
la precipitarea proteinelor, concentraiile mari de
sruri conduc la apariia unor interacii ntre zonele
hidrofobe de pe suprafaa proteinelor ceea ce are ca
rezultat precipitarea acestora din soluiile apoase.
Totui, prin creterea concentraiei de sruri chiar
pn la punctul de precipitare, prin utilizarea unor
concentraiimaidiluatedeproteiniprinexpunerea
soluiei proteice la o matrice slab hidrofob
imobilizat, proteinele se leag la matricea de pe
coloan mai uor dect s precipite. Sub aceste
condiii proteinele i menin conformaia nativ (de
exemplu proprietatea biologic). Aceasta este o
consideraie important n condiiile purificrii unor
enzime, eficiena separrii putnd fi realizat prin
monitorizareaactivitiilor.
 Mai puin probabil n cazul RPC, unde fazele mobile i organice au tendina
de a deplia (dezmembra, denatura) proteinele, faza staionar mpachetat i
condiiile de operare ale HIC sunt alese astfel nct menin proteinele n
conformaiile lor native, biologic active. n HIC, liganzii slab hidrofobi (comparativ
cu mpachetrile din RPC), cum ar fi gruprile nepolare cu caten scurt fenil ori
octil, sunt ataate chimic la matrice hidrofile, cnd se manifest interacii distincte
ntre proteine i suprafaa fazei staionare, prin utilizarea unei faze mobile ce
conine sruri antichaotrope de trie ionic mare. Contrar RPC, n cazul HIC sunt
utilizate densiti sczute de ligand pe matricea mpachetat (deseori o zecime
fa de suporturile utilizate n RPC).
n decursul ultimilor ani, HIC a fost dezvoltat de ctre muli cercettori iar
astzi reprezint o tehnic bine stabilit i deosebit de util n tehnicile de
separare cromatografic din laborator sau n procesele industriale de purificare a
proteinelor. Dezvoltarea unui numr mare de faze staionare diferite a condus la o
cretere a aplicaiilor HIC n purificarea unor biomolecule, precum proteine serice,
proteine nucleare, hormoni, proteine recombinante i enzime.
 CROMATOGRAFIA DE ADSORBIE TIOFILIC

Importana atomilor de sulf pentru n cromatografia de adsorbie prin intermediul

unui ligand a fost recunoscut acum 40 de ani. Adsorbia aromatic a fost atunci un
fenomen studiat i s-a descoperit c ea este mediat prin imobilizarea de grupri 2,4-
dinitrofenil n timp ce un efect sinergistic de adsorbie a fost evideniat n condiiile n
care ligantul a coninut un atom de sulf n locul unuia de oxigen, aflat n apropierea
inelului aromatic. Aceasta a fost una dintre primele indicaii c atomul de sulf, ca parte a
ligandului are un efect de adsorbie a solutului. Tria acestei interacii a aprut
dependent de substituenii electrofili i nucleofili ai inelului aromatic; n fapt, s-a dovedit
c adsorbia are la baz formarea de complexe electron donoracceptor.
Asocierea dintre sorbenii tiofili i separarea imunoglobulinelor s-a realizat odat cu
demonstrarea acestei proprieti de ctre Porath i colaboratorii (1985) i a fcut posibil
fracionarea proteinelor plasmatice prin cromatografie pe sorbeni, derivai din agaroz,
realizai n urma reaciei dintre divinilsulfon i 2-mercaptoetanol. Dup aceasta, acest
mod de separare a fost deseori aplicat n purificarea anticorpilor deoarece sorbentul
prezint specificitate clar pentru acest tip de proteine. Aceast descoperire a
reprezentat o etap important n dezvoltarea metodelor de separare a anticorpilor
implicnd, drept liganzi cromatografici, o mare varietate de structuri chimice care conin
atomi de sulf i de azot, avnd diferite nivele de selectivitate.
 Structural, cei mai obinuii sorbeni pentru cromatografia de adsorbie tiofilic deriv din
aa-numitul gel B; care conine liganzi lineari, cu doi atomi de sulf. Aceti derivai au fost gsii
destul de buni n legarea selectiv a imunoglobulinelor, n prezena unor concentraii mari de
sruri formatoare de structur a apei, denumite de altfel sruri liotrope, de tipul sulfatului de
amoniu sau sulfatului de sodiu. Din punct de vedere al acestei trsturi, cromatografia de
adsorbie tiofilic se aseamn cu cromatografia de interacie hidrofob: adsorbia este
favorizat de concentraii mari de sruri, eluia realizndu-se n condiiile n care concentraia lor
este redus. Totui, n cazul cromatografiei de adsorbie tiofilic nu se pot manifesta asocieri
hidrofobe sau interacii ionice cu sorbenii tiofilici deoarece structurile tio-etilsulfonice nu posed
o hidrofobicitate pronunat, pe de o parte i nu conin sarcini electrice, pe de alt parte.
Cromatografia de adsorbie tiofilic, descris de ctre Porath, s-a artat a fi de real folos n
purificarea anticorpilor monoclonali i n general n fracionarea proteinelor.
Matricele tiofilice de afinitate sunt cuplate cu ajutorul unor liganzi cu urmtoarea
structur chimic:

(M)atrice-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-X-Y

unde M reprezint matricea de agaroz iar X reprezint S, N ori O, iar Y este un rest
mic, alifatic, sau un heteroatom
 Principiul operaional care st la baza cromatografiei de adsorbie tiofilic se
aseamn cu cel al cromatografiei de interacie hidrofob. Astfel, proteinele sunt legate
la trii ionice mari i eliberate n urma scderii triei ionice. Fa de matricele tradiionale
hidrofobe precum fenil-Sepharose sau octil-Sepharose, matricele tiofilice conduc la
randamente nalte de separare ct i la separri n zone nguste, avnd drept
caracteristic o afinitate nalt fa de imunoglobulinee i sczut fa de
albumine.

Cromatografia de adsorbie tiofilic este descris ca o metod de purificare a

anticorpilor monoclonali murini din supernatantul unor culturi celulare. n acest caz se
utilizeaz sulfat de potasiu n concentraie de 0,5M n tamponul de legare, obinndu-
se imunoglobuline de nalt puritate. Totui datorit concentraiei tipice sczute
anticorpilor monoclonali din supernatantul unor culturi celulare, capacitatea matrix-ului
este n consecin, de asemenea sczut. Capacitatea de legare a anticorpilor
monoclonali diluai poate fi crescut cu un factor de 10 sau mai mult prin schimbarea
srii liotrope din tamponul de legare, adic prin utilizarea sulfatului de amoniu i n
acelai timp prin creterea concentraiei sale pn la 1,0-1,2M
Purificareaanticorpilormonoclonaliprincromatografiedeadsorbietiofilic.Seilustrareaz
legrea,splarea ieluia.Etape:ILegarealaconcentraiemarede(NH 4)2SO4,deexemplu,
1,2M (NH4)2SO4 II eluia la o concentraie sczut de (NH4)2SO4, de exemplu 0,8M (eluia
impuritilor).IIIeluiaanticorpuluimonoclonalpurificatrealizatcuTRIS/HCI0,05M,pH9,0.
 CROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC

Cromatografia de schimb ionic (ion-exchange chromatography, IEC), denumit uneori i

cromatografie ionic (IC), se refer la metodelemoderne i eficiente de separareideterminare
a speciilor ionice, pe rini schimbtoare de ioni. Cromatografia de schimb ionic a fost iniial
dezvoltat la miljocul anilor 70 cnd s-a artat c un amestec de anion ori de cationi poate fi rapid
rezolvat pe coloane de cromatografie ori de nalt performa, mpachetate cu un suport alctuit
dintr-o rin schimbtoare de ioni, anioni ori cationi. n acel moment, detecia se realiza n general
prin msurtori conductometrice. Astzi, sunt disponibile diverse detectoare utilizate n
cromatografia de schimb ionic.
Schimbul ionic este probabil cea mai frecvent utilizat tehnic cromatografic pentru
separarea i purificarea proteinelor, polipeptidelor, acizilor nucleici, polinucleotidelor, a altor
biomolecule ncrcate electric. Raiuniunea pentru succesul cromatografiei de schimb ionic este
reprezentat de generala sa aplicabilitate, puterea sa matre de rezoluie i marii sale capaciti, a
simplicitii, reproductibilitii i controlabilitii ei.

Cromatografia de schimb ionic reprezint o variant a cromatografiei de adsorbie n

care adsorbentul solid posed grupri chimice ncrcate electric legate covalent la un
suport solid, inert. Ionii sunt legai electrostatic la gruprile ncrcate electric; aceti ioni
pot fi schimbai cu ionii aflai ntr-o soluie apoas. Schimbtorii de ioni sunt cel mai
frecvent utilizai n coloane, pentru a separa moleculele funcie de sarcin; deoarece
moleculelencrcateelectricse leaglaschimbtorulde ionireversibiliastfelelepotfi
legateorieluateprinschimbareatrieiionicesauapH-uluisolventuluideeluie.
 Dou tipuri de schimbtori de ioni sunt disponibile: unii care posed grupri funcionale legate
chimic, cu sarcini electrice negative denumii schimbtori cationici i alii care posed grupri
funcionale cu sarcini electrice pozitive denumii schimbtori anionici. Sarcinile de pe schimbtori
sunt balansate de ctre contraioni de tipul ionilor clorur n cazul schimbtorilor anionici i de ioni
metalici n cazul schimbtorilor cationici. Moleculele din soluie, care vor fi adsorbite pe schimbtori
au de asemenea sarcini nete care sunt i ele balansate de ctre contraioni. De exemplu, dac se
analizeaz un proces de schimb ionic i se consider c moleculele din soluie au sarcini negative
(X-), acestea sunt contrabalansate de ionii de sodiu (Na+). Astfel de molecule ncrcate electric
negativ pot fi cromatografiate pe un schimbtor anionic (A+), care posed ioni de clorur drept
contraioni pentru a se neutraliza i a produce A+Cl-. Cnd moleculele (Na+X-) din soluie
interacioneaz cu un schimbtor de ioni, X- dislocuie ionul clorur, Cl-, de pe schimbtor i se
leag electrostatic, formndu-se A+X-, simultan cu eliberarea ionilor de sodiu. Acest proces de
schimb ionic este ilustrat n figura de mai jos. Un proces similar, dar opus, se va produce pentru
molecule ncrcate pozitiv (Y+CI-), care se vor cromatografia pe un suport cu sarcini electrice
negative. Acesta este cazul schimbtorilor cationici (C-Na+), unde schimbtorii cationici vor lega
moleculele ncrcate pozitiv din soluie.

Schema unui proces de schimb ionic:

moleculele (Na+X-) din soluie
interacioneaz cu un schimbtor de
ioni,X-dislocuieionulclorur,Cl-,depe
schimbtor i se leag electrostatic,
formndu-se A+X-, simultan cu
eliberareaionilordesodiu.
 ECHILIBRUL DE SCHIMB IONIC
Procesele de schimb ionic se bazeaz pe un echilibru de schimb dintre ionii din soluie i
ionii de acelai semn de pe suprafaa unui suport insolubil, cu mas molecular mare.
Schimbtorii naturali de ioni precum cleiurile i zeoliii au fost recunoscui i utilizai de
mult vreme. Rinile schimbtoare de ioni sintetice au fost produse pentru prima dat
la mijlocul anilor 1930 pentru dedurizarea i deionizarea apei ori pentru purificarea unor
soluii. Cele mai comune situsuri active ale unor rini schimbtoare de cationii sunt
gruprile sulfonil acide - SO3H+, puternic acid i carboxil acid, -COO-H+, slab acid.
Schimbtorii anionii conin grupri amino teriare -N(CH3)3OH-, puternic bazic, ori
grupri amino primare -NH3OH-, slab bazic.
n cazul n care un schimbtor de ioni de tipul acid sulfonic este adus n contact cu un solvent
apos care conine un cation, Mx+, se produce un echilibru de schimb ce poate fi descris prin reacia:

- + x+ - x+ + unde RSO-3H+ reprezint una din multitudinea

x RSO 3 H + M (RSO 3) x M + xH de grupri sulfonice ataate pe o
solid solutie solid solutie macromolecul polimeric.

n mod similar, un schimbtor bazic puternic interacioneaz cu un anion Ax- dup reacia:

+ x-
xRN(CH3)OH + Ax- [RH(CH3) 3]x A + xOH
solid solutie solid solutie
 Ca un exemplu de aplicare a legii masei la un echilibru de schimb ionic, se consider pe
coloan are loc o reacie ntre un ion monovalent, B+ cu o grupare acid-sulfonic prezent pe
suportul cromatografic. Din considerente de neutralizare, retenia iniial a ionilor B + se realizeaz
la captul superior al coloanei dup reacia:

unde (s) i (aq) delimiteaz faptul c sistemul conine o faz solid, respectiv apoas. Eluia
cu o soluie diluat de acid clorhidric, de exemplu, modific echilibrul din ecuaia 1 n partea
stng, ceea ce conduce la transferul parial a ionilor B + din faza staionar n faza mobil. Aceti
ioni coboar apoi de-a lungul coloanei printr-o serie de transferuri ntre fazele staionar i mobil.
Constanta de echilibru Kex, pentru reacia de schimb prezentat n ecuaia1 ia forma:

unde [RSO3B+]s i
[RSO3H+]s reprezint
concentraiile (strict
sub form de activiti)
Dup rearanjare rezult:
ale ionilor B+ i H+ n
faza solid.
 n timpul eluiei, concentraia ionilor de hidrogen din faza apoas este mult mai mare
dect concentraia ionilor de compus B, monovalent din faza mobil. Pe lng aceasta,
schimbtorul posed un numr enorm de situsuri de schimb ionic comparativ cu numrul
de ioni B+ ce pot fi reinui. Astfel, concentraia total a ionilor, [H+]aq i [RSO-3H+]s nu este
afectat de schimburile din ecuaia 1 ce descrie reacia global. Pentru acest motiv, n
condiiile n care [RSO-3H+]s >> [B+]aq termenii din dreapta ecuaiei 3 sunt n mod
substanial constani i astfel se poate scrie:

unde K reprezint constanta ce corespunde

constantei de distribuie descris anterior. Astfel,
toate ecuaiile descrise n tratarea teoretic din
primul capitol pot fi aplicate cu succes.
 Se poate nota c Kex din ecuaia 2 reprezint afinitatea rinii pentru ionul B+ comparativ cu un
alt ion (n cazul de fa, H+). n condiiile n care Kex este mare, se poate spune c exist o puternic
tendin a fazei solide de a reine B+; n cazul n care Kex este mic, efectul este diametral opus.
Prin selecia unui ion comun de referin precum H+, se pot compara experimental rapoartele de
distribuie pentru diveri ioni pe un tip dat de rin schimbtoare de ioni. Experimentele relev c
ionii polivaleni sunt mai puternic legai dect speciile cu o singur sarcin electric. Pentru un
numr de sarcini date, totui, apar diferene care sunt legate de mrimea ionului hidratat precum i
de alte proprieti. Astfel, pentru o rin schimbtoare de ioni sulfonat, clasic, obinuit, valorile
Kex scad n ordinea: Tl+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+. Pentru cationii divaleni,
ordinea este: Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO22+.
n cazul anionilor, Kex pentru o rin bazic scade n ordinea: SO42-> C2O4- > I- > NO3- > Br- >
Cl- > HCO2- > CH3COO- > OH- > F-. Aceast serie este oarecum dependent de tipul de rin i de
condiiile de reacie, putnd fi considerat numai aproximativ.

Separarea prin cromatografie de schimb ionic depinde de adsorbia reversibil a

moleculelor de solut ncrcate electric la gruprile de semn contrar imobilizate pe
schimbtorul de ioni. Cele mai multe experimente sunt realizate n cinci etape
importante, ilustrate n figuraurmtoare.
 Principiul comatografiei de schimb
ionic realizat prin eluie n gradient de
sare(salin)

Prima etap o reprezint echilibrarea n care schimbtorul de ioni este adus n starea de start
n termeni de pH i trie ionic, stare ce va permite legarea moleculelor de solut. Gruprile
schimbtoare de ioni sunt asociate n acest moment cu contraionii de schimb (uzual anioni ori
cationi simplii, precum ionii clorur sau de sodiu).
Cea de a doua etap o reprezint aplicarea i adsorbia probei, n care moleculele de solut
care posed sarcini corespunztoare, ajung i dislocuie contraionul, legndu-se reversibil la suport.
Substanele nelegate vor fi eluate de pe schimbtor utiliznd acelai tampon de start.
n etapa a treia, substanele sunt ndeprtate de pe coloan prin schimbarea condiiilor de
eluie nefavorabile pentru legarea ionic a moleculelor de solut.
Aceast eluie implic n mod normal creterea triei ionice a tamponului de eluie sau
schimbarea pH-ului acestuia. n figura de mai sus, desorbia se realizeaz prin introducerea unui
gradient cresctor de sare, ceea ce conduce la eliberarea moleculelor de solut de pe coloan n
ordinea triei legrii lor, substanele cele mai slab legate elund primele.
Etapele a patra i a cincea sunt cele de ndeprtare de pe coloan a substanelor care nu au
fost eluate n condiiile experimentale anterioare i de reechilibrare a coloanei pentru un nou proces
de purificare.
 Separarea este astfel obinut datorit diferenelor
de interacii dintre un schimbtor de ion cu molecule cu
densiti diferite de sarcin i de distribuie a acestora pe
suprafaa lor. Figuraalturat prezint schematic modul
de legare a unor molecule cu sarcini diferite. Aceste
interacii pot fi controlate prin variaia condiiilor precum
tria ionic ori a pH-ului. Diferenele n proprietilor
electrice ale compuilor biologici sunt deseori
considerabile, din aceast cauz cromatografia de
schimb ionic este capabil s separe specii cu foarte
mici diferene n proprieti, de exemplu dou proteine
care difer numai printr-un aminoacid ionizabil, motiv
pentru care aceast tehnic este deosebit de important
n analiza biochimic.

Reprezentarea schematic a diferenei de legare i

de eluie ale unor molecule cu densiti diferite de
sarcin precum i de distribuie a sarcinilor pe
suprafaalor.
 FACTORUL DE CAPACITATE A L UNUI SCHIMBTOR DE IONI
Factorul de capacitate sau de retenie, k, este o msur a reteniei unui component netrebuind
a fi confundat cu capacitatea de ncrcare (mg prob/ml) ori cu capacitatea ionic (mmol/ml).

O cromatogram posibil pe baza

creia se poate calcula factorul de
capacitate k, a unui peak
cromatografic. Legend: V0 = void
volume,VR1=volumuldeeluieapeak-
ului 1, VR2 = volumul de eluie a peak-
ului2,Vt=volumultotal,w R1=limea
peak-ului1,w R2=limeapeak-ului2.

Factorul de capacitate se calculeaz pentru fiecare peak individual. De exemplu, factorul

de capacitate k pentru peak-ul 1 din figura alturat este derivat din ecuaia:

Tehnica de adsorbie precum cea de cromatografie de schimb ionic ofer factori mari de
capacitate dup cum condiiile experimentale pot fi alese astfel nct s conduc la volume de
retenie a peak-ului mari n exces a Vt, opus tehnicii de gel filtrare unde capacitatea este limitat
deoarece toate peak-urile trebuiesc eluate cu un volum egal cu (Vt - V0).
 Capacitatea unui schimbtor de ioni este o msur cantitativ a abilitii sale de a
mbunti schimbul de contraioni, din aceast cauz fiind un parametru deosebit de important.
Capacitatea poate fi exprimat ca i capacitate ionic total, capacitate disponibil sau capacitate
dinamic.
Capacitatea ionic total reprezint numrul de grupri ncrcate electric substituite per gram
de schimbtor uscat ori per gram de schimbtor mbibat. Capacitatea ionic total poate fi
msurat prin titrare cu un acid sau o baz puternic.
Cantitatea total de protein care poate fi legat la un schimbtor de ioni, n condiii
experimentale definite, determin capacitatea disponibil pentru gel. Dac condiiile definite includ
i viteza de curgere la care gelul opereaz, cantitatea legat se refer la capacitatea dinamic
pentru schimbtorul de ioni. Capacitatea disponibil i cea dinamic depind de:
proprietile proteinei;
proprietile schimbtorului de ioni;
condiiile experimentale alese;

Proprietile proteinei care determin disponibilitatea sau capacitatea sa dinamic pe o

matrice schimbtoare de ioni particular sunt mrimea sa i raportul dintre sarcina sa/pH.

Proprietile matricei schimbtoare de ioni care determin capacitatea lui de disponibilitate

pentru o protein aleas sunt limita de excluziune, tipul i numrul de grupri funcionale de schimb
ionice substituite. O capactitate nalt de disponibilitate este obinut n condiiile unei matrice care
estre macroporoas i nalt substituit cu grupri ionice care i menin sarcina ndr-un domeniu
larg de condiii experimentale. Matrix-urile neporoase au o capacitate considerabil de mic
comparativ cu matrix-urile poroase, dar i o mare eficien datorit distanelor mai mici de
difuziune.
Condiiile experimentale care afecteaz capacitatea observabil sunt pH-ul, tria ionic a
tamponului, natura contraionului, viteza de curgere i temperatura.
 GRUPRI SCHIMBTOARE DE IONI
Prezena gruprilor schimbtoare de ioni este o proprietate fundamental a oricrui
schimbtor de ioni. Tipul de grupare determin tipul i tria schimbtorului de ioni, numrul
total al acestora i disponibilitatea determinnd capacitatea de schimb. Exist o varietate de
grupri care au fost selectate pentru a fi utilizate n procesul de schimb ionic, o serie dintre
acetia fiind prezentai n tabelul de mai jos.
Gruprile sulfonice i amino-cuaternare sunt utilizate pentru a forma schimbtori de ioni
puternici, celelalte grupe funcionale formnd schimbtorii de ioni slabi. Termenele de
puternic i slab se refer la msura variaiei de ionizare cu pH-ul i nu la tria legrii.
Schimbtorii de ioni puternici sunt complet ionizai pe un domeniu mare de pH, n timp ce la
schimbtorii de ioni slabi gradul de disociere i astfel capacitatea de schimb variaz mai puin
marcant cu pH-ul.

Schimbtori anionici Grupare funcional

Dietilaminoetil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Aminoetil cuaternar (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Gruprifuncionaleexistente
Ammoniu cuaternar (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+
(CH3)3 peschimbtoriideioni.
Schimbtori cationici Grupare funcional

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO-

Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-

Metil sulfonat (S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-

 Schimbtori de ioni pe baz de dextran
Schimbtorii de ioni pe baz de dextran sunt produi prin introducerea unor grupri
funcionale pe scheletul acestuia, o matrice de detran, reticulat. Aceste grupri sunt ataate
la unitile de glucoz din structura matricei prin legturi eterice, stabile.

Domeniul complet al schimbtorilor de ioni pe baz de Sephadex este prezentat n

tabeluldemaijos. Schimbtorii de ioni anionici i cationici sunt desemnai ca A-25 ori A-50 i
C-25 ori C-50, respectiv, depinznd de porozitatea matrix-ului.

SchimbtorideionipebazdeSephadex

Tipuri Descriere Grupare funcional Contraion

A-25 Schimbtor de ioni slab bazic

DEAE Sephadex Dietilaminoetil- Clorur
A-50

A-25 Schimbtor de ioni bazic tare

Dietil-(2-hidroxi-
QAE Sephadex Clorur
A-50 propil)aminoetil-

C-25 Schimbtor de ioni slab acid

CM Sephadex Carboximetil- Sodiu
C-50

C-25 Schimbtor de ioni acid tare

SP Sephadex Sulfopropil- Sodiu
C-50
 Schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex sunt insolubili n orice
solvent. Ei sunt stabili n ap, soluii saline, solveni organici, soluii slabe
acide i alcaline. n soluii puternic acide se pot manifesta procese de
hidroliz a legturilor glicozidice din care cauz valori ale pH-ului mai
mici de 2 trebuiesc ocolite, n particular la temperaturi crescute.
Schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex pot fi de asemenea utilizai n
prezena solvenilor denaturani proces ce poate fi important n condiiile
separrii unor substane numai pe baza proprietilor lor electrostatice.
n timpul regenerrii schimbtorul de ioni poate fi expus pentru timp
sczut la o soluie de NaOH, 0,2 M, fr o hidroliz apreciabil.
Schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex sunt susceptibili la atacul
unor dextranaze, motiv pentru care este nevoie ca n condiiile de
stocare s fie prezent i un agent antimicrobian. Proprietile fizice ale
acestor schimbtori sunt prezentate n tabelul urmtor:
 Schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex pot fi sterilizai prin autoclavare, (121C), pn la
30 minute, la unpH neutru, n form de sare. n timpul autoclavrii totui, se elibereaz o
Stabilitatea fizic cantitate de carbohidrai.

Proprietile de umflare ale schimbtorilor de ioni pe baz de Sephadex sunt asemntoare cu

cele ale Sephadex-urilor de tip G de la care provin. n plus, Schimbtorii de ioni pe baz de
Capacitatea de umflare Sephadex de tip 50 se umfl mai puternic dect cei de tip 25. datorit prezenei gruprilor
ionice de schimb, pe matrice, umflarea (mbibarea) variaz cu tria ionic i cu pH-ul.
La trii ionice sczute, repulsia dintre gruprile ce poart aceeai sarcin pe matrice sunt
maxime, din aceast cauz umflarea gelului n aceste condiii, este mare. Gradul de umflare
Dependena de tria ionic scade cu creterea triei ionice. Se poate nota c schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex nu
trebuie umflai n ap distilat deoarece, datorit puternicelor interacii ionice care e manifest
n aceste condii, structura perlat se distruge.
Gradul de disociere i de aici extensia cu care un schimbtor de ioni este ncrcat electric este
dependent de pH. Repulsia dintre gruprile schimbtoare de ioni este maxim la valori ale
pH-ului la care gruprile schimbtoare de ioni sunt total disociate, scznd la valori de pH
Dependena de pH apropiate de pK ale gruprilor schimbtoare de ioni. Se poate nota c schimbtori tari precum
QAE Sephadex i SP Sephadex au proprieti de umflare practic independente de pH
deoarece sunt ncrcai electric pe un mare domeniu de pH.
Datorit diferenelor n caracteristicile de umflare, schimbtorii de ioni pe baz de Sephadex
G-25 au o capacitate ionic mai mare have per ml gel dect cei pe baz de Sephadex G-50.
Astfel, pentru biomolecule mai mici (masa molecular < 30 000) schimbtorii de ion de tip A-
25 i C-25 au o capacitate de disponibilitate mai mare. n domeniul de mase moleculare
Capacitatea cuprins ntre 30 000 i 100 000 totui, schimbtorii de ion de tip A-50 i C-50 posed o
capacitate de disponibilitate mai mare datorit existenei unor pori mai mari. n condiiile
lucrului cu macromolecule mai mari de 100 000, s-a observat frecvent o mai mare capacitate
de disponibilitate la tipurile A-25 i C-25 dei, la aceste mase moleculare, legarea se
realizeaz numai pe suprafaa perlei de schimbtor de ioni.
Celuloza este utilizat ca matrice, dup introducerea unor grupri schimbtoare de ioni,
de tipul dietilaminoetil (DEAE) ori carboximetil (CM), ceea ce conduce la obinerea unor
schimbtori de ioni anionici respectiv cationici.
DEAE celuloza comercializat sub denumirea de DEAE Sephacel este macroporoas i are o
limit de excluziune a proteinelor cu mas molecular de aproximativ 1 x 10 6. Interacia ionic a
macromoleculelor cu mas molecular mult mai mare de 1 x 106 este restiricionat doar la
sarcinile electrice situate pe suprafaa perlelor de schimbtor.

DEAE i CM Sepharose CL-6B sunt disponibile sub form prenmuiat, putnd fii
utilizate imdeiat pentru ncrcare (mpachetare) pe coloan. n privina capacitatii, se
poate spune c deoarece DEAE i CM Sepharose CL-6B sunt schimbtori de ioni slabi,
numrul de grupri ionice legate care sunt schimbate i deci capacitatea pentru
macromolecule este dependent de pH. Aceast dependen se ilustreaz cu ajutorul
curbelor de titrare. Domeniul de pH la care se lucreaz cu DEAE Sepharose CL-6B este de
2-9 n timp ce pentru CM Sepharose CL-6B este de 6-10.
 SELECIA GRUPRII SCHIMBTOARE DE IONI
n selecia suportului cromatografic trebuie avut n vedere c nu exist un singur schimbtor de ioni perfect
pentru oricare separare. Alegerea matrix-ului i a gruprii ionice substituite depinde de:
necesitile specifice aplicaiei;
mrimea molecular a componentelor probei;
punctul izoelectric al componentelor probei.
Substanele se leag la schimbtorul de ioni n momentul n care posed o sarcin opus celei prezentate
de suportul cromatografic. Aceast legare este electrostatic i reversibil.
n cazul n care substanele ce doresc a fi separate posed numai un tip de sarcini electrice, alegerea
schimbtorului este clar. n condiiile separrii unor substane cu ncrctur mixt, ce prezint sarcini att
pozitive ct i negative, substane denumite amfotere, sarcina net va depinde de pH. n consecin la o anumit
valoare a pH-ului, o substan amfoter va avea o sarcin net egal cu zero. Aceast valoare este denumit
punct izoelectric (pI) i n acel punct substanele nu se vor lega nici de schimbtorul anionic nici de cel cationic,
dup cum se observ schematizat n figurademaijos.

Curbdetitrare.Sarcinanetaunei
proteinecafunciedepH
 Astfel, pH-ul unui tampon determin sarcina unor molecule amfotere n timpul unui
experiment. Din acest motiv, n principiu, se poate utiliza att un schimbtor anionic ori unul cationic
pentru a lega substana amfoter, prin selectarea unui pH optim. n practic totui, alegerea este
bazat pe un tip de schimbtor i un anumit pH, care conduc la cea mai bun separare a
moleculelor de interes, fr constrngeri referitoare la stabilitatea lor la acel pH.
O multitudine de macromolecule biologice se denatureaz ori i pierd din activitate n afara
unei domeniu bine stabilit al pH-ului i astfel, alegerea schimbtorului de ioni poate fi limitat de
stabilitatea probei. Sub valoarea punctului su izoelectric o protein are o sarcin net pozitiv,
schimbul i astfel adsobia realizndu-se pe un schimbtor cationic. Deasupra pI-ului su proteina
are o sarcin net negativ, putndu-se adsorbi pe schimbtori de ioni anionici. Totui, ea este
stabil numai n domeniul de pH cuprins ntre 5 i 8, astfel se va utiliza un schimbtor de ioni
anionic.
Sepottrageurmtoareleconcluzii:
Dac componentele probei sunt mult mai stabile mai mici dect valoarea pI, trebuie utilizat un
schimbtor cationic.
Dac ele sunt mai stabile n jurul valorilor pI, trebuie utilizat un schimbtor anionic.
Dac stabilitatea componentelor este mare pe tot domeniul de pH, pe ambele laturi ale pI, se
poate utiliza oricare schimbtor de ioni.
Metodedetestarentubacondiiilordeselecieaschimbtoruluideioni
 CROMATOGRAFIA DE AFINITATE

Conform Uniunii Internaionale de Chimie Pur i Aplicat (IUPAC), cromatografia de afinitate

este definit ca o tehnic cromatografic lichid care se bazeaz pe o interacie biologic
pentru separarea i analiza unui analit specific dintr-o prob. Exemple ale acestor interacii
includ legarea unei enzime la un inhibitor sau al unui anticorp la un antigen. Astfel, cromatografia
de afinitate presupune, n prim faz obinerea unui agent de legare cunoscut sub termenul de
ligand afin, care interacioneaz selectiv cu analitul dorit, acesta fiind apoi plasat pe un suport solid
ntr-o coloan cromatografic. Odat preparat ligandul imobilizat el poate fi utilizat la izolarea ori la
cuantificarea unui analit.
Ligandul imobilizat este factorul cheie care determin succesul oricrei metod de
cromatografie afin. Dup definiia dat anterior n cromatografia de afinitate cei mai muli liganzi
au origine biologic, totui termenul de cromatografie afin este de asemenea utilizat de mult
vreme pentru a descrie o serie de coloane care conin drept liganzi selectivi cu origine nebiologic.
Exemple ale acestor liganzi nebiologici sunt boronaii, complexe de ioni de ioni metalici imobilizai,
colorani sintetici. Termeni precum cromatografie de bioafinitate i de adsorbie biospecific sunt
utilizai ocazional pentru a specifica dac ligand afin estre un compus biologic real. n ceea ce
privete originea ligandului, utilizat pentru a divide tehnicile afine de cromatografie se pot meniona
diverse subcategorii precum cromatografia cu lectine imobilizate, cromatografia de imunoafinitate,
cromatografia cu ligand colorant de sintez, ori cromatografia de afinitate cu ion metalic imobilizat.
Aceste tehnici afine vor fi examinate n continuare.
 Un alt factor utilizat pentru a se face distincie ntre o metod afin de
alta este tipul de suport utilizat n coloan. n cromatografia de
afinitate cu presiune atmosferic (sau pe coloan), n mod uzual, suportul
utilizat are un diametru mare iar gelul nu estre rigid. Este cazul suportului
de agaroz, dextran, ori celuloz.

Ca mecanism de separare cromatografia de afinitate separ proteinele pe baza

unor interacii reversibile dintre o protein (ori un grup de proteine) i un ligand specific
cuplat la o matrice cromatografic.
Tehnica este ideal n capturarea (extracia) unei proteine sau ca treapt
intermediar ntr-un protocol de purificare i poate fi utilizat oriunde este disponibil un
ligand potrivit pentru proteina (proteinele) de interes. Cu o selectivitate nalt i de aici o
rezoluie mare, o mare capacitate pentru proteina (proteinele) de interes treptele de
purificare realizeaz mari factori de recuperare, de ordinul a sutelor i chiar miilor de ori.
Proteina (proteinele) int sunt colectate ntr-o form purificat, concentrat.
 Interaciile biologice dintre ligand i molecula int pot fi rezultatul unor
interacii electrostatice sau hidrofobe, a unor fore van der Waals' i/sau legturi
de hidrogen. Pentru a elua molecula int de pe mediul afin interacia poate fi
reversat att prin metode specifice, de utilizare a unui ligand competitiv ct i
nespecific prin schimbarea pH-ului, a triei ionice sau a polaritii. Astfel, ntr-o
singur etap, purificarea prin cromatografie de afinitate poate oferi un imens
avantaj din punct de vedere a timpului de realizare comparativ cu procedurile
de separare n etape multiple. Efectul de concentrare conduce la posibilitatea
procesrii unui volum mare de prob, i n final, proteina (proteinele) int
putnd fi capturat dintr-un amestec biologic complex; formele native de pot fi
separate de formele sale denaturate, putnd fi purificate din volume mici de
material biologic, cu un nivel nalt de ndeprtare a substanelor contaminante.
Succesul purificrii prin cromatografie de afinitate presupune existena unui
ligand biospecific care poate fi ataat covalent la matricea cromatografic,
ligandul cuplat trebuind s rein prin legare specific afin i reversibil
molecula int i astfel, s permit moleculei int s fie eluate n forma sa
activ. Orice component poate fi utilizat ca i ligand pentru purificarea
partenerului su respectiv de legare.
Interaciibiologiceutilizatenselectarealiganduluirespectivamoleculeiint,
utilizatencromatografiadeafinitate

Enzim Substrat analog, inhibitor, cofactor

Anticorp Antigen, virus, celul.
Polizaharide, glicoproteine, receptor celular
Lectin
de suprafa, celul.
Secvena de baze complementar, histone,
Acid
polimeraza acidului nucleic, proteina de
nucleic
legare a acidului nucleic.
Hormon,
Receptor, protein transportoare (carrier)
vitamin
Glutatio Glutation-S-transferaz ori proteine de

n fuziune GST
Proteine de fuziune poli (His), proteine
Ioni
native cu histidin, cistein i/sau resturi de
metalici
triptofan pe suprafaa lor.
O reprezentare schematic a unui proces de separare prin cromatografie de afinitate

Reprezentareaschematicaunuiprocesdeseparareprincromatografiedeafinitate.a)mediul
afin este echilibrat cu tamponul de legare; b) proba este aplicat n condiii care favorizeaz
legarea specific a moleculei (moleculelor) int la substana complementar de legare
(ligandul).Substaneleintseleagspecific,darreversibil,laligand,ntimpcecomponentele
carenuprezintafinitatepentruligandsuntndeprtateprineluie(splare)depecoloanaafin;
c) proteina int este recuperat prin schimbarea condiiilor ce au favorizat legarea la ligandul
imobilizat.Eluiaserealizeazspecific,prinutilizareaunuiligandcompetitivorinespecificprin
schimbarea pH-ului, a triei ionice ori a polaritii. Proteina int este astfel colectat ntr-o
formpurificaticoncentrat;d)mediulafinestereechilibratcutampondelegare
Reprezentarea schematic a procesului de cromatografie afin.
Etapelea),b),c),id)suntprezentatenfiguraprezentatmaisus.
Condiii de eluie n cromatografia de afinitate

Metodedeeluie:
Metoda 1, cel mai simplu caz: o
schimbare n compoziia tamponului
conduce la eluarea substanei legate,
fr a o altera i fr a denatura
ligandul.

Metoda 2. Se utilizeaz pH-uri extreme

oriconcentraiimarideagenichaotropi
pentrueluie,nsacestprocedeupoate
conduce la alterarea temporar ori
permanent a moleculei int ori a
ligandului.

Metodele 3 i 4. Se realizeaz o eluie specific prin

adugarea unei substane care competiioneaz la
legarea de ligand. Aceste metode pot crete
specificitateamediilorcareutilizeazliganzispecificide
grup.
 ALEGEREA MATRICEI CROMATOGRAFICE

Alegerea matricei optime reprezint o etap foarte important n orice proces

cromatografic. O matrice bun pentru a fi utilizat n cromatografia de afinitate
trebuie sa posede urmtoarele proprieti:
1. Hidrofilicitate: s posede proprieti specifica care s-i confere interacii
nespecifice reduse.
2. Pori mari: s permit tuturor spaiilor matricei s fie disponibile la cele mai
multe molecule din amestecul de separat. O serie de matrici permit legarea numai la
suprafaa extern, fiind utilizate mai ales n separarea unor molecule foarte mari, a
unor celule sau a unor virui.
3. Rigiditate: matricea trebuie s reziste la presiunile de mpachetare i de
curgere a solventului n timpul eluiei sau a splrii.
4. Inerie: matrice nu trebuie s contribuie la procesul de separare
cromatografic.
5. Stabilitate chimic: matricea trebuie s fie stabil la toi solvenii utilizai n
separarea cromatografic.
O matrice optim trebuie s posede o structur macroporoas cu o mare
stabilitate chimic i fizic, cu o ct mai mic adsorbie nespecific, care s faciliteze
o capacitate nalt de legare i de recuperare a probei, alturi de o rezisten mare
fa de eluiile n condiii dure sau condiiile de splare.
 CROMATOGRAFIA DE AFINITATE CU ION DE METAL IMOBILIZAT
La mijlocul anilor 70, echipa de cercettori condus de Porath a introdus un nou tip de
cromatografie ce a fost atunci denumit iniial cromatografie cu metal chelat, dup care s-a
redenumit cromatografie de afinitate (adsorbie) cu metal (ion) imobilizat (immobilized metal
affinity chromatography, IMAC).
Tehnica se bazeaz pe diferenele de afinitate ale proteinelor fa de ioni metalici
legai de substane ce au proprieti chelatoare, care sunt imobilizate pe un suport
(rin) cromatografic.
Cu toate c bazele acestei metode nu au fost noi, Porath i colaboratorii s-au focusat pe
utilizarea acestei noi tehnici n separarea proteinelor. Aceast caracteristic de bio-afinitate
a captat atenia biochimitilor, chimitilor i biologilor care au utilizat IMAC i au descoperit
noi valene n aplicaii particulare a metodei.
Cea mai cunoscut mbuntire o reprezint aplicaiile ce utilizeaz o coad
(tag) de poli-histidin la separarea polipeptidelor recombinante care consist din
inseria unei secvene terminale de resturi histidinice fie la captul N- ori la cel C-
terminal al proteinei (peptidei). Utilizarea unor astfel de histidine sau a altor secvene ce
posed afinitate pentru metale n IMAC a dovedit a reprezenta o metod deosebit de util n
recuperarea proteinelor, n special n condiiile n care se urmrete o producie mare i a
unui randament crescut de proteine. n consecin, IMAC a aprut drept o metod major
utilizat n purificarea proteinelor, pornind din faza de laborator pn la cea de pilot ori
industrial.
Au fost publicate o multitudine de studii referitoare la IMAC, unele dintre ele prezentnd
noi aplicaii ale metodei ori de introducere a unor noi posibile arii de utilizare, n care aceast
tehnic poate fi exploatat.
Interaciiledintreresturilenvecinatealesecveneihexa-
histidiniceimatriceaNi-NitriloTetraAcetat.

aciduliminodiacetic,IDA;
acidulnitrilotriacetic,NTA
 Utilizarea diferenelor de afinitate n interacia protein ion metalic

Legarea proteinelor (ori a peptidelor) la ionii metalici se bazeaz pe interaciile

dintre gruprile donoare de electroni prezente pe suprafaa proteinelor i un ion
metalic care prezint unul sau mai multe situsuri de coordinare, mai mult sau mai
puin accesibile, expuse. IMAC se realizeaz ntre un sorbent, ori un matrix, la care
se ataeaz covalent grupri metalice, chelatoare (Figurademaijos).

Reprezentarea schematic a
mecanismelor implicate n
adsorbia i desorbia
proteinelor n cromatografia
de afinitate cu metal (ion)
imobilizat (IMAC). Se
prezint interaciile specifice
ce se stabilesc ntre ionul de
metal chelator, suportul
chelator i secvena
polihistidinic.
 n condiiile n care ionii metalici sunt adugai (ncrcai), chelatorii multidentai i ionii metalici
formeaz complexe n care ionii metalici sunt fixai pentru interacia urmtoare cu compuii ce
trebuie s fie rezolvai. La sfritul acestei etape, ionii metalici aflai n complexe trebuie s posede
situsuri de coordinaie libere la care se vor lega solventul ori moleculele de solut dup interacia
dintre proteine i ionii metalici, proteinele legate pot fi eliberate prin utilizarea unui dezlocuitor
(precum imidazolul).

Tria legturii metalprotein variaz de la o protein la alta ceea ce

conduce n majoritatea cazurilor la o difereniere ntre proteine,
proces ce poate fi exploatat efectiv n randamente mari de separare
ori n izolarea unor proteine specifice.
 Ioni metalici utilizai n mod comun n IMAC

Diferenele n afiniti ale proteinelor pentru un metal pot fi explicate, cel puin n parte, pe
baza principiului acizilor ori bazelor tari sau slabe, descrise de ctre Pearson. n aceast teorie
se statueaz c dac doi atomi formeaz o legtur, un atom acioneaz ca un acid Lewis iar
cel de al doilea atom ca o baz Lewis. Tria legturii este guvernat de valorile intrinseci tari
ori slabe ai atomilor implicai. Teoria acizilor tari sau slabi ori a bazelor tari i slabe dicteaz c
legturile dintre atomi cu o poziie similar, de exemplu un acid tare combinat cu o baz tare
sunt cele mai puternice. Urmnd conceptul de mai sus, ionii metalici precum K +, Ca+2, Mg+2 i Fe
+3
sunt clasificai drept acizi Lewis tari, n timp ce ionii monovaleni ai metalelor precum Ag + i
Cu+ sunt categorisii drept acizi Lewis slabi. Ionii metalelor tranziionale de tipul, Co+2, Zn+2, Cu+2
i Ni+2, sunt considerai acizi de limit. Aceti ioni metalici sunt cel mai adesea utilizai n
IMAC, nparticularNi(II),careconferlaunnumrdecoordinaieegalcuase,posedo
stabilitateelectrochimicncondiiicromatografice,opolarizabilitatelimitiostabilitate
redox. Ionii metalici chelatori manifest variaii n afinitate fa de proteine, care poate fi
precizat prin utilizarea teoriei descrise de Pearson.
Aceast teorie a acizilor i bazelor tari i slabi postuleaz c exist trei tipuri majori de
liganzi. Acei liganzi care conin oxigen (de exemplu carboxilat), azot alifatic (precum asparagina
i glutamina) i fosfor (de exemplu aminoacizi fosforilai) sunt clasificai drept baze Lewis tari.
Liganzii care conin sulf (de exemplu cisteina) sunt clasificai drept baze slabe, acei care conin
azot aromatic (de exemplu histidina i triptofanul) sunt considerai baze de limit. Acizii aflai la
limit i care conin Co+2, Zn+2, Cu+2 i Ni+2, coordineaz n mod favorabil cu atomii de azot
aromatici (baze la limit) i de asemenea cu atomii de sulf (baze slabe).
 n interaciile dintre ionii de Cu(II), Ni(II), Co(II) ori Zn(II) imobilizai i resturile de
aminoacizi de pe suprafaa proteinei, gruprile funcionale imidazolil, tiol i indolil
sunt principalele inte pentru ionii metalici. Gruprile funcionale carboxil i fosfat
sunt principalele inte pentru ionii metalici tari precum Fe(III) i Mg(II). Un concept
acceptat este acela al distribuiei spaiale a resturilor de histidin pe ntreaga suprafa a
unei proteine n timp ce accesibilitatea acestora va influena caracteristicile de retenie
ale moleculei proteice. Au fost descrise n literatura de specialitate o serie de peptide cu
mare afinitate pentru metal dup cum s-au prezentat motife din structura proteic de
legare a metalului nenvecinate precum cele gsite n prolactin sau n hormonul de
cretere. Este de remarcat c existena unui motif de legare al metalului nu este
ntotdeauna garania pentru succesul IMAC, dup cum exist un numr de enzime cu
afinitate pentru metal care se leag la matrix-ul chelator prin intermediul unui situs care
nu este cel catalitic de legare a metalului. O serie de seciuni de legare a metalului la
protein, chiar dac sunt expuse, pot contribui foarte puin la tria net a reteniei a
proteinei n IMAC.
 Chelatori de metale i matrix-uri polimerice de chelare
Majoritatea gruprilor chelatoare utilizate n IMAC sunt compui chelatori multidentai ce
furnizeaz tria complexului format de ctre protein, ion metalic i gruparea chelatoare. Aceste
substane chelatoare sunt ataate pe o suprafa de sorbent prin intermediul unor grupri de legare
(brae, spacere) care pot varia n lungime ori n compoziie. Structura final format dup ce ionul
metalic este chelatat de ctre gruparea chelatoare trebuie s permit o oarecare libertate situsurilor
de coordinaie n ion metalic pentru adsorbia ori legarea proteinelor i a moleculelor de solvent.
Diferenele n numrul de situsuri de coordinaie libere poate explica n parte de ce o serie de
substane chelatoare (acidul iminodiacetic, IDA; acidul nitrilotriacetic, NTA, etc.) prezint
selectiviti diferite i activiti de adsorbie fa de proteina int, dat. n tridentatul IDA, metalul se
va lega la atomul de azot i de doi atomi de oxigen din gruprile carboxilat, lsnd trei situsuri
libere pentru molecula de protein ori solvent (n condiiile utilizrii Ni +2 ca metal chelator, acesta
putnd da o trie metal-chelatoare superioar, dar pe de alt parte, o slbire a puterii de reinere a
proteinei. O alt nsuire a chelatorului ar fi reprezentat de o scdere a riscului de scurgere
(pierdere) a metalului chelat. Figura de mai jos arat un model al celor mai comuni i utilizai
chelatori, IDA i NTA legai la atomii de Ni.

Structurile a doi dintre cei mai comune rini chelatoare

ncrcate cu ioni de Ni(II): Ni(II) acid iminodiacetic, Ni(II)
IDA(a)iNi(II)acidnitrilotriacetic,Ni(II)NTA(b)precumi
o comparaie a interaciilor dintre matricele chelatoare cu
ioniidenichel(c,d).
 Acidul iminodiacetic, IDA, reprezint standardul, cel
mai comun agent ligand chelator de metal pentru
imobilizarea ionilor metalici n suporturile IMAC. Muli ali
chelatori (adsorbeni) utilizai n IMAC au fost proiectai n
ultimele decade, fiecare avnd propriile lor avantaje i
limite. Ei sunt predominant amine carboximetilate
precum tetraetilenpentamina (TEPA) ori acidul aspartic
carboximetilat (CM-ASP). Un alt chelator foarte utilizat n
IMAC este NTA, mai recent dezvoltat.
Dezvoltarea unor ageni chelatori poteniali noi cu
afinitate pentru metal nu este limitat la o grupare
funcional ceea ce va conduce la apariia unor noi clase
de compui cu proprieti de ancorare a metalului utilizate
n IMAC. O serie de compui, nenrudii structural cu
aminele carboximetilate, sunt relativ utilizai n prezent.

Compoziia tamponului de eluent folosit variaz n mare msur

n condiiile identificrii condiiilor optime pentru o separarea unei
proteine date i n multe cazuri, reprezint factorul principal al
specificitii atinse ntr-un protocol de purificare prin IMAC.
 Factorii care contribuie la legtura proteinmetal

O multitudine de studii indic histidina drept aminoacidul care posed cea

mai puternic afinitate pentru ionii metalici. Este general acceptat c histidina,
asemeni resturilor de triptofan i cistein ca rezultat al interaciilor puternice cu
ionii metalici sunt compuii cheie n legarea proteinelor n IMAC. Aceti trei
aminoacizi au cele mai mari retenii, comparativ de exemplu, cu resturile
glutamat i aspartat, care esenial nu prezint nici o retenie. Studiile efectuate
au corelat reteniile unui mare numr de peptide sintetice ori biologic active pe
Ni(II), Zn(II) i Cu(II) chelai pe IDA, cu profilurile lor n aminoacizi n scopul de
a evalua proprietile de adsorbie ale aminoacizilor implicai n retenia
peptidelor. Alte investigaii au relevat c proprietatea de retenie a unor proteine
este n mare parte guvernat de resturile de histidin expuse pe suprafaa
proteinei.
 Cisteina prezint de asemenea o afinitate puternic fa de metal,
dei oarecum mai sczut dect histidina. Afinitatea pentru metal a
acestor doi aminoacizi poate fi atribuit n general gruprilor lor
funcionale, n particular a gruprilor imidazol i tiol, ale histidinei
respectiv cisteinei. n cazul histidinei, alte grupri funcionale precum
gruprile carboxil i amino, joac de asemenea un rol n procesul de
legare la metal. Ali aminoacizi care pot s posede o afinitate substanial
fa de metal sunt triptofanul, fenilalanina i tirozina care acioneaz
direct prin intermediul catenelor lor aromatice, n timp ce arginina,
lizina, asparagina, glutamina i metionina, acioneaz indirect prin
efecte individuale sau combinate pe accesibilitatea histidinei. Cu toate c
retenia proteinelor ori a peptidelor este n mod primar (cauzal) dat de
afinitatea fa de metal a aminoacizilor constitueni, ali factori pot
contribui profund alturi de afinitatea fa de metal, factori ce includ
secvena n aminoacizi (poziia aminoacizilor n caten, structura
primar), plierea proteinei ori proprietile suprafeei acestora.
Se poate spune faptul c aceste caracteristici de retenie ale
proteinelor n IMAC nu este uor de precizat.
 n interaciile dintre ionii de Cu(II), Ni(II), Co(II) ori Zn(II) imobilizai i resturile
de aminoacizi de pe suprafaa proteinei, gruprile funcionale imidazolil, tiol i
indolil sunt principalele inte pentru ionii metalici. Gruprile funcionale
carboxil i fosfat sunt principalele inte pentru ionii metalici tari precum Fe(III)
i Mg(II).
Un concept acceptat este acela al distribuiei spaiale a resturilor de
histidin pe ntreaga suprafa a unei proteine n timp ce accesibilitatea
acestora va influena caracteristicile de retenie ale moleculei proteice. Au
fost descrise n literatura de specialitate o serie de peptide cu mare afinitate
pentru metal dup cum s-au prezentat motife din structura proteic de legare
a metalului nenvecinate precum cele gsite n prolactin sau n hormonul de
cretere. Este de remarcat c existena unui motif de legare a metalului nu
este ntotdeauna garania pentru succesul IMAC, dup cum exist un numr
de enzime cu afinitate pentru metal care se leag la matrix-ul chelator prin
intermediul unui situs care nu este cel catalitic de legare a metalului. O serie
de seciuni de legare a metalului la protein, chiar dac sunt expuse, pot
contribui foarte puin la tria net a reteniei a proteinei n IMAC.
 Chelatori de metale i matrix-uri polimerice de chelare

Majoritatea gruprilor chelatoare utilizate n IMAC sunt compui chelatori multidentai ce

furnizeaz tria complexului format de ctre protein, ion metalic i gruparea chelatoare.
Compoziia tamponului de eluent folosit variaz n mare msur de condiiile optime identificate
pentru separarea unei proteine date i n multe cazuri, reprezint factorul principal al specificitii
atinse ntr-un protocol de purificare prin IMAC. Aceste substane chelatoare sunt ataate pe o
suprafa de sorbent prin intermediul unor grupri de legare (brae, spacere) care pot varia n
lungime ori n compoziie. Structura final format dup ce ionul metalic este chelatat de ctre
gruparea chelatoare trebuie s permit o oarecare libertate situsurilor de coordinaie n ion metalic
pentru adsorbia ori legarea proteinelor ori a moleculelor de solvent. Diferenele n numrul de
situsuri de coordinaie libere poate explica n parte de ce o serie de substane chelatoare (acidul
iminodiacetic, IDA; acidul nitrilotriacetic, NTA, etc.) prezint selectiviti diferite i activiti de
adsorbie fa de proteina int, dat. n tridentatul IDA, metalul se va lega la atomul de azot i de
doi atomi de oxigen din gruprile carboxilat, lsnd trei situsuri libere pentru molecula de protein
ori solvent (n condiiile utilizrii Ni+2). n acelai mod, tetradentatul NTA este considerat a lega ionul
meztalic cu un oxigen extra carboxilat, acesta putnd da o trie metal chelatoare superioar, dar pe
de alt parte, o slbire a puterii de reinere a proteinei. O alt nsuire a chelatorului tetradentat ar fi
reprezentat de o scdere a riscului de scurgere (pierdere) a metalului chelat.
Figura arat un model al celor mai comuni i utilizai chelatori, IDA i NTA legai la atomii
de Ni.

Structurile a dou dintre cei mai

utilizate rini chelatoare ncrcate cu
ionideNi(II):
a.Ni(II)acidiminodiacetic,Ni(II)IDAi
b.Ni(II) acid nitrilotriacetic, Ni(II) NTA
precum i o prezentare a modului de
realizare a interaciilor dintre matricele
chelatoarecuioniidenichel(c,d).
 Acidul iminodiacetic, IDA, reprezint standardul, cel mai utilizat agent ligand
chelator de metal pentru imobilizarea ionilor metalici n suporturile IMAC. Muli ali
chelatori (adsorbeni) utilizai n IMAC au fost proiectai n ultimele decade, fiecare
avnd propriile lor avantaje i limite. Ei sunt predominant amine carboximetilate
precum tetraetilenpentamina (TEPA) ori acidul aspartic carboximetilat (CM-ASP). Un
alt chelator foarte utilizat n IMAC ar fi NTA, mai recent dezvoltat. Dezvoltarea unor
ageni chelatori poteniali noi cu afinitate pentru metal nu este limitat la o grupare
funcional ceea ce va conduce la apariia unor noi clase de compui cu proprieti
de ancorare a metalului utilizate n IMAC. O serie de compui, nenrudii structural cu
aminele carboximetilate, sunt relativ utilizai n prezent.

Structurialeunornoigrupri
chelatoareutilizatenIMAC

De exemplu dye-resistant yellow 2KT, O-fosfoserina (OPS) i 8-hidroxiquinolina (8-HQ).

Selectarea unei combinaii optime de chelator i de ion de metal este important dup cum i
rina chelatoare poate avea efecte adverse n retenia proteinei. S-a observat c diferit de
metalul utilizat, rina chelatoare poate avea un efect important n retenia proteinei,
sugerndu-se c, prin utilizarea unei rini diferite, retenia proteinei poate fi alterat ca
rezultat al interaciilor dintre complexul proteinmetal i rina chelatoare utilizat.
 Suportul polimeric utilizat trebuie s ndeplineasc o serie de
caracteristici fizico-chimici n scopul de a fi corespunztor procesului IMAC.
Astfel un suport ideal trebuie s fie:
uor de derivatizat;
s nu manifeste adsorbie nespecific;
s prezinte proprieti fizice, mecanice bune i o bun stabilitate
chimic;
s posede o porozitate nalt care s conduc la o accesibilitate
uoar a ligandului;
s poat fi utilizat la viteze mari de curgere;
s fie stabil la elueni, inclusiv, n ultim instan la compui
denaturani;
s permit regenerarea coloanei fr o degenerare a matrix-ului;
s furnizeze geluri stabile care s nu-i modifice volumul prin
deshidratare ori umflare n timpul procesului cromatografic.
 Factorii care guverneaz adsorbia i desorbia
proteinelor

numrul de legturi dintre ionul de metal i un un chelator de metal imobilizat guverneaz

afinitatea total a complexului chelatorion de metal pentru proteine ori peptide. Chelatorul trebuie
s aib o puternic afinitate pentru ionul de metal (pentru a preveni, de exemplu, efectul transferului
de ion de metal), dar trebuie s lase de asemenea o serie de situsuri de coordinare libere pentru a
fi capabile s lege proteina la ionul de metal. Se pare c stabilitatea structurii chelatorion de metal
depinde de tipul de ion de metal i de compoziia tamponului eluent utilizat. Un numr de
caracteristici ale chelatului pot s influeneze selectivitatea legrii metalprotein: geometri de
coordinare a complexului, sarcina, volumul steric i chiralitatea.

FAZA MOBIL: pH-ul, TRIA IONIC I CAPACITATEA DE TAMPONARE

Selectivitatea unei IMAC pentru o protein poate de asemenea s depind de

compoziia fazei mobile. Creterea triei ionice a tampoanelor poate s conduc la
o supresie a interaciilor secundare, electrostatice nedorite cu o cretere a legrii
proteinei la complexul chetator dup cum o scdere a concentraiei saline poate
conduce uneori la o mai slab adsorbie a acesteia. Clorura de sodiu (la
concentraii de 0,11,0 M) este n mod constant inclus n tampoanele IMAC
pentru a suprima interaciile ionice dintre prob i matrix, ca i cele dintre proteine.
Utilizarea valorilor crescute de pH (7 ori 8) i a unei trii ionice mari conduce la particularizarea
IMAC fa de alte tehnici cromatografice, precum cea de schimb ionic. IMAC se aseamn cel mai
bine cu cromatografia de interacie hidrofob (HIC) deoarece se realizeaz cu tampoane ce conin
concentraii crescute de sruri.
Adsorbia unei proteine n IMAC se realizeaz la un pH dat la care gruprile
donore de electroni de pe suprafaa unei proteine sunt parial neprotonate. Este
deseori ntlnit n practic inducerea adsorbie proteinei pe un suport IMAC sub
condiii uor alcaline, n prezena unei trii ionice crescute a tamponului.
Tampoanele fosfat i acetat sunt cele mai utilizate n IMAC. Rolul pH-ului este
deosebit de complex n eluia i adsorbia proteinelor, deoarece el influeneaz un
numr de proprieti, inclusiv caracterul nucleofil al componentelor tamponului,
proprietile electron-donor acceptor ale soluilor i stabilitatea ionului de metal.
Domeniul de pH cuprins ntre 6 i 8 favorizeaz retenia resturilor histidinice i
cisteinice; ntr-un domeniu mai alcalin, coordinaiile dintre gruprile amino
funcionale sunt favorizate, ceea ce conduce la o scdere a selectivitii.
Aditivi i dezlocuitori de proteine

Detergenii pot fi utilizai n IMAC drept amplificatori de selectivitate. Tween-ul-80, la o concentraie

de 0,01% (v/v) a fost utilizat n purificarea prolactinei recombinate umane ori a prolactinei de la
primate, dovedind a fi deosebit de util n diminuarea interaciilor nedorite. Uneori, un solvent organic
este adugat la tampon pentru a ajuta la ndeprtarea endotoxinelor fr efecte duntoarea asupra
mpachetrii corecte a proteinelor, ori n scopul eliminrii unor contaminani n cazul purificrii
albuminei din extracte proteice
 Avantajele i dezavantajele cromatografie
de afinitate cu metal imobilizat

IMAC se realizeaz deseori ntr-o singur treapt de purificare;

Capacitatea de ncrcare cu protein este relativ nalt,
comparativ cu alte tehnici de cromatografie de afinitate (0,110 mM/ml
gel);
Ionii de metal pot fi uor de ndeprtat de pe rin cu ajutorul
unui agent chelator mai puternic, EDTA sau EGTA. Ionii de metal
diferii pot fi astfel testai utiliznd aceeai rin chelatoare, pentru a
determina ligandul ce d cele mai mari satisfacii n separarea unei
proteine de interes;
Trecerea la scal mare a procesului IMAC este extrem de uoar
i reproductibil, ceea ce face din aceast tehnic un candidat n
aplicaiile industriale;
IMAC este utilizat n concentrarea soluiilor diluate de proteine;
IMAC este compatibil un numr mare de tampoane cu for
ionic crescut i care conin componente chaotrope;
 n general, IMAC nu are efecte adverse asupra
structurii proteice, fiind raportate puine cazuri n care
metaloenzimele care posed un ion de metal esenial a
fost extras. Un caz a fost de asemenea raportat n pentru o
protein separat prin IMAC pe o coloan Cu(II) IDA, dar
alterarea a fost cauzat de ctre agenii reductori care au
cauzat proteoliza oxidativ catalizat de ionul de Cu(II);
Efectuarea unei treceri (pasaj) printr-o coloan
nencrcat de IMAC, conduce la obinerea unor soluii
tranzitoriu sterile deoarece toi ionii de metal eseniali
creterii bacteriene sunt ndeprtai prin chelatare;
O rin IMAC pot fi regenerate de foarte multe ori,
fr o pierdere a caracteristicilor cromatografice. Gelurile
utilizate n IMAC sunt extrem de robuste cu condiia ca
valori de pH sub 4 s nu fie utilizate.
 OcomparaientreIMACiprocedeelestandarddecromatografiede
afinitate

Afinitate Biospecificitate/
Caracteristic
pentru metal bioafinitate
Stabilitatea ligandului nalt Sczut
ncrcarea cu protein nalt Sczut
Condiii de eluie Blnde Deseori extrem
Recuperarea ligandului Complet n general
dup regenerarea incomplet
coloanei
Selectivitate Sczut-medie nalt
Cost Sczut nalt
 DEZAVANTAJELEUTILIZRIIIMAC

Fenomenul de transfer al ionului de metal conduce la pierderi de protein

i la randamente mici n recuperare. O alt problem ar fi dac proteina int
reine ionul de metal capturat n structura sa. n acest caz ionul capturat poate
afecta sau chiar aboli bioactivitatea proteinei. Sechestrarea ionului de metal de
ctre protein este de asemenea periculoas dac se intenioneaz a o utiliza
n scop terapeutic, deoarece o serie de metale n mod curent utilizate n IMAC
sunt considerate a fi carcinogene. Ionii metalici de Co(II) ori Ni(II), aproape
generaal utilizai n IMAC, sunt cunoscui a fi ageni carcinogeni, dei ei sunt
considerai mutageni slabi, comparativ cu arsenul ori cromul hexavalent.
Nichelul a fost legat de o expresie anormal a unui numr mare de gene
considerate a fi implicate n inducia cancerului. Acest fenomen poate fi
remediat prin alegerea unui alt ion metalic chelator care interacioneaz cu
proteina int. O alt cale care poate fi urmat este cea n care se utilizeaz un
agent chelator adsorbent puternic, de tipul TED [tris(carboximetil)-etilen
diamin].
 Scurgerea de ion de metal de pe rin conduce la contaminarea cu acesta a
produsului final, problem deosebit de important n cazul preparatelor terapeutice.
O problem aparte n acest caz este cea datorat chiar de interacia dintre ionul
metalic i proteina nsi,, mai ales n cazul proteinelor cu uz terapeutic, dup cum
este cunoscut faptul c ionii de metal nu numai c sunt catalizatori ai reaciilor
oxidative ci i afecteaz negativ stabilizarea preparatelor proteice liofilizate, dei se
tie c ionii de metal au fost utilizai drept aditivi alturi de zaharide n creterea
stabilitii proteinelor n decursul liofilizrii. n acest caz, n care ionul de metal este
un factor destabilizator, creterea stabilitii preparatului proteic se poate realiza prin
adugare de ageni chelatori. Probele proteice care conin ion metalici contaminani
dup o treapt de IMAC pot fi n continuare supuse unor alte etape de purificare
care n final conduc la preparate necontaminate, cu uz terapeutic. n cazul n care
se dorete eliminarea urmelor de metal ntr-o singur treapt se poate recurge la o
coloan de tipul de tipul TED n scopul capturrii ionilor de metal contaminani din
preparatul proteic. O alt cale elegant de eliminare a scurgerii de ion de metal o
reprezint utilizarea unor suporturi de imobilizare a metalului cu constante mari de
legare a acestuia, i astfel se poate preveni pierderea ionului de metal.
Utilizarea condiiilor oxidative i catalitice n timpul procesului de separare n
condiiile n care ionii metalici sunt imobilizai sunt nedorite datorit apariiei unor
procese redox care conduc la alterarea proteinei.
Utilizarea cromatografiei de afinitate pentru ion de metal n conjunctie
cu alte tehnici cromatografice

SECVENELE TERMINALE CU AFINITATE PENTRU

METAL: AVANTAJE I APLICAII
Identificarea proteinelor de fuziune
Creterea vitezei procesului de purificare
imobilizarea unei proteine pe o suprafa
Utilizarea secvenelor tag
creterea stabilitii proteinei i de cretere a nivelului de
exprimare
 CROMATOGRAFIA CU IONI DE ARGINT INCLUI

Cromatografia cu ion de argint (denumit uneori i cromatografie

de argentare) reprezint o tehnic care se bazeaz pe o proprietate a
ionilor de argint de a forma complexe polare i reversibile cu centrii
nesaturai prezeni ntr-o serie de molecule organice precum cele din
lipidic ori flavonoidic. Se face astfel posibil separarea pe baza
numrului, configuraiei geometrice i a poziiei legturilor duble. n
practica cromatografic aceasta se realizeaz n conjuncie cu una
dintre procedurile cromatografice stabilite: prin TLC, n cele mai multe
experimente realizate n trecut sau mai recent, prin HPLC ori prin
cromatografie de fluid supercritic.
Sistemul, n mod uzual utilizat, implic ncorporarea ionilor de
argint ntr-un suport solid i uneori, n cazul cromatografiei cu faz
invers, utilizarea unei faze mobile n care au fost dizolvai ioni de argint.
Celelalte componente ale aranjamentului cromatografic de baz sunt
similare cromatografiei convenional.
O multitudine de metode de cromatografie cu ion de argint sunt
general aplicabile la o varietate de probe n timp ce altele, sunt mult mai
specifice.
 PRINCIPIUL I MECANISMUL CROMATOGRAFIEI CU IONI DE ARGINT INCLUI

Cromatografia cu ioni de argint inclui se bazeaz pe principiul c moleculele organice

nesaturate reacioneaz reversibil cu metale tranziionale precum argintul, formnd complexe
polare cu sarcin transferat. Astfel, se formeaz o legtur sigma ntre electronii 2 p * ai
legturii duble i orbitalii 5s i 5p liberi ai ionului de argint. Este implicat de asemenea o
legtur ntre electronii de antilegtur 2 p * ai legturii duble i orbitalii 4d ocupai ai
ionuluideargint.Triacomplexuluiestedeterminatdeaccesibilitateaelectronilornorbitali
ideinhibiiilestericealeacestora.
Se cunoate mai mult despre stabilitatea acestor complexe realizate n studii de interacie a
ionilor de argint cu diverse olefine cu caten scurt.
n cazul cromatografiei cu ioni de argint inclui n suportul cromatografic, a acizilor grai este
cunoscut c, n cazul dienelor cu grupri metilen ntrerupte, stabilitatea complexelor crete odat cu
creterea numrului de legturi duble, izomerii cu legturi duble aflate n poziie cis sunt mai
puternic reinut dect izomerii trans, iar stabilitatea scade odat cu creterea lungimii catenei, i
tinde odat cu creterea iniial a distanei dintre legturile duble s devin mai mare. Dienele
conjugate sunt reinute mai puin puternic dect dienele cu grupri metilen ntrerupte i monoenele
care sunt mai puternic reinute comparativ cu monoinele.
 Coloanele cromatografice de tipul n care ionii de
argint sunt legai prin intermediul legturilor ionice la resturi de
acid fenilsulfonic, legate la rndul lor de matricea de silice
posed proprieti chimice relativ bune.
Numeroi factori, n special cei legai de compoziie,
de temperatur a coloanei i de viteza de curgere a fazei
mobile pot fi controlai cu acuratee.
Acest sistem a fost utilizat n obinerea unor informaii
cantitative asupra mecanismului de interacie ntre ionii de
argint i legturile duble. S-a constatat c in acest sistem
cromatografic interactia ionului de argint inclus poate implica
un mecanism mixt de retenie. De exemplu, dupa cum ionii de
argint particip la complexarea legturilor duble, gruprile
libere de silanol interacioneaz cu gruprile esterice ale
acizilor grai.
Cromatografia n strat subire 2 al -
Santalene (banda 1), -Santalene (banda
2) i amestec hidrocarburi terpenice
(banda 3) pe (2A) gel de silice normal
(0% AgNO3)
Anticancer Benzotriazoles
 CROMATOGRAFIA CU FAZ STAIONAR CHIRAL
Enantiomerii, dup cum bine se cunoate, posed proprieti fizico-chimice identice pn n
momentul n care sunt plasai ntr-un mediu care este nsui chiral. Din acest motiv, ei trebuie s
posede o retenie egal n interacia cu orice faz staionar achiral, neputnd fi separai cu
ajutorul sistemelor cromatografice achirale. Pentru a crea un mediu chiral, se poate aduga o
component chiral adiional la sistemul cromatografic, aa-numitul selector chiral.
Selectorulchiralpoatefiprezentnfazamobil(tehnicdenumitfazmobilchiral)
orinfazastaionar(fazstaionarchiral).
Exista si cazul general, in care selectorul chiral este prezent n ambele faze iar
recunoatereachiralsemanifestsimultan,nfazelemobilistaionar.
FAZE STAIONARE CHIRALE

Majoritatea acestora sunt realizate pe suport de silicagel ce este

acoperit cu un material polimeric de care este legat un izomer optic
activ. De exemplu, forma L a prolinei se leag la un copolimer
reticulat polistiren-p-divinilbenzen pentru a se produce o faz
staionar optic activ necesar separrii a unor amestecuri
racemice de aminoacizi.
n aceast aplicaie, sunt introdui ionii de cupru n soluia
enantiomeric de analit ce urmeaz a fi separat. Dup cum se
observ n figura urmtoare are loc formarea unui complex teriar
ntre faza staionar, anionii de aminoacid i cationii de cupru.
Constanta de formare a acestui complex difer de formele D i L ale
aminoacidului analit ceea ce face posibil separarea acestora.
Reprezentareaschematicacomplexului
ternarformatntre
L-prolinlegatlafazastaionar,
unaminoacidprezentntr-unanaliti
ionulbivalentdecupru.
 Au fost dedicate o serie de studii pentru dezvoltarea unei mai bune
metodologii n cromatografia chiral, enantioselectiv, ceea ce a condus la
identificarea unor noi faze staionare chirale. O serie de ageni chirali au fost
derivatizai i imobilizai pe suprafaa suportului cromatografic (deseori
reprezentat de silicagel) servind drept discriminatori chirali n timpul procesului
cromatografic. De multe ori fazele staionare chirale sunt de preferat n
procesul de separare cromatografic datorit vitezei de analiz, posibilitatea
analizrii ori a purificrii unor enantiomeri dintr-un amestec complex, a
reproductibilitii analizei precum i a flexibilitii ei. n plus, sistemele
cromatografice analitice pot fi adaptate la separri preparative cnd se pot
colecta enantiomeri n form pur.

Aceast tehnic cromatografia cu faz staionar chiral are drept aplicabilitate

practic studiile de recunoatere molecular, dup cum retenia diferenial a
enantiomerilor n sistemul cromatografic care utilizeaz faze chirale staionare poate
fi datorat discriminrii chirale la nivelul situsurilor chirale, interacii care se pot
explora.
S-a artat c parametrii cromatografici obinui prin fazele staionare chirale pot fi
deosebit de sensibili, ceea ce conduce la separri n cazul unor enantiomeri cu proprieti
foarte apropiate. n plus, fazele staionare chirale pot fi utilizate n studii specifice de
recunoatere chiral ntre molecule. O alt aplicaie a cromatografiei cu faz chiral o
constituie studiul unor medicamente cu structur chiral.
O clasificare convenional a tipurilordefazestaionaredupmodul
deinteracientrefazastaionarienantiomer

Tip de interacie Exemple

albumina seric, glicoproteina a1-

Afinitate chiral a proteinelor acid (orosomucoid), ovomucoid i
chimotripsina.

Acces stereoselectiv la polimeri chirali

Polizaharide derivatizate ori libere.
helicai

Interacii sterice - ntre un donor i

un acceptor de tip chiral cu grupri Interacii Pirkle.
amido aromatice

Interacii gazd-macromolecul n Ciclodextrine, eteri coroan i

interiorul unei caviti chirale polimeri legai.

Ioni de cupru complexai cu zone

Schimb de ligand
moleculare chirale.
 Afinitate chiral a proteinelor

Dei -1 glicoproteina acid (AGP, orosomucoid) i ovomucoidul

(OVM) au cel mai mare cmp de aplicaii, multe rapoarte tiinifice au
descris separarea cromatografic i/sau studii de legare prin utilizarea
albuminei serice bovine (BSA), a albuminei serice umane (HSA) i a
celobiohidrolazei I (CBH I) drept selectori chiral imobilizati. Toate
aceste coloane sunt disponibile comercial la fel precum si coloanele
chiralecuavidinoripepsin,legate.
Proteine precum proteina de legare a riboflavinei, ovoglicoproteina
(fracia activ a preparatelor proaspete de ovomucoid) i
amiloglucozidaza reprezint sunt candidai promitori n separarea
chiral a compuilor biologic activi.
Alte faze chirale staionare descrise n literatur utilizeaz cu o
aplicabilitate relativ limitat sunt:
tripsina imobilizat
-chimotripsina,
conalbumina (ovotransferina) i
lizozimul.
 Se mai poate nota c numrul de proteine care pot fi utilizate
drept selectori chirali imobilizai n electroforeza capilar ori n alte
tehnici nrudite este mult mai mic dect cel utilizat n cromatografia
lichid.
Au fost descrise separri chirale prin electrocromatografie n
tuburi deschise capilare (open tubular capillary
electrochromatography, OTCEC) cu proteine adsorbite pe perete
(lizozim, avidin, albumina seric bovin - BSA, orosomucoid,
albumina seric uman - HSA) ca faze staionare.
n paralel au fost testate reele de BSAdextran i geluri reticulate
de BSA i celobiohidrolaz I n geluri de electroforez de afinitate.
n concluzie, aceste faze staionare se realizeaz din proteine
naturale legate la matricea de silice. Caracteristica de baz o
reprezint faptul c aceste proteine conin un mare numr de centrii
chirali recunoscui a reaciona puternic cu analiii mici manifestnd o
selectivitate chiral puternic. S-au evideniat situsuri interactive
specifice care conduc la selectivitatea chiral, dar, sunt prezente mult
mai multe situsuri ce numai contribuie la retenia general. Aceste alte
situsuri pot fi dezactivate de ctre aditivii prezeni n faza mobil (de
exemplu octilamina) care reduc astfel retenia general dar cresc
selectivitatea chiral.
 Acces stereoselectiv la polimeri chirali helicai
Cel de al doilea tip se bazeaz pe interacii chirale ntre solut i polimeri naturali i a fost
dezvolt de ctre Okamato i colaboratorii ce au descris n anul 1987 prima preparare de
suport chiral la care polizaharidele au fost legate de gelul de matricea solid activat prin
intermediul amino-propil-silice. Metoda de fixare const din utilizarea drept reactiv de legare
a diizocianatului.

Fixarea 3,5-dicloro- i a 3,5-

dimetilfenilcarbamatatuluila
celuloz pe gel de
aminopropilsilice.
 Dintre diversele tipuri de polimeri polizaharidici precum celuloza, amiloza, chitosanul, xilanul,
curdlanul, dextranul i inulina, celuloza i amiloza au fost utilizate n prepararea i comercializarea
suporturilor cromatografice de separare chiral. Celuloza i amiloza ca atare nu pot i nu sunt
comercializate drept suporturi cromatografice de separare chiral datorit capacitii lor sczute n
rezoluie ca i din cauza problemelor ce apar n manipularea lor. Din aceast cauz aceti polimeri
au fost derivatizai sub diverse forme (precum tricarbamai ori triesteri). Aceti derivai sunt apoi
legai pe suportul de silice.
Catenele polimerice ale unitilor de D(+) glucoz conin legturi -1,4 n cazul celulozei i
respectiv 1,4 n cazul amilozei. Aceste catene se afl ntr-o parte i n alta n form linear n
cazul celulozei i n form elicoidal n cazul amilozei.
Suporturile cromatografice de separare chiral pe baz de polizaharide sunt disponibile att n
modul de cromatografiere n faz normal ct i n cel de faz invers.

Structuriletridimensionalealecelulozei
ialeamilozei
 Mecanismul de recunoatere chiral la nivel molecular a interaciei
chirale n cazul suporturilor cromatografice chirale pe baz de
polizaharide rmne nc neclar dei s-a raportat c rezoluia chiral
realizat pe baza acestora este realizat prin interacii de hidrogen,
interacii , interacii dipol dipol induse, ntre suportul chiral i
enantiomeri.
S-a observat c legarea coordinativ contribuie de asemenea la rezoluia
chiral a enantiomerilor ce conin atomi de sulf n cadrul moleculei.
n plus fa de aceste legturi, efectele sterice guverneaz de asemenea
rezoluia chiral pe aceste suporturi pe baz de polizaharide.
Aadar, structura tridimensional a amestecurilor racemice (racemailor,
care conin grupri funcionale i inele aromatice) se asambleaz stereogenic
n diverse moduri n cavitile chirale ale fazei staionare, care se stabilizeaz
prin aceste legturi de magnitudini diferite att pentru enantiomerii (+) ct i
pentru cei () i astfel are loc ori se manifest rezoluia enantiomerilor.
Structurile chimice i ale celor mai
utilizatesuporturicromatograficede
separare chiral pe baz de
polizaharide (celuloz i amiloz).
Esterideceluloz:celuloztriacetat
(1); celuloz tribenzoat (2); celuloz
tri-4 metilbenzoat (3); celuloz
tricinamat (4); celuloz tri-3-
metilbenzoat (5); Carbamai ai
celulozei: celuloz trifenil carbamat
(6); celuloz tri-3,5-dimetilfenil
carbamat (7); celuloz 4-clorofenil
carbamat (8); celuloz tri-4 metil
fenilcarbamat (9); Carbamai ai
amilozei: amiloz tris 3,5-
dimetilfenil carbamat (10); amiloz
tris (S)- metilfenil carbamat (11);
amiloz tris (R)- metilfenil
carbamat(12).
 Interacii sterice - ntre un donor i un acceptor de tip chiral cu
grupri amido aromatice (Interacii Pirkle.)

Cel de al treilea tip este reprezentat de substanele chirale cu o mas

molecular relativ mic legate la silice. n acest caz fazele chirale staionare
de tip Pirkle sau nrudite cu acest tip de faze sunt compuse din selectori chirali
mici, sintetici ori molecule chirale care sunt ataate la gruprile silanol ale
suportului de silice prin brae (spacere) achirale.
Selectorii chirali conin grupri ori pri aromatice (fenil, dinitrofenil, naftil,
etc.), capabile s interacioneze printr-o interacie n trei puncte ce are loc
ntre selectorul chiral i analit. n plus fa de interaciile prin legturi de
hidrogen i cele dipol-dipol, interaciile dintre prile aromatice din
structura selectorului chiral i analit, joac un rol predominant.
Fiecare dintre gruprile legate are un numr limitat de centrii chirali dar,
datorit mrimii lor mici, se pot lega un numr mare de grupri la silice (opus
cazului n care complexelor mai mari cu pri chirale). Din aceast cauz apare
o probabilitate relativ nalt de meninere a interaciei dintre solut i centru
chiral. Avantajul fazelor chirale Pirkle este acela c per total, cum molecula
care interacioneaz este mic, soluii nu sunt puternic reinui i astfel
selectivitatea chiral devine factorul dominant.
 William Pirkle este cel care a descoperit i dezvoltat acest tip de faze staionare chirale. n
raionamentul su, Pirkle s-a bazat pe faptul c dac o molecul chiral are afiniti diferite
pentru enantiomeri, ea trebuie s posede un minimum de trei puncte de interacie; dintre
acestea, cel puin unul este stereochimic dependent.
n condiiile utilizrii fazei staionare chirale de tip Pirkle, recunoaterea chiral se
manifest la ambele situsuri de legare. Situsurile majore de legare sunt clasificate astfel: inele
aromatice - bazice; inele aromatice acide; situsuri acide; situsuri bazice; situsuri acide;
situsuri de interacie steric.
Inelele aromatice sunt potenial realizatoare de interacii . Situsurile acide furnizeaz
hidrogenii pentru formarea punilor intermoleculare poteniale dintre acetia. Situsurile bazice,
ca i electronii , pot de asemenea forma puni de hidrogen. Interaciile sterice se pot manifesta
de asemenea ntre dou grupri mari.
Suporturile de cromatografie chiral prin interacie Pirkle se divid n trei clase:
acceptori de electroni; donori de electroni; acceptori de electroni i donori de electroni .
Figura de mai jos prezint schematic mecanismul de legare chiral prin interacie Pirkle.

Reprezentarea schematic a mecanismului de

legare chiral prin interacie Pirkle. A= grupare
acid;B=Situsacid;C=Situsbazic.
 Un mare avantaj n utilizarea fazelor staionare chirale de tip Pirkle o
reprezint capacitatea de a inversa ordinea de eluie prin utilizarea aceluiai tip
de faz staionar chiral, dar cu configuraie absolut inversat. Este astfel
posibil a elua n urme enantiomerul, naintea celui major, o trstur dorit n
cazul determinrii puritii enantiomerilor. Pentru separri preparative este
benefic a elua compusul dorit, primul.

Fazele staionare chirale de tip Pirkle pot separa o multitudine de

enantiomeri din numeroase grupe de compui, precum: medicamente din
clasa acidului aril propionic, compui antiinflamatori nesteroidici, compui cu
importan n agricultur, produse naturale, - blocante, o multitudine de
compui farmacologici activi, etc.
 Al patrulea tip de faze staionare chirale este reprezentat de suporturi ce conin n
structura lor glicopeptide macrociclice i a fost introdus n cromatografie de ctre
Armstrong,n anul1994.
Glicopeptidele macrociclice sunt compui chimici care conin un numr mare de
centrii chirali, care genereaza o serie de caviti moleculare n care moleculele de solut
pot intra i astfel interaciona cu grupri aflate n aceste zone.
Caracterul spaial al solutului va determina gradul de ptrundere i n consecin
proximitatea interaciei care, n schimb, va determina energia de interacie i
magnitudinea reteniei.

Antibioticele macrociclice posed o serie de caracteristici care le permit s interacioneze cu

analiii i astfel s serveasc drept selectori chirali. Ele posed un numr de centrii stereogenici i
grupri funcionale, care particip la multiplele interacii cu moleculele chirale. Ele posed o mas
molecular cuprins ntre 600 - 2200 i au deseori numeroase grupri funcionale inserate pe
structura lor.
-pot fi acide, bazice ori neutre, neavnd ori avnd o absorban redus n domeniul UV
VIS.
-pot interaciona prin interacii hidrofobe, dipoldipol, interacii , legturi de hidrogen
precum i prin repulsii sterice.
Una dintre cele mai importante interacii sunt cele ionice ori cele de schimb de electroni. n
plus fa de prile hidrofobe, aceste molecule posed grupri hidrofile precum i un numr de
grupri ionizabile, ceea ce permite o bun solubilitate n soluii apoase.
 Ansamicinele, rifamicina B i
rifamicina SV, au o semnificaie
istoric, deoarece ele au fost
utilizate la nceput drept
selectori chirali exclusiv n
Cele mai de succes i mai utilizate
electroforeza capilar, nainte
antibiotice macrociclice ca i selectori
de a fi utilizate n cromatografie.
chirali sunt glicopeptidele. Ansamicinele,
Rifamicina B a fost primul dintre
polipeptida tiostrepton i
compuii ansa utilizai n
aminoglicozidele, fradiomicin, kanamicin
electroforeza capilar pentru
i streptomicin, au fost de asemenea
separarea efectiv a unei
utilizate drept selectori chirali.
varieti de analii ce conin
grupri amino. Aceste au o
structur caracteristic ansa ce
cuprinde o structur de inel ori
un cromofor ce este nepat de
o caten. Catena alifatic poate
fi nalt substituit din care cauz
ansamicinele difer prin tipul i
poziia substituenilor pe inelul
naftohidroquinonic, dup cum
se observ n figur
UTILIZATAREA UNOR ANTIBIOTICE CA FAZE STAIONARE CHIRALE

Structurilechimice,numerotare
(A,B)ireprezentareaschematic
spaial(C,D)arifamicineiBia
rifamicineiSV.
 Catena alifatic a ambilor compui prezint un etil ester la C 21 i un metil eter la C23.
ansamicinele cele mai des utilizate n separri chirale sunt rifamicina B i rifamicina SV. S-a artat
c rifamicina B prezint enantioselectivitate fa de compui cationici, n timp ce rifamicina SV este
enantioselectiv fa de solui neutrii ori oarecum anionici.
Ansamicinele rifamicina B i SV, absorb puternic n regiuni spectrale UV i vizibile din cauza
inelului naftohidroquinonic. Fiecare compus are maximum de absorbie la 220, 304 i 425 nm. Din
aceast cauz rifamicinele sunt utilizate la concentraii relativ nalte (2025 mM), separrile fiind n
monitorizate (urmrite) cel mai adesea prin detecie indirect. Detecia indirect se realizeaz n
general, prin analiza peak-urilor negative, proces datorat reducerii absorbanei comparativ cu
semnalul de fond (semnal background).
Glicopeptide
Antibioticele macrociclice de natur glicopeptidic par a fi cei mai buni selectori chirali
descoperii pn n prezent. Ele includ avoparcina, ristocetina A, teicoplanina, vancomicina i doi
analogi derivai ai vancomicinei.

Structurile chimice ale antibioticelor

macrociclice de natur glicopeptidic
utilizate n cromatografia cu faz
chiral: (A) vancomicina, (B)
teicoplanina, (C) avoparcina, (D)
ristocetinaA.
 tiostreptona
Polipeptide i aminoglicozide Kanamicin sulfat
Streptomicina
fradiomicina

O dat cu introducerea fazelor legate ce conin antibiotic macrociclic acestea au devenit

extrem de populare deoarece s-au dovedit deosebit de utile ca n separrile chirale prin
cromatografie lichid, n special de nalt performan. Antibioticele macrociclice vancomicina,
ristocetina A, teicoplanina, avoparcina, rifamicina B i tiostreptona au fost utilizate pentru
separri chirale. Antibioticele macrociclice de natur glicopeptididic, vancomicina, ristocetina A,
teicoplanina i avoparcina par a avea o enantioselectivitate mai larg comparativ cu cea a
ansamicinelor ori a polipeptidului tiostrepton. Antibioticele macrociclice sunt legate covalent la
gelul de silice prin intermediul unor variate puni de natur chimic ce le asigur stabilitatea cu
meninerea proprietilor de recunoatere chiral.
Antibioticele macrociclice de natur glicopeptididic i tiostreptona sunt ataate la gelul de
silice prin reacia gruprilor lor carboxilice cu organosilani, n timp ce antibioticul macrociclic
rifamicina B poate fi ataat prin intermediul reaciei dintre gruprile aminice cu organosilani.
Antibioticele macrociclice de natur glicopeptidic pot fi de asemenea ataate prin reacie de
epoxilare similar metodei utilizate pentru imobilizarea ciclodextrinelor, ori pot fi imobilizate prin
metoda cu izocianat, n mediu anhidru de dimetilformamid.
 Fazele cu glicopeptide legate pot fi utilizate n modul de faz normal, faz
invers ori n solveni organici polari pentru a atinge diferite enantioselectiviti sau
pot fi derivatizare pentru a li se altera enantioselectivitatea.
Fazele cu antibiotice macrociclice legate realizeaz criteriul general pe care
cele mai utilizate faze legate l ndeplinesc, adic sunt suficient de efective ca
medii de separare, manifest o bun rezisten mecanic, alturi de un pre
accesibil. Fazele legate cu antibiotice macrociclice sunt similare fazelor staionare
chirale cu proteine legate i au o capacitate mai mare alturi de o mai bun
stabilitate.
Enantioseparrile se realizeaz printr-o multitudine de interacii precum:
complexri ,
legturi de hidrogen,
incluziuni hidrofobe,
interacii dipol-dipol,
repulsii sterice, precum i
combinaii ale acestor interacii.
n timp ce cu alte faze staionare se pot produce o serie din interacii
asemntoare, ele nu sunt n mod normal accesibile pentru o singur faz legat
cu o proximitate nchis.
n opoziie la fazele staionare chirale cu proteine legate, cele pe baz de
antibiotice macrociclice pot fi utilizate n procedeul cu faz normal fr nici o
modificare ireversibil n enantioselectivitate, proces datorat n primul caz
denaturrii proteinei legate. Aceste faze pot fi utilizate i n separri preparative.
 Vancomicina, rifamicina B i tiostreptona au fost primele
antibiotice macrociclice introduse sub form legat n cromatografia cu
faz staionar chiral. Dintre acestea trei, numai vancomicina a
demonstrat un potenial larg de aplicare, fiind folosit att n procedeul
cromatografic cu faz invers ct i n cel cu faz normal. Vancomicina
a fost de asemenea derivatizat cu 3,5-dimetil - fenilizocianat (DMP) i
evaluat apoi din punct de vedere al calitilor de faz chiral. Faza
staionar cu DMP - vancomicin a fost capabil s rezolve o serie de
compui pe care suportul chiral cu vancomicin nu a reuit, n special n
cazul hidroxizinei i a altiazidei.
Suportul chiral cu vancomicin legat a fost utilizat ntr-un mare
numr de aplicaii, pentru separarea multor compui optic activi. Acest
suport chiral a fost utilizat la rezolvarea unor amestecuri racemice de
piridone (derivai ai piridinei cu una sau mai multe grupri cetonice pe un
inel), arildihidropirimidin carboxilai (analogi dihidropiridinici ai
modulatorilor canalelor de calciu de tip nifedipinic, un agent clasic
coronaro vasodilator i blocant al canalului de calciu, care reduce
accesibilitatea ionilor de calciu la nivelul musculaturii netede i a inimii,
utilizat n tratamentul anginei pectorale); enantiomeri ai citalopramului
(medicament utilizat n tratamentul depresiilor) ori ai metaboliilor
demetilai derivai ai acestuia din plasma uman, a aminoacizilor i
dansil derivailor acestora; imide ciclice, barbiturice, piperdin-2,6-dione i
produi de semisintez din alcaloizi izolai din ergot.
 Teicoplanina s-a utilizat ca faz chiral legat n separarea a peste de
compui 90 optic activi printre care aminoacizi i peptide, salbutamolului (un
agent simpatomimetic utilizat drept bronhodilator, n special n tratamentul
astmei) i ai metaboliilor lui din matrix-uri biologice, n determinarea
enantiomerilor albuterolului (un stimulant -adrenergic utilizat drept
bronhodilator n tratamentul astei i a altor boli obstructive de pulmon) din
plasm, n separarea unor aminoacizi rari aromatici. Aceasta din urm difer de
vancomicin printr-o coad hidrofob, ceea ce-i confer proprieti chirale
diferite. Teicoplanina a fost deseori utilizat mpreun cu vancomicina n
separarea unui mare numr de solui.
Ristocetina A reprezint unul din ultimele glicopeptide utilizate n
cromatografia cu faz chiral. Prin utilizarea ei s-au separat peste 230 de
amestecuri racemice, n sistem de faz normal ori faz invers. Din punct de
vedere al caracteristicilor de retenie, al stabilitii coloanei, se pare c acest
suport chiral este complementar primelor dou glicopeptide prezentate mai sus,
vancomicina i teicoplanina.
 Avoparcina a fost izolat din sangele de pui de gin i
a fost utilizat la drept faz chiral legat la gelul de silice n
analizele HPLC, fiind folosit n condiiile n care alte faze
staionare chirale nu pot rezolva n totalitate o serie de
amestecuri racemice, precum cele ale verapamilului (un
vasodilator calciu blocant utilizat n tratamentul
hipertensiunii, anginei pectorale i a unor aritmii cardiace),
a tiroxinei (un hormon ce conine iod secretat de ctre
glanda tiroid i care amplific viteza metabolismului
celular, reglnd creterea), ori a mefenitoinei (un
medicament toxic anticonvulsiv cu denumire comercial
mesantoin utilizat n tratamentul epilepsiei n condiiile n
care alte medicamente anticonvulsive devin ineficace).
Interactii de schimb de ligand (Ioni de cupru complexai cu zone moleculare chirale)

Al cincilea tip de cromatografie cu faz chiral legat se

refer la cea de schimb enantioselectiv de ligand, tehnic
sugerat de Davankov i colaboratorii spre sfritul anilor 70,
fiind utilizat la rezolvarea unor amestecuri de racemici n
enantiomerii constitueni, fiind astfel prima tehnic de
cromatografie lichid care conduce la o separare complet i
cert a stereoizomerilor din cele mai importante clase de
compui naturali ori de sintez, precum aminoacizii,
hidroxiacizi, aminoalcooli i a multor altora. Introducerea
cromatografiei cu schimb de ligand a condus la o dezvoltare n
cercetarea chimic (studii stereochimice, sinteze asimetrice,
cataliz enantioselectiv) i n cea farmacologic.
 Principiul de baz al separrii enantioselective prin cromatografie cu schimb de
ligand a fost demonstrat de ctre un selector chiral chimic legat la o matrice polimeric
precum un complex al Cu (II) cu o serie de aminoacizi naturali care formeaz n anumite
condiii complexe ternare compuse din ligandul chiral din faza staionar, ionul de Cu (II)
i analit. Enantioselectivitatea formrii de complexe ternare, de exemplu diferena n
stabiliti termodinamice a dou structuri diastereoizomerice ce cuprind enantiomeri (R)
sau (S) ai analitului este extrem de mare.
Implicarea a doi enantiomeri ntr-un proces de complexare este aproape identic iar
n ceea ce privete mrimea i sarcina celor dou complexe diastereomerice ternare
formate acestea sunt exact identice. Dou specii diastereomerice pot diferi numai prin
forma spaial a lor, singura diferen care poate afecta n mod dramatic reprezentnd-o
adsorbia lor pe suprafee solide ori pseudo-solide. Acest fenomen reprezint baza fizic
a procesului de discriminare chiral
 Metode de separare

de atingere a s tarii de echilibru

Cromatografia Elec tro foreza (steady state, displacement electrophoresis)
frontal, liber, de migrare n s olutii (tampon)
moving boundary electrophoresis is otachophoreza
focus are (focalizare) is oelectrica
n medii s tabilizate, zonalisoelectric focusing
(zone electrophoresis)
suportul stabilizeaz zonele de migrare
si permite o mai bun separare
suporturi chimic active
medii suport cu structur capilar
medii suport cu structur reticular imunoelectroforeza
pe strat subtire electroforeza de afinitate
pe hrtie
pe folii de acetat de celuloz pe poliacrilamid
pe agar, agaroz
pe amidon
 Istoric
600 i. C. - Thales din Milet
1908- Reiss
1909 Michaelis
1937 Tiselius
1947 Martin & Synge - definesc
ionoforeza
 Concepte de baza in electroforeza
Fenomenele electrocinetice de transport se tine cont de
faptul de:
Particula care migreaza (coloidul de dispersie)
Mediul de dispersie
Coloizii de dispersie sunt putatori de sarcina electrica
Cohen-la contactul dintre dou faze, faza cu constanta
dielectric mare se ncarc pozitiv
Graham- chemosorbtie
 qs reprezint densitatea electric superficial
d2 este grosimea stratului dublu
este constanta dielectric a mediului
(zeta)=potenial electrocinetic care apare la
suprafaa particulei din mediu i care
genereaz separarea electroforetic

k-1 = grosimea stratului dublu electric (sau

lungimea Debye)
kB = constanta Boltzmann
T= temperatura
e = sarcina electric
F = constanta Faraday
I = tria ionic zi ; ci = valena respectiv concentraia molar
a ionilor din soluie
O particul ncrcat electric, ntr-un mediu lichid tamponat, sub ac iunea unui cmp electric uniform, se va
deplasa cu o vitez constant, determinat de aciunea a patru fore:
Fora de atracie electroforetic (F1) egal cu produsul dintre sarcina electric Q a particulei ( a entit ii
electrocinetice) i intensitatea cmpului electric aplicat (E)

Fora de frecare Stokes (F2), egal cu produsul dintre coeficientul de vscozitate a mediului (), raza
particulei (r) i viteza electroforetic, v dup relaia:

F2= 6rv

Fora de frnare electroforetic (F3) rezultat ca urmare a atraciei exercitate de cmpul electric asupra
ionilor electrolitului (soluia tampon n care se deplaseaz particula) conform rela iei:

F3= (Q - r)E
unde, Q reprezint sarcina electric a particulei;
este constanta dielectric a mediului;
reprezint potenialul zeta;
r este raza particulei;
E reprezint intensitatea cmpului electric aplicat.
Fora datorat efectului de frnare (F4), for care apare din cauza redistribuirii ionilor electrolitului n
apropierea particulei, sub aciunea unui cmp electric uniform.
 Imediat dup aplicarea unui cmp electric , suma vectorial a celor patru for e devine
egal cu zero, iar viteza electroforetic devine constant:

Pentru electroforeza n medii stabilizate (gel de amidon, poliacrilamid, etc.) F3 i F4 sunt practic
neglijabile, astfel nct for ei de atrac ie electroforetice ( F1) se opune for a de frecare Stokes
(F2):

ceea ce nseamn c:

Din ultima rela ie se calculeaz viteza electroforetic:

Ecuaia de mai sus conduce la relaia Huckel:

unde reprezint poten ialul zeta;

este constanta dielectric a mediului;
H este gradientul de poten ial, egal cu raportul dintre tensiunea
aplicat, E i distan a dintre electrozi, l.
r este raza particulei;
E reprezint intensitatea cmpului electric aplicat.

La baza fenomenelor electrocinetice importan practic are relaia Helmholtz-

Smoluchovski:

Henry, plecnd de la relaiile Huckel i Helmholtz-Smoluchovski, le generalizeaz

conform teoriei stratului difuz:

unde re reprezint raza efectiv a particulei hidratate, r+, iar este inversul grosimii
stratului dublu electric, fiind cuantificat de relaia:
 n care: z reprezint valena;
e este sarcina elementar;
n este numrul ionilor

La temperatura camerei,
pentru n=c (n moli/litru)

Se poate deci evalua potenialul zeta ():

unde v reprezint viteza electroforetic.

 MOBILITATEAELECTROFORETIC

Mobilitatea electroforetic este n relaie de proporionalitate

direct cu viteza electroforetic, fiind raportul dintre viteza
electroforetic i intensitatea cmpului electric. Ea se determin
prin msurarea intervalului de timp, t, necesar unei particule sau
unei interfee solid-lichid s parcurg o anumit distan , d, sub
aciunea unei diferene de potenial exterior.

Dac l, reprezint distana dintre electrozi msurat n interiorul

soluiei, atunci mobilitatea electroforetic se poate scrie:

Cum H (gradientul de potenial), este egal cu raportul

dintre intensitatea cmpului electric aplicat (tensiunea
aplicat), E i distana dintre electrozi, l, se poate scrie:

de unde se deduce mobilitatea efectiv (msurat n sistemul

internaional n m2V-1s-1), :
n practic se folosete mobilitatea relativ, o care
este proporional cu distana de migrare:

Mobilitatea relativ se calculeaz prin compararea mobilitilor diferitelor particule,

considerndu-se c timpul de migrare i intensitatea cmpului electric sunt constante
(adic particulele care se compar au condi ii identice de migrare electroforetic.

Pentru electroforeza n medii stabilizate, cnd

adic,

Se calculeaz viteza de migrare drept:

Coeficientul 6r este denumit coeficient de friciune (frecare) n

medii stabilizate. El depinde de o multitudine de factori.
 Substituind viteza electroforetic din rela ia de mai
sus n ecuaia mobilitii relative:

atunci,

Se observ astfel faptul c mobilitatea relativ este n funcie de sarcina particulei, Q

i de raza sa, r:

unde :
Q reprezint sarcina particulelor,
iar r este raza particulei.
Se poate spune c particulele cu un raport Q/r identic vor avea o mobilitate identic
 Cum Q este produsul dintre suprafa i
densitatea de sarcin superficial, qs,
pentru o particul sferic cu raza r, sarcina
particulei este:
Q = 4 r2qs

iar mobilitatea relativ este funcie de raportul Q/r

atunci, Q/r = 4 rqs

ceea ce arat c dac variaiile dimensiunilor particulelor sunt compensate de

variaiile de sarcin electric superficial, particulele vor migra cu mobilit i
egale.
 REZOLUIADESEPARARE

n electroforeza ntr-un mediu stabilizat, particulele cu

mobiliti () diferite se vor deplasa n zone discrete.
Teoretic separarea diferitelor particule sub form de zone
discrete este realizat, dac mobilitile relative sunt suficient
de diferite i dac distana migrrii este suficient de mare.
Eficiena unei separri electroforetice este exprimat printr-o
mrime denumit rezoluie de separare, Rs.

Considernd dou zone separate electroforetic, cu l imea benzii egal

cu l1 i l2, iar distana dintre ele fiind egal cu d, rezoluia de separare
este egal cu:

unde d reprezint distana dintre centrele zonelor 1 i 2, iar l1 i l2 sunt limile celor
dou zone formate de dou tipuri de particule.
 Drumul parcurs (distana) n procesul separrii electroforetice este
egal cu: d = vt
unde v reprezint viteza electroforetic iar t este timpul de migrare

Din relaia mobilitii, =V/E se deduce viteza electroforetic, v=E, iar drumul
parcurs de o particul n funcie de mobilitatea sa este dat de relaia:

Se poate spune c drumul parcurs de o particul este egal cu produsul dintre

mobilitatea sa, timpul de migrare i cmpul electric aplicat.
Pentru particula 1, drumul parcurs de aceasta este egal cu d1 = 1Et iar drumul
parcurs de particula 2 este egal cu d2 = 2Et.

Cum d reprezint distana dintre centrele zonelor 1 i 2 fiind egal cu diferena de

migrare ntre cele dou particule (d1-d2) se deduce rezoluia de separare:
Se consider c:
(1)pentru o separare electroforetic eficient este necesar o rezolu ie de separare
cuprins ntre 1 i 1,5;
(2)limea zonelor de separare (l1 i l2 din figura de mai sus) are un rol hotrtor. Ea
este asociat cu dispersia Gauss datorat procesului aleatoriu de deplasare.
Dispersia total este suma a cinci termeni care acioneaz independent:
Difuziunea termic;
Microheterogenitatea;
Difuziunea turbulent;
Electrodifuziunea;
Electrosorbia.
Primii doi termeni acioneaz i sunt importan i n cazul electroforezei n mediu liber;
difuziunea termic i difuziunea turbulent sunt termeni importanti n cazul
electroforezei pe medii stabilizate.
Pe de alt parte, analiza relaiei rezolu iei de separare n contextul proceselor de
dispersie arat c pentru creterea rezolu iei dee separare este de preferat cre terea
intensitii cmpului electric i nu a timpului de migrare.
 FACTORIICAREINFLUENEAZREZOLUIADE
SEPARAREIMOBILITATEAELECTROFORETIC

Mobilitatea particulelor care se deplaseaz ntr-un cmp electric uniform

precum i rezoluia de separare dintre particule cu mobilit i diferite sunt
influenate de urmtorii factori:
pH-ul soluiei tampon. Acesta afecteaz mobilitatea deoarece sarcina
electric este funcie de pH. Din aceast cauz, alegerea solu ie i cu pH
optim conduce la rezoluii superiore.
Difuziunea postelectroforetic care depinde de metoda electroforetic
utilizat.
Factori proprii particulelor: mrime, form, sarcin electric,
concentraie, gradul de hidratare i disociere.
Factori caracteristici mediului de separare: vscozitate, pH, intensitatea
cmpului electric, timpul de migrare.
Ali factori.
 TRIAIONIC(FORAIONIC)

Cmpul ionic dezvoltat de un ion n soluie depinde de:

(a)concentraia sa;
(b)valena (sarcina) sa;
(c)prezena altor ioni n soluie.
n soluii diluate, tria ionic este independent
de natura chimic a ionului. Pentru a ine cont
de toi ace ti parametrii, s-a introdus o mrime
denumit trie ionic (for ionic).
Prin definiie, tria (fora) ionic (j) reprezint
semisuma termenilor obinui prin nmulirea
concentraiilor molare (c) a fiecrui ion n
soluie cu ptratul valenei sale (z):

unde i = 1,2,....n
n calculul forei ionice a unei soluii tampon se consider c acizii slabi sunt
nedisociai, n schimb srurile lor sunt complet disociate.
Astfel, pentru o soluie tampon coninnd 8,8 g/l acid dietilbarbituric i 10,3
g/l dietilbarbiturat de sodiu, fora ionic este dat numai din disocierea srii de sodiu
i ionul de dietilbarbiturat. Cum dietilbarbituratul are masa molecular de 206,18g,
10,3 grame reprezint 0,05 moli/l, de aici se trage concluzia c tria ionic (j) este
egal cu 0,05M.
Teoretic, mobilitatea electroforetic este invers propor ional cu rdcina ptrat a
forei ionice:
Din aceast relaie se poate observa c la micorarea triei ionice
are loc o cretere a intensitii cmpului electric uniform aplicat.
Astfel, datorit faptului c rezoluia de separare este direct
proporional cu intensitatea cmpului electric uniform aplicat,
scderea triei ionice conduce la creterea rezoluiei de separare.
n general se consider c:
(a)soluii tampon cu fore ionice mici permit viteze de migrare mari,
deci mobiliti mari;
(b)fore ionice mai mari de 0,15M conduc la viteze de migrare mici
la timpi de migrare mici dar cu o rezoluie bun. Trebuie totu i avut
n vedere c o for ionic prea mic poate conduce la precipitarea
probelor.
 EFECTULTERMICJOULE

n timpul unei separri electroforetice, la trecerea curentului

electric prin soluie are loc o degajare de cldur denumit
cldur Joule sau efect Joule. Acest efect este deosebit de
important n condiiile n care poate afecta negativ separarea
electroforetic prin favorizarea proceselor de difuziune, a
apariiei curenilor de convecie ori de denaturare a probei
(mai ales n cazul enzimelor). Din acest motiv este necesar
meninerea ntre anumite limite a acestui efect.
Efectul termic Joule poate fi controlat
(a)n sisteme tampon continue prin valoarea puterii electrice
intrate (dac temperatura este constant);
(b)n sisteme tampon discontinue (multifazice) prin controlul
rezistenei electrice a mediului de separare.
Rezistena electric crete odat cu avansarea frontului mobil datorit
scderii conductivitii mediului. Astfel, la o intensitate a curentului ( I)
constant, crete tensiunea (U) i cldura degajat este n relaie direct
cu timpul de migrare. Dac tensiunea este constant, scderea
intensitii este funcie de timpul de separare iar cldura degajat
dezvoltat prin efect Joule va fi redus ns rezolu ia de separare va fi
slab.
Conform primei legi a lui Ohm, intensitatea curentului (I) este direct
proporional cu tensiunea electric (voltajul, V) i invers
proporional cu rezistena (R). Rezistena sistemelor electroforetice
este dat de
tampoanele utilizate,
de tipul de configuraii ale gelului
de volumul total al gelurilor care se ruleaz.
tensiunea electric este dat de produsul dintre intensitate i rezisten
dup relaia:
 ELECTRO(ENDO)OSMOZA

Electro(endo)osmoza este un fenomen electrocinetic care apare n urma deplasrii

fazei lichide de dispersie printr-un capilar, sisteme capilare sau medii poroase la
aplicarea unui cmp electric exterior.
Ea se caracterizeaz prin deplasarea electrolitului n cmpul electric aplicat.
Din aceeai categorie de fenomene fac parte potenialul de curgere (fenomen opus
electroendoosmozei) i potenialul de sedimentare.
n medii suport stabilizate (hrtie de filtru, dar mai ales n gelul de agaroz)
electroendoosmoza se coreleaz cu proporia de sarcini negative ale acestora , motiv
pentru care se induce un flux de lichid spre catod. Cum particulele care se separ sunt
ncrcate negativ, iar migrarea lor se realizeaz spre anod, apar fenomene de convec ii
interne, deci se produc modificri ale mobilit ii electroforetice i astfel ale rezolu iei
de separare.
n medii poroase saturate cu o soluie ionic se manifest o serie de sarcini electrice
fixate pe suprafaa fazei solide, distribuia spa ial a anionilor i cationilor din faza
lichid are la baz teoria stratului dublu electric. Dac sarcinile fixe sunt negative, sunt
necesari cationi n exces din faza mobil pentru a asigura electro-neutralitatea. La
aplicarea unui cmp electric exterior, ace ti cationi n exces exercit un moment
adiional n fluidul din por care conduce faza lichid spre catod. Aceast micare
net a fluidului fa de structura solidului ntr-un gradient electric impus este denumit
electroosmoz. n practic, viteza electroosmotic este descris la scal macroscopic de
relaia:

n concluzie, pentru ca electroforeza s fie reproductibil, este

necesar a se preciza riguros condi iile de lucru precum: calitatea
mediului de separare, proprietile sistemului tampon,
caracteristicile probei, stabilirea cmpului electric aplicat,
temperatura i timpul de lucru.
 APARATURA UTILIZAT LA
SEPARRILE ELECTROFORETICE

Pentru a realiza un experiment de separare

i analiz electroforetic sunt necesare
urmtoarele sisteme:
Surs de putere care genereaz un curent
electric continuu, stabilizat;
Aparatul propriu-zis alctuit dup metoda
electroforetic utilizat, avnd o construcie
variat dar care trebuie s prezinte
compartimente pentru electrozi (din platin,
grafit, etc.) i uneori sisteme de
termostatare;
Dispozitive anexe care cuprind:
(a) dispozitiv de turnat plci (amidon,
poliacrilamid, etc.);
(b) cuve de fixare, colorare, splare
(decolorare);
(c) sistem de uscare (uneori cu aer
cald);
(d) sisteme de evaluare optic
(spectrofotometru cu sistem de baleiere,
densitometru cu lungime de und fixa, cu
sistem de reflexie sau fluorescen, sisteme
video de preluare a imaginii i de analiz a
gelurilor;
(e) dispozitive specifice.
 ELECTROFOREZA N MEDIU LIBER

Prin definiie, electroforeza n mediu liber se bazeaz pe deplasarea

liber a componentelor cu mobiliti diferite dintr-un amestec sub
aciunea unui cmp electric exterior. n acest context, ntre diferitele
componente se formeaz suprafee de separare (fronturi - de unde i
denumirea de electroforez frontal). Aceste fronturi pot fi observate
prin modificarea brusc a indicelui de refracie (ca i n cazul
ultracentrifugrii). Prin msurarea acestui indice de refrac ie de-a
lungul celulei electroforetice se obin diagrame electroforetice denumite
diagrame Schlieren. Din deplasarea fronturilor se calculeaz vitezele
de migrare.
Tehnica este pretabil la automatizare i computerizare, fiind de
asemenea utilizat la separarea componentelor n flux continuu
(proteine, organite celulare, celule).
Aparatura utilizat n electroforeza n mediu liber are la baz aparatul Tiselius,
care are forma literei U, ns aparatele moderne au modificri la sistemul de
electrozi (reversibili), la modul de alimentare cu solu ie tampon, modul de
ncrcare a probei, modul de nregistrare a vitezei de deplasare.
Prile principale ale aparatului sunt reprezentate din
(a)compartimentul de electrozi;
(b)celula electroforetic;
(c)sistemul de termostatare;
(d)sistemul de nregistrare.
Celula electroforetic este alctuit din trei sectoare care se pot deplasa lateral prin
glisare. Modul de ncrcare cu prob este prezentat n figura de mai jos. Separarea
se realizeaz la temperaturi sczute (2 - 4oC) la o diferen de potenial de 4-10
V/cm timp de 6 ore.
S presupunem c avem un amestec de dou componente P A i PB (pot fi luate n
discuie dou proteine) cu mobiliti diferite (A B) care se deplaseaz n aceeai
direcie.
Dac n momentul iniial concentraia celor dou proteine este constant/identic pe
tot parcursul tubului electroforetic, dup cum semnalul la sistemul optic este
constant. Dup introducerea n cmp electric, proteina PA, cu mobilitate mai mare va
migra mai rapid spre anod, mbogind frontul de solvent dar srcind coada tubului
(figura de mai jos)

Principiul de separare a dou componente prin electroforez n mediu liber.

 Dup trecerea unui timp suficient de mare proteina P A se va concentra n
fronul de electroforez, iar proteina PB va migra dup aceasta. Dac se
reprezint grafic semnalul primit de sistemul optic se realizeaz o diagram
Schlieren.

Diagrama Schlieren pentru dou componente

(PA i PB) separate prin electroforez n mediu
liber (c=concentraie, n=indice de refracie).

Prin derivatizarea concentraiei sau a indicelui de refrac ie rezult o

electroforegram cu peak-uri electroforetice.
 AVANTAJELEUTILIZRIIELECTROFOREZEI
FRONTALE

De la introducerea electroforezei n mediu liber (free-flow electrophoresis, FFE), n anii 1960,

aceast metod de separare i-a gsit o poziie permanent printre metodele de analiz i
preparative n biochimie precum i n chimie pentru separarea, de exemplu, a celulelor,
organitelor celulare, a peptidelor, proteinelor, a compu ilor anorganici i organici. n FFE,
substane de analizat sunt separate n mod continuu ntr-un cmp electric aplicat perpendicular
peste un strat subire de tampon transportor n flux continuu dup cum se observ n figura
urmatoare.
Un amestec de prob este injectat n fluxul continuu de electrolit transportor, iar dup un timp de
migrare, componente, diferit ncrcate, se mpart pe culoarele de migrare diferite care pot fi n
continuare colectate la captul aparatului.
Sistemele FFE disponibile la scar larg n comer au fost iniial dezvoltat ca sisteme de cur are
a unei probe, de exemplu, ca o treapt de Prefracionare nainte de a o electroforez
bidimensional. n continuare au fost dezvoltate mini sisteme cu dimensiuni reduse de FFE care
se pot cupla la spectrometrul de mas sau la cromatograful de lichide i care permit separarea
continu cu posibiliti de detectare a on-line. Aceast combinaie de FFE, ca metod pentru
separarea continu cu detectare on-line, permite monitorizarea n timp real a analitului, n cazul
probelor biologice ale unor pacieni, produi de reacie, etc. Sistemele rmn n continuare
complicate i sunt nc lente n funcionare, totu i utilizarea lor pare a fi foarte promitoare.
Aparatele electroforetice care func ioneaz dup principiul curgerii libere (frontale) n form
miniaturizat (-FFE) i-ar putea gsi aplicaii n construc ia unor aparate miniaturizate portabile
de monitorizare a unor pacieni.
O ilustrare a principiului electroforezei
libere frontale i principalele
componente ale unui sistem de
separare electroforetic i micro-
electroforetic. Tamponul curge n flux
laminar ntr-un film continuu de 0,3 mm,
de sus n jos sub aciunea forei
gravitaionale. Proba se introduce
lateral. Sub aciunea cmpului electric,
componentele probei se deplaseaz
spre anod lateral i totodat de sus n
jos, odat cu tamponul.
FFE la spitalul universitar din
Basel
Miniaturizarea FFE implic mai multe avantaje mai ales avnd n vedere
volumul eantionului i de vitez de separare. n contrast cu volumele de
ordinul mililitrilor de prob consumate de tehnicile convenionale de
dispozitivele FFE, microsistemele FFE au nevoie doar de cteva zeci de
nanolitrii pn la cteva sute de microlitri de prob. Acest lucru este deosebit
de util n analizele clinice, n cazul n care de multe ori sunt disponibile numai
volume sczute de prob biologic. Mai mult, timpul de analiz scade de la
cteva ore-zeci de minute, la cteva secunde n cazul timpului de analiz
microdispozitive FFE

DEZAVANTAJELE ELECTROFOREZEI FRONTALE

Dintre dezavantajele electroforezei frontale se pot enumera:

Aparatura necesar;
Amestecarea zonelor datorit difuziunii, curenilor de convec ie, motiv pentru
care este strict necesar existena unui sistem de termostatare;
Existena unor anomalii de interpretare. Astfel, suprafa a peak-ului nu este identic
cu concentraia de protein. Un alt tip de anomalii sunt legate de migrare. n acest
context viteza de migrare ascendent nu este identic cu viteza de migrare
descendent. Acest fenomen, n mod obinuit, se poate neglija, dar pentru o
electroforez de mare acuratee, aceast anomalie nu este de dorit.
APLICAII ALE ELECTROFOREZEI FRONTALE

Date recente arat c toate tipurile de

electroforez standard pot fi aplicate cu
succes electroforezei frontale, dintre care
cele mai obinuite aplicaii sunt:
electroforeza frontal n flux continuu,
focalizarea izoelectric n flux
continuu,
izotacoforeza n flux continuu i
electroforeza frontal n trepte de cmp
electric
 SEPARAREA POPULAIILOR DE CELULE PRIN
ELECTROFOREZ N FLUX CONTINUU

Exist mai multe dificulti implicate n separarea electroforetic de celule sau alte bioparticule.
n primul rnd, celulele care urmeaz a fi separate trebuie s fie prezente ca o suspensie
monocelular. Agregatele de celule sau ansamblurilor lor nu pot fi separate. Astfel, celule
sanguine, limfatice, sau prezente n alte fluide ale corpului pot fi destul de uor pregtite, n timp
ce celulele din esuturi trebuie s fie mai nti izolate prin dezintegrare mecanic. Multe
proceduri de izolare a celulelor conduc la o deteriorare a acestora prin disrupere i de eliberare a
nucleilor sau a ADN-ului, oferind preparate care nu pot fi utilizate la separarea electroforetic.
Distrugerea celulelor prin simpla dezintegrare mecanic poate fi redus prin tratarea esuturilor
cu diferite enzime combinat apoi cu metode mecanice blnde, cum ar fi amestecare u oar sau
aspiraie printr-o pipet gur larg. Aceast procedur este singura modalitate de a obine o
suspensie monocelular din esuturi precum cel tumoral. Enzimele care s-au dovedit a fi adecvate
pentru obinerea de suspensii monocelulare din esuturi diferite sunt tripsina, chimotripsina,
colagenaza, hialuronidaza i dispaza. Cu toate acestea, astfel de enzime, de multe ori au
dezavantajul de a cliva o serie de grupri specifice de suprafa, modificnd sarcina superficial a
acestora, care reprezint o condiie prealabil pentru separarea electroforetic. Acesta este unul
dintre principalele motive pentru care un numr relativ mic de exemple de succes de separare
electroforetic a celulelor esutului pot fi gsite n literatura de specialitate.
O abordare diferit, utilizat la pregtirea prealabil a celulelor, cum ar fi a nefronilor, care
sunt conectai ntre ei prin intermediul unor complexe juncionale Ca 2+-dependente, este de a
trata esutul cu complexani slabi ai Ca 2+, precum citratul, EDTA sau EGTA, n combinaie cu
o agitarea blnd. n general, orice nuclei eliberai n timpul procedurii de izolare pot fi
eliminai prin filtrarea suspensiei pe vat de sticl introdus ntr-o pipet Pasteur. ADN-ul
liber, care poate aprea n cazul n care nucleii sunt dezintegrai, trebuie s fie de asemenea,
eliminai, deoarece, n cmp electric, conduc la agregarea celular. Un tratament scurt cu DN-
az ultrapur (20-30g/ml) la temperatura camerei timp de 5-10 minute este n general
suficient.
O alt problem este alegerea mediului de pregtire i de separare. Cele mai multe dintre
instrumente de electroforez n flux continuu prezint sisteme eficiente de rcire care permit a
se crete tria ionic a mediului de separare pn la 8-10 x 102 ohm/cm. Aceasta este nc o
trie apropiat condiiilor fiziologice n care se separ celule n stare viabil. n scopul de a
atenua pierderea viabilitii celulelor acestea trebuie s fie colectate n mai multe soluii
fiziologice, cum ar fi medii de cultur, dup ce acestea au fost separate prin camera
electroforetic. Compoziia cele mai potrivit a tamponului de separare trebuie s fie
identificat pentru fiecare tip de celule.
 ELECTROFOREZA FRONTAL
PE COLOANA

O alt aplicaie a electroforezei n flux continuu o reprezint tehnica

denumit electroforez n flux liber pe coloan, n timp ce metoda cea mai
cunoscut fiind electroforeza preparativ ascendent.

Aparatul este alctuit dintr-o coloan cilindric par ial umplut cu

tampon cu densitate specific mai mare dect cea a celulelor.
Suprafaa astfel realizat va reprezenta stratul de start pe care
celulele sunt depuse (starting cushion).). n continuare coloana se
umple cu o soluie izoton de tampon.
Densitatea specific crescut a stratului de start se realizeaz cu
Ficoll-Hypaque, sucroz ori ap grea. Electrozii se gsesc n
compartimente separate.
n condiiile aplicrii unui cmp electric, celulele vor migra
ascendent spre anod, viteza de migrare a acestora fiind n relaie
direct cu sarcina superficial de pe suprafa a lor. Separarea dureaz
circa o or, formndu-se zone distincte care se pot colecta n
fraciuni. Coloana este termostatat i prezint o capacitate de circa
2x106-2x108 celule/ciclu de separare.
 StudyingMaterialsandProcessesinMicrogravity:
MaterialsScience

The Continuous Flow

Electrophoresis
System is used to
separate and purify
biological cells and
proteins.
O importan deosebit o reprezint utilizarea electroforezei n mediu liber la
studiul analitic al macromoleculelor biologice. Tiselius, folosind un tampon cu
pH=7,6 a reuit s separe proteinele serice n patru frac iuni: albumina, cu
mobilitatea cea mai mare i trei fraciuni globulinice (, i , cu mobilit i
descresctoare de la , la i ). Ulterior s-a observat c la pH=8,6 (la care toate
proteinele serice sunt negative, ele migrnd spre anod), globulinele se rezolv
ca dou subfracii 1 i 2, iar la introducerea unor ioni de calciu (Ca 2+
interacioneaz cu componentele serice modificnd astfel mobilitatea lor) ntr-un
tampon veronal, fracia se separ n dou componente: 1 i 2.
n mod curent, electroforeza n mediu liber se utilizeaz la separarea:
(a)celulelor intacte (de exemplu a celulelor sanguine);
(b)a organitelor celulare (lizozomi, mitocondrii, aparat Golgi);
(c)sistemelor de membrane celulare.
Procedeul este utilizat:
a. la studiul adezivitii bacteriilor,
b. la purificarea plasminogenului tisular exprimat n drojdii,
c. la separarea celulelor transformate i clonate, fiind utilizat n tehnologia
anticorpilor monoclonali.
Prin utilizarea unei celule electroforetice n flux liber orizontale (figura alturat)
procedeul se utilizeaz la studiul eritrocitelor umane din snge periferic n cazuri
normale i patologice (malarie), n studiul celulelor imunocompetente T i B i a
celulelor dendritice, la diagnosticarea i clasificarea unor leucemii i monitorizarea
tratamentului aplicat precum i la urmrirea efectelor antitumorale ale unor
medicamente. S-a obinut astfel un medicament cu structur de polizaharid extras
din Coriolus versicolor (familia Basidomicetae) denumit krestin cu efect
antitumoral i reversor (care reinstaureaz comportamentul normal al limfocitelor,
readucndu-le n limite normale funciile leucocitelor i macrofagelor).
Prezentarea schematic a reducerii selective i masive a
sarcinii electrice superficiale la unele popula ii celulare cu
ajutorul unor anticorpi specifici n cazul separrii celulelor cu
mobiliti electroforetice apropiate sau identice.
 ELECTROFOREZA ZONAL
n momentul n care Tiselius (1937) a publicat lucrarea sa clasic referitoare la
electroforeza n mediu liber. n 1937, Konig (1937) a indicat posibilitatea de a
utiliza hrtia de filtru pentru separarea electroforetic a amestecurilor de proteine.
n deceniul al cincilea din secolul trecut o serie de cercettori au descris variate
tehnici care au utilizat hrtia ca agent anticonvectiv pentru separarea
amestecurilor de aminoacizi, peptide, proteine i alte substane.

Utilizarea hrtiei de filtru sau a altor medii suport solide introduc de asemenea o serie de
factori care implic mobilitatea electroforetic a moleculelor ncrcate electric:
Electroosmoza
curgerea hidrodinamic a lichidului
Adsorbia
efecte cromatografice
efecte de stivuire.
Din acesteast cauz, electroforeza zonal nu poate fi utilizat pentru determinarea precis a
mobilitii electroforetice, a punctului izoelectric sau a altor propriet i de migrare a
substanelor fr o procedur de standardizare adecvat pentru tehnicile particulare. Suportul
ideal ar trebui s fie acela care nu prezint impurit i, este chimic inactiv n ceea ce prive te
substanele separate, nu prezint activitate adsorbtiv i prezint cel mai sczut efect
electroosmotic. Nici o hrtie de filtru nu ndepline te n totalitate toate aceste condi ii. Totu i,
noi medii suport au fost introdus care posed propriet i mult mai favorabile, precum
acetatul de celuloz, gelurile de agaroz i de poliacrilamid

n prezent se folosesc o varietate de medii suport stabilizante care se pot mpr i n:

Medii suport cu structur capilar, care
(a) prezint proprieti anticonvective - dac seciunea capilar este suficient de mic (ntr-un canal cu
seciune circular curgerea descrete cu puterea a 4-a a razei);
(b) sunt stabile fizico-chimic;
(c) prezint proprieti mecanice bune;
(d) sunt netoxice;
(e) sunt ieftine i astfel accesibile;
(f) sunt relativ inerte este cazul hrtiei de filtru, a acetatului de celuloz, a mediilor specifice
cromatografiei pe strat subire (celuloza microcristalin, silicagelul, alumina, silicagelul );
(g) au proprieti electroforetice specifice bune nu interac ioneaz dect foarte slab cu compu ii pe
care i separ (excepie face hrtia de filtru la care se observ o adsorb ie nespecific ).
n cazul acestor medii suport, proteinele serice se separ n albumin i patru sau mai multe
componente globulinice dar cu o rezoluie inegal, cu o pozi ie relativ a frac iunilor (zonelor)
asemntoare.
Medii suport care, datorit structurii poroase caracteristice, particip activ n separare.
n acest caz separarea electroforetic are loc att densitii sarcinilor electrice ct i a
efectului de cernere molecular. Astfel, dou particule cu aceea i sarcin electric dar cu
dimensiuni diferite, vor fi separate ca zone distincte, particulele mai mici migrnd mai u or.
De exemplu, dac prin electroforez pe hrtie proteinele serice se separ n frac iile
albumin, 1-, 2-, - i -globuline, dup electroforeza pe gel de amidon se identific
circa 15 zone proteice. Din categoria acestor medii fac parte gelul de amidon, gelul de
agaroz (unde efectul de sit molecular apare la concentra ii mari de gel) i gelul de
poliacrilamid (care prezint avantajul de a putea alege dimensiunea porilor).
Medii afine.
 ELECTROFOREZA PE HRTIE

n acest caz, hrtia de filtru reprezint mediul stabilizant care posed urmtoarele caracteristici:
(a) conine minimum 96% celuloz, insolubil n NaOH concentrat;
(b) prezint o capacitate mare de imbibi ie (absorb ie) - mrimea acestei propriet i este dat de
firma productoare i trebuie s fie de dou ori mai mare dect greutatea sa;
(c) este lipsit de metale grele (de exemplu Pb), care modific conductibilitatea sa electric; (are
o structur uniform a fibrelor de celuloz, unidirec ionate;
(d) prezint o densitate caracteristic a fibrelor - o hrtie de filtru fin sau medie prezint o
textur deas care va conduce la separri n zone bine delimitate, dar ntr-un timp mai mare, n
timp ce o hrtie de filtru grosier se mbib rapid cu cantit i mari de tampon iar separrile vor
conduce la zone neclare, ntr-un timp mai scurt;
(e) la un pH acid i la trii ionice sczute apar fenomene de adsorb ie a proteinelor pe suportul de
hrtie de filtru ceea ce va conduce la formarea benzilor cu coad.
Tamponul, reprezint de asemenea o component important n sistemul
electroforetic. n cazul electroforezei pe hrtie, tamponul se afl n
compartimentul electrozilor, la un nivel egal i constant, evitndu-se
fenomenul de sifonare. Meninerea evaporrii tamponului n limite rezonabile
se realizeaz prin:
(a)scderea forei ionice, legat de efectul Joule i de efectul de flux capilar;
(b)saturarea compartimentului de separare cu vapori;
(c)adugarea de propilenglicol sau glicerin (5-15%) n solu ia tampon sau
(d)n cazul electroforezei de nalt tensiune, prin plasarea hrtiei de filtru n
solveni hidrofobi.
Valoarea pI este specific unei proteine i ea depinde
de natura solventului i de concentraia electrolitului
(a nu se confunda pI cu punctul izotonic, definit ca
valoarea pH-ului unei soluii apoase de protein dup
ndeprtarea tuturor ionilor necoloidali din solu ie).
n separarea electroforetic este necesar o conduce
cu mare atenie pH-ul i tria ionic a solu iei tampon.
De obicei tria ionic a soluiei tampon este cuprins
ntre 0,06-0,1. Soluiile tampon cu o trie ionic mai
mic de 0,06 nu tamponeaz suficient n timp ce
soluiile cu o trie ionic mai mare de 0,1 conduc la Dependena dintre pH-ul soluiei i
sarcina electric a dou polipeptide,
un efect Joule, marcant, ceea ce conduce la o degajare insulina uman i fragmentul
semnificativ de cldur. polipeptidice des-B23-B30-
Echipamentul utilizat n electroforeza pe hrtie octapeptid insulin (DOI).
consist din dou componente principale: o camer
(tanc) electroforetic i o surs de putere electric.
Tancurile electroforetice sunt variate n construcie i
depind de aranjamentul pe orizontal sau vertical a
benzii de hrtie electroforetic precum i de
necesitile caracteristice ale unor experimente
particulare.
Tancul electroforetic comun utilizat
la electroforeza pe hrtie de voltaj
sczut este de dou tipuri, dup cum
hrtia de filtru este a ezat. n tipul
orizontal, hrtia de filtru este fixat
orizontal la capetele incintei. La tipul
vertical, hrtia de filtru este a ezat
vertical pe o baghet. La extremit i,
banda de hrtie este imersat n vasele
de tampon la aceea i adncime n
timp ce nivelul tamponului n cele
dou compartimente trebuie s fie
egal. Unele aparate prezint un sistem
labirint prin care comunic, n condiii
speciale, cele dou rezervoare,
prevenindu-se astfel fenomenul de
sifonare prin banda de hrtie n timpul
separrii electroforetice. Aparatul este
de asemenea prevzut cu un capac,
realizat de obicei din plexiglas.

Reprezentarea schematic a tipurilor de tancuri utilizate la

electroforeza pe hrtie: (a) tip orizontal; (b) tip vertical; (c) tip cu
banda de hrtie imersat; (d) tip cu banda de hrtie nchis.
Cele mai bune rezultate sunt obinute cu electrozi obinui din platin n form de fir sau folie ,
care pot fi utilizai n variai electroli i la diverse pH-uri. Pentru a se preveni contaminarea cu
produ i de electroliz care se elibereaz la nivelul electrodului, banda de hrtie de filtru nu
trebuie s fie introdus direct n compartimentul electrozilor, ci ntr-un compartiment adiacent
acestora, iar contactul electric este realizat prin intermediul unor buc i din hrtie de filtru sau
bumbac a unor puni din agar sau printr-un sistem special de labirint.
Volumul de electrolit-tampon n vase trebuie s fie suficient de mare pentru a preveni influen a
produ ilor de electroliz asupra separrii electroforetice. Volumul V care transport ionii de
hidrogen n timpul unui experiment poate fi calculat astfel:

unde UH+ reprezint mobilitatea H+, I este intensitatea curentului (Amperi), t este timpul
(secunde) iar K este conductivitatea soluiei. Astfel, n cazul unor electrolii diluai i la timpi
mari de separare, tamponul trebuie s circule continuu ntre compartimentele cu electrozi.
Sursa de curent trebuie s fie capabil s ofere un curent sau un voltaj constant, preferabil
ambele. Pentru cele mai comune separri sursa de curent adecvat trebuie s aib capacitatea de a
oferi 50 mA i 500V. Intensitatea maxim a curentului care poate fi utilizat pe unitatea de arie a
benzii de hrtie de filtru supuse separrii electroforetice poate fi calculat astfel:

unde I (mA) reprezint intensitatea curentului, P (cm2) este aria benzii de hrtie
de filtru msurat ntre suprafeele de electrolit i compartimentele electrozilor
iar U (V) este potenialul electric.
n general tensiunea maxim de lucru este de 400 V, cu o cdere maxim de
15V/cm (n medie de 2-10V/cm).
Pentru determinri cantitative substanele separate pe benzile din hrtie de filtru pot fi utilizate
att metode directe ct i cele indirecte. n cazul metodelor directe, substan a care trebuie s fie
msurat trebuie s absoarb radiaie UV sau s fie fluorescent ori radioactiv. n metodele
indirecte zonele separate trebuie s fie mai nti colorate iar absorban a msurat cu ajutorul unui
densitometru racordat. Au fost construite o serie de densitometre semi - sau total automatizate
care traseaz grafic intensitatea luminii transmise sau reflectate de pe o electroforegram colorat
versus distana de-a lungul benzii electroforetice n form de curbe electroforetice. Aria din
interiorul acestor curbe este determinat fie automat printr-o scalare integrat, fie cu ajutorul unui
planimetru ori prin tierea ariilor reprezentate i cntrirea lor. Sunt descrise de asemenea
scannere computerizate care permit analiza cantitativ complet a unei electroferograme n
cteva secunde. Aria din interiorul acestor curbe este determinat fie automat printr-o scalare
integrat, fie cu ajutorul unui planimetru ori prin tierea ariilor reprezentate i cntrirea lor.
Aplicarea probei se face pe banda de hrtie de filtru mbibat
cu soluie tampon, fixat n aparat, dup crearea unui mediu
saturat i stabilizat n vapori, cu ajutorul unei pipete capilare,
seringi Hamilton (1-5l), micropipete, fr a zgria hrtia. Se
folosesc dou tipuri de spotri: n pictur sau n linie.

Profilul electroforetic al proteinelor serice

separate pe hrtie, de filtru, colorate cu
amino black 10B i scannate cu un
densitometru semiautomat.
Pentru urmrirea separrii electroforetice
se apeleaz la un colorant ca substan de
referin. De obicei se utilizeaz albastru
de bromofenol, un colorant trifenilmetanic

Albastru de brom fenol

CEI MAI FOLOSII COLORANI UTILIZAI N EVIDENIEREA
COMPONENTELOR PROTEICE SEPARATE prin electroforez pe hrtie sunt
amino black 10B, Azocarmine B, Light Green SF i Ponceau Red 2R.

Structura chimic a colorantului diazolic

Amido black 10B, utilizat n practica
biochimic la colorarea total a proteinelor.

Structura chimic a azo-colorantului Ponceau 2R

(Xylidine ponceau, Ponceau G, Red R, Acid Red
26, Food Red 5).
Componentele lipoproteice ale serului sanguin pot fi detectate pe banda de hrtie prin
colorare cu Sudan Black B ori Oil Red O.

Structura chimic a colorantului diazo Sudan

Black (10)B.

Structura chimic a colorantului diazo Oil Red O

(Solvent Red 27, Sudan Red 5B, C.I. 26125,
C26H24N4O).).
Prin utilizarea acestor proceduri se pot separa i detectate patru frac ii lipoproteice:
chilomicroni, -lipoproteine, pre--lipoproteine and -lipoproteine. Totu i, cea mai
bun rezoluie a fraciilor lipoproteice din serul sanguin se ob in pe gelul de agaroz ori
pe membrane de acetat de celuloz.
Componentele glicoproteice sunt detectate pe hrtie cu ajutorul
reactivului Schiff-acid periodic, n cazul glicoproteinelor neutre,
difenilamin pentru mucoproteine i glicozaminoglicani,
albastru de toluidin i Azure A pentru glicoproteine acide,
alcian blue pentru glicozaminoglicani acizi.
Pe un ser normal se regsesc 5-6 frac ii glicoproteice, a cror concentra ie se
modific n timpul proceselor patologice ale ficatului, rinichilor, sistemului nervos
central i n timpul maladiilor tumorale.
Dup colorare, excesul de colorant este ndeprtat de pe banda de hrtie prin splare cu
un solvent convenabil. Pentru o decolorare mai eficient se poate aduga detergent la
soluia de solvent ori splarea se realizeaz la o temperatur de aproximativ 80C.
 ELECTROFOREZA PE HRTIE LA TENSIUNE NALT

n acest caz tensiunea aplicat este de circa 50-215V/cm, iar la bornele sursei de curent
tensiunea a redresorului este de 10 kV. Se poate afirma c o cre tere de la 5V la
100V/cm (adic o cretere de 20 de ori) viteza de migrare cre te de asemenea de 20 de
ori dar cantitatea de cldur degajat va cre te de 20 2, adic de 400 de ori, motiv pentru
care este absolut necesar o termostatare uniform (o termostatare neuniform conduce
la apariia zonelor de semilun-marginile hrtiei se usuc mai tare . Se mai poate nota c
la concentraii mari de prob rezoluia de separare este sczut i se vor ob ine zone cu
coad.
Electroforeza pe hrtie la tensiune nalt se utilizeaz la separarea aminoacizilor (se
produce n tampon acid formic-acetat de sodiu), a peptidelor (separarea se realizeaz n
tampon piridin-acid acetic (la un pH cuprins ntre 3,0 i 5,0), glucidelor sau a bazelor
azotate purinice i pirimidinice.
Sub forma bidimensional, electroforeza pe hrtie la tensiune nalt se poate combina
cu cromatografia pe hrtie.
 ELECTROFOREZA PE STRAT SUBIRE
n momentul introducerii cromatografiei n strat subire i a electroforezei n strat
subire, cu ceva timp n urm, comoditatea i sensibilitatea crescut (de la 10 la 50 de
ori) n comparaie cu tehnicile pe hrtie au fost considerate metode promi toare
pentru analizele compoziiei proteinelor i a acizilor nucleici. Electroforeza n strat
subire combinat cu cromatografia n strat subire a reprezentat o metod de rutin
pentru separarea a unor mici cantiti de aminoacizi, nucleotide, ioni anorganici i a
altor substane cu mas molecular mic.
Utilizarea mediilor suport de strat subire ofer urmtoarele avantaje fa de tehnicile
care utilizeaz hrtia:
(1) necesit un echipament mult mai simplu pentru preparare;
(2) rezoluia este n general superioar;
(3) separrile se pot realiza la poteniale nalte n perioade de timp foarte scurte;
(4) sunt necesare mici cantiti de prob, putndu-se realiza mai u or separri att
cantitative ct i micro-preparative;
(5) probele nu trebuie desalinizate, ele se aplic direct pe strat. Astfel, ureea i
glucidele rmn n start, ionii migrnd rapid;
(6) se pot utiliza reactivi agresivi de spray-ere i n acest mod se coboar limita de
detecie.
Din punct de vedere al echipamentului
utilizat, se folosesc aparate convenionale
de tip orizontal, similare celora utilizate
electroforeza pe hrtie, acetat de celuloz
ori pe gel de agar. Pentru separri la
poteniale mai nalte i pentru separri Camer pentru electroforez n strat subire. (a)
bidimensionale, s-au descris diverse plac orizontal prevzut cu system de rcire; (b)
camere prevzute cu sisteme de rcire. foie de izolare; (c) strat subire pe plac de sticl;
Aparatul pentru electroforez pe strat (d) bride de hrtie (Whatman 3 MM); (e) plac de
subire este prezentat schematic n sticl, 5 mm grosime; (f) compartimente pentru
tampon i electrozi; (w) sistem de rcire.
alturat. El posed un plan orizontal
sub care se afl un sistem de rcire cu
ap, pe care se a eaz placa (cu
dimensiuni de 10 x 10 sau 20 x 20 cm) cu
strat subire (circa 250-300 m) care este
pus n contact cu tamponul prin
intermediul unor bride din hrtie de filtru.
Aparatul este acoperit cu o plac de
sticl. Mica distan dintre placa cu strat
subire i placa care acoper aparatul HunterThinLayerPeptideMapping
acioneaz ca o camer umed i previne ElectrophoresisSystem,CE.For high
uscarea stratului subire. resolution two dimensional tryptic peptide
mapping and phosphoamino acid (PAA)
analysis
n cazul separrilor efectuate pe ser sanguin, volumul de prob este n funcie de cantitatea de
creatinin. n general proba spotat trebuie s conin maximum 5 g de creatinin. Timpul de
separare este de aproximativ 25-30 minute la o tensiune de 30 V/cm.
Proteinele sau alte substane macromoleculare pot fi separate prin utilizarea gel filtrarea pe strat
subire-electroforeza pe strat subire. n funcie de masele moleculare ale probei, se poate utiliza
Sephadex Superfine (de la G-25 la G-200). Sephadex-ul, echilibrat cu tamponul adecvat, este
depus pe o plac de sticl. Placa cu strat sub ire este plasat ntr-un aparat adecvat ca cel
prezentat n figura alturat, fiind echilibrat cu un tampon care curge prin stratul de gel.
Stratul trebuie conectat cu un rezervor prin intermediul unei bride din hrtie de filtru Whatman
No. 1 la captul superior, iar placa se nclin ntr-un unghi de 15-20o fa de orizontal.
O bucat de hrtie de filtru Whatman 3MM este
ataat la captul inferior pentru a ndeprta
fluidul filtrat. Dup finalizarea filtrrii, placa este
aranjat orizontal iar electroforeza este realizat
pe o direcie perpendicular fa de prima Aparat pentru o separare bidimensional
dimensiune. Pentru a obine o imagine a spoturilor utilizndgelfiltrareaielectroforezapestrat
subire de Sephadex. (a) sistem suport; (b)
proteice, placa este acoperit cu grij cu o bucat fantpentruconexiuneaprinhrtiedefiltru;
de hrtie de filtru Whatman No. 1 i dup 5 minute (c) sistem de rcire a platformei cu ap; (d)
bazin care conine tampon ori solvent
de contact, hrtia este ndeprtat de pe stratul utilizat la dezvoltarea electroforegramei; (e)
subire, uscat la 100C i colorat cu amino black sistem de schimbare a poziiei suportului
plcii;(f)orificiii(g)uruburideprindere.
ori un alt colorant specific proteinelor.
Gel filtrarea pe dextran/electroforeza pe strat
subire a fost utilizat la separarea proteinelor
serice, a diferii colorani tetrazolici, a unor
aminoacizi urinari i peptide i alte substane.
 ELECTROFOREZA PE FOLII DIN DERIVAI DE CELULOZ

Dac iniial membranele de acetat de celuloz au fost produse pentru filtrare, utilizarea
membranelor de acetat de celuloz ca mediu suport a fost sugerat de Kohn n 1957.
Foliile de acetat de celuloz se obin prin tratamentul celulozei cu anhidrid acetic, iar
produsul, triacetat de celuloz este cel mai des utilizat pentru electroforez.
Membrana (cu o grosime de cca. 12 m i cu un diametru al porilor de cca. 0,4 m)
este un material omogen care conine numai urme de impurit i.
Este de culoare alb opac, cu suprafa neted i uniform.
La microscop se observ o structur microporoas care mpiedic difuziunea zonelor
sau a spoturilor, din acest motiv se obine o bun separare a proteinelor plasmatice chiar
la o tensiune mic.
Puritatea materialului este mare, lipsesc hemicelulozele, lignina iar metalele grele
sunt prezente numai n urme. Fa de hrtia de filtru, adsorb ia proteinelor i a altor
substane pe acest mediu suport este minim, deci fenomenul de coad sau de aspect de
comet fiind practic eliminat.
Timpul de separare este mai scurt iar membranele de acetat de celuloz sunt ideale
pentru tehnicile de imunodifuzie i imunoelectroforez.
 Foliile (strips-urile) din acetat de celuloz sunt insolubile n ap, alcooli,
eteri, acizi i baze diluate i n majoritatea hidrocarburilor, dar sunt uor
solubile n fenol, acid acetic glacial, diclorometan i aceton, i n mod
particular n cloroform:etanol 90:10 (v/v) i diclorometan:aceton 50:50
(v/v).
Strips-urile pot fi transformate n translucide (transparente) prin imersia
lor n ulei din semine de bumbac, decalin, ulei de parafin ori ulei
Whitemore 120, care este important pentru scanarea optic a benzilor
colorate de pe foliile de acetat de celuloz. Ele pot fi impregnate i
permanent stocate n glicerol, care previne destrucia spoturilor colorate.

Dintre dezavantajele utilizrii membranelor de acetat de celuloz

enumerm preul mai mare fa de hrtia de filtru, necesitatea de a acorda
mai mult atenie pentru obinerea unor rezultate reproductibile.
n prezent s-au adus mbuntiri ale produsului iniial prin apariia
acetatului de celuloz gelatinizat (Cellogel).
 Pentru separri electroforetice de proteine i acizi nucleici s-au introdus membranele de
nitroceluloz. Aceste membrane, cu o mrime a porilor cuprins ntre 0,1-12 m, au fost
utilizate n mod constant n analizele de acizi nucleici n special a hibrizilor RNA-DNA i
DNA-DNA. Acetia prezint o adsorbtivitate selectiv fa de proteine i acizi nucleici n
condiii adecvate.
Membranele de dimensiuni dorite sunt aezate ntr-o plac Petri cu tampon i lsate s
pluteasc pn la dispariia petelor alb-opace dup care se scufund complet. Membranele
de Cellogel nu necesit aceste precauii, ele putndu-se scufunda timp de 10 minute.

Strip-urile din nitroceluloz (5 x 1 cm), cnd sunt utilizate la electroforeza proteinelor,

trebuie mai nti tratate timp de 5 minute cu o solu ie de Tween 60, 2% preparat ntr-un
tampon compus din veronal, citrat i oxalat, pH=8,6. Astfel, membranele de nitroceluloz
tratate cu detergent nu adsorb proteine i pot fi utilizate pentru separri de proteine n
gradieni nali de potenial de 15-20 Vcm-1 timp de 10-15 minute.
Membranele mbibate se plaseaz imediat n sistemul reglabil i se
aplic probele cu ajutorul unei micropipete sau unui dispozitiv de
aplicare simultan a probelor (10-16 probe).) Volumul aplicat de
prob este n funcie de grosimea membranei i de concentra ia
proteic.

La pH neutru i alcalin, RNA migreaz rapid n folie spre anod, n

timp ce DNA nativ rmne pe linia de start. DNA monocatenar
denaturat migreaz spre anod. Membranele de nitroceluloz cu
dimensiuni variate a mrimii porilor, impregnate cu detergen i ori
soluii de albumin seric, pot fi utilizate la separri de proteine,
polinucleotide i nucleoproteine.

Nigrozina (denumit i Indian ink) este cel

mai bun colorant al proteinelor pe folii de
nitroceluloz.
Un alt colorant utilizat cu bune rezultate n
colorarea proteinelor este Ponceau S.
Modelul de baz a tancurilor electroforetice utilizate pentru
membranele de celuloz seamn cu cele utilizate la tehnica
electroforetic pe hrtie. O serie dintre acestea prezint
sisteme de rcire i pot fi utilizate concomitent pentru
electroforez pe membrane i pe strat subire. Ambele
separri se pot realiza att la voltaje sczute ct i la cele
nalte. Pentru a minimaliza procesul de evaporare, se poate
aduga glicerol la soluia tampon. Controlul evaporrii se
poate realiza i prin folosirea de soluii tampon cu trii ionice
mici (o concentraie mic a soluiei tampon favorizeaz
cre terea vitezei de migrare n paralel cu scderea efectului
Joule.

Astfel, dac tria ionic este dat de rela ia:

Dup electroforez strip-ul de acetat de celuloz este uscat la 100C
timp de aproximativ 10 minute.
Metodele de colorare i detecie utilizate sunt asemntoare cu cele
utilizate la hrtia de filtru.
Sunt de preferat ca soluiile apoase de colorant fa de solu iile
alcoolice, concentraia acestora fiind deobicei mai sczut fa de cea
aplicat pentru hrtia de filtru.
Membranele din acetatul de celuloz i nitroceluloz sunt ideale
pentru examinrile absorbiometrice i fluoro-densitometrice, precum
i de detecie a substanelor radioactive prin autoradiografie ori prin
metode de scanare direct.
 MICROELECTROFOREZA PE ACETAT DE CELULOZ
Benzile (strips-urile) de membrane (acetat de celuloz sau nitroceluloz) de mici
dimensiuni (50 x 10mm) disponibile dau posibilitatea efecturii a analizei proteice
complete pe 0,25 l de ser sanguin (electroforeza microzonal, microelectroforeza pe
acetat de celuloz) n 50 minute.
Procedeul de miniaturizare prin reducerea dimensiunilor membranei, a probelor i a
timpului se bazeaz pe faptul c mobilitatea electroforetic este rela ie direct cu distan a
de migrare i invers proporional cu timpul i intensitatea cmpului electric aplicat dup
relaia:
 Aplicaii ale electroforezei pe membrane de acetat de celuloz

Membranele de celuloz sunt utilizate n mod comun pentru separarea proteinelor

plasmatice, glico- i lipoproteinelor, hemoglobinelor, enzimelor i a altor proteine.
Ele putnd fi folosite n metodele analitice i n scopuri preparative.
Metoda electroforetic pe membrane de acetat de celuloz este nc cea mai des
utilizat n diagnosticarea unor maladii. Tabelul urmtor prezint profilul
electroforetic obinut n urma separrii pe Cellogel al unei proteinograme din ser
sanguin normal.
Procente Deviaie
Fracia electroforetic analizat
% standard
Albumine 61% 1,5
Alfa 1-globuline 2,5% 1,5

Alfa 2-globuline 2,0

8%
Beta globuline 10% 2,0
Gama globuline 16% 3,5
Analiza proteinogramei este deosebit de important n identificarea unor maladii prin analiza
concentraiei unor proteine serice. Astfel prin interpretarea unei proteinograme se pot depista:
-hipergamaglobulinemiile (creterea tuturor claselor de imunoglobuline);
-hipogamaglobulinemiile (diminuarea tuturor claselor de imunoglobuline);
-mielomul sau macroglobulinemia lui Waldenstrm (apariia unei benzi foarte omogene care
semnific prezena unei proteine monoclonale);
-sindromul nefrotic (hiperexpresia globulinelor 2 i , cu diminuarea albuminei i a
globulinelor);
-ateroscleroza (creterea globulinelor);
-poliatrita reumatoid (creteri policlonale ale globulinelor i creterea frac iei 2 globulinei.

Figura de mai prezint profilul unei electroforegrame ob inute dup procesarea

electroforetic a unei probe de ser sanguin normal.
Protinogramme srique normal
INTERPRETATION du protinogramme (2)
Valeursnormales
Causes derreur
srum hmolys
prsence de fibrinogenen
InflammationAIGUE(2)
 Insuffisancehpatique
(cirrhoses,hpatitesfulminantes)
SyndromeNEPHROTIQUE
Hypogammaglobulinmiedes
dficitsimmunitaires
Hypergammaglobulinmie
POLYCLONALE
Hypergammaglobulinmie
MONOCLONALE
 Tehnica electroforetic care implic membranele de acetat de celuloz este de
asemenea util n monitorizarea unui tratament aplicat. Ea este superioar
tehnicilor imunologice n determinarea izoenzimelor enolazei (procedeul dureaz
circa 10 minute iar necesarul de ser este de circa 10l), activitatea enzimatic
fiind determinat n aproximativ 5 minute prin bioluminiscen .
Enolaza, de asemenea, cunoscut sub numele de fosfopiruvat hidrataza (EC 4.2.1.11), este o
metaloenzima responsabila de conversia 2-fosfogliceratului (2-PG) la fosfoenolpiruvat (PEP),
etapa a noua i penultima a glicolizei. Reacia chimic catalizat de enolaza este:
2-fosfo-D-glicerat fosfoenolpiruvat + H2O
Enolaza aparine familiei de liaze, hidro-liaze specifice, care cliveaz legturile carbon-oxigen.
Denumirea sistematic a acestei enzime este 2-fosfo-D-glicerat hidro-liaza (formatoare de
fosfoenolpiruvat).
Reacia este reversibil, n funcie de concentraiile de mediu ale substraturilor. Enolaza este
prezenta n toate esuturile i organismele capabile sa posede calea glicolizei sau organismele
fermentative.
Enzima a fost descoperita de Lohmann i Meyerhof n 1934 si a fost izolata dintr-o varietate de
surse, inclusiv esutul muscular ori eritrocite.
In om sunt prezente 3 subunitati ale enolazei, , , si , fiecare dintre ele fiind codificate de gene
separate. Cele 3 subunitati se pot combina si forma cinci izoenzime diferite: , , , , and
. Trei dintre acestea (toate homodimere) sunt mai reprezentative in celulele omului adult decat
celelalte. La om, deficiena in izoenzima ENO1 este legata de anemia hemolitic ereditar n timp
ce deficienta in izoenzima ENO3 este legata de boala de stocare glicogenului XIII.
Electroforeza pe membrane de acetat de celuloz a fost i este utilizat la studiul comparativ
al unor proteine serice la om i la alte animale.

A fost folosit la studiul histonelor (proteine bazice ale cromatinei la eucariote), la studiul
hemoglobinelor normale i patologice cnd s-au evideniat la pH=8,4, hemoglobina A, Hb F,
Hb S, Hb S i Hb C de Hb E i Hb O.
Membranele de acetat de celuloz se utilizeaz i n tehnicile de imunoelectroforez,
colorarea efectundu-se n acest caz cu ajutorul AgNO3, iar imunodetecia realizndu-se direct,
pe membran, fr transfer pe o alt membran de nitroceluloz.
Blocurile de Cellogel (cu o grosime de circa 2,5-5 mm) s-au folosit n scop preparativ, n
acest caz utilizndu-se la separare 0,25-1 ml de ser sanguin.
Electroforeza pe gel de amidon

Loadingsamplesontoastarchgelforelectrophoresis
Electroforeza pe gel din amidon, prima metod de electroforez
zonal care a pus n valoare efectul de sit molecular a mediului
suport a fost introdus de Smithies. Ea a fost recunoscut drept o
tehnic care furnizeaz mijloace elegante de rezolvare a ionilor
similari i cu mobiliti libere identice. Astfel, o matrice de gel - nu
i n cazul mediilor poroase de tipul hrtiei sau a granulelor de
amidon - prezint o structur reticulat care poate impune o
rezisten fricional apreciabil la trecerea ionilor, accesul
acestora n structura de reea fiind dat de mrimea porilor i
dimensiunea ionilor care migreaz. Dac n cazul gelurilor de
amidon, domeniul dimensiunii medii a porilor se apropie de
domeniul dimensiunilor proteinelor, fracii proteice variate vor fi
ntrziate diferenial ntr-un grad proporional cu dimensiunea lor.
Ca atare, datorit reticulrii fine i avnd un efect de sit
molecular, separarea amestecurilor este realizat n astfel de
geluri matrice att prin dimensiunile, forma, ct i prin diferenele
de sarcin electric.
Amidonul este un polizaharid insolubil n ap. n stare nativ,
n prezena apei el se umfl. Matricea electroforetic se ob ine
printr-o hidroliz parial cnd amidonul se convertete ntr-o
form care se solubilizeaz la o temperatur de circa 70 oC i
care apoi se solidific ntr-un gel ferm la temperatura camerei.
Mrimea porilor din gelul de amidon este dat de
concentraia acestuia i de gradul de hidroliz, ea variind ntr-
un domeniu redus prin faptul c nici concentraii, nici gradul de
hidroliz nu pot fi schimbate dect n anumite limite, bine
definite, fr a afecta caracteristicile mecanice ale gelului.
Dac la nceput s-a utilizat amidonul din cartof, s-a constatat
c rezultate mai bune se obin cu cel din orez.
Fa de alte medii stabilizante de separare a proteinelor, peptidelor ori a
acizilor ribonucleici, amidonul prezint o serie de avantaje comparativ
cu hrtia, gelatina, agarul, silicagelul:
(i) Adsorbia celor mai multe proteine pe amidon este neglijabil;
(ii) Eluia segmentelor de amidon dup separarea electroforetic se
realizeaz mai uor dect n cazul gelului de gelatin ori agar ceea ce
reprezint un factor important n scopurile preparative;
(iii) Amidonul formeaz mai uor o past omogen cu diverse tampoane
fa de pudra de celuloz;
(iv) Electrosmoza este mai mic dect n cazul multor altor medii suport
dei acest fenomen poate cauza o separare slab, mai ales n cazul cnd
tehnica este cea de bloc de amidon i se realizeaz n modele de
aranjament orizontal.
Electroforeza pe gel de amidon este considerat dup unii
autori a fi o metod blnd de purificare a proteinelor fr
anse de denaturare, putndu-se pune alturi de metoda salting-
out ori precipitarea cu acizi, alcool sau aceton. Pe de alt
parte, ali autori consider c din contr, n timpul
electroforezei au loc procese ireversibile de denaturare care
conduc la o pierdere considerabil de protein. Chestiunea n
cauz se ridic dac acest proces se manifest din cauza
dezvoltrii de cldur cauzat de efectul Joule, la intensiti de
17-20 mA a curentului electric cu soluii tampon de trie mare.
De altfel, procesul de denaturare nu se observ la trii ionice
sczute, rezultatele fiind satisfctoare.
Amidonul este utilizat ca mediu suport
n trei tehnici electroforetice zonale:
Electroforeza clasic pe gel de
amidon, descris pentru prima dat de
Smithies;
Electroforeza pe coloan, dezvoltat
de ctre Carlson i independent de
Flodin i Porath;
Electroforeza pe bloc de amidon,
introdus de Kunkel i Slater.
Aparatura utilizat n electroforeza pe
gel de amidon este de dou tipuri: I)
pentru geluri orizontale; II) aparate cu
gel vertical. Ambele aparate sunt
alctuite de 2 rezervoare cu soluie
tampon, compartimentate pentru a
mpiedica produii de electroliz s
intre n contact direct cu gelul.
Contactul dintre suport i gel se
realizeaz prin intermediul unor bride
din hrtie de filtru sau tifon (bumbac)
iar legturile dintre compartimente se
formeaz n acelai mod.
Godeurile se efectueaz cu ajutorul unui pieptene din plexiglace care se plaseaz peste
stratul de amidon nainte de gelificare i se ndeprteaz dup aceasta. Dimensiunile
godeelor sunt de 15-30 mm lungime, 1 mm lime i 50 mm adncime.
n general separri bune sau foarte bune se pot ob ine la temperatura camerei la o
tensiune de 6V/cm timp de 6 ore sau la o temperatur de 5 oC i la o tensiune de
10V/cm, n sistem de tampon continue sau discontinue.

Dup separarea electroforetic sunt recomandate diverse proceduri de colorare a

gelurilor. Astfel, gelul este extras cu grij din cuva de electroforez i tiate paralel cu
suprafaa n dou pri egale. Colorarea se realizeaz prin turnarea colorantului peste
suprafaa secionat. O serie de lucrri prezint colora ia cu solu ie de Amido black 10B
n metanol:ap:acid acetic glacial (50:50:10) timp de l0-30 min.

Lipoproteinele pot fi colorate prin incubare timp de 16 ore ntr-o o soluie alctuit din:
1,2 g Sudan black 10B, 40 ml de ap distilat, 600 ml etanol i 2 ml NaOH,.
Decolorarea complet se realizeaz dup 6-8 zile dup imersare ntr-o soluie de etanol
60%. De asemenea, pentru a vizualiza lipoproteinele se poate utiliza o solu ie saturat
de Oil Red O pregtit ntr-un amestec metanol:ap:acid acetic glacial (60:10:30).).
Proteinele care conin cupru precum hemocianina, sunt detectate prin
plasarea gelului secionat pentru 3-4 ore ntr-o soluie care conine 50 ml
acetat de sodiu l0% i 3 ml de soluie ditio-oximid, 0,1% preparat n
alcool. Apariia unei coloraii verde-nchis este un rezultat pozitiv.
Hemoglobinele sunt detectate cu reactiv benzidin sau cea descris
pentru electroforeza pe gel de agar. Hem-proteinele pot fi de asemenea
colorate cu o-tolidin.
Pentru complexul acestor proteine cu hemoglobina care prezint o
activitate peroxidaz-like, o-dianisidina pare a fi cel mai bun reactiv, ea
formnd o coloraie brun.
 o serie de aplicaii ale electroforezei pe gel de amidon

Trie ionic
Material biologic Tampon pH V mA Timp (ore)
(Molaritate)
Barbital 0,1 25-60
Lipoproteine serice normale i patologice 8,6 100-500
Fosfat 0,5 24
Proteine lenticulare bovine Barbital 0,1 8,6 400 - 24
Tuberculo-proteine Barbital 0,1 8,6 360 17-20 30
Fosfataza alcalin intestinal Barbital 0,02 8,6 200 7-9 12
Acetat 0,017 4,00 175 30 24
Hormonul de cretere (somatotropin)
Carbonat 0,1 11,2 175 30 72
-Galactozidz Pirofosfat 0,025 8,5 370 1 16
Chimotripsinogen Cacodilat 0,1 6,6 3,2V/cm - 65
Tirozinaz de mamifere Barbital 0,1 8,5 300 11 19
Tripsin Acetat 0.1 4,00 /300 - 10
0,02M borat +
Hemocianin Borat 8,0/3 92V/cm - 12
NaOH 0,008M
Hemoglobin Borat 0,05 M 8,5 6V/cm - 5
Plasm uman Borat 0,025 - 450 - 18
 ELECTROFOREZA PE GEL DE AGAROZ
Agaroza este singurul hidrocoloid neadeziv care i-a gsit o multitudine de utilizri n tiinele
separatologice dup prepararea sa de ctre Araki (1937) ca un component aparent fr grupri sulfat,
din agaropectina, bogat n astfel de grupri, la rndul ei obinut din agar.
Cele dou componente se separ prin acetilare i dizolvare n cloroform cnd agaroza acetilat este
solubil. nc din secolul al XVII-lea n Japonia, agarul i o muli ali hidrocoloizi derivai dintr-o serie
de alge roii de mare din clasa Rhodophyceae (speciile Gelidium i Gracilaria) au fost utilizai la
prepararea hranei.
Agarul a fost introdus ca mediu pentru imunoelectroforez de ctre Grabar i Williams n anul 1953,
tehnica original descris de acetia fiind ocazional utilizat i astzi. Electroforeza pe agar tratat este
de altfel principala metod curent de identificare a variantelor de hemoglobin.
Agarul a fost aplicat de ctre Polson n anul 1961 pentru separri cromatografice bazate pe
proprietatea sa de sitare molecular, dup care acesta a fost nlocuit gradat cu agaroza, nceputul fiind
fcut de ctre Hjerten (1961).
Coninutul n sulfat a agarozelor de diferite grade furnizate pentru utilizare n laborator este n
general sub 0,12% comparativ cu 4% coninutul n agaropectin. Din aceast cauz agaroza poate fi
utilizat n prepararea gelurilor fr nevoia utilizrii unor aditivi sau a unor agen i de reticulare iar
ineria sa fa de interacia cu proteinele i acizii nucleici reprezint principalele ra iuni ale ei n larga
utilizare ca mediu de separare. Tot ce este necesar n prepararea gelurilor este de a dizolva agaroza
pulbere prin nclzire controlat la fierbere sau aproape de temperatura de fierbere, dup care s se lase
s se rceasc. Procesul de gelificare se manifest spontan i este complet n gelurile reci. n plus fa
de simplicitatea pregtirii gelului de agaroz, alturi de iner ia fa de interac ii cu proteinele i acizii
nucleici i ofer acesteia o multitudine de avantaje ca mediu de separare precum recuperarea simpl a
probei, netoxicitatea i simplicitatea pregtirii gelului.
Agaroza este de asemenea unic ca aplicativitate n numeroase proceduri imunoelectroforetice.
n comparaie cu gelul de poliacrilamid, gelul de agaroz este un material foarte poros, ceea ce i
limiteaz oportunitatea folosirii sale n form nemodificat n separri de proteine bazate pe
efectul de sit molecular la cele cu mas molecular mai mic de 60 kDa. Pe de alt parte,
marea sa permeabilitate face din ea un mediu superior poliacrilamidei pentru studii
imunochimice.

Proprietile gelurilor de agaroz. Din punct de

vedere chimic, agaroza este un polizaharid liniar
compus din uniti alternative de D- i L-
galactozobioz (agarobioz) legate prin legturi
1-4 (figura alturat) cu catene de o lungime dat
de cele 400 de uniti de agarobioz, legate prin
legturi 1-3 i cu o mas molecular de circa 120
kDa (figura de mai jos), cu resturi substituite
carboxilat, piruvat i/sau sulfat.
Gelificarea se manifest ca un proces de inter-legare a protofibrilelor. Astfel, n timpul acestui
proces, lanurile dublu catenate elicoidale se desfac iar legturile 3,6 din structura 3,6
anhidrogalactozei se desfac de asemenea, ceea ce conduce la fragmentarea lan ului ini ial n
lanuri dublu elicoidale mai scurte a cror capete se vor uni ncruciat, proces de numit
schimbarea partenerului. n continuare are loc asocierea n suprafibrile cu raza de 10-20 nm
(figura de mai jos), supranfurare care explic rezistena mai mare i porii mai mari a gelului
de agaroz comparativ cu alte geluri care nu formeaz suprafibrile (ca de exemplu gelul de
amidon, gelul de poliacrilamid cu un grad de reticulare, C% cuprins ntre 1 i 5).

Gelurile sunt translucide

deoarece fibrele nfurate
mprtie lumina dar devin
transparente prin uscare.
Abilitatea de a forma fibrile groase, puternice permit agarozei s formeze geluri chiar
la concentraii sub 0,2%. ncorporarea agarozei n suprafibre groase fac aceste geluri
nalt poroase pn la o concentraie mai mare de 6%, limita la care agaroza poate fi
dizolvat fr a apela la temperaturi de autoclavare. Concentra ii pn la 16% se pot
realiza numai prin autoclavare. La gelurile cu o concentraie egal cu 2% efectul de
sit molecular nu este prezent, electroforeza fiind de tip capilar, n timp ce la
gelurile cu o concentraie cuprins ntre 3 i 10%, distan ele ntre i din interiorul
suprafibrilelor devin egale i ia astfel na tere un gel cu o singur dimensiune a
fibrelor. Porozitatea mare a agarozei o face superioar poliacrilamidei pentru
separarea proteinelor mari, polipeptidelor, complexelor cu un domeniu de mas
(Mr) cuprins ntre 100 kDa i mai muli megadaltoni. Prin utilizarea agarozei se
pot separa fragmente de ADN din domeniul 1000 la 23000 perechi de baze (bp).
n cazul agarozei hidroxietilate numrul de lanuri din constituia suprafibrilelor este
mai mic dect n cazul agarozei nesubstituite i din aceast cauz porii gelului sunt
mai mici fiind similari cu cei ai gelului de poliacrilamid, avnd o mare capacitate de
sitare molecular similar gelului de poliacrilamid ns rezistena mecanic este mai
mic dect a agarozei nemodificate. Recent, au fost ob inute noi formule de deriva i
de agaroz care au proprieti mecanice mbuntite.
n funcie de gradul de substituie cu sarcini negative i de modificrile chimice survenite, se
disting trei categorii de agaroz caracterizate prin:
a)coninutul n resturi sulfat (exprimat n %);
b)electroosmoz;
c)temperatura de gelificare;
d)temperatura de topire.
Electroendoosmoza preparatelor de agaroz este dat de parial de con inutul n resturi sulfat i
piruvat. Ea poate fi msurat convenional fie
cu ajutorul ciancobalaminei (vitamina B12), colorat n rou,
fie cu Dextran-500, care poate fi detectat n urma precipitrii cu etanol,
fie urmrind migrarea albuminei serice bovine (BSA).
De obicei se utilizeaz deplasarea BSA la pH=8,6 iar n urma acestei analize se
determin factorul mr, dup care se clasific agarozele n agaroze cu electroosmoz mare,
medie (standard) i mic. Gruprile sulfat prezente n cele mai multe preparate induc o mic
electroendosmoz (EEO) n timpul electroforezei. Electroendosmoza se manifest ca o curgere
de tampon prin gel. Efectul este datorat faptului c sarcinile negative ale gruprilor sulfat din
matricea de gel nu se pot mica spre anod motiv pentru care apare ca rezultat o pompare
compensatoare de tampon spre catod. Efectul asupra mobilitii proteinelor este n general mic,
totui devine pronunat n sisteme de tampon discontinue utilizate pentru ngustarea benzilor
din proba aplicat. EEO poate astfel induce colapsarea gelurilor n sisteme tampon discontinue
datorit electroendosmozei inegale prin frontul de tampon. Astfel, o serie de sisteme de
tamponare descrise pentru gelurile de poliacrilamid nu func ioneaz la fel de bine pentru
gelurile de agaroz.
Agarozele cu electroosmoz diferit se utilizeaz n tehnici specifice precum:
Agarozele cu electroosmoz mare (-mr=0,25) se utilizeaz n tehnicile de
contraimunoelectroforez;
Agarozele cu electroosmoz standard i mic ( -mr =0,13-0,07) se utilizeaz pentru
electroforez i imunoelectroforez. Ele sunt folosite la separarea acizilor nucleici
(agarozele standard), dedetectnd DN-azele, RNA-azele, proteazele, inhibitorii
endonucleazelor, enzimele de restricie i modificare, ligazele, polimerazele.
Agarozele cu electroosmoz egal cu zero sunt utilizate pentru focusare (focalizare)
izoelectric. Ele se obin prin adugarea unor aditivi sau printr-un procedeu chimic
(reacie de substituie) n scopul blocrii (contrabalansrii) sarcinilor electrice negative
cu grupri electropozitive. Aditivii dintr-o serie de zero-EEO agaroze contribuie la
formarea unui background n timpul colorrii.
Agarozele hidroxietilate (numrul de grupri hidroxietil fiind de circa 15%) formeaz
geluri cu concentraie de 2-10% cu dimensiunile porilor aproximativ egale cu cea a
proteinelor. Ele au o temperatur de gelificare n jurul a 25oC iar temperatura de
solidificare de aproximativ 45oC (25/45). Astfel, o agaroz hidroxietilat 15/45
formeaz geluri de concentraie 2-10%, asemntoare gelurilor de poliacrilamid.
Agarozele cu un procent de 5% hidroxietil formeaz geluri cu o temperatur de topire
de 60-65oC
 Echipamente i sisteme tampon.

Gelurile de agaroz sunt n mod curent utilizate pentru electroforez plan,

orizontal pe care gelurile sunt plasate ntre electrodul anodic i catodic afla i n
camere umplute cu tampon i conectate prin puni umede. Cu excep ia unor
cerine uzuale la platforma pe care se aeaz gelul se poate adapta u or un
sistem de rcire prin recircularea apei. Gelurile sunt turnate n casete deschise
ori prevzute cu dou spaiatoare. Se are n vedere c utilizarea pun ilor din
hrtie sau bumbac conduce la o pierdere de voltaj prin ele ceea ce conduce la
o creterea a efectului de nclzire i apariia fenomenului de condensare n
camera de separare electroforetic. Pierderea de voltaj de-a lungul gelului
trebuie s fie controlat direct de la nivelul gelului i nu din sursa de curent. n
plus hrtia de filtru nu este totdeauna recomandat deoarece prin utilizarea sa
drept brid de contact, datorit procesului de electroosmoz, puntea dinspre
anod se poate usca mpreun cu extremitatea respectiv a gelului n timp ce la
extremitatea catodic se adun lichid n exces, deoarece hrtia de filtru nu
poate prelua i transfera cantiti mari de lichid. Condensarea vaporilor pe gel
este uor de prevenit printr-o simpl barier de vapori care se a eaz pe gel.
Pentru electroforeza acizilor nucleici
utilizarea punilor (bridelor) de legtur a
fost eliminat prin aplicarea tehnici
cunoscute drept submers n care gelul
este a ezat pe o platform ncrcat cu
tampon conectat la camerele
electrozilor. Modul de electroforez
submarin nu este n mod curent aplicabil
n electroforeza proteinelor deoarece
acestea au tendina de a difuza n
tamponul nconjurtor, n timp ce acizii
nucleici posed constante de difuziune
foarte mici, motiv pentru care migreaz
aproape n ntregime prin gel la aplicare
unui cmp electric, cu o doar mic
difuziune. Gelurile de migrare din
agaroz n format vertical cu camere de
electrozi sunt rareori utilizai deoarece
agaroza are tendina de a se dilata i
astfel de a prsi caseta.
Iniial, aplicarea probei n gelul de agaroz s-a realizat
prin tierea unei fante n gel. Aceast tehnic este n
continuare utilizat la electroforeza acizilor nucleici,
care formeaz benzi nguste cnd migreaz nerestinctiv
din soluia de prob n gelul de migrare restrictiv,
comparativ cu proteinele la care se manifest foarte
mic ngustare a benzii care permeaz gelul uor. n
plus, godeurile induc distorsiuni ale benzilor proteice
datorit: (i) procesului de permeaie parial n
marginile godeului nainte de nceperea de facto a
separrii electroforetice; i (ii) datorit tensiunii
electrice inegale care se manifest le-a lungul godeului
n momentul aplicrii unui cmp electric. Datorit
uurinei cu care soluiile pot fi mbibate n agaroz
urmat de compresia temporar cu hrtie de transfer,
(iii) probele pot fi depuse pe gel n benzi demarcate
prin intermediul aa-numitei tehnici folie de aplicare a
probei, un plastic subire ntins peste gel care are
prevzute nite fante prin care probele sunt depuse pe
gel. Acest sistem de aplicare a probei a fost sugerat de
Cawley simplificnd procedura comparativ cu cea de
formare de godeuri.
Din punct de vedere electric, n cele mai multe aparate se utilizeaz un gradient de
potenial de 15-20 V/cm. Acesta corespunde unei puteri totale a cmpului electric de
250-300 V i o intensitate de curent de 100-140 mA, depinznd de mrimea
electrozilor. n cazul gelurilor subiri de 3 mm grosime, tensiunea aplicat este de 6
V/cm.
Fixarea fraciilor proteice se realizeaz: a) fie prin imersarea gelului n solu ie de acid
acetic 20% timp de o or, dup care gelul se usuc timp de 16 ore la 37oC; b) fie prin
imersarea sa ntr-un amestec de acid picric (solu ie saturat):acid acetic (20%) ntr-un
raport 3/1 timp de 15 minute, dup care gelul se usuc.

Toate metodele comune de colorare utilizate

(bazate pe Coomassie Brillant Blue,
fluorescen, chimiluminescen, i de tip
coloidal) funcioneaz bine cu agaroza,
metoda cu Coomassie coloidal fiind una
dintre cele mai rapide. Amido Black 10B
(soluie 1% preparat ntr-o soluie de acid
acetic 7% sau preparat ntr-un amestec
metanol:acid acetic:ap, n raport de 5:1:5)
este utilizat deoarece produce zone distincte Structura chimic a Coomassie
i faciliteaz vizualizarea - i - Brillant Blue G-250 (sinonime: Serva
lipoproteinelor. blue G sau C.I. acid blue 90), un
colorant trifenilmetanic.
O adaptare a electroforezei pe agaroz o reprezint electroforeza de
nalt rezoluie. Ea este utilizat n clinic n laboratorul de analize
medicale. Prin utilizarea ei, se evideniaz schimbri calitative i cantitative
ale proteinelor serice, semnificative din punct de vedere clinic care nu pot fi
decelate prin electroforez convenional sau pe acetat de celuloz.
Practic se lucreaz pe gel de agaroz de 1 mm grosime, turnate
pe folii de film flexibil de poliester, Gelbond care sunt pstrate n soluie
tampon i n ambalaje ermetice, care faciliteaz mnuirea i stocarea gelului
prelucrat.
Volumul de prob este de 2-4 L, putndu-se aplica simultan 6 ori
12 probe. Timpul de separare este de aproximativ 45 de minute la o
tensiune de 20V/cm
 INTERPRETAREA ELECTROFOREGRAMELOR N TERMEN DE
VARIAIE A PROTEINELOR INDIVIDUALE
Abilitatea gelului de agaroz de a
revela proteine diferite variaz n
funcie de concentraia de protein,
capacitatea de legare a colorantului i
de gradul de omogenitate
electroforetic. n general, capacitatea
de legare a colorantului scade odat
cu creterea coninutului n
oligozaharide i lipide. Figura de mai
jos d o prezentare schematic a
concentraiei relative i eterogenitatea
electroforetic a proteinelor
plasmatice majore, ntr-un subiect
sntos, avnd cel mai frecvent
fenotip Distribuia electroforetic i concentraiile relative ale proteinelor majore plasmatice
comparativ cu fraciile obinute prin electroforez clasic. Abreviaii: Alb, Albumin;
Lp, Lipoproteine; Om, Orosomucoid; 1-At, 1-antitripsin; 2-M, 2-macroglobulin;
GC, componente specifice de grup; Hp, haptoglobine; CIG, globulin insolubil la
rece; Hz, hemopexin, Tf, transferin; C3, complement C3; Fg, fibrinogen; Ig,
imunoglobuin; i CRP, protein C-reactiv
Tabelul de mai jos prezint proteinele individuale care pot fi prezente n concentraii
care pot influena profilul electroforetic. Datele din paranteze sunt prezente la a a
concentraii nct nu pot influena semnificativ profilul electroforetic.
Proteina int Domeniul normal (g/L)

Prealbumina 0,15-0,36
Albumina 39-51
-Lipoproteine (3-7)
(-Fetoproteina)a <1-1 -5
(Orosomucoid) 0,40-1,05
1-Antitripsina 0,8-1,9
Globuline specifice de grup 0,2-0,55
(Inhibitorii inter-1-tripsin) 0,2-0,7
(Ceruloplasmina) 0,22-0,46
2-Macroglobulinele 1,2-2,4
Haptoglobinele (1-1, 2-2, 2-1) 0,40-2,9
Globulinele insolubile la rece 0,1-0,3
Transferina 1,7-2,7
-Lipoproteinele 2,2-7,4
Al treilea component al sistemului complement, C3 0,6-2,2
IgA 1,0-3,0
Fibrinogenul 2,2-4,4
(IgM) 0,6-2,2
IgG 6,5-15,5
(Catenele de imunoglobulin uoar) <0,001
(Proteina C-reactiv) <0,02
 Analiza profilului electroforetic

Zone electroforetice Observaie Cauze posibile

Mas celular hepatic sczut,
Zona prealbuminei Sczut Rspuns inflamator
Malnutriie
Rspuns inflamator,
Malnutriie,
Sczut Pierderi n greutate,
Zona albuminei Maladii maligne,
Un volum extracelular crescut.
Medicamente (penicilin)
Front anodal rapid
Icter
Intensitate sczut Leziuni ale celulei hepatice
Interzona albumin-
1 Malnutriie
Intensitate crescut Abuz de alcool
1- Lipoproteine
Nivel estrogenic crescut postmenstrual
Polimorfism Variante genetice.
Rspuns inflamator,
Zona 1 Crescut
Alterarea celulei hepatice
1-Antitripsina
Deficien genetic,
Relativ sczut
Scderi n greutate.
Zona 2 Dependent de vrst la copii,
Crescut Persoane n vrst (>70),
2-Macroglobulina
Proteinurie selectiv
Crescut Rspuns inflamator,
Haptoglobina
Relativ sczut Hemoliz in vivo
Benzi nguste Componenta M
Imunoglobuline Difuzie crescut Cretere policlonal
Apariie n benzi Cretere oligoclonal, infecie viral, malignitate
Un profil policlonal semnificativ al electroforezei proteinelor serice
pe gel de agaroz (anodul fiind n stnga). Banda prevzut cu
asterisc este lrgit i se ntinde pe toat aria de mobilitate gama
(Panelul B). Trasarea densitometric a acestei observaii vizuale
relev un peak difuz de mobilitate gama. Acest profil este cel mai
adesea dat de prezena unui proces inflamator ori reactiv, precum i n
bolile cronice ale ficatului, n bolile esutului conectiv, n infec ii
cronice, ori ntr-o maladie limfoproliferativ (Panel A).
 Variante genetice (proteina Bence Jones,
Polimorfism
componenta M, hemoglobin)
Zona 1
Crete Deficien de fier, estrogeni
Transferina
Malnutriie, scderi n greutate rspuns
Scade
inflamator

Hipercolesterolemie
-Lipoproteine Poziie crescut O mobilitate sczut cu creterea intensit ii
sugereaz o obstrucie biliar

Zona 2 Malignitate, infecii ale mucoasei, artrit, abuz

Cretere selectiv
IgA de alcool
Polimorfism Variante genetice,
Poziie Conversia in vivo/invitro a C3 la C3c
C3 Rspuns cronic inflamator,
Crete
Obstrucie biliar
Scade Activarea complementului
Zona Crete Rspuns inflamator
Fibrinogen
PROFILUL ELECTROFORETIC AL PROTEINELOR DIN PLASM COMPARATIV
CU CELE DIN FLUIDUL CEREBROSPINAL
n mod normal, aproximativ 80% din proteinele fluidului cerebrospinal fluid (CSF) au
originea n plasm iar restul sunt sintetizate local. Timpul de njumt ire pentru
proteinele plasmatice care intr n spaiul subarahnoid este de aproximativ o
sptmn, i din acest motiv compoziia n proteine a CSF o urmeaz pe cea din
plasm, cu o oarecare ntrziere. Rezistena de transfer a proteinelor plasmatice crete
rapid odat cu masa molecular i din acest motiv raportul dintre proteinele mari
(IgM, -lipoproteine i 2-macroglobuline) i albumin, este n mod normal mai sczut
n CSF dect n plasm. Aceast discriminare pe baza masei moleculare se mic oreaz
cnd concentraia proteic a CSF este crescut.

PROFILUL ELECTROFORETIC AL PROTEINELOR

DIN URIN COMPARATIV CU CELE DIN PLASM
Un determinat primar pentru profilul proteinelor urinare este compozi ia i cantitatea de
proteine care permeaz filtrarea glomerular n rela ie cu capacitatea resorbtiv
tubular. n mod normal, aceasta este limitat la aproximativ 200 mg/zi. Asupra
pierderii urinare intense de cantit i de protein, analizele comparative electroforetice
disting trei posibiliti majore:
(a) proteinuria glomerular neselectiv,
(b) proteinuria glomerular selectiv, i
(c) proteinuria Bence Jones.
 PROTEINURIA BENCE JONES

Excreia urinar a catenelor uoare de imunoglobuline ori , cu origine monoclonal

(proteinuria Bence Jones) conduce la apariia unei singure (ori uzual dubl) bande, mai mult ori
mai puin nchis la culoare, undeva n zona 1 spre zona cu mobilitate mic . Natura ei poate fi
demonstrat prin imunoelectroforez, dar este de preferat o eviden iere prin imunofixare dup o
electroforez pe gel de agaroz n prezen a antiserurilor anti i anti . Rezultatul unor analize
imunoelectroforetice convenionale este mai dificil de interpretat dect rezultatul ob inut prin
imunofixare dac concentraia de caten u oar monoclonal este sczut, deoarece catenele
policlonale uoare apar n urin.
Electroforeza proteinelor urinare pe gel de agaroz n
prezen de dodecil sulfat de sodiu

S-a introdus pentru analiza calitativ a proteinelor urinare electroforeza pe gel de poliacrilamid n prezen a
dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE). SDS-PAGE separ proteinele n funcie de mrimea lor molecular, iar
monomerii catenelor uoare libere (policlonale sau monoclonale) sunt vizualizate ca o band cu mas
molecular (Mr) de 25.000 Da, care sunt deosebite cu uurin de imunoglobulinele intacte (cu mas
molecular de 150.000 Da). SDS-PAGE difereniaz, de asemenea, proteinuriea cu origine glomerular
(proteine, cu mas molecular de 66.000 Da), de cea cu origine tubular (proteine cu mas molecular de
66.000 Da), sau cu origine mixt. Aceast metod este, aadar, un potenial instrument clinic pentru evaluarea
funciei renale, un important factor de prognostic n MM. Cu toate acestea SDS-PAGE, nu este utilizat pe
scar larg n laboratoarele clinice, pentru c este exigent din punct de vedere tehnic, un timp mai
mare, i este mai costisitoare.
Le Bricon i colaboratorii (1998; 2000) propun pentru prima dat o tehnic de
analiz a proteinelor urinare prin electroforez pe gel de agaroz n prezen de
dodecil sulfat de sodiu (SDS-AGE) la pacieni suferinzi de Mielom multiplu. Astfel,
urina, fr o concentrare prealabil, se analizeaz prin SDS-AGE pe suport
Hydragel, mediu electroforetic utilizat n mod comun la analiza proteinuriei.

Profilul electroforetic a cinci probe diferite obinut

dup SDS-AGE. De la stnga spre dreapta: 1,
proteinurie glomerular selectiv: transferin i
albumin; 2, BJP prerenal pur: dimeri ai
catenelor u oare i monomer, nainte de
tratamentul cu mercaptoetanol; 3, proteinurie
mixt: immunoglobuline, transferin, albumin,
1- microglobulin (Alfa-1 ), monomeri ai
catenelor u oare (policlonali), proteina de legare
a retinolului (RBP) i 2-microglobulin (Beta-2
); 4, BJP prerenal pur: monomeri ai catenelor
u oare; 5, proteinurie tubular: mici cantiti de
albumin, monomeri ai catenelor u oare
(policlonale) i RBP. Caracterul monoclonal al
catenelor u oare detectate sunt confirmate prin
imunofixare.
Trebuie ns accentuate o serie de limitri ale tehnicii SDS-AGE. Cea mai important
este faptul c SDS-AGE nu poate s realizeze o distincie definitiv ntre proteinele
monoclonale i cele policlonale. n absena unor leziuni tubulare (n cazul BJP pur
sau n proteinuria glomerular), se evideniaz ntotdeauna banda electroforetic
corespunztoare Mr=25.000 Da caracteristic BJP.
n concluzie, SDS-AGE
pare a fi un instrument de laborator clinic pentru urmrire a pacienilor diagnostica i cu
MM.
SDS-AGE are o nalt rezoluie, sensibilitate, i reproductibilitate.
ntr-un laborator specializat, metoda este util n monitorizarea progresiei maladiei la
pacieni prin intermediul determinrii semicantitative a BJP.
Comparativ cu electroforeza pe gel de agaroz de rutin, SDS-AGE combin simplitatea
(nu este nevoie de o concentrare prealabil a urinei) cu o sensibilitate crescut pentru
detectarea BJP.
Profilurile electroforetice glomerulare, tubulare ori mixte se identific u or pe gelul de
agaroz. Interpretarea profilurilor benzilor proteice dup SDS-AGE cere, totui,
contientizarea unor capcane, n special n ceea ce privete polimerizarea catenelor u oare i
prezena unor catene uoare mono-i/sau policlonale n specimenele de urin a pacienilor
diagnosticai cu mielom multiplu.
n unele cazuri, SDS-AGE poate fi uor mai sensibil dect imunofixarea n detec ia
proteinelor Bence Jones la concentraii sczute.
 ELECTROFOREZA FRAGMENTELOR DE ADN PE GEL DE AGAROZ

Acizii nucleici sunt polimeri compu i din uniti nucleotidice individuale, unitile fiind conectate prin
intermediul legturilor diester fosfat la scheletul zaharidic. Efectul net al acestor legturi este cel de a oferi
polimerilor o sarcin net negativ.
nc de la nceputul tehnicilor electroforetice s-a axiomat faptul c moleculele care transport o sarcin
electric vor migra ntr-un cmp electric ntr-un mod previzibil. Atunci cnd este supus unui cmp electric, o
molecul care transport o sarcin net negativ va migra spre polul pozitiv, n timp ce o molecul ncrcat
cu o sarcin net negativ va migra spre polul negativ.

Atunci cnd macromolecule de acizi nucleici ncrcate electric sunt plasate n

matricea semi-solid a unui gel, ele vor migra spre polul pozitiv ntr-un mod
previzibil i reproductibil, procesul putnd fi descris ca o funcie exponenial
negativ a lungimii acestora. Altfel spus, moleculele mai scurte vor migra mai repede
n timp ce moleculele mai mari (mai lungi) vor migra mai lent. ntr-adevr, n cazul
unui acid nucleic, aflat ntr-un cmp electric uniform, orice alt element al expresiei
migrrii sale este o constant, iar mobilitatea sa este complet determinat de
mrimea moleculei (masa molecular a unui acid nucleic se exprim n daltoni sau
n perechi de baze, base pair, bp, de fapt nucleotide; o pereche de baze este
aproximativ egal cu 660 daltoni). Metoda este deosebit de simpl, rapid i
sensibil pentru separarea, identificarea i purificarea fragmentelor de ADN.
Din punct de vedere practic, intr-un gel de
agaroz, este dificil s se rezolve cu
precizie acizi nucleici dubli catenari mai
mici de aproximativ 100 de baze, deoarece
proprietile de cernere molecular a
agarozei nu sunt suficient de pregnante. Pe
de alt parte, macromoleculele mai mari
de aproximativ 25.000 bp dar mai mici de
aproximativ 2.000.000 bp vor migra n gel
cu viteze diferite, datorit limitrii de
mobilitate. Macromoleculele de acizi
nucleici mai mari de 2.000.000 bp nu vor
putea penetra un gel convenional de Mobilitatea electroforetic a fragmentelor de
agaroz. Astfel, domeniul efectiv de restricie a ADN ntr-un gel de agaroz. DNA provine
mrime pentru electroforeza acizilor din bacteriofagul lambda n urma digestiei cu enzima
nucleici dublu catenari pe un gel de restricie Hind III. Graficul arat c distana de
migrare n centimetri n funcie de mrimea n perechi
convenional de agaroz este ntre 100 bp
de baze a fragmentului separat
i 25.000 de bp. n acest interval
comportamentul macromoleculei este
precis i previzibil. Acest comportament
este prezentat n figura alturat.
n anii 80, a fost prezentat o teorie prin care se consider c
acizi nucleici migreaz prin gel asemntor micrii
ondulatorii a unui arpe. Astfel macromolecula se mic din
fa i trage restul de macromolecul dup ea. n acest model,
cu ct molecula este mai mare, cu att ea interac ioneaz mai
puternic cu matricea de gel i astfel ntmpin o rezisten mai
.
mare din partea acesteia n aa fel nct timpul su de sta ionare
ntr-o zon este mai mare. Aa cum a fost artat mai sus,
creterea rezistenei gelului este neliniar. Acest model, numit
biased reptation, este suficient pentru a explica tot
comportamentul unui acid nucleic ntr-o matrice de semi-
solid.
n anul 1989 un grup de cercettori de la Universitatea din
Washington, au testat aceast teorie, filmnd macromoleculele
de ADN care se deplaseaz printr-un gel de agaroz. Filmul a
artat att micarea ondulatorie, sigmoidal, ct i interac iunile
dintre acid nucleic i matricea gelului de agaroz.
Separarea fragmentelor de ADN de dimensiuni
diferite prin electroforez pe gel vertical. Gelul este
preparat prin turnarea agarozei topite sau a
acrilamidei nepolimerizate ntre dou geamuri de
sticl aflate la o distan de c iva milimetrii. Dup
solidificarea agarozei ori polimerizarea acrilamidei
se formeaz o matrice de gel, a crei pori depinde de
concentraia de gel sau de acrilamid utilizat.
Deoarece porii sunt mai mari n gelurile de agaroz
dect n cele de poliacrilamid, cel din nainte este
utilizat la separarea fragmentelor mari de ADN (ntre
500 i 20 kb) n timp ce al doilea se utilizeaz la
separarea fragmentelor mici (de la o nucleotid, pn
la 2 kb). Amestecul de fragmente de ADN care
urmeaz a fi separat este depus ntr-un godeu din
partea superioar dup care se aplic un cmp
electric prin gel. Fragmentele de ADN se mi c spre
polul pozitiv cu o vitez invers proporional cu
logaritmul lungimii lor formnd benzi care pot fi
vizualizate prin autoradiografie (dac fragmentele
sunt radiomarcate) ori prin adugare de colorant
fluorescent de tipul bromurii de etidiu; n acest ultim
caz, agaroza lichefiat este lsat s se solidifice pe
un suport de sticl sau plastic orizontal
Cum matricea de gel restricioneaz difuzia ntmpltoare a
moleculelor, moleculele cu lungimi diferite se separ n zone
discrete (benzi) a cror lime este egal cu l imea godeului
unde s-a plasat amestecul original de ADN

Analiza unor fragmente de ADN

dup separare electroforetic pe
gel de agaroz. Prima linie conine
fragmente cu mas molecular
cunoscut de ADN obinute n
urma digestiei cu o enzim de
restricie a unui ADN cunoscut.
Celelalte patru linii arat diverse
fragmente cu mrimi diferite
prezente n probe.
Se poate spune astfel c mobilitatea ADN este funcie de masa molecular,
cmpul electric aplicat, compozi ia nucleotidic, temperatura de lucru i
soluia de tampon utilizat la separare. Deplasarea moleculelor liniare de
ADN se realizeaz cu o vitez invers propor ional cu logaritmul masei lor
moleculare.
Dup cum se cunoate, conformaia ADN explic mobilit ile diferite la
mase moleculare egale. Astfel, ADN o serie de conforma ii: circular nchis
(covalentry closed circle) supranf urat (supercoiled), circular deschis
(open circular), liniar. Moblitatea electroforetic a celor trei forme de
ADN este n funcie de condiiile de lucru.
Pentru vizualizate postelectroforetic a
fragmentelor de ADN se utilizeaz tehnici
autoradiografice (dac fragmentele sunt
radiomarcate) ori prin adugare de colorant
fluorescent de tipul bromurii de etidiu
(figura alturat).

Bromura de etidiu, o molecul planar, se

intercaleaz n structura ADN ntre bazele
azotate iar buclele supranf urate
ncrcate cu sarcin negativ ale
conformaiei circular nchise se desfac i n
aceste condiii mobilitatea electroforetic
se reduce.
Legarea bromurii de etidiu la ADN crete de asemenea fluorescen a intrinsec. Ca
rezultat, n condiiile iluminrii unui gel cu lumin ultraviolet, regiunile de gel care
conin ADN, vor fi mai strlucitoare fa de regiunile gelului fr ADN.

La concentraii de 0,1-0,5 g/ml de bromur de etidiu, toate buclele

nfurate sau supranfurate sunt desfcute. De asemenea, bromura de
etidiu reduce i mobilitatea conformaiilor circular nchise i liniare. ADN
marcat radioactiv poate fi vizualizat i prin autoradiografia gelului. n acest
caz, gelul este depus n contact cu un film fotografic, la ntuneric; filmul
astfel expus va indica poziiile ADN prezent marcat. Dac filmul se
developeaz, se obine imaginea fotografic a ADN. Benzile de ADN
radiomarcat pot fi detectate prin analiza particulelor eliberate de
moleculele marcate din gel. Datele rezultate se pot stoca n computer i pot
fi convertite ntr-o imagine asemntoare unei autoradiograme
Compoziia nucleotidic nu influeneaz n mod semnificativ mobilitatea electroforetic, n
schimb, concentraia de agaroz este esenial: cu ct concentraia de gel este mai mare, cu
att mobilitatea fragmentelor de ADN este mai mic. Prin folosirea gelurilor n gradient de
concentraie este posibil separarea ADN de diferite mrimi.
Pentru a obine o rezoluie bun, cderea de tensiune ntre bornele aparatului de electroforez
trebuie s fie de 5V/cm. n general, la diferene mici de poten ial, mobilitatea fragmentelor
lineare de ADN este proporional cu intensitatea cmpului electric.
n general se lucreaz la temperatura camerei. Pentru geluri care con in mai pu in de 0,5%
agaroz, se recomand migrarea la o temperatur de 4oC. Majoritatea protocoalelor de lucru
recomand tamponul Tris, 50mM, pH=7,5-7,8 drept optim n ceea ce prive te tria ionic i
capacitatea de tamponare.
Aparatura utilizat este de obicei orizontal, asemntoare celei utilizate la electroforeza
proteinelor. Este de asemenea necesar un redresor de curent cu o intensitate maxim de 100 mA
i o tensiune maxim de 100V, iar pentru evideniere postelectroforetic a fragmentelor de ADN
dup colorare cu bromur de etidiu, de o lamp UV prevzut cu un filtru de 300 nm.
Tehnica de lucru pentru electroforeza
submers a fragmentelor de ADN. De obicei se
utilizeaz o agaroz cu o electroosmoz
standard (-mr = 0,13) sau mai mic (-mr = 0,07).
Gelurile se prepar asemntor celor de
amidon, iar dup solidificare se plaseaz pe
platforma cuvei unde se acoper cu tampon,
stratul de deasupra fiind de circa 1 mm. La
trecerea unui curent electric, rezistena electric
a stratului de soluie tampon este aproape egal
cu cea a gelului i astfel, cea mai important
parte a curentului aplicat va trece prin gel.
Aceast tehnic este numit electroforez cu
gel scufundat (submers) i este cea mai utilizat
tehnic de analiz electroforetic a
fragmentelor de ADN.
 ElectroforezafragmentelordeADNncmpelectric
pulsator

Dac prin metoda clasic, convenional se pot separa fragmente de ADN de pn la 20 kbp cu
rezoluie bun, cele pn la 40 kbp cu rezoluie satisfctoare, pentru separarea fragmentelor
pn la 500 kbp se rezolv cu rezoluie slab, ntr-un gel de agaroz foarte fragil cu o concentraie
de 0,1%. La mijlocul anilor `80 s-au dezvoltat o serie de metode de analiz electroforetic a
moleculelor de acizi nucleici n domeniul de mrime care limiteaz mobilitatea. Solu ia a implicat
introducerea mobilitii dependente de mrime a moleculelor de acizi nucleici prin alterarea
cmpului electric. Primul tip de alterare implic simpla schimbare de polaritate a cmpului
electric ntr-o manier regulat. S-a artat c o schimbare periodic a polarit ii va induce
moleculelor o micare de ntoarcere n forma literei U, n matricea de gel. Chiar pentru cele mai
mari molecule, aceast ntoarcere permite separarea moleculelor. Dac lungimea timpului de
reversare a moleculelor este de aproximativ o treime din timpul de micare spre nainte, ele se vor
putea separa n cteva ore pe agaroz standard. Prima demonstra ie practic a acestei metode,
denumit electroforez n cmp inversat (Field Inversion Gel Electrophoresis-FIGE), a
rezolvat complet printr-o migrare de o secund nainte urmat de o secund napoi molecule
mari de 2.000.000 bp precum cromozomii intaci din drojdie. De atunci s-au dezvoltat o varietate
de metode, n mod comun denumite electroforez n cmp pulsator. Prin aceste tehnici cele mai
mari molecule de ADN cu o lungime cuprins ntre 210 4 la 107 bp (20 kb la 10 megabp, Mb), se
pot separa n funcie de masa lor molecular. Separarea prin electroforez n cmp pulsator
depinde de comportamentul singular al moleculelor mari de DNA ntr-un cmp electric care este
pornit i oprit (pulsat) la intervale mici de timp.
n condiiile n care se aplic un cmp electric unor
molecule mari de ADN aflate ntr-un gel, molecule
migreaz n direcia cmpului electric i de asemenea se
ntind pe toat lungimea lor. Dac curentul este stopat,
moleculele ncep s se relaxeze prin nf urri
ntmpltoare. Timpul necesar pentru relaxare este
direct proporional cu lungimea moleculei. Cmpul
electric este apoi reaplicat ntr-un unghi de 90 ori 180
fa de prima direcie. Moleculele mai mari se relaxeaz
mai puin dect moleculele mai scurte n momentul n
care curentul este oprit. Cum moleculele trebuie s se
relaxeze prin nfurri ntmpltoare naintea miscrii
lor ntr-o nou direcie, moleculele mai mari ncep s se
mite n direcia nou impus mai lent dect cele mai
scurte. Alternarea repetat a direciei cmpului electric
foreaz moleculele mari de ADN de diferite mrimi s
se ndeprteze mai mult i mai multe ntre ele.

Electroforeza n cmp pulsator este foarte important n purificarea moleculelor mari de

ADN, pn la 107 bp n lungime. Tehnica este necesar pentru analiza cromozomilor
celulari de la 5105 bp (cel mai mic fiind cromozomul de la drojdie) pn la aproximativ 2-
3108 bp (cromozomii animali i de plante). Cromozomii cei mai mari trebuie n prealabil s
fie digerai n fragmente de 107 bp ori mai mici nainte de analiz. Astfel de fragmente de
restricie pot fi generate cu ajutorul enzimelor de restric ie care taie la situsuri de restric ie
gsite la situsuri de restricie de 8 bp
Se poate spune c principiul (caracteristica metodei) o reprezint faptul c
fragmentele de ADN sunt obligate s-i schimbe periodic direc ia de deplasare ca
urmare a schimbrii direciei cmpului electric. Intervalul de timp pentru migrare
ntr-o direcie sau alta determin limita superioar a dimensiunii fragmentelor de
ADN care se vor separa distinct. Dependena de timp este aproape liniar: la
frecvene de timp de 0,1 secunde, se separ fragmente mai mari de 10 Kbp, n timp
ce la intervale de timp de o or, se vor separa fragmente de circa 1 Mbp. Timpul
necesar separrii prin electroforez n cmp pulsator este cuprins ntre 20 i 80 de
ore, n condiiile n care gelul de agaroz are o concentraie de 0,5-1%

Temperatura de lucru este de 14-15oC, la o cdere de tensiune de 2,5-10V/cm.

Calculul voltajului se realizeaz prin asumarea faptului c n sistemele
electroforetice submarine, numai aproximativ 80% din curent trece prin gel, cderea
de tensiune (V/cm) poate fi estimat prin relaia:
 Schemele unei serii diverse de tipuri de aparate
utilizate n electroforeza acizilor nucleici n cmp
pulsator.

Mobilitatea moleculelor de ADN este n funcie de tensiunea (diferena de potenial) aplicat,

temperatura de lucru, frecvena schimbrii direciei cmpului electric i de solu ia de tampon
folosit, din care cauz trebuie identificat combinaia optim tensiune/temperatur (rezolu ia
de separare scznd odat cu creterea temperaturii i a tensiunii, de i viteza de migrare
electroforetic crete). Din acest motiv se recomand schimbarea frecven ei ciclurilor de dou
sau mai multe ori n timpul separrii. Prin aceast tehnic, este oarecum dificil a se determina
mas molecular cu toate c se pot utiliza markeri de mas. Asemntor vizualizrii
fragmentelor mici de ADN, i n acest caz gelul poate fi colorat cu bromur de etidiu (1 g/ml),
cnd fluorescena intens orange a colorantului intercalat n molecula de ADN dublu helical
conduce la cuantificarea a minimum 50ng de ADN.
Dintre aplicaiile electroforezei n cmp pulsator se pot enumera
obinerea hrilor genetice, (a librriilor metagenomice), a cariotipului
electroforetic la drojdii (Sacharomices cerevisiae, Candida albicans) la
protozoare (Giardia intestinalis). Ea s-a utilizat n studiul genomului
uman, de analiz a unor regiuni implicate n maladii cunoscute precum
complexul major de histocompatibilitate, de analiz a genei distrofiei
musculare Duchenne, unde s-a pus la punct un test molecular de
diagnostic n cazul femeilor vector purttoare a genei defecte i astfel
de diagnostic prenatal n familii cu risc crescut. Se poate spune c
apariia electroforezei n cmp pulsator a contribuit semnificativ la
dezvoltarea biologiei moleculare.
Dintre dezavantaje se pot enumera timpul mare de izolare i restric ie a
ADN care preced electroforeza, acesta fiind dezavantajul major a
analizelor de macrorestricie prin intermediul electroforezei n cmp
pulsator. Astfel, un protocol standard dureaz cinci- ase zile pn la
evaluarea rezultatelor
 ELECTROFOREZA
PROTEINELOR PE GELURI
DE POLIACRILAMID
Sursele comerciale furnizeaz acrilamid i N,N'-metilen bisacrilamid
cu o puritate suficient care permite utilizarea lor fr o aciune de
pregtire. O serie de reactivi pot fi obinui n form pre-mixat
(amestecai) gata pentru reacia de polimerizare. Exist disponibile
comercial componente nalt purificate care permit formarea gelurilor
transparentelalungimideundcuprinsendomeniulultraviolet(260 i
280 nm), care permit scanarea direct pentru identificarea acizilor
nucleicioriaproteinelor.
Dintredezavantajesepotenumera:neurotoxicitatea,cancerogenitatea
acrilamidei iar la contactul cu pielea, componentele amestecului de
polimerizare pot cauza iritaii. n plus, reproductibilitatea depinde de
puritatea reactivilor i a condiiilor de lucru. Ca regul, componentele
trebuie s fie stocate n vase nchise la culoare, la frigider. Odat ce
monomerii au fost dizolvai durata de via a solu iei este de
aproximativ 3 luni. Este recomandat ca pH-ul soluiei s fie msurat
periodic deoarece odat cu mbtrnirea soluiei, pH-ul va crete.
Astfel, aceast soluie va necesita un timp mai ndelung de
polimerizare, fenomen care servete de asemenea drept indicaie c
monomeriisedeterioreaz.
Acrilamida (amida acidului acrilic, 2-propen amida) este o pulbere
alb, uor solubil n ap, solubil n solveni polari (etanol, aceton,
cloroform) i insolubil n solveni nepolari (tetraclorur de carbon, n-
heptan) Ea i pstreaz proprietie chimice timp ndelungat dac este
pstrat corespunztor. Dac este expus la lumin, polimerizeaz slab
i formeaz mici cantiti de poliacrilamid. Amida acidului acrilic se
prepar fie prin sintez chimic, prin hidroliza acrilonitrilului, fie prin
biosintez, cnd utiliznd o tulpin de Cornynebacterium se obine cu
un randament de aproximativ 100% acrilamid.
Acrilamida se purific prin recristalizare la o temperatur de 60 oC din
cloroform sau soluii alcoolice cu un randament de circa 60%.
Acrilamida astfel obinut este apt pentru focusare izoelecric i alte
tehnici unde sunt necesare geluri foarte subiri.
Utilizarea unor reactivi de nalt calitate este o condiie prealabil pentru
obinerea unor geluri reproductibile i de nalt rezoluie. Acest lucru este
valabil mai ales pentru acrilamid, care constituie componenta cea mai
abundent n amestecul de monomeri. Reziduurile de acid acrilic,
poliacrilamid liniar i a impuritilor ionice sunt contaminani majori care
scad calitatea preparatelor de acrilamid.
1. Acid acrilic va copolimeriza cu acrilamida i bisacrilamida, ceea ce pentru
gelul rezultant confer proprieti de schimbtor de ioni.
2. Poliacrilamida linear, prin furnizarea unui nucleu de polimerizare
necontrolat, poate conduce la geluri nereproductibile.
3. Contaminanii ionici pot s includ att inhibitori ct i acceleratori ai
reaciei de polimerizare. n special, metale precum cuprul poate inhiba
polimerizarea gelului.
Componentele tampon trebuie s fie de grad de reactiv i numai apa
deionizat trebuie s fie utilizat pentru toate fazele electroforezei pe gel de
poliacrilamid.
N,NCistaminbisacrilamida este utilizat la gelurile de acrilamid
solubilizabile, nlocuind echimolecular bisacrilamida. Gelurile se
solubilizeaz utiliznd ageni reductori ai legturii disulfurice (-S-S-), 2
mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritriol.
Diacrilpiperazina (N-Bis-acrililpiperazin, BAP) se sintetizeaz relative uor
i este foarte solubil n ap. Ea formeaz geluri cu conductibilitate mai
mare dect cele obinute prin copolimerizarea acrilamidei cu bisacrilamid.
Aceste geluri nu se umfl prea tare cu ap iar n prezen a dodecilsulfatului
de sodiu porii gelului scad aparent. Prin utilizarea gelurilor cu
diacrilpiperazin drept agent de reticulare separarea i detec ia proteinelor
este mbuntit, iar transferul proteinelor pe membrane de nitroceluloz
este mai eficient.
N,N Dialiltartratdiamina formeaz geluri care i mresc volumul cu
aproximativ 30% n ap. Ele sunt solubile n acid periodic sau periodat de
potasiu. Gelurile formate de N,Ndialiltartratdiamin au o stabilitate
mecanic mai bun, sunt mai aderente pe sticl i sunt perfect transparente,
comparabil cu cea a gelurilor de poliacrilamid-bisacrilamid.
 Al i agen i de reticulare.

Versatilitatea gelurilor poliacrilamide este, de asemenea demonstrat de numrul mare de agen i de

reticulare, pe langa Bis, care pot fi folosii pentru a turna geluri cu proprieti specifice n scopul
unei fracionri diferite. Acestea sunt enumerate n tabelul de mai sus. N,N'-(1,2-Dihidroxietilen)
bisacrilamida (DHEBA) poate fi folosit pentru turnarea geluri reversibile, deoarece structura de
1,2-diol face DHEBA un conpus sensibil la clivaj prin oxidare cu acid periodic. Acelai principiu se
aplic, de asemenea, pentru gelurile pe baz de N,N'-(1,2-Dihidroxietilen) bisacrilamid (DATD)
Alternativ, geluri pe baz de etilen diacrilat (EDA) pot fi utilizate, deoarece acest agenytul de
reticulare conine legturi ester care pot clivate prin hidroliz. Agenii de reticulare poli(etilen glicol
diacrilat) fac parte din aceeai serie de derivai esterici. Aa cum s-a descris anterior, gelurile pe baz
de N,N-bisacrililcistamin (BAC) conin puni disulfurice uor clivabile.
Structura chimic a
unor monomeri
acrilamido N-
substituii utilizai la
prepararea gelurilor
de poliacrilamid
n general sistemele catalitice se pot mpri n:
Sisteme catalitice n care radicalii liberi sunt genera i prin reac ii redox;
Sisteme catalitice n care radicalii liberi sunt genera i prin fotocataliz.
n afara celor dou mari categorii exist de asemenea sisteme combinate.
Sisteme catalitice redox constau de obicei din:
Iniiator al reaciei de polimerizare vinilic (acesta este o substan care
introdus n sistemul chimic n concentraie mic poate declan a procesul
chimic respectiv. Iniiatorul se descompune cu uurin n radicali liberi). Cel
mai utilizat iniiator al reaciei de polimerizare este persulfatul, S 2O82-.
Catalizator (accelerator) al reaciei de polimerizare (acesta este o substan
care modific viteza de reacie, cataliznd formarea de radicali liberi, n acest
caz). O condiie necesar pentru a funciona drept catalizator este de a poseda
dou grupri amino separate prin doi atomi de carbon sau o grupare amino
teriar.
Schema reaciei de descompunere a persulfatului i de generare a radicalilor liberi
Cel mai utilizat accelerator n polimerizarea vinilic a
acrilamidei este tetrametiletilen diamina, TEMED. n
acest sistem, TEMED accelereaz descompunerea
moleculelor de persulfat n doi radicali sulfat iar
acetia iniiaz reacia de polimerizare

Trebuie ns avut n vedere necesitatea prezenei TEMED

pentru aceast reacie. Eficiena polimerizrii n acest sistem
scade rapid la valori ale pH-ului mai mici de 6,0

1.4. piperazin dimetil (1. 4 dimetilpiperazina, DMPIP)

reprezint un alt catalizator utilizat n polimerizarea
vinilic. Acesta este ns un catalizator mai slab dect
TEMED, dar este mai bun pentru colorarea gelurilor cu
argint amoniacal (n acest caz se adaug la sistemul
catalitic tiosulfat de sodiu alturi de persulfat).
 Un alt sistem catalitic utilizat la prepararea gelurilor de poliacrilamid este format din
riboflavin i TEMED. Astfel, riboflavina, sub aciunea radiaie UV genereaz radicali
liberi care iniiaz reacia de polimerizare. Sistemul con ine i TEMED pentru a mri
viteza de reacie. Polimerizarea dureaz circa o or iar n absen a TEMED reac ia
decurge n aproximativ 8 ore, dup circa o or, doar 60% din monomeri fiind
polimerizai, obinndu-se astfel geluri nereproductibile, monomerii neintra i n reac ie
putnd interaciona cu resturile de aminoacizi din constituia proteinelor supuse separrii
electroforetice, putnd chiar interaciona cu diverse componente ale sistemului tampon.
De obicei fotopolimerizarea cu riboflavin drept accelerator, este utilizat pentru gelurile cu
pH sczut .

Un sistem diferit de fotopolimerizare

cuprinde un colorant cationic (albastru
de metilen) i un cuplu redox alctuit din
sodiu toluen sulfinat (un reductor )i
clorur de difeniliodoniu (un oxidant
mediu).
Catalizatori ai reaciei de fotopolimerizare: A. clorur de difeniliodoniu
(DPIC); B. toluen sulfinat de sodiu (STS), C. albastru de metilen (MB).
Ultimul, poate fi utilizat i n combinaie cu riboflavin-5'-fosfatul
 FACTORII DE CARE DEPINDE VITEZA REACIEI DE
POLIMERIZARE
Viteza reaciei de polimerizare depinde de:
(1) Concentraia net de monomeri i de radicalilor liberi ( de obicei se utilizeaz TEMED
n concentraie de 10 mM i persulfat);
(2) Temperatura la care are loc reacia de polimerizare. n acest context se cunoate c
reacia de polimerizare este exoterm i din aceast cauz temperatura trebuie s fie
controlat cu atenie. Ea se desf oar mai u or la temperatura camerei, cu toate c exist
matrice termostatate. n general la gelurile plate, disiparea cldurii este mai eficient cu ct
grosimea gelului este mai mic;
(3) Puritatea reactivilor;
(4) Concentraia de inhibitori. Prin inhibitor trebui neles orice compus care distruge
radicalii liberi. Astfel, orice compus care poate aciona ca o trap pentru radicalii liberi va
aciona ca un inhibitor de polimerizare. Oxigenul atmosferic este cel mai important inhibitor
i din acest motiv este necesar o degazare corespunztoare a amestecului de polimerizare
pentru a elimina oxigenul dizolvat n soluiile de acrilamid. Prezen a oxigenului este critic
pentru o reproductibilitate absolut a electroforezei. Cu toate acestea, pot fi acceptabile i
geluri obinute fr o degazare complet. Al i inhibitori ai reac iei de polimerizare sunt (a)
aminele alifatice, (b) compuii aromatici precum piridina, (c) protonii (existen i n mediul
acid).
Pentru ca gelurile s fie reproductibile, to i ace ti parametrii trebuie s fie controla i cu
atenie.
 PROPRIETILE GELULUI DE POLIACRILAMID

Prin polimerizarea acrilamidei cu bisacrilamida, se formeaz o re ea tridimensional n condi iile n care

agentul de reticulare bifuncional se leag de lanurile liniare de poliacrilamid adiacente formnd un mediu
poros n care dimensiunile porilor sunt n funcie de concentra iile ini iale ale monomerilor (acrilamid i
bisacrilamid) i de condiiile de realizare a reaciei de polimerizare (sistem catalitic, temperatur, etc.).
Prin convenie, gelurile de poliacrilamid sunt caracterizate printr-o pereche de valori, T% i C
%, n cazul n care T% reprezint procentul de greutate al cantit ii totale de monomeri, inclusiv
a agentului de reticulare (n g/100 ml),

adic:

unde a reprezint cantitatea de acrilamid iar b este cantitatea de

bisacrilamid n timp ce V este volumul total de soluie.
C(%) reprezint procentul (proporia) de agent de reticulare ca procent din totalul de
monomeri, adic din cantitatea total de monomeri.

C(%) se calculeaz dup relaia:

Dup cum se observ, C(%) este practic gradul de reticulare.

S-au observat o serie de anomalii n condiiile n care se utilizeaz doi agen i de
reticulare cu mase molecular diferit. Acetia nu vor avea aceea i frecven .
agentul de reticulare mai mic va avea o frecven mai mare. Astfel, uneori se
utilizeaz fracia molar, X care poate fi definit ca:
 Efectul de cernere molecular
Termenul de por nu definete un element geometric dect n sens orientativ i comparativ.
Mrimea porilor semnific rezistena opus de reeaua tridimensional a gelului la
deplasarea macromoleculelor (n spe a proteinelor). Cu ajutorul gelului de poliacrilamid
se pot separa molecule de la cteva sute la cteva milioane de daltoni. Mrimea efectiv a
porilor este n funcie de concentraia total a monomerilor, T (%) i de propriet ile
agentului de reticulare, C (%).

Dependena de concentraia de monomeri, T(%) i C(%)

O macromolecul cu sarcin electric dat n funcie de dimensiunile sale i de

dimensiunile porilor va fi mai mult sau mai puin frnat n deplasarea sa n cmp, fiind
caracterizat printre altele, prin mobilitatea electroforetic. n practic se folose te
mobilitatea relativ electroforetic care este propor ional cu distan a de migrare. Ea se
calculeaz prin compararea mobilitilor diferitelor macromolecule considernd timpul
de separare i intensitatea curentului electric, constante.
Mobilitatea relativ se noteaz cu Rf i definete ca raportul dintre mobilitatea unei
macromolecule oarecare i mobilitatea unei macromolecule standard sau a unui
colorant care migreaz cu frontul. Rf poate fi definit i ca raportul ntre mobilitile
unei macromolecule n mediu restrictiv i mobilitatea sa ntr-un mediu liber,
nerestriciv, o dup relaia:

Rf este o constant fizic care caracterizeaz o macromolecul dat ntr-un gel cu

o anumit compoziie, n condiii definite
Pentru a obine date despre: (a) dimensiunile i sarcina net a unei macromolecule, (b) omogenitatea,
(c) concentraia optim a unui gel care poate rezolva sau diferenia dou specii moleculare, se folosesc
reprezentrile Ferguson (figura alturat).
KR (msura frnrii deplasrii macromoleculei n gel) i y0 (msur a mobilitii macromoleculei n
mediu liber, nerestrictiv la T (%)=0) sunt parametrii caracteristici ale macromoleculei luate n studiu.
n plus, y0 poate fi corelat cu sarcina electric net.
n lumina acestei reprezentri gelurile pot fi:
Zerodimensionale, cnd fibrele de polimer au o lungime aproximativ egal cu 0, polimerul fiind liniar
i supranfurat formnd suprafibre cu pori mari cu raza de 20-40 nm.
Unidimensionale, cnd fibrele de polimer au o lungime infinit iar numrul de capete este
neglijabil. Este cazul poliacrilamidei convenional reticulate cu C(%)=2-5% care pare a avea
predominant caracter de gel unidimensional cu fibre cu raz de 1-2 nm.

Reprezentarea Ferguson. Din panta

dreptei () se calculeaz coeficientul KR iar
din intersecia cu axa oy se obine yo
valoare dat pentru T(%)=0.
Interpretarea gelurilor native este mai complex dect interpretarea gelurilor
dup SDS PAGE deoarece mobilitatea relativ reflect diferenele de
sarcin electric i de mas sau ambele, mai ales n cazul n care proteinele
au un pI mai mic dect pH-ul tamponului, caz n care acestea nu vor migra
sau vor migra n sens opus ("retro-forez) napoi n camera de tampon
superioar.

Ecuaia care guverneaz mobilitatea unei proteine n geluri native este

urmtoarea:

logRf=log(Yo)-KRT

Unde:
Rf = mobilitate relativ, normalizat fa de frontul de colorant
sau fa de un alt standard.
Yo = mobilitatea relativ a proteinei n absena oricrei interacii
cu gelul.
KR = "coeficient de retardare," n msura n care matricea de
gel afecteaz mobilitatea.
T =% concentraia de monomeri din matricea de gel.
 Configuraiile geometrice probabile ale diferitelor tipuri structurale de geluri de
poliacrilamid

Tipuri structurale de geluri de poliacrilamid. A. Poliacrilamid nereticular

cu C(%)=0%. Este un gel unidimensional iar consisten a polimerului este
lichid-vscoas. B. Un gel de poliacrilamid cu C(%) de valoare medie. C. Un
gel de poliacrilamid cu C(%) de valoare mare. D. Un gel de poliacrilamid
reticulat pur, zerodimensional (C(%)=T(%)).
La valori ale C% situate n domeniul 5-50%, fibrele de poliacrilamid sunt
zerodimensionale, supranfurate, diametrul porilor crete, iar practic moleculele
nu mai sunt frnate n migrarea lor n cmp electric. Figura de mai jos prezint
dependena factorului de frnare n funcie de concentraia total de polimeri, T%.

Dependena mrimii porilor de gradul de reticulare, C(%).

Creterea ulterioar a C% cauzeaz formarea de legturi mai scurte i

mai groase de lanuri de polimer.
n ceea ce privete dependena mrimii porilor de parametrul T(%), se poate spune
c la o valoare constant a gradului de reticulare (C%=2-5%), mrimea porilor
scade pe msur ce valoarea parametrului T% crete dup rela ia :

Astfel, mrimea efectiv a porilor a unui gel de

poliacrilamid este o funcie invers a concentraiei totale
de monomeri (T%). Pentru orice concentraie total de
monomer dat, dimensiunea porilor efectiv, variaz de
asemenea, n funcie de proporia de agent de reticulare
din amestecul de reacie (C%). Odat cu creterea T(%),
la o concentraie sczut de agent de reticulare, numrul
de catene liniare crete, iar mrimea porilor scade. Cnd
T% este crescut la o concentraia fix, dar sczut de
agent de reticulare, numrul de catene crete iar
dimensiunea porilor se reduce. Pe de alt parte,
dimensiunea porilor este o funcie bifazic dependent de
C (%). n condiiile n care se variaz C (%), la un T%
constant, scade dimensiunea porilor, nivelul minim fiind
atins la aproximativ C=5%
Pe lng aplicaiile evidente de analiz a puritii unor probe proteice, electroforeza este
utilizatladeterminrifizico-chimice.Dacproteinasupusanalizeintr-oseriedegeluricu
concentraii(T%)isemsoarmobilitateaeielectroforeticrelativ, Rm(Rm, Rfestedefinit
caraportuldintredistanamigratdeproteinadat idistanamigratdecolorantultrasor,
deobiceialbastruldebromfenol)nfiecaregelsepoateconstruiodiagramliniar,logRm
versus T% (diagrama Ferguson). Aceast reprezentare poate da o important informaie:
panta acestei drepte este o msur a mrimii moleculare i este denumit coeficient de
retardare (retardation coefficient, KR). Prelungirea acestei drepte care intersecteaz axa 0y
(Y=Rm cnd T=0) este o msur a mobilitii electroforetice n condiii libere (cnd gelul nu
esteprezent)iaadaresteomsurasarciniielectricenete.
 Reprezentarea grafic a
logaritmului mobilitii
electroforetice a BSA
versus concentraia
(densitatea) gelului (T%) la
un grad de reticulare (C%)
constant de 2%.

n cazul electroforezei bidimensionale, prima dimensiune se realizeaz n cele

maibunecondiiingeluricilindrice.
Dac gelurile plac pot fi n egal msur omogene sau n gradient, gelurile
cilindricesuntdeobiceiomogene.
 STRATEGIADESEPARAREA
PROTEINELORPEGELURIDIN
POLIACRILAMID

nfunciedeproprietileproteinei(proteinelor)luatenstudiu
infunciedescopulurmrit,trebuieavutnvedere:
- compoziia chimic, concentraia i structura gelului de
poliacrilamid(gelomogen,gelngradient,etc.);
-formagelului(gelulpoateficilindricsauplat);
- condiiile de separare (denaturante, nedenaturante,
disociative,nedisociative);
-sistemultampon(continuusaudiscontinuu)
-foraionicipH-ulsistemuluitampon.
 Compoziiachimic,concentraiaistructurageluluidepoliacrilamid

Din punct de vedere al compoziiei chimice, acrilamida poate fi polimerizat cu

bisacrilamida (cel mai adesea folosit), bisacrilcistamina (BAC), dialiltartatdiamina
(DATD), dihidroxietilenbisacrilamida (DHEBA), etc. Ultimii trei agen i de reticulare se
utilizeaz la prepararea gelurilor solubilizabile, n tehnici la scal micropreparativ,
deoarece aceti ageni permit solubilizarea gelului n condi iile cele mai avantajoase
pentruconservareaintegritiistructuraleifuncionaleaproteinelorluatenanaliz.
Dac gelul este format din dou zone, gelul de concentrare (T%=4%) este plasat
deasupra gelului restrictiv de rezolvare, ultimul avnd o concentra ie de monomeri
cuprins ntre 5 i 30%. Gelul de concentrare (de stivuire) con ine tampon Tris-HCl
0,125 M, pH=6,8, iar gelul de separare con ine tampon Tris-HCl 0,375 M, pH=8,8.
Discontinuitatea de pH dintre cele dou geluri suprapuse este desemnat pentru a
regla mobilitatea efectiv ale ionilor de glicinat din compartimentul catodic.
Concentraiile de tampon Tris-HCl din cele dou geluri deriv din considera ii
electrochimice. Porozitatea gelului de concentrare este att de mare pentru a nu
mpiedic micarea proteinelor i funcioneaz n general ca un mediu suport cu
proprieti anticonvective n timpul formrii zonei nguste de start. Separarea
proteinelorserealizeazmaijos,ngelulderezolvare.Porozitateaacestuidinurmgel
este determinat empiric fiind potrivit mobilitii proteinelor din prob. Nu exist o
regulclarpentruapredicionaconcentraiacorectaconcentra ieidegelpentruun
amestec de proteine necunoscute neanalizate electroforetic. Alegerea este fcut
astfelcaproteineledeinteressseseparengel.nmodobi nuitsencepecuungel
cu7,5%Tpentruelectroforezainiialaprobeicumobilit inecunoscute.
Concentraia geluluisereferlaconcentraiatotalamonomerilor(parametrulT
%) i agradului de reticulare (parametrul C%) Pentru proteine binecaracterizate,
alegerea concentraiei gelului nu reprezint o problem. n general, pentru
proteine cu mas molecular cuprins ntre 20.000 i 150.000 daltoni, se
recomandgeluricuT%=5-12%.ncazulproteinelorcumasmolecularcuprins
ntre 10.000 i 80.000 daltoni se recomand geluri cu T%<10-12% iar n cazul
proteinelor mas molecular mai mic de 15.000 daltoni se utilizeaz geluri cu T
%>15%.
Structura gelurilor este strns legat de parametrii T(%) i C(%) Astfel, un gel
omogen se caracterizeaz printr-o singur valoare a concentraiei totale de
monomeri,T(%),ntimpceungelcugradientestecaracterizatprintr-ungradient
de concentraie, deobicei cuprins ntre 5 i 20%. Gelurile n gradient sunt mai
avantajoase deoarece ofer mai multe date despre proteinele supuse
electroforezei. Gradientul poate fi liniar sau exponen ial, putnd astfel vorbi
despregradientdepori.Gelurileomogeneauporideaceeaimrime.
Pentru obinerea unei rezoluii optime de separare a dou proteine, se folosete
un gel omogen de concentraie potrivit. Concentraia gelului este n func ie de
mrimea i sarcina electric a proteinei luate n studiu, putnd s fie stabilit
(determinat) prin msurarea mobilitii fiecrei proteine ntr-o serie de geluride
concentraii(T%)diferite.
Se disting patru categorii de probleme (situaii) de separare:
1.Cele dou proteine au densiti de sarcin electric identice, deci mobiliti identice
ntr-un mediu nerestrictiv (panelul A).

2. Proteina cu mobilitate mai mare (densitate de sarcin electric mai mare) este mai mic
n dimensiuni. n acest caz separarea se realizeaz pe baza mobilit ii i a masei
moleculare. Se consider c cele dou proteine sunt sinergice iar prin cre terea
concentraiei de gel crete i rezoluia de separare (panelul B).
3. Una dintre proteine are dimensiuni mai mari i mobilitate electroforetic mai mare. n
acest caz separarea se realizeaz n funcie de dimensiune i sarcin electric, cele dou
proteine fiind antagoniste. Cazul este caracteristic sistemelor nedisociative (panelul C).
4. Dou proteine au aceleai dimensiuni dar au mobilit i electroforetice diferite (este cazul
izoenzimelor, hemoglobinelor, etc.). n acest caz concentra ia monomerilor nu are efect
asupra separrii relative a celor dou proteine. Situa ia corespunde separrilor prin
focusare izoelectric sau prin izotacoforez (panelul D).
Soluiile de monomeri se prepar uzual ca soluii stoc, concentrate. Pentru gelurile utilizate n
separarea de proteine este preferat o soluie stoc de monomeri cu T%=30% i C%=2,7% care se
prepar prin dizolvarea a 29,2g de acrilamid i 0,8g de bisacrilamid n 7 0 ml de ap complet
deionizat (volumul final fiind de 100 ml iar densitatea specific de 1,025). Soluia de monomeri
trebuie filtrat i stocat la rece, preferabil ntr-un vas de sticl. Pentru gelurile utilizate n
separarea de acizi nucleici se folose te un amestec alctuit din acrilamid:bisacrilamid cu T
%=30% i C%=3,3% preparat din 29g de acrilamid i 1g de bisacrilamid.
Concentraiile de iniiator sunt determinate empiric prin urmrirea polimerizrii n timp de 15-
20 minute dup adugare. n aceste condiii, gelificarea se realizeaz complet n 90 de minute.
Dac se utilizeaz geluri de concentrare, este necesar ca acestea s aib structuri poroase mari.
Pentru o polimerizare rapid (n circa 8-10 minute) se adaug persulfat de amoniu, la o
concentraie final de 0,05% respectiv TEMED, 0,1%.
Soluiile stoc de monomer i de tampon se combin pn la concentra ia dorit i apoi se
deaereaz sub un vid modest timp de aproximativ 15 minute. Ini iatorul i catalizatorul sunt apoi
adugate iar amestecul se toarn n aparatul montat. Dac se utilizeaz gel de concentrare, se
prepar i se toarn mai nti gelul se rezolvare (separare). El este apoi acoperit cu o solu ie de
izobutanol saturat n ap pentru a exclude aerul din vecintatea superioar a gelului i pentru a
forma o legtur puternic ntre cele dou geluri. Dup aproximativ o or, stratul de alcool este
ndeprtat i gelul format n partea superioar se spal cu ap pn la dispari ia mirosului
caracteristic de butanol, dup care se toarn amestecul de gel de concentrare peste gelul de
separare i se introduce un pieptene formator de godeuri pentru a forma spa ii n care se aplic
proba. Dup finalizarea polimerizrii i ndeprtarea pieptenului, gelul este gata de utilizare.
Gelurile de poliacrilamid sunt inerent instabile n afara domeniului de
pH cuprins ntre 4 i 6. Dup un stocaj de aproape 4 luni la o temperatur
de 4oC, n tampoanele uzual utilizate n electroforez, uneori are loc o
scdere notabil a profilului benzilor separate electroforetic. Astfel,
pentru a obine o rezoluie maxim, este necesar s se utilizeze numai
geluri preparate n soluii ct mai proaspte. Alterarea structurii
poliacrilamidei este un proces lent de hidroliz a gruprilor carbox-
amididice (-CO-NH2) ale monomerilor de acrilamid i care se manifest
n tampoane bazice. Hidroliza conduce la formarea unor grupri carboxil
(-COO-), ionizabile. Gelurile vechi au o structur a porilor este schimbat
ele lund caracteristici de schimbtori de ioni datorit hidrolizei.
mbtrnirea gelurilor de poliacrilamid are o semnifica ie comercial
deoarece limiteaz perioada de utilizare a gelurilor preturnate.
 Forma gelului
Primele electroforeze care au folosit poliacrilamida drept mediu suport s-au efectuat pe
geluriplate,orizontale iapoipegeluricilindrice(undeamesteculdepolimerizaresetoarn
n tuburi de sticl sau plexiglace). n prezent ns, n majoritatea cazurilor se apeleaz la
separareapeverticalngeluriplate(geluriplac),cuogrosimeageluluicuprinsntre50
mi3mm.

Gelurile plac orizontal (sau vertical) sunt simplu de preparat , ntr-un timp scurt. Pe
un astfel de gel se aplic mai multe probe, inclusiv proteine standard cu mas
molecular cunoscut, separndu-se n condiii identice. Numrul de probe aplicate este
n funcie de necesiti iar analiza calitativ i estimrile cantitative se efectueaz cu mai
mult u urin i precizie n cazul gelurilor cilindrice. Se elimin astfel artefactele optice,
ceea ce face posibil fotografierea corect. n plus, n cazul gelurilor plac, cldura
produs prin efect Joule este mai repede disipat comparativ cu gelurile cilindrice iar
uscarea gelurilor este relativ simpl.
Gelurile cilindrice sunt
de nenlocuit la separarea proteinelor marcate cu radioizotopi cnd se urmre te
determinarea cantitativ a radioactivitii.
Ele sunt de preferat atunci cnd trebuie determinat activitatea enzimatic a
fraciunilor separate deoarece cantitatea aplicat este mult mai mare (fr a afecta
calitatea separrii).
Gelurile cilindrice sunt preferate la testarea pH-ului optim de lucru i a concentraiei
optime a gelului de poliacrilamid
 CONDIII DE SEPARARE
Condiiile de separare trebuie s asigure o solubilizare complet a probelor
proteice, alegerea acestora realizndu-se sistematic n funcie de propriet ile
hidrofile/hidrofobealeproteinelor.
Pentru testareasolubilitii numai prin disocierea legturilorhidrofile, probaeste
incubatnsoluiitamponalcaline,neutre iacide,nprezena/absena clorurii de
potasiu (0,1-0,5 M), la o temperatur de 4oC, pentru a nu afecta activitatea
biologic.

Dac proba nu se solubilizeaz, se repet testarea n

prezen de EDTA (etilendiaminotetraacetat), 0,1 M. EDTA
complexeaz ionii metalici divaleni i astfel se desfac
legturile n care acetia sunt implicai.

Urea este deseori utilizat ca agent de disociere n electroforeza pe gel. Urea, care disrupe
legturile de hidrogen i legturile hidrofobe poate cauza agregri nedorite ori formarea unor
structuri secundare care afecteaz mobilitile proteinelor. Ea este deseori utilizat n
denaturarea acizilor nucleici. Urea este un component esenial al gelurilor la care este
necesar meninerea configuraiilor unicatenare a ADN sau ARN, pentru a se determina cu
acuratee masele moleculare. Disocierea legturilor de hidrogen necesit uree n concentraii
mari (7-8 M).

Poliolii (de exempul glicerina, trixidroxipropan, propantriolul) este folosit frecvent pentru
solubilizarea proteinelor n condiiile meninerii activitii biologice.
 Dac proba continu s rmn insolubil se recurge la detergeni, compui
care modific hidrofobicitatea relativ a proteinelor i care astfel mbuntesc
separarea electroforetic.
ntr-o mic msur acelai efect se obine prin folosirea tampoanelor relativ
hidrofobe pe baz de N-etilmorfolin sau hidroxietilmorfolin

O N CH2 CH3 O N CH2 CH2 OH

A B

Structura chimic a N-etilmorfolinei (A) i a hidroxietilmorfolinei (B)

 Electroforeza n condiii denaturante
Cea mai mare parte a studiilor de electroforez n gel de poliacrilamid folosete condiii
denaturante, disociative. n aceste condiii, proteinele oligomere disociaz n lanuri
polipeptidice, componente. Astfel, proteinele i pierd activitatea biologic. Detergenii se
utilizeaz n electroforez cnd este necesar disruperea interac iilor protein-lipid i
protein-protein. n acest scop au fost utilizai o serie de detergeni. Cel mai cunoscut
agent de disociere este dodecilul sulfat de sodiu (lauril sulfatul de sodiu, SDS).
SDS este un detergent ionic care are formula CH3-(CH2)10-CH2-SO3-Na+.

Structura chimic a
dodecilsulfatului de sodiu, SDS.
Se observ braul nepolar i
regiunea polar care posed o
sarcin negativ
 Cele mai multe proteine sunt uor solubile n SDS, fcnd electroforeza n prezen
de SDS (SDS-PAGE) o metod general aplicabil.
Puritatea (calitatea) detergentului este o condiie important n SDS-PAGE.
Efectele impuritilor prezente n preparatele de SDS sunt impredictibile.
Dintre contaminani, cele mai nedorite efecte le au probabil alchil sulfaii,
alii dect dodecil sulfatul (C12); n special decil sulfatul (C10), tetradecil
sulfatul (C14) i hexadecil sulfatul (C16) Acetia se leag la proteine cu
afiniti diferite i n consecin afecteaz mobilitile.
Contaminanii lipofilici prezeni n preparatele de SDS, printre care
dodecanolul, pot fi inclui n complexele SDS-protein i n micelele de
SDS conducnd la scderea rezoluiei. Numai SDS purificat (care se
realizeaz prin recristalizare n n heptan) trebuie utilizat pentru
electroforez, dar chiar cu SDS pur, diferite glicoproteine, lipoproteine i
nucleoproteine au tendina de a se lega la detergent neregulat, rezultanta
fiind o migrare anormal a complexelor SDS-polipeptide n ceea ce
privete masele lor moleculare. n plus, prezena unor sruri anorganice n
preparatul de SDS conduce la modificarea proprietilor tensioactive ale
acestuia. Dintre proprietile fizice ale SDS se pot aminti:
SDS are o solubilitate n ap de 3% (mas/volum);
SDS precipit la temperaturi cuprinse ntre 0-10oC.
Dodecil sulfatul de litiu (lithium dodecyl sulfate, LDS) a fost uneori
substituit SDS n analizele efectuate pe geluri de poliacrilamid dup cum
bromura de cetiltrimetilamoniu (cetyltrimethylammonium bromide, CTAB) a
fost de asemenea utilizat n electroforeza proteinelor.
LDS este mai solubil dect SDS i nu precipit la temperaturi sczute (la
4oC se leag afin la poliacrilamid, dei la 25oC nu prezint o astfel de
proprietate), ceea ce permite migrarea gelurilor la temperaturi sczute. S-
a constatat c dac ntr-un sistem tampon continuu, SDS este nlocuit cu
LDS, separarea moleculelor cu mas molecular mic este accelerat
datorit deficitului de LDS n regiunea frontal a gelului. Dac gelul este
saturat n LDS, rezoluia separrii la 4oC pe acest gel este mai bun dect
cea obinut dup electroforez un gel de poliacrilamid n prezen de
SDS efectuat la 25oC.
CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) este un denaturant mai slab dect
SDS, prezervnd anumite activiti biologice care sunt distruse de ctre SDS.
MAJORITATEA PROTEINELOR LEAG SDS NTR-UN RAPORT CONSTANT DE 1,4 G
SDS/GRAM PROTEIN. N ACESTE CONDIII, SARCINILE INTRINSECI (PROPRII) ALE
POLIPEPTIDELOR SUNT NESEMNIFICATIVE COMPARATIV CU SARCINILE ELECTRICE
NEGATIVE REZULTATE DUP LEGAREA SDS. DENSITILE DE SARCIN ELECTRIC
SUPERFICIALALECOMPLEXELORSDS-POLIPEPTIDESUNTNPRINCIPIUIDENTICE,
CEEA CE PERMITE SEPARAREA (NTR-UN GEL CU POROZITATE CONTROLAT)
STRICT N FUNCIE DE DIMENSIUNILE POLIPEPTIDELOR. n acest fel, pe lng
compoziia(coninutul)polipeptidelordinprob,sedetermin imaselemoleculareale
polipeptidelor, dac sunt separate n acelai timp cu un set de proteine cu mas
molecular cunoscut, prin raportare la acestea. Tehnica de lucru este simpl iar
cantitateadeprobestedeordinulamicrosauananogramelor.
Cea mai mare parte dintre proteine se solubilizeaz n SDS, indiferent de
surs,nsexist i excepii:astfel,
glicoproteinele i lipoproteinele nu pot fi saturate n SDS, deoarece, n primul caz,
parteaneproteic a unitilorhidrofileoligozaharidice previnlegareamicelelor deSDS
parteaproteicnumaiinteracionndcuacesta.
 Proteinele puternic bazice (de exemplu, histonele)interacioneazprin
legareelectrostaticamicelelordeSDSprinintermediulgruprilorsulfat.

n cazul glicoproteinelor, impedimentul poate fi relativ ndeprtat prin

utilizareatampoanelorTris-boratncondiiialcaline,astfelcrescndu-sesarcina
net negativ a glicoproteinelor ceea ce conduce la viteze de migrare bine
corelatecumasamolecular.

Migrarea histonelor poate fi mbuntit prin utilizarea gelurilor n

gradient de pori care permit catenelor polipeptidice s acceadla limitalorde
pori.

Pe de alt parte, proteinele pure, au tendina ca la temperaturi ridicate s formeze

agregate i s precipite. Este cazul hemaglutininei bacteriene care disociaz
complet dup 30 de minute de fierbere la 100oC n prezen de SDS. Competiia
agregare/dezagregare se poate rezolva prin scderea concentraiei proteinei din
prob.
 S-a studiat interaciunea diferiilor detergeni anionici cu albumina seric bovin
(BSA). n stare nativ, BSA conine 10-11 situsuri cu constante mari de legare a ionilor
de detergent. Legarea ionilor de detergent de proteina nativ nedenaturat se realizeaz
secvenial (unul dup altul), n timp ce legarea detergentului la proteina denaturat este
puternic cooperativ. Existena complexelor discrete protein-detergent sugereaz c
asocierea ionilor de detergent este, de asemenea important, atunci cnd afinitatea
detergentului pentru protein este mai mic. Un raport de legare mai mare dect cel
normal pentru un singur situs de legare se explic numai prin formarea de micele de
detergent n acel loc, adic ionii de detergent se leag att la protein ct i la ionii de
detergent deja legai. acest fenomen este numit amplificarea legrii, iar acest tip de
legare poart numele legare micelar i s-a demonstrat c este reversibil. La atingerea
concentraiei micelare critice acest mecanism nceteaz.
Saturarea cu SDS a unei proteine depinde de asemenea n punctul izoelectric
al acesteia, indirect influennd comportamentul electroforetic. De asemenea, saturarea
cu SDS este posibil la temperatura camerei i se aplic la electroforeza bidimensional,
gelurilor folosite la separarea proteinelor prin focusare izoelectric fiind pregtite pentru
a doua dimensiune, electroforeza pe gel de poliacrilamid n prezen de SDS (SDS-
PAGE). n acest caz, incubarea la fierbere este nlocuit printr-o incubare la temperatura
camerei ntr-un amestec format din uree, 9M i Triton X-100, 20%.
Un alt agent de disociere foarte aplicat n disocierea probelor pregtite pentru
electroforezesteureea.
Denaturarea produs de uree este dependent de temperatur, pH i trie
ionic. Pentru o denaturare complet, se utilizeaz uree cu o concentraie mai
mare sau egal cu 8M, alturi de agenii reductori ai punilor disulfurice. Totui
existproteinecarenusepotdenatura.
Avantajul utilizrii ureei drept agent de denaturare const n faptul c n
unele separri electroforetice ea nu afecteaz sarcina electric intrinsec a
proteinei permind astfel o separare att n funcie de masa molecular ct i n
funcie de sarcina electric. Efectul denaturant al ureei datorat ruperii legturilor
de hidrogen inter i intramoleculare poate fi reversat prin ndeprtarea ei prin
dializ.
Dezavantajeleutilizriisaleconstaunfaptulcnusepoatedeterminacu
precizie masa molecular, nu este la fel de eficient ca SDS n disocierea
proteinelor.Deexemplu,ureeadisociaznproporiede50%unlizatcelularbrut
(la electroforez, 50% din lizat este agregat nefiind apt s penetreteze gelul) n
timpceSDSdisociazacelaipreparatnproporiede90%.
Uneleproteine,pentruafidisociatecompletnecesitprezen asimultan
aSDSiaureei.
Clorura de guanidin (guanidina hidrocloric) este, de asemenea, un
agent de disociere utilizat n disocierea probelor pregtite pentru
electroforez. n concentraii de 4-6M, ea realizeaz ruperea legturilor
necovalente provocnd desfacerea structurii cuaternare i distrugerea
structurilor secundare i teriare datorit capacitii superioare de a
participa la stabilirea legturilor de hidrogen. Majoritatea proteinelor n
guanidin hidrocloric au o conformaie total dezordonat i din aceast
cauz este rareori folosit n separrile electroforetice.
Disocierea complet a celor mai multe proteine se realizeaz prin
incubarea probei diluate n tamponul de migrare la 95-100oC (pe baie de
ap) timp de 2-5 minute n prezena att a SDS n exces ct i a -
mercaptoetanolului, ditioeritrolului sau ditiotreitolului (ageni utilizai la
reducerea punilor disulfurice)

Mecanismul reducerii
punilor disulfurice de ctre
tiocompui. Coloana din
stnga: reducerea cu
monotioli (de tipul -
mercaptoetanolului).
Coloana din dreapta:
reducerea cu ditioli ciclizabili
(cum ar fi ditiotreitolul, DTT).
Sferele ntunecate reprezint
suprafaa proteinei.
Practic, testarea celui mai bun amestec de disociere se face prin
pstrarea constant a concentraiei proteice, a concentraiei de
agent reductor (de obicei -mercaptoetanol), i a concentraiei
de detergent cu varierea timpului de incubare. Dac rezultatul
este nesatisfctor, se trece la varierea unui alt parametru dintre
cei artai mai sus.

n procedura Laemmli (1970) probele pregtite pentru electroforez pe gel de

poliacrilamid n prezen de SDS (SDS-PAGE) se prepar n tampon Tris-HCl, 0,0625
M, pH 6.8, SDS, 2%, -mercaptoetanol, 5%, glicerol, 10%, i aproximativ 0,025%
(greutate/volum) colorant de monitorizare a migrrii, albastru de bromfenol.
Este de preferat a se prepara un stoc de tampon pentru prob care s conin toate
componentele cu excepia -mercaptoetanolului, acesta adugndu-se chiar nainte de
utilizare. Glicerolul ofer probei o densitate care i permite depunerea sa n godeul
gelului de separare aflat sub tamponul de migrare.
Colorantul de migrare permite att aplicarea probei ct i monitorizarea migrrii
electroforetice (el migreaz odat cu ionul frontal, adic odat cu frontul).

Cantitatea de detergent prezent n tamponul probei este suficient pentru a

asigura saturarea amestecului de proteine. n cazuri rare, cnd proba are o
trie ionic foarte crescut (> 0,2 M), ea poate fi dizolvat n tamponul stoc al
probei (tamponul de ncrcare) ntr-un raport de 1:1 (v/v), fiind totui, mai
indicat o diluie ntr-un raport de cel puin 1:4 (v/v).
Cantitatea de protein din proba care se ncarc pe un gel depinde de
metoda de detectare utilizat. Proteinele de interes care se ncarc pe gel
trebuie s fie ntr-o cantitate suficient pentru a fi ulterior localizate.
Detectarea n geluri impune o cantitate de protein/band de circa 1 g
pentru a avea o vizibilitate uoar a benzilor proteice colorate cu coloranii
anionici, de tipul Coomassie Brilliant Blue R-250 sau de 0.1 g de
proteine/band n cazul colorrii cu argint.
 Electroforeza n condiii nedenaturante

n acest tip de electroforez se pstreaz conformaia nativ a proteinelor,

interaciile dintre subuniti i activitatea biologic, separarea realizndu-se pe
baza dimensiunii i sarcinii nete a proteinelor. n acest caz, se utilizeaz
detergeni neionici, n general nedenaturani, folosii la solubilizarea proteinelor
de membran sau a altor proteine cnd se urmrete pstrarea activitii
biologice.
Cel mai cunoscut detergent neionic utilizat n electroforez este Triton X-100,
care din punct de vedere structural este o polioxietilen, cu structura chimic
prezentat alturat (unde n=10). n scopul desluirii mecanismului molecular de
legare, s-a studiat interacia detergent-protein. Astfel, Triton X-100
interacioneaz hidrofob cu unele proteine precum albumina seric bovin (BSA),
albumina seric uman, -lactoglobulina, n timp ce alte proteine nu leag acest
detergent (mioglobina, imunoglobulina G uman, etc.). S-a constatat c BSA are
4 situsuri de legare a Triton X-100, nefiind ns o legare cooperativ (prezent la
legarea cu SDS), probabil, datorit concentraiei micelare critice relativ mici.
Avantajul utilizrii Triton X-100 deriv din capacitatea de solubilizare a proteinelor
de membran, iar n general, sunt preferai detergeni cu o concentraie micelar
critic mai mic de 1 mM.
 SISTEMETAMPON
Dei cunotinele cu privire la proprietile geluri sunt
relativ modeste, se cunoate destul de mult despre
comportamentul ionilor din tampoane n condiiile
aplicriiunuicmpelectric.Astfel,aufostconceputeo
seriedesistemetamponinteresantesiutile,astfelnct
exist o mare flexibilitate n alegerea sistemului de
tampon
Tamponul de electrolit, evident, are un efect profund asupra
migrrii electroforetice. Tipul de tampon utilizat conduce la stabilirea
condiiilor intensitii cmpului electric aplicat i afecteaz separarea i
de aici rezoluia. Proteinele difer foarte mult n sensibilitatea lor la
trii ionice, specii ionice, pH, i necesit ile lor n cofactori (dac sunt
enzime). Astfel, sistemul de tampon utilizat este n funcie de proba
care urmeaz a fi separat electroforetic.
Tamponul ales pentru separarea proteinelor prin electroforez
nativ (nedenaturant) de multe ori depinde mai mult de tipul
proteinelor luate n studiu dect de cerinele electroforetice.
Sistemele electroforetice n care ionii unei singure solu ii tampon
sunt prezeni n prob, gel i compartimentul electrozilor
(concentraia lor putnd fi diferit) la un pH constant se numesc
SISTEME TAMPON CONTINUE. Un sistem continuu de tampon se
poate utiliza pentru separarea acizilor nucleici i a proteinelor la
concentraii de aproximativ 1 mg/ml sau mai mare. n acest caz, n tancul
electroforetic se folosete acelai tampon, la un pH constant, ca i la
prepararea gelului. De asemenea, proba este ncrcat direct pe gelul unde
se va produce separarea electroforetic. Dup cum moleculele vor migra
prin porii de gel, acestea sunt fracionate n funcie de mobilitatea lor.
Limea benzilor este determinat n principal de volumul probei aplicate,
acest parametru limitnd rezoluia n sistemele continue de electroforez.
Probe diluate necesit volume mari pentru a furniza cantiti detectabile de
material, obinndu-se benzi relativ largi. Utilizarea gelurilor de
dimensiunea porilor constant, limiteaz sistemele continue la probe cu o
concentraie mare de proteine care conduc astfel la cele mai bune rezultate.
De obicei gelul are porii suficient de mici pentru a permite separarea n
funcie de dimensiunile macromoleculelor proteice.
Unele proteine plasmatice i celulare se pot separa mai bine n geluri de
poliacrilamid cu gradient de concentraie n sistem continuu ,viteza
de deplasare a proteinelor descrescnd n timp i ajungnd zero, odat cu
atingerea limitei lor de por. n acest fel, crete rezoluia de separare,
electroforeza cu limit de pori fiind foarte valoroas pentru separri de
proteine pe baza masei lor moleculare.
Se poate spune c ntr-un gel omogen separarea
macromoleculelor se realizeaz n func ie de sarcin electric i mas
molecular, n timp ce ntr-un gel cu gradient de concentra ie, separarea
macromoleculelor se realizeaz n funcie de mas molecular.
De exemplu, ntr-un gel omogen cu T%=7,5 1-antitripsina are o
mobilitate mai mic dect albumina, migrnd dup aceasta, ntr-un gel n
gradient de concentraie, 1-antitripsina (MM=54.000 Da) va migra n faa
albuminei (MM=68.000Da).
Folosind geluri de poliacrilamid cu gradient liniar de concentra ie
(gradient de pori) %T=3-30, %C=3,8, n sistem de tampon continuu, se
constat c distana de migrare (D) este proporional cu logaritmul
timpului de migrare dup relaia:
unde a reprezint panta dreptei iar b este intersecia cu abcisa

Dreapta de regresie utilizat la calculul

masei moleculare a unei macromolecule
dup electroforez pe geluri cu gradient
de concentraie a porilor.

Exist o relaie liniar ntre logaritmul masei moleculare i

logaritmul pantei dreptei de regresie, dat de relaia:

Aceast formul este utilizat la calculul masei

moleculareauneiproteinestudiate.
mbuntirea puterii de rezoluie s-a realizat odat cu introducerea sistemelor de tampon
discontinue. Altfel spus, aceste sisteme sunt concepute pentru a accentua zonele probei pentru
separri de nalt rezoluie. Sistemele de tampon discontinue (sau multifazice) utilizeaz ioni
de tamponare diferii n gel i n soluiile de electrozi. N ELECTROFOREZA ZONAL
MULTIFAZIC, DISCONTINU, probele sunt aplicate pe un gel cu porozitate mare,
gelul de concentrare (stivuire), care servete ca i un mediu anticonvectiv. Toate speciile
ionice, inclusiv moleculele din prob, formeazfronturinmicare.
Ionii din tamponul de gel, formeaz un front de ioni care se mic naintea moleculelor
de prob.
Ionii din tamponul de electrozi formeaz un front care se mi c n spatele probei.
Ionii din prob (macromoleculele cu sarcin electric) dintre fronturile de tampon se
concentreaz (se stivuiesc) n zone extrem de ngust aranjate n ordinea descreterii mobilitii
lor. Moleculele din prob se concentreaz (se stivuiesc) rapid, n regiuni foarte nguste, nu mai
mari de cteva sute de microni, cu coninut proteic ridicat, de circa 100 mg/ml protein.
Probele (macromoleculele) stivuite se vor deplasa prin pori mari ai gelului de stivuire
ca zone individuale foarte nguste, indiferent de volumul de prob iniial, i intr n gelul
restrictiv de rezolvare (sau de separare), gel cu o dimensiune mic a porilor, n serii foarte
nguste aflate la distane mici, unele de celelalte. Odat ajunse n gelul de rezolvare, cernerea
devine predominant i macromoleculele de prob "se destivuiesc" i se separ, n funcie de
mrimea i sarcina lor electric.
 Sisteme de tampon discontinue
Ornstein (1964) i Davis (1964) au dezvoltat pentru prima dat sisteme electroforetice pe gel de
poliacrilamid (PAGE) de nalt rezoluie pentru separarea proteinelor native. Sistemul propus de
ei a fost att de popular, nct este nc utilizat pe scar larg. Acesta a fost conceput pentru
analiza de proteine serice, dar funcioneaz bine pentru o gam larg de tipuri de proteine.
Sistemul de tampon Ornstein-Davis este prima tehnic de ncercat atunci cnd se lucreaz cu o
prob nou de proteine native. Ornstein a recunoscut c o nalt rezoluie este atins atunci cnd
zona de start a proteinelor din prob este ct mai ngust posibil. Astfel, el a conceput o metod
electroforetic care comprim zonele de protein cu mult dincolo de limitele atinse prin mijloace
mecanice. Formularea lui se bazeaz pe ecuaiile care descriu fluxul de curent n soluii ionice i
proprietile tampoanelor.
Ideea lui Ornstein a fost cea de includere a proteinele din prob ntr-un tip de sandwich intim
mrginit de dou fronturi de ioni de electrolii care se deplaseaz n cmp electric. Sub influena
cmpului electric, proteinele din prob devin comprimate ntre frontul de ioni conductor i cel
de extremitate final i segreg n zone nvecinate, n ordinea de mobiliti lor relative. Acest
proces are loc n regiune gelului cu pori mari, de concentrare. Proteinele din prob ajung la gelul
de rezolvare ntr-o band de start foarte subire. Odat ce proteine trec n gelul de rezolvare,
predomin efectul de separare prin cernere molecular. Sistemul Ornstein-Davis, folose te ioni
de clorur drept ioni conductori, dup cum ionii glicinat sunt ioni finali, n timp ce ionul
Tris este un ion comun. Dintre componentele posibile disponibile n momentul n care sistemul
electroforetic a fost dezvoltat, proprietile acestor tampoane au fost cele mai potrivite pentru
cerinele procesului de electroforez. n timp, prin analize electrochimice s-au descris o serie de
sisteme tampon care se preteaz separrii electroforetice.
 Electroforeza pe geluri de poliacrilamid n condiii
discontinue i nedenaturante dup Ornstein-Davis.
Este instructiv de a considera evenimentele ionice care au loc n timpul electroforez
discontinue, mai ales avnd n vedere popularitatea acestuia. Alte sisteme discontinue
funcioneaz prin mecanisme similare.
Sistemul Ornstein-Davis, folosete la separarea proteinelor, dou tampoane diferite care
conin anioni diferii i un cation comun. Ionul clorur, prezent n gel de cnd acesta este
turnat, devine ion frontal iar ionii glicinat care provin din tamponul de migrare (tamponul
de electrozi) devine ion terminal. Ionul Tris, comun, susine electroneutralitatea. Cele mai
multe proteine serice transport sarcini negative nete n acest sistem i migreaz spre
anod.
Sistemul Ornstein-Davis const din patru pri interdependente: (1) un gel de stivuire
(concentrare), (2) un gel de separare, (3) un tampon de electrod (de migrare), i (4)
prob. Etapele succesive dintr-o separare electroforetic n sistemul de tampon descris
de Ornstein-Davis sunt prezentate n figuraurmtoare.
Gelul este format din dou seciuni (panel A), o poriune cu porozitate mare (gelul de
concentrare) cu T%=4 este turnat peste gelul restricitiv de rezolvare (T%=5-30). Gelul
de concentrare conine tampon Tris-Cl, 0,125 M, pH=6,8, n timp ce gelul de separare
conine tampon Tris-Cl, 0,375 M, pH=8,8. Discontinuitatea de pH dintre cele dou zone
de gel este desemnat pentru a regla mobilitatea efectiv a ionului glicinat.
ei.
Etapele succesive dintr-o separare electroforetic n sistemul de tampon descris de Ornstein-Davis

EtapeleseparriiunuiamestecdeproteinensistemdiscontinuutamponOrnstein-Davis.(A)
gelul este format din dou seciuni. Un gel de concentrare cu pori mari aflat n parte
superioaresteturnatpesteungelrestrictivderezolvare(separare).Fiecaresec iunedegel
coninetamponTris-HCl,darconcentraiileipH-urilecelordoutampoanecorespunztoare
celor dou seciuni sunt diferite. Gelul de concentraie este indicat printr-o nuan de gri
deschis n timp ce gelul de separare este de culoare gri-nchis. Proba proteic dizolvat n
tamponulgeluluideconcentrarediluatesteplasatngodeurilegeluluideconcentrare(linii
orizontale ntunecate). Tamponul Tris- glicin de electrozi (culoarea fondului figurii) este n
contactcuparteadesusagelului,parteadesusaprobei,precumiparteadejosagelului.
Anodulestesituatnparteainferioarageluluiiarcatodulseaflnzonasuperioar,nefiind
prezentate.nacestsistemproteinelesericedeexemplu,ausarcininetenegativeisemi c
n jos spre anod. Ionii de Tris sunt distribuii n ntregul sistem i servesc la meninerea
electroneutralitii. Intensitatea cmpului electric, E, la scurt timp dup aplicarea unei
tensiunielectrice,estereprezentatngraficuldinparteadreaptaimaginiidegel.Cmpul
electric din gel, E este relativ sczut, ca o consecin a conductivitate relativ ridicat
datorationilordeclorur,mobili.
(B ). n momentul aplicrii unei tensiuni, constituenii anionici ai sistemului se
vor alinia n ordinea de mobiliti lor electroforetice. Magnitudinea mobilit ii
ionuluiclorur(Cl-),nzonatamponuluidegelestemaimaredectmobilitatea
ionului glicinat (Gly), provenit din zona tamponului de electrozi. Proteinele din
prob,cumobilitiintermediare,suntintrodusentr-unsandwich(nordineade
mobilitatealor)ntrefrontulclorurifrontuldeioniglicinat.Astfel,proteinele
din prob devin "stivuite" n regiunea foarte ngust dintre cele cele dou
fronturideionidetamponnmicareiformeaz,spaial,ozonfoartengust
de start. Intensitatea cmpului electric este influenat de distribuie local a
purttorilordesarcin,caresuntproteineledinzonadeprob.Intensitatea,E,a
cmpului n zone diferite care conin ioni este ajustat, astfel nct toate
fronturileionicemigreazcuaceeaivitez.(C).Lascurttimpdupceprocesul
deconcentrareestefinalizat,proteineledinprobtrecngelulderezolvarecare
este prevzut cu pori mai mici pori unde micarea este ncetinit datorit
procesului de cernere molecular. n gelul de rezolvare, ionii de glicinat
depesc proteinele din prob i vor migra chiar n spatele ionilor clorur. n
timpul etapei de rezolvare, proteinele vor rspunde la cmpul electric relativ
ridicatdeterminatdeioniiglicinatdingel.Electroforezacontinucuproteinele
dinprobntamponTris-glicin,pncndaparatulestenchis.
Stivuirea. Cnd este aplicat o tensiune de curent, ionii clorur din seciunile
de gel, proteinele anionice din prob, precum i ionii de glicinat din zona
tamponului de electrod ncep s se deplaseze spre anod (panel B). Tris-ul (o
baz), precum i orice alt protein cationic din prob migreaz spre catod.
Aa cum ioni de clorur prsesc proba, n spatele lor se creeaz o regiune
localizat, de conductivitate sczut i cmp nalt. Cmpul crescut din spatele
frontului de ion clorur accelereaz proteinele din prob i ionii de glicinat de
la tampon electrodului la aceeai vitez ca i a ionilor clorur (E=constant).
Gradul de ionizare a glicinei, la pH-ul tamponului de electrozi (pH=8,3) este
de aa natur c mobilitatea efectiv a ionilor glicinat este mai mic dect ca
a ionului clorur i a proteinelor din prob. (Mobilitatea efectiv a unei
electrolit slab este mobilitatea medie a formei ionizate; ef=x, unde x este
fraciunea de molecule ionizate la un pH specific iar este mobilitatea
acestuia. Fiecare molecul poate fi gndit ca fiind ionizat x% din timp i
neionizat restul timpului. pKa a glicinei este pH=9,8 iar la pH=8,3, moleculele
de glicin sunt disociate n proporie de 1/30 n ioni glicinat).
O regiune a frontului mobil se formeaz rapid cu ioni de clorur, frontali
i ionii de glicinat n spate, iar proteinele din prob sunt comprimate
ntre ele. Proteinele formeaz, zone individuale sub iri, a ezate precum
fiicul de monede, n ordinea descresctoare a mobilitii, ntre ionul
conductor, clorur i ionul de sfrit, glicinat. n acest timp, pH-ul
gelului de concentrare devine 8,3 deoarece ionii de glicin se
deplaseaz prin acest gel. n stiva creat, fiecare zon proteic se afl
ntr-un cmp electric sczut care se mic n fa i un cmp electric
ridicat aflat n spatele ei. Orice molecul de protein avanseaz n
zona din faa sa unde ntlnete un cmp electric cu intensitate
sczut, fiind ncetinit pn cnd zona sa l va prelua. Invers, o
molecul proteic care provine spatele acestei zone este accelerat de
cmpul electric crescut de acolo. n starea de echilibru, fiecare dintre
proteine este concentrat ntr-o zona ngust, de nalt densitate,
determinat exclusiv de mobilitatea sa, n condiii electroforetice.
Separarea. n cazul n care regiunile mobile se deplaseaz n ajung la
interfaa dintre gelul de concentrare (stivuire) i gelul de rezolvare, proteinele
vor fi ncetinite accentuat datorit existenei porilor restrictivi ai gelului de
separare. n acelai timp, pH-ul este brusc crescut la o valoare de 8,8 i
crete rapid la un pH de 9,5 deoarece tris-Cl se nlocuiete cu tris-glicinat.
Mobilitatea efectiv a ionilor de glicinat la pH 9,5 este destul de mare i ca
atare dep e te proteinele din prob care sunt ncetinite n mi care de ctre
porii gelului de rezolvare, migrnd chiar n spatele frontului de clorur (x=1/3)
n aceste condiii zonele de proteine devin necomprimate i ncepe s se
separe n benzi macroscopice prin cernere molecular (panelC). In gelul de
rezolvare, proteine se mi c la pH 9,5. pH-ul de operare a gelului de
separare, egal cu 9,5 a fost introdus n sistemul Ornstein-Davis pentru a
asigura o mobilitate eficient a glicinatului, mai mare dect cea a celei mai
rapide proteine serice (prealbumina) n geluri cu %T=7,5. Dup cum are loc
progresul migrrii, benzile proteice, iniial foarte sub iri se l esc ntr-un ordin
de milimetrii, drept consecin a difuziei i diluiei.
 Principiul electroforezei pe gel de
poliacrilamid n sistem discontinuu.
Electroforeza pe geluri de poliacrilamid n condiii discontinue i denaturante
dup protocolul descris de Laemmli.

Laemmli (1970) a modificat sistemul Ornstein-Davis, pentru a permite

determinri ale greutate molecular. Sistemul Laemmli conine SDS 0,1% n
tampoanele Ornstein-Davis i utilizeaz o etap de denaturare prin tratament termic
a probei. Tratamentul este conceput pentru a denatura complet proteinele de prob
n componentele lor polipeptidice constitutive nainte de electroforez.
n momentul n care un amestec de proteine se incubeaz ntr-un tampon
care conine SDS (2%) i un agent tiol reductor, cum ar fi 2-mercaptoetanolul
(5%) la temperatur, proteinele sunt complet denaturate iar polipeptidele rezultate,
datorit SDS-ului, se ncarc cu o sarcin negativ uniform, n raport cu masa lor.
Agentul de reducere rupe legturile disulfurice ntre segmentele proteinelor native,
n timp ce SDS, un denaturant bine-cunoscut, mbrac polipeptidele uniform, cu
1,4 g de SDS pe gram de polipeptid. Proprietile detergentului ecraneaz
proprietile polipeptidelor. Toate filmele SDS-polipeptide iau o form similar
prelungit, asemntoare unei vergea, cu dimensiuni proporionale cu greutatea lor
molecular. n plus, densitatea de sarcin a complexelor SDS-polipeptid este
independent de pH n intervalul 7-10 i astfel fracionarea n gel este guvernat
strict de procesul de cernere molecular, astfel nct prin utilizarea acestui sistem
se poate la estima greutile moleculare ale polipeptidelor separate.
 O serie de tipuri de proteine nu se comport ntr-un mod ateptat n cursul
SDS-PAGE. Proteinele incomplet reduse, cu unele puni intra- sau intermoleculare
disulfurice intacte, nu sunt saturate cu SDS, deoarece o parte din domeniile lor de legare
a SDS nu sunt disponibile la detergent. Glicoproteinele i lipoproteinele nu sunt, de
asemenea, saturate cu SDS, deoarece componentele lor neproteice nu interacioneaz cu
detergent. Proteine care conin secvene neuzuale de aminoacizi, n special cele cu un coninut
crescut n resturi de lizin sau cele cu un coninut crescut n resturi de prolin, proteinele foarte
bazice i cele foarte acide se comport anomal n SDS-PAGE, probabil pentru c raportul
sarcin electric/mas a complexelor SDS-polipeptid sunt diferite de cele care ar fi de
ateptat, dat pentru dimensiunea lor. n mod similar, complexele foarte mari SDS-protein, cu
mase moleculare de sute de kilodaltoni, ar putea avea conforma ii anormale.
Polipeptidele mai mici de aproximativ 12.000 Da nu sunt rezolvate bine n cele mai
multe sisteme SDS-PAGE. Complexe SDS-polipeptid mici, fie au aceleai conforma ie
aproximativ sferic, fie nu pot fi separate de zona de micele de SDS pur care se formeaz n
spatele frontului de ioni conductori.
Sistemele electroforetice descrise de Laemmli i Ornstein-Davis pot fi utilizate la
separarea att a proteinelor ct i a acizilor nucleici. n cazul separrii acizilor nucleic, este
totui preferat sistemul Laemmli deoarece n cazul acestei tehnici, prezena SDS conduce la
denaturarea nucleazelor contaminante.
 ESTIMAREA MASEI MOLECULARE PRIN SDS-PAGE

n procedura descris de Laemmli, tratamentul probei anterior SDS-PAGE conduce la

desfacerea proteinelor n subunitile lor componente i las subunitile acoperite cu detergent
anionic. Mobilitile electroforetice ale tuturor complexelor polipeptid-SDS rezultate i asum
aceeai relaie funcional n referitoare la masa lor molecular. ntr-o prim aproximare, vitezele
de migrare a derivailor SDS sunt invers proporionale cu logaritmii maselor lor moleculare. SDS-
polipeptidele, astfel, se vor deplasa prin geluri ntr-un mod previzibil, complexele cu mas
molecular mic vor migra mai repede dect cele mari. Aceasta nseamn c masa molecular a
unei proteine poate fi estimat din mobilitile relative ale subunitilor sale n SDS-PAGE, calibrat.
Estimrile de mas molecular sunt printre aplicaiile cele mai des folosite de electroforeza pe gel
i reprezint o parte a popularitii SDS-PAGE prin metoda Laemmli.

MaselemolecularesuntdeterminatenSDS-PAGEprincomparareamobilitiiproteineide
testare cu mobilitile unor proteine marker cunoscute. Parametrul relevant este
mobilitatea relativ, Rf, definit ca mobilitatea a unei proteine raportat la mobilitatea
frontului de ioni. Acest parametru permite normalizarea mobilitilor la o mrime
msurabil semnificativ i caracteristic. Mai degrab dect a determina mobiliti, este
suficientssecalculezeRf caraportuldintredistantaparcursadeoproteinadinparteade
sus a gelului de rezolvare mprit la distan de migrare a frontului de ioni. Deoarece
frontuldeioniestedificildealocaliza,npractic,mobilitilesuntnormalizatelacolorant
deurmrirecaremigreazdoarpuinnspatelefrontuluideioni:
Graficul log M vs Rf construit
din distanele de migrare a
standardelor conduc la
calibrarea curbei gelului.
Valorile Rf ale proteinelor de
testat sunt apoi comparate cu
cele ale standardelor.
Interpolarea valorilor Rf ale
proteinei de testat pe curba
standard ofer masa ei
molecular aproximativ Curb de calibrare, logMr vs. Rf plotat cu o serie de markeri
de mas molecular cuprins n domeniul 10.000-200.000Da,
separai pe un gel omogen (T%=10% i C%=2,75%) de
poliacrilamid n prezen de SDS. Se poate observa devia ia
de la linearitate. Proteinele marker sunt (masa molecular,
Mr fiind dat n kDa): miozin (194); RNA polimeraz
(subunitatea ) (160); galactozidaz (116); fosforilaz B
(94); RNA polimeraz (subunitea ) (95); albumin seric
bovin (68); ovalbumin (43); RNA polimeraz (subunitea
) (38,4); anhidraz carbonic (30); tripsinogen (24.5); -
1actoglobulin (17,5); lizozim (14,5).
Curbele standard sunt de fapt n form sigmoidal. Liniaritatea aparent a
curbei standard nu poate acoperi ns, ntreaga gam de mase moleculare
pentru un amestec de proteine separate ntr-un gel particular. Cu toate
acestea, log M este suficient de aplatizat, ntr-un sens matematic, pentru a
permite estimri n mas molecular destul de exacte care urmeaz s fie
fcute prin interpolare, i chiar i prin extrapolare, peste domenii relativ
mari. Intervalele aproximative utile a gelurilor dup SDS-PAGE pentru
estimri de mas molecular sunt dup cum urmeaz: pentru mase
moleculare din domeniul 40.000 la 200.000 Da, geluri cu T%=7,5%; pentru
mase moleculare din domeniul 30.000 la 100.000, geluri cu T%=10%;
pentru mase moleculare din domeniul 15000 la 90000 Da, geluri cu T
%=12%; pentru mase moleculare din domeniul 10.000 la 70.000 Da, geluri
cu T%=15%.
Amestecuri de proteine standard cu mas molecular cunoscut sunt
disponibile n comer pentru calibrarea geluri n vederea electroforezei
proteinelor.
 Markeri de mas molecular utilizai n SDS-PAGE

Este important a avea la ndemn o gama larg de markeri de

mas molecular, astfel nct s se exploreze orice dimensiune a
unui polipeptid. Acetia ar trebui s suficieni pentru cele mai multe
scopuri, deoarece se ntind pe un interval de aproximativ 1000 de
ori a masei moleculare (dei markeri cu mas mai mic de 10 kDa
sunt rar folosii).
Kit-urile care acoper intervale de mas molecular limitate sunt, n
general, disponibile din mai multe surse comerciale De exemplu, se
ofer trei seturi de markeri denumii markeri pe un domeniu sczut,
pe un domeniu mare i markeri pe o gam larg, pentru a fi utilizate
ca standarde pentru separaii de proteine n intervale cuprinse ntre
14.000-90.000 Da, 45.000-200.000 Da, respectiv 6.500-200.000
Da. Dac acetia nu sunt de ajuns, se poate pregti o serie proprie
prin reticularea catenelor polipeptidice ale unor proteine mici (de
exemplu, lizozim, hemoglobin, albumin seric bovin).
Hart de migrare a proteinelor pe gel. Poziia relativ a proteinelor standard sunt
prezentate pentru o serie de geluri, dup separare n SDS-PAGE, procedura Laemmli.

Este uor s se aleag concentraiile optime ale gelului (%T) necesar separrii proteinelor mai ales pentru
SDS-PAGE dect pentru cele separate prin electroforez n cond ii native pentru c separarea complexelor
protein-SDS este n principal dependent de lungimea catenei polipeptidice. Astfel, gelurile Laemmli cu
T=7,5% rezolv proteine din domeniul de mase moleculare cuprins ntre 40 i 200 kDa, n timp ce gelurile
T=10% rezolv proteinele cu greutate molecular cuprins ntre 20 i 200 kDa, gelurile cu T=12% rezolv
proteinele cu greutate molecular cuprins ntre 15 i 100 kDa, iar gelurile cu T=15% rezolv proteinele cu
greutate molecular cuprins ntre 6 i 90 kDa
 ELECTROFOREZA PE GELURI DE POLIACRILAMID N GRADIENT DE
POROZITATE
Migrareamacromoleculelorntr-omatricedegelcuoconcentraiecontinuuvariabil(ceea
cesemnificungradientdeporozitate),arecaefectcompactareazonelordeproteinede-a
lunguldirecieidemigrare,astfelcbandaproteic,traverseazconcentraiidincence
mai mari de gel, iar viteza sa de migrare scade continuu. Acest proces conduce la o
ngustareprogresivabenziiproteice.Existialtemotivepentruarecurgelageluride
porozitategradat.

Principiul tehnicii este prezentat n figura alturat, cnd,

dup o separare electroforetic n timp suficient (de cel
puin 10 kVh) pentru ca mobilitatea proteinelor s fie
constantinceledinurmsncetezepentrucfiecare
element constitutiv al probei s ajung ntr-o regiune a
geluluicuodensitatelacaredimensiuneamedieaporilor
seapropiedediametrulproteinelor(limitadepori).Astfel,
raportuldintredistaneledemigrareauneiproteinecucea
aoricruialteiadevineoconstant,dupceauintrattoate
ntr-o regiune a gelului n care acestea sunt supuse unor
condiii de cernere drastic. Din aceast cauz profilul
electroforetic devine constant dup o migrare prelungit
ntr-un gel cu gradient de concentraie. Concentraia de
gel, la care rata de migrare pentru o protein dat devine
constantsenumetelimitdepori:dacacestporozitate
marcat n mod corespunztor cu ajutorul unui set
adecvat de proteine marker, atunci este posibil s se
corelezedistanademigrareaoricruielementconstitutiv
namesteccumasasamolecular.
Metoda descris pentru determinarea masei
moleculare dup SDS-PAGE, folosind un gradient
linear de pori. Curba arat o relaie liniar ntre
logaritmul masei moleculare i D (D1/2) pentru o
serie de 34 de proteine standard care acoper
domeniul de masele moleculare cuprinse ntre
13.000 i 95.000 Da, separate pe un gel n
gradient T%=3-30% (la un C% constant de 8,4%).
Schema unui sistem pentru turnarea gelurilor de
poliacrilamid n gradient linear: A, dispozitiv bicameral de
formare a gradientului; B, rezervor; C, camer de
amestecare; D, supap; E, bar magnetic de agitare; F,
agitator magnetic; G, robinet; H, pomp peristaltic; I,
tubulatur; J, caset de turnare a gelului plac vertical.
 Calitatea gradientului generat poate fi verificat prin adugarea
unui colorant, cum ar fi p-nitrofenolul sau albastru de bromofenol
ntr-unul dintre rezervoare i apoi de scanarea gelului cu un
densitometru.

n cazul n care se are n vedere

turnarea simultan a unui numr de
geluri plac verticale

Reprezentarea schematic a unui

aparat pentru prepararea unui numr
de geluri de poliacrilamid cu gradient
liniar de pori: A, sistem de producere a
gradientului; B, rezervor (concentraie
mare de monomeri, T% mare); C,
camer de amestecare (concentraie
mic mare de monomeri, T% mic); D,
valv; E, bar magnetic; F, agitator
magnetic; G, robinet de nchidere; H,
pomp peristaltic; I, caset de
turnare a mai multor copii de geluri
verticale.
 Limitele concentraiei aleas pentru gradient depinde de compoziia probei ce
urmeaz a fi separat. Gradieni de tipul 4-24, 4-26, 4-30, 2-30% etc., sunt considerai
n general mai potrivii a se utiliza pentru cele mai multe probe proteice (de exemplu
proteine serice, proteine urinare, etc.), dei, dac electroforeza este prelungit este
posibil ca proteinele cu Mr n jur de 30,000 Da s migreze n afara gelului.
. Aplicaii ale electroforezei pe geluri de poliacrilamid n gradient de
porozitate
Electroforeza n gradient de pori n prezen a SDS poate rezolva, o gam larg de proteine
ntr-un domeniu mare de mas molecular. Prin urmare, asocierea dintre focalizare
izoelectric i electroforeza n gradient de pori n prezen de SDS maximizeaz numrul de
proteine identificate ntr-un gel dup o singur separare bidimensional. Pentru a obine pI-ul
i masa proteinelor native, se utilizeaz n prima dimensiune focalizarea izoelectric n
absena ureei urmat de electroforeza n gradient de pori n condi ii nedenaturante

n cazul unei proteine multimerice, parial purificate, numrul de subunit i i masa

molecular a subunitilor sunt analizate simultan prin electroforez 2-D cu electroforeza n
gradient de pori pentru prima dimensiune i SDS-PAGE pentru a doua dimensiune. Dup o
prim electroforez n gradient de pori n condi ii nedenaturante, poziia proteinelor
multimerice n gel este determinat prin teste specifice acestei proteine pentru estimarea
masei sale moleculare native, dup care proteina multimeric este disociat n subunitile
sale prin tratament cu SDS. Masa molecular a fiecrei subunit i este determinat prin
electroforez pe gel de poliacrilamid n prezen de SDS iar numrul de subunit i dintr-o
protein nativ complex se calculeaz din aceste valori.
Au fost descrise alte aplicaii ale electroforezei n analiza lipoproteinelor, inclusiv
lipoproteinelor cu densitate mare (HDL) precum i a lipoproteinelor cu densitate mic
(LDL). n cele mai multe laboratoare de analiz specializat, metodele uzuale de
separare i analiz a lipoproteinelor din ser sunt cele de ultracentrifugare n gradient de
densitate. Un dezavantaj al acestei metode const din necesarul unui echipament scump
i personal cu experien, n timp ce separarea i analiza acestora prin electroforez n
gradient de pori este o metod relativ simpl, necostisitoare, i sensibil pentru
detectarea subfraciilor lipoproteice dintr-un volum mic de ser. De altfel, electroforeza
n gradient de pori n condiii nedenaturante separ lipoproteinele, pe baza diferenelor
de dimensiune a particulelor i astfel poate oferi n mod direct dimensiunea particulelor,
n timp ce separarea ultracentrifugarea n gradient de densitate se bazeaz pe diferena
de densitate, parametru indirect, dependent de dimensiunea particulelor. Dac, nainte
de electroforez, n cazul n care lipoproteinele din prob sunt precolorate printr-o
tehnic de colorare a lipidelor (colorare cu negru de Sudan B, de exemplu) migrarea lor
poate fi monitorizat n timp real. De exemplu, HDL poate fi fracionat n 14 subclase
prin electroforez n gradient de pori n condiii nedenaturante.
n plus fa de interaciunea funcional a proteinelor sau a subunitilor
acestora, reaciile antigen-anticorp sunt analizate dup separarea prin electroforez
n gradient de pori n condiii nedenaturante. Mobilitatea unui complex de
antigen-anticorp este mai lent dect cea a unei molecule singulare de antigen.
Mai mult dect att, un complex al unei molecule de antigen i doi anticorpi
monoclonali care recunosc doi epitopi distinci migreaz mai lent dect un
complex format dintr-un antigen i un anticorp monoclonal. Prin urmare, prin
electroforez n gradient de pori n condiii nedenaturante se poate determina dac
dou anticorpi monoclonali mpotriva acelai antigen recunosc epitopi diferi i sau
identici, i astfel este posibil realizarea unui studiu de cartografiere a epitopilor
prin electroforez pe gel.
se poate realiza de asemenea, studiul complexelor ADN-proteine. n analiza de
modificare a mobilitii electroforetice (electrophoretic mobility shift assay,
EMSA), electroforeza n gradient de pori n condiii nedenaturante are o
capacitate de rezoluie nalt i este util pentru analiza complexele ADN-proteine
care conin proteine diferite ori pentru detectarea unor proteine de legare a de
ADN mutani.
 ELECTROFOREZA PE GELURI DE POLIACRILAMID N PREZENA
BROMURII DE CETIL-TRIMETIL-AMONIU

n cazul n care, n loc de ncrcarea negativ cu SDS, se utilizeaz o

ncrcare pozitiv a proteinelor cu detergeni de tipul bromurii de
cetiltrimetilamoniu (CTAB), sarcina negativ a glucidelor se neutralizeaz
prin legarea suplimentar a unor molecule de detergent. Acest lucru
conduce la obinerea unor benzi mai clare. CTAB este cunoscut c
solubilizeaz proteinele foarte eficient i a fost folosit pentru izolarea unor
proteine "dificile"
n CTAB-PAGE proteinele se deplaseaz spre polul negativ, mai degrab
dect spre electrodul pozitiv i ca atare trebuie utilizat un sistem diferit de
tamponare.
2D-CTAB/SDS-PAGE este o tehnic de electroforez bidimensional n gel, potrivita
n special pentru separarea unor proteinele membranare.
Prin aceasta tehnica, se pot analiza chiar i acele proteine cu pI puternic bazic
deoarece CTAB este un detergent cationic care stabilizeaz sarcini pozitive n afara
regiunilor hidrofobe ale proteinelor membranare, ceea ce conduce la meninerea lor
n soluie iar separarea se realizeaza funcie de dimensiunile lor. Efectul de stabilizare
este susinut de un pH acid.
n plus fa de acest efect, condiiile acide conduc la o eliminare parial a
proteinelor solubile.
ELECTROFOREZA NATIV PE GEL DE POLIACRILAMID N PREZEN
DE COOMASIE BRILLANT BLUE
n ultimii ani, separarea de complexe proteice prin electroforez nativ pe gel de
poliacrilamid n prezen de CBB (Blue native PAGE, BN-PAGE) s-a dovedit a fi o
metod dominant n identificarea unor tulburri funcionale prin analiz din
omogenate totale, esuturi, celule ori fraciuni celulare. Metoda a fost utilizat la
determinarea greutii moleculare a complexelor proteice din intervalul cuprins ntre
10 i 10.000 kDa. Au fost analizate cu succes mai ales complexele membranare
intrinseci de transfer a electronilor/protonilor din mitocondrii i cloroplastele.
Metoda a fost combinat cu alte tehnici pentru a determina starea oligomeric,
stochiometria, activitatea enzimatic i structura molecular a complexelor
multiproteice. Aa cum multe probe pot fi separate n paralel, ntr-o singur migrare
electroforetic, printr-o comparaie direct a complexelor proteice se permite uor
identificarea unor tulburri, ceea ce permite direc ionarea spre analize funcionale
suplimentare. n proteomic, separarea de nalt rezoluie de proteine este, n general
realizat prin separri bidimensionale (2-D), n conformitate cu punctul izoelectric al
proteinelor (IEF-PAGE) i masa lor molecular (SDS-PAGE). Aceasta ultim tehnic
de denaturare separ sute de mii de proteine din probe complexe. Cu toate acestea,
proteinele hidrofobe de membran sunt greu detectabile, dup 2-D IEF/SDS-PAGE.
BN-PAGE reprezint o strategie alternativ de separarea cu rezoluie nalt a proteinelor de
membran i de meninere a funciei lor enzimatice. Metoda se nume te nativ, deoarece
cele mai complexe de proteine separate i pstreaz funciile enzimatice i blue native,
deoarece separarea electroforetic se bazeaz pe proprietatea colorantului Coomassie blue
G250 (CBB) de a se lega la proteine. BN-PAGE a fost descris pentru prima data n 1991 n
cazul separrii complexelor de proteine membranare din lanul respirator al mitocondriei
umane.
 Astzi, BN-PAGE reprezint o alegere n cazul n care este necesar o
analiz a interaciunilor proteinelor native de membran, la o rezoluie nalt i cu
randament sporit.
Importana biologic a interaciunilor dintre proteine este dat de faptul
c proteinele se exprima n funcie de gene n toate organismele vii. Proteinele sunt
molecule funcionale care opereaz pe ci metabolice, de dezvoltare i de reglare,
dintr-o celul, esut sau dintr-un organism. Proteinele multiple sunt complexe
integrate, n scopul organizrii lor n mai multe funcii enzimatice. Complexe de
proteine, prin urmare, reflect organizarea macromolecular a strii celulare, care
reprezint fundamentul n nelegerea funciilor celulare. n practica proteomic,
obiectivul central l reprezint identificarea tuturor proteinelor prezente ntr-o stare
definit de dezvoltare a unui organism, esut, celule sau subfrac ie celular i de a
caracteriza modificrile lor calitative i cantitative, ca rspuns la schimbrile de
mediu.
Pregtirea probei n vederea BN-PAGE. Blue native PAGE separ complexe ale proteinelor de
membran n stare nativ. Pentru a obine rezultate optime, pregtirea probelor reprezint pasul
cel mai critic, din acest motiv toate treptele de prelucare se efectueaz pe ghea. Pentru a mri
ansele de solubilizare a complexelor proteice i de cre tere a stabilit ii lor, se are n vedere c
solubilitatea proteinelor depinde att de natura probei, precum i pe tipul de detergent i de
concentraia acestuia, aceste variabile trebuind testate pentru oricare prob de interes.
Solubilizarea complexelor proteice. Membranele biologice sunt ansambluri complexe de lipide i
proteine. Un compus lipidic este de obicei compus din dou cozi hidrofobe de hidrocarbur
conectate la un cap polar. Lipidele sunt cel mai adesea aranjate ntr-o structur bistratificat cu
cozile hidrofobe alturate iar capetele hidrofile ale acestora sunt ndreptate spre exterior.
Proteinele de membran sunt ncorporate n zonele hidrofobe ale bistratului membranar prin
interaciunea lor cu faza hidrofob lipidic. Proteine se adun n complexe multisubunitare pentru
a ndeplini funciile celulare n cadrul fazei de membran.
Evoluia unui proces de migrare electroforetic prin BN-PAGE. Imaginile reprezint trei puncte
caracteristice din perioada de timp de electroforez prin BN-PAGE. Aparatul electroforetic const din
anod(parteadejos)itanculrezervordetamponcatodic(sus,umplutecutamponcatodic,carecon ine
CBB,albastru),gelulseaflsituatntredouplcidesticl(caunsandwich)iarmen inereatemperaturii
(la 4oC) se realizeaz printr-un sistem de rcire prin intermediul tamponului anodal n tot timpul
electroforezei.Tamponuldinzonaanodalesteagitatpentruamen ineotemperaturconstant.nainte
dencepereaelectroforezei,tamponulcatodalcarecon ineCBBestecompletatnrezervorulcutampon
iprobelesuntdepusengodeuri(sgeatadeculoarealb,godeulprobei,panelul1,naintedenceperea
migrrii).ntimpulelectroforezei,probelencrcateelectricintrngeluldeconcentrare(stivuire)idup
untimp,colorantulCoomassiecaresedeplaseazcufrontulajungelajumtateageluluideseparare.n
acest moment, complexele proteice ncep s devin vizibile n gelul de separare. n acest moment,
tamponul cu Coomassie catodic se schimb cu un tampon catodal incolor (sgeile de culoare alb,
panelul2,ntimpulmigrrii).BN-PAGEpoatefiopritatuncicndtamponcoloratcuCBBptataajuns
lasfritulgeluluideseparareiseparareadecomplexeestefinalizat(sgeiledeculoarealb,panelul
3,sfritulmigrrii)
BN-PAGE a complexelor de proteine membranare tilacoide.
Markerul de mas molecular (MP) conine urmtoarele
proteine standard separate: tireoglobulin 696, feritin 440,
catalaz 232, lactat dehidrogenaz 140, i albumin 67, kDa.
Din 1108 cloroplastele de orz corespunznd la 400 g de
protein, au fost izolate plastide care au fost n continuare
lizate, iar membranele tilacoide au fost colectate prin
centrifugare. Proteinele membranare au fost solubilizate cu
dodecilmaltozid i separate pe un gel de poliacrilamid cu
gradient liniar de pori (6-12%), prin blue native PAGE (TM).
Linia a doua de gel a fost colorat cu CBB (CS). Pentru a se
determina activitatea diaforazei
NAD(P)H:plastoquinon:oxidoreductazei (asterisc pe partea
dreapt a gelului), gelul din prima dimensiune, a fost incubat
n 50 mM tampon fosfat pH=8,0/EDTA, 1mM. Reac ia de
culoare a fost iniiat prin adugarea a 0,2 mM NADH i 0,5
mg/ml nitro blue tetrazoliu. Gelul s-a incubat n continuare
timp de 12 ore. Se evideniaz (prin sgei) dou complexe
proteice care conin clorofil (AS) la o mas molecular de
550 kDa (semnalul de sus, echivalent complexului PS I, LHC
I) i un altul, la o mas molecular de 120 kDa (semnalul mai
mic, echivalent complexului LHC II).
 ELECTROFOREZANATIVPEGELURI
DEPOLIACRILAMIDINCOLORE

nu este nimic altceva, dect un sistem de gel folosit n BN-PAGE, fr a utiliza

colorantul CBB

Pentru a evita o potenial agregare a proteinelor de membran din extractele de

detergent n timpul migrrii electroforetice, se adaug detergeni blnzi la gelurile
native incolore (tabelul de mai jos)

Detergentul utilizat Proba biologic

Mitocondrie la mamifere
-D-dodecilmaltozid Mitocondria la drojdii
Cloroplaste la plante (tilacoide)
-D-decilmaltozid Mitocondrie la mamifere
-D-octilglucozid Mitocondrie la drojdii
Triton X-100 Mitocondrie la drojdii
Nonidet P-40 Mitocondrie la drojdii
Lubrol Mitocondrie la drojdii
Digitonin Mitocondria la drojdii
Structura chimic a octilglucozidului
(octil-beta-D-glucopiranozid).
SEPARAREA PROTEINELOR PE GELURI DE POLIACRILAMID
PRIN FOCALIZARE(FOCUSARE)IZOELECTRIC
IEF (isoelectric foccusing) este o tehnic electroforetic pentru frac ionarea
compuilor amfoterici n funcie de pI-ul lor de-a lungul unui gradient continuu
de pH. In opozitie cu electroforeza zonala, unde mediul de separare posed un
pH constant (tamponat) care stabilete o sarcin electric constant pe
suprafaa moleculei i care conduce, n absena procesului de stivuire (cernere
molecular) la o mobilitate constant, sarcina electric de suprafa ale unui
compus amfoter n IEF este ntr-o continu schimbare, i scdere, n funcie de
curba sa de titrare, n timp ce trece de-a lungul unui gradient de pH pn cnd
ajunge la o poziie de echilibru, adic n regiunea n care pH-ul se potrivete cu
pI-ul su.
Acolo, mobilitatea acestei molecule este egal cu zero iar molecula se
oprete. In unele sisteme, gradientul este creat i meninut, prin trecerea
unui curent electric printr-o soluie de compui amfoterici, care au valori ale
pI-urilor apropiate pe o distan care cuprinde un domeniu dat de pH.

Principiul focalizrii izoelectrice. In alte sisteme, inainte de ncrcarea probei, se

stabilete un gradient de pH. (A) Se ncarc proba i se aplic pe gel. Proteinele vor
migra n funcie de pH-ul lor izoelectric, localizare la care sarcina lor net este nul;
(B) Proteinele formeaz benzi electroforetice care pot fi excizate sau utilizate n
experimente ulterioare.
Din punct de vedere chimic, amfoliii transportori sunt acizi oligo-amino, acizi oligo-carboxilici ,
disponibili comercial sub denumiri diferite. Exist trei abordri de baz n sinteza amfoli ilor
transportori:
abordarea Vesterberg, care implic o reacie dintre oligo-amine diferite (tetra-, penta-i hexa-
amine) cu acid acrilic;
procesul de sintez chimic propus de Soderberg i colab. care implic co-polimerizarea de
amine, aminoacizii i dipeptide cu epiclorhidrin;
abordarea Pogacar-Grubhofer, care a utilizeaz etilenimina i propilendiamina pentru reacii
ulterioare cu propansulfona, vinil sulfonatul de sodiu i clormetil fosfonatul de sodiu.

Transportul electroforetic cauzeaz acestor AMFOLII

TRANSPORTORI (Carrier Ampholyte, CA)stivuirea n
funcie de pI-lor, astfel nct se realizeaz un gradient de
pH care crete de la anod la catod, i care este stabilizat.
La nceputul unei migrrii, mediul de separare are un pH
uniform, este egal cu pl-ul mediu al amfoliilor
transportori. Astfel, cei mai muli amfolii au o sarcin net
i o mobilitate net. Amfolitul cel mai acid migreaz n
apropierea anodului i se concentreaz ntr-o zon la
care valoarea pH-ului su este egal cu pI, n timp ce cel
mai bazic amfolit se deplaseaz adiacent i n apropierea
catodului.
 Un amfolit mai puin acid migreaz adiacent i uor catodal ntr-o zon stablit
de pH-ul su i astfel toi componenii sistemului ating o stare de echilibru.
Dup finalizarea acestui proces de aranjare (stivuire), unii amfolii transportori
tind s se deplaseze n zone cu pH mai mare sau mai mic prin procese de
difuziune n cazul n care sistemul nu se afl ntr-un echilibru izoelectric. Dar,
aa cum imediat ce acetia intr n aceste zone, amfoliii transportori devin
ncrcai electric iar tensiunea electric aplicat i foreaz s se ntoarc
napoi n poziia lor de echilibru.

Formarea unui gradient de pH

-Amfolitii transportori sunt:
- molecule mici (300-1000 Da)
- compuii amfoteri (acizi&bazici) cu pI
distinct
- acioneaz ca ageni de tamponare
- Floteaza n gel
In camp electric se ordoneaza in functie de
pI
Denumiri comerciale: Ampholine, BioLyte
etc.
O diagram a formrii unui gradient de pH,
ntr-un cmp electric, cu ajutorul amfoliilor
transportori.nmomentulaplicriiunuicmp
electric, amfoliii ncrcai negativ migreaz
spre anod, n timp ce aceia ncrcai pozitiv
migreazsprecatodiarvitezalordemigrare
depinde de mrimea sarcinii lor nete.
Moleculele de amfolii transportori cu cele
mai mici valori ale pI migreaz spre anod n
timpcemoleculeledeamfoliicuvaloareapI
cea mai mare va migra spre catod. Ceilali
amfolii se vor alinia n funcie de pI i vor
determina pH-ul mediului, crendu-se astfel
un gradient stabil, unde pH-ul crete treptat
de la 3 la 10, de exemplu. Cum amfoliii
purttori au o greutate molecular mic, ei
posed o vitez mare de difuziune n gel.
Acestfaptpresupunecnmomentulncare
difuzeaz mai departe de valoarea lor de pl,
ei sunt obligai din considerente
electroforetice de pH s migreze napoi n
mod constant i rapid. Procesul este
deosebit de important atunci cnd se
realizeaz gradieni de pH foarte plai,
deexemplu, cuprins ntre 4,0 i 5,0, folosii
pentruobinereauneirezoluiinalte
 Focalizarea izoelectric cu gradieni de pH imobilizai (Immobilized pH
gradients, IPG)).

Se realizeaz cu tampoane, un set de ase acizi slabi i baze neamfotere, avnd o

compoziie chimic general, CH2=CH-CO-NH-R, unde R reprezint fie dou gruprii
carboxil diferite slab acide, cu pK-uri de 3,6 respectiv 4,6, sau patru grupri teriare
amino, cu pK-uri de 6,2, 7,0, 8,5, i 9,3 (disponibile sub denumirea comercial de
Immobiline, figuraalturat).

gradientii de pH imobilizai (IPG) sunt

realizati prin amestecarea a dou tipuri de
de acrilamid modificata chimic
(Immobiline), unul cu avnd proprieti de
tamponare acide i un altul cu proprieti
de tamponare bazice.
Gradienii (Imobilinele) imobilizai de pH sunt preparai prin amestecarea a
dou soluii de polimerizare diferite, ntr-un sistem generator de gradient
asemntor celui utilizat la obinerea gradienilor de pori. n principiu, se
utilizeaz dou soluii care conin monomer de acrilamid i catalizatori de
polimerizare ai matricei de gel. Imobilinele se utilizeaz n soluii stoc, cu
concentraii de 0,2 moli/L, soluia mai dens coninnd glicerol. Astfel, n
timpul reaciei de polimerizare, gruprile carboxilat i amino se leag
covalent la matricea liniar de gel

Reprezentarea grafic a unei reele

de poliacrilamid copolimerizat cu
imobiline.
 STRATEGIA DE SEPARARE A PROTEINELOR PE GELURI DIN POLIACRILAMID
PRIN FOCALIZARE IZOELECTRIC

Proteinele, ca molecule amfotere, posed sarcini nete pozitive, negative, sau neutre n
funcie de pH-ul de mediului n care se afl dizolvate. Sarcina per ansamblu a unei proteine
particulare este determinat de resturile de aminoacizi acizi sau bazici ionizabili de pe
catenele polipeptidice i de gruprile protetice. Gruprile carboxilice acide (-COOH), din
proteine sunt neionizate n soluii acide i disociaz n form anionic (-COO -), la valorile ale
pH-ului mai mari, de mai sus de pH=3,0. Gruprile amino (-NH 2) i ali compui de baz din
proteine, cum ar fi guanidinele, sunt nencrcate electric la un pH alcalin, dar devin cationi la
un pH mai n jur de 10,0 (de exemplu,-NH 3+). pH-ul la care o caten polipeptidic disociaz
este afectat de compoziia total a proteinei i de propriet ile mediului n care se afl
dizolvat. Ca urmare, fiecare grupare individual ionizabil dintr-o protein are un punct
aproape unic de disociere.
Sarcina net a unei proteine este suma algebric a tuturor sarcinilor sale, pozitive i negative.
Dup cum s-a mai amintit n acest capitol, exist un pH specific pentru fiecare protein la
care sarcina net care o posed este egal cu zero. Aceast valoare este denumit pH
izoelectric (pI) este o proprietate caracteristic fizico-chimic specific fiecrei proteine. n
cazul n care numrul de grupri acide dintr-o protein depete numrul de grupri bazice,
pI-ul proteinei va avea o valoare sczut a pH-ului. Pe de alt parte, n cazul n care numrul
gruprilor bazice sunt mai numeroase dect cele acide, pl-ul va fi nalt. Proteinele arat
variaii considerabile ale punctelor izoelectrice, dar valorile pl-urilor se ncadreaz de obicei,
n intervalul de pH cuprins ntre 3 i 10.
n general, IEF se efectueaz n condiii nedenaturante, fiind o tehnic de nalt
rezoluie. Deseori, rezoluia a dou proteine diferite se realizeaz la valori ale pI-
ului lor de doar 0,02 uniti de pH, sau mai puin. Din cauza acestei naltei
rezoluii, probe de proteine care par a fi omogene atunci cnd sunt testate prin
alte mijloace poate fi adesea separate n mai multe componente prin IEF. Astfel,
microheterogenitatea poate fi un indiciu dat de diferene n structura primar,
existena unor izomeri conformaionali, a unor diferenele de tipuri i de numr
de grupri prostetice, sau de denaturare a proteinei.

n funcie de proprietile proteinei

(proteinelor) luate n studiu i n funcie de
scopul urmrit, trebuie avut n vedere:
- compoziia chimic, concentraia i
structura gelului (de poliacrilamid ori
agaroz);
- forma gelului (gelul poate fi cilindric sau
plat);
- condiiile de separare (IEF, CA-IEF).
 REZOLUIA DE SEPARARE N FOCALIZAREA IZOELECTRIC

Conform teoriei focalizrii izoelectrice i rezultatelor experimentale, diferena

de pI (pI) ntre dou benzi de proteine adiacente rezolvate prin aceast
tehnic este direct proporional cu rdcina ptrat a gradientului de pH
i invers proporional cu rdcina ptrat a gradientului de tensiune
(intensitatea cmpului electric aplicat) conform relaiei :

pI = (gradient de pH / gradient de voltaj)1/2

Astfel, n focalizarea izoelectric, un domeniu ngust de pH i o tensiune nalt, aplicat, conduce

la o rezoluie nalt (un pI mic). n plus fa de aceti doi factori, o rezoluie bun este
favorizat de substane cu coeficieni de difuzie sczu i. De asemenea, vitezele ridicate de
schimbare a mobilitii, cu un pH apropiat de punctele lor izoelectrice conduc la o rezolu ie
nalt. Cele mai multe dintre proteine ndeplinesc ultimele dou criterii, dar aceti factori nu sunt,
desigur, sub controlul experimentatorului. Schimbarea distan ei dintre electrozi pentru o tensiune
dat i alegerea unui domeniu de pH, va schimba n aceeai msur att pH-ul ct i gradienii de
tensiune, astfel nct, cu excepia cazului n care intervalul amfoliilor transportori sau tensiunea
electric aplicat sunt de asemenea, modifica i nu au drept consecin o modificare n rezoluie.
APARATURA UTILIZAT N FOCALIZAREA
IZOELECTRIC
 SEPARAREA PROTEINELOR PRIN ELECTROFOREZ
BIDIMENSIONAL PE GEL DE POLIACRILAMID

PREGTIREA PROBEI N VEDEREA 2-D PAGE

Pretratarea probelor n vederea 2-D PAGE implic solubilizarea, denaturarea i

eliminarea complet a interaciuniilor dintre proteine. Dei este de dorit, nu exist o
metod unic de pregtire a probelor care poate fi universal aplicat din cauza
diversitii probelor care sunt analizate prin electroforez bidimensional. O procedur
ideal pentru solubilizarea probei n vederea 2D PAGE trebuie s conduc la
perturbarea tuturor complexelor proteice legate necovalent i a agregatelor
polipeptidice din soluii cu obinerea unor componente individuale. Cu toate acestea,
indiferent de metoda aleas de preparare a probei, cel mai important aspect este cel
de reducere la minimum a modificrilor structurale ale proteinelor i care ar putea
conduce la spoturi artefactuale pe hrile 2D. Probele care conin uree nu trebuie s fie
nclzite deoarece, n acest caz, tratamentul termic poate conduce la procese de
carbamoilare a proteinelor datorit izocianatului format prin descompunerea ei, acest
proces genernd o mare heterogenitate a proteinelor. n general, probele trebuie s fie
supuse unei minime manipulri i se pstreaz pe tot parcursul, la rece
SEPARAREA PROTEINELOR PRIN ELECTROFOREZA BIDIMENSIONAL PE GEL DE
POLIACRILAMID

Prima dimensiune a 2D PAGE implic separarea proteinelor prin focalizare izoelectric

care se realizeaz pe geluri cilindrice (T=3-5%), turnate n tuburi de sticl capilare (cu
diametrul intern de 1-1,5 mm) sau pe stripuri. n mod uzual, gelurile conin uree 8 M i
un detergent neionic sau zwitterionic. Detergentul inclus are de obicei o concentra ie de
2% (mas/volum), aceasta putnd fi adesea redus pn la 0,5% fr a afecta modul de
separare. Gelurile conin de asemenea amfolii sintetici transportori care genereaz
gradientul de pH-ul necesar procesului de separare ntr-o concentraie de 2%
(mas/volum). Din acest punct de vedere, sunt disponibili o varietate de amfoli i
sintetici, majoritatea acestora fiind potrivii n 2D PAGE.
Adesea este folosit o gam ampl de amfolii (pH 3-10), cu toate c, un amestec de
amfolii dintr-un domeniu de pH=4-8 poate oferi, de multe ori, rezultate excelente dup
cum n gelurile cilindrice utilizate n IEF, gradientul final de pH rareori se poate extinde
peste 7,5.
A doua dimensiune poate fi realizat fie pe sisteme orizontale, fie pe sisteme verticale.
Pentru set-up-urile orizontale, de laborator se pot utiliza geluri gata de utilizare ori
geluri de poliacrilamid cu SDS (cu o grosime de 0,5 mm a ezate pe un film GelBond
PAG) care sunt plasate pe placa de separare cu sistem de rcire a unitii de
electroforez orizontal.
Gelurile de poliacrilamid supuse anterior separrii prin focalizare
izoelectric echilibrate, sunt plasate de-a lungul gelului care va fi utilizat
n a doua dimensiune. Scopul echilibrrii gelurilor separate n prim
dimensiune prin focusare izoelectric este cel de a pregti proteinele
focalizate pentru transferul lor n a doua dimensiune a gelului de SDS-
PAGE. Aceast operaiune implic incubarea timp de aproximativ 30
minute a gelului folosit la focusare ntr-o soluie tamponat care conine
SDS, uree i glicerol. Aceast operaiune este necesar deoarece
proteinele care au fost iniial separate pe baza sarcinii lor electrice
intrinsece trebuie s fie echilibrate cu un detergent anionic care ofer
sarcina electric obligatorii separrii n cea de a doua dimensiune
(proteinele focalizate la valorile lor de pI sunt nencrcate electric) i
pentru a asigura ca masa polipeptidic reprezint caracteristica primar a
separrii n cea de a doua dimensiune. Surfactantul anionic SDS este ales
n acest scop. SDS formeaz complexe cu proteinele ntr-un raport de
aproximativ 1,4 g SDS/g protein, care supra-acoper sarcina intrinsec a
proteinei, acordnd o sarcin electric net negativ complexelor SDS-
protein i dnd astfel polipeptidelor aproximativ aceea i form
hidrodinamic .
Metode de disrupie a celulelor

Structura chimic a detergentului

Nonidet P 40 (4-Nonil fenil-polietilen
glicol). Alte denumiri ale acestui
compus: Imbentin-N/52, NP 40.
Structurile chimice ale A, fenilmetilsulfonilfluorurii
(PMSF); B, Pefabloc SC (4-(2-Aminoetil) benzen
sulfonilfluorur hidrocloric, sinonim AEBSF
hidroclorur); C, pepstatinei (X-Val-Val-Statil-Ala-
Statin).
 Echilibrarea gelurilor supuse focalizrii
izoelectrice n detergent (SDS)

Transferul gelurilor de poliacrilamid

supuse anterior separrii prin focalizare
izoelectric pe suprafaa gelurilor ncrcate
cu SDS n sistem orizontal

Transferul gelurilor de poliacrilamid

supuse anterior separrii prin focalizare
izoelectric pe suprafaa gelurilor ncrcate
cu SDS n sistem orizontal
 Avantajele electroforezei 2D n studiile de proteomic care
nu sunt uor furnizate prin abordri alternative include:
(1) maturitatea metodologiei;
(2) accesibilitatea;
(3) nalt transfer de prob;
(4) detectarea unor proteine post-translaional modificate,
inclusiv proteine fosforilate sau glicozilate;
(5) detectarea unor fragmente de proteine.

Este important s se recunoasc limitele electroforezei 2D n

cazul proteomicii. Acest lucru este crucial pentru ca
experimentele s poat fi proiectate ntr-un mod corespunztor.
n plus este necesar concentrarea ateniei asupra zonelor care
necesit o dezvoltare tehnic ulterioar
 (1) dificultile cu separarea proteinelor prin focusare izoelectric la valori extreme ale pH-
ului (<3, >10), mai ales a proteinelor bazice care reprezint o propor ie semnificativ din
proteomul predicionat total n cazul celor mai multe organisme eucariote. Proteinele bazice au
tendina de a forma dungi pronunate, mai degrab dect pete discrete, din cauza efectelor
electroendosmotice, a migrrii agenilor reductori, precum ditiothreitolul i datorit potenialei
hidrolize a acrilamidei la valori bazice de pH. Aceste efecte pot fi parial depite prin
alimentarea continu cu DTT n timpul focalizrii izoelectrice, combinat cu includerea de
glicerol sau izopropanol pentru a suprima electroendosmoza ori prin folosirea de agen i care
impiedica reformarea punilor disulfitice.

(2) dificulti cu separarea prin focusare izoelectric a proteinelor membranare,

hidrofobe;
(3) dificulti la separarea proteinelor foarte mici (<10 kDa) sau extrem de mari, cu
mase moleculare> 200 kDa;
(4) o insuficient sensibilitate a detec iei proteinelor. O provocare major pentru toate
tehnicile de proteomic este cea de dezvoltare a unor abordri analitice pentru a face fa
gamei dinamice mare a proteinelor de expresie.
 VARIANTE ALE ELECTROFOREZEI
BIDIMENSIONALE

Electroforeza bidimensional pe geluri de poliacrilamid n sistem BN/SDS

Electroforeza bidimensional pe geluri de poliacrilamid n sistem BAC/SDS

Structura chimic a detergentului cationic

clorur de benzildimetil-n-hexadecilamoniu
(BAC, 16-BAC) utilizat n BAC/SDS PAGE.
 Proteinele hidrofobe, precum proteinele legate de membran, se separ ntr-o prim
dimensiune pe un gel acid la un pH=2,1 n prezena detergentului cationic 16-BAC, cnd
pironina Y este utilizat drept marker de migrare electroforetic i de finalizare a separrii.
Urmeaz apoi o electroforez n prezen de SDS. O rezoluie decent se va ob ine dac profilul
de separare n 16-BAC difer difer n mod substanial fa de cel ob inut n prezen de SDS.

Structura chimic a compusului

Pironin Y, utilizat ca marker de
migrare i finalizare a separrii n
BAC-PAGE.
 ELECTROFOREZA PREPARATIV

recuperarea proteinelor dintr-un gel de poliacrilamid este de o

importan crescnd. Pentru a obine o rezoluie i o
recuperare optim a componentelor int prin aplicaii
preparative ale electroforezei pe gel este necesar o alegere
cu grij a urmtorilor parametrii: compoziia i concentraia
gelului, dimensiunile lui, ncrcarea probei, gradientul de
voltaj, durata electroforezei i viteza de migrare
1. amestecul de proteine (sau de ali macroioni) este n primul rnd
separat prin migrare electroforetic pe un gel de poliacrilamid; n
continuare zonele sunt localizate, decupate, mrun ite iar materialul
este apoi eluat sau eliberat din gel prin migrare electroforetic.

2. compuii care sunt separai pe un gel cilindric sunt

lsai s migreze pn la captul gelului, ntr-o camer de
unde sunt eluai cu un tampon de (eluie) transport ctre
un monitor UV i n continuare ctre un colector de
fraciuni. Tamponul de eluie poate fi livrat pentru sisteme
att continue, ct i discontinue (eluie intermitent).
 3.9.1.1. Electroeluia proteinelor din gelul de poliacrilamid
Electroeluia, ca metod de recuperare a proteinelor din geluri excizate, dup PAGE, devine
din ce n ce mai popular datorit excelentei recuperri i reproductibilit ii crescute, fr a se
utiliza un sistem ori un aparat scump.
3.9.1.2. Factorii care afecteaz recuperarea proteinelor din gel.
n tehnologia de electroeluie a proteinelor din gel, dup PAGE, eficiena de recuperare
depinde de:
(1) gelul de concentrare i sistemul tampon (pH, putere ionic, prezena/absena agenilor
disociativi) din PAGE;
(2) sistemul tampon pentru electroeluie, tensiunea aplicat i timpul de eluie
(3) natura proteinelor individuale care urmeaz s fie recuperate, de exemplu, pI i masa
molecular.
Condiiile optime ale PAGE i ale electroelu iei ulterioare, nu sunt neaparat valabile pentru
toate proteinele. Ele depind de tipul de protein motiv pentru care condiiile corespunztoare
fiecrei specie proteic trebuie s fie determinate individual, n experimente preliminare.
Alegerea concentraiei de gel i sistemul tampon se examineaz n detaliu pentru fiecare protein.
 n general, sistemul de tampon pentru electroelu ie este n concordan cu tamponul
pentru PAGE ori este oarecum modificat. Sistemele tampon pentru PAGE pot fi
clasificate n cele realizate pentru condiii nedisociative ori disociative. n condiii
nedisociative, n cazul n care proteina de interes i poate menine, probabil, activitatea
biologic, natura intrinsec a proteinei (pI, masa molecular, hidrofobicitatea, etc.)
definete sarcina net i solubilitatea proteinei n mediul tampon dat. Prin urmare, ar
trebui s fie evitate utilizarea de tampoane de electroelu ie la pH-uri din jurul pI a
proteinei analit, deoarece migrarea electroforetic a proteinelor ncetinete considerabil
la pI ca urmare a pierderii sarciniielectrice nete, iar uneori, multe proteine precipit n
matricea de gel, rezultnd astfel un randament sczut de protein extras, chiar i dup o
electroeluie prelungit.
Pentru o electroeluie eficient a proteinelor, pH-ul tamponului de electroelu ie
trebuie s difere cu cel puin o unitate de pH fa de pI-ul proteinei, att timp ct se
conserv activitatea biologic n condiiile date.
 Proceduri premergtoare electroeluiei

Localizarea proteinei de interes

Pretratamentul gelului excizat- piesa excizat de gel
este scufundat n tampon de electroeluie i
echilibrat pentru cteva minute, nainte de eluare
Metode de electroelutie
Capturarea proteinei eluate pe membrane
semipermeabile

Electroeluia n tuburi de dializ

 Metod Prob i cantiti (exemple) Tip PAGE Tampon de eluie Putere electric
Membran
Tub de dializ - + SDS fosfat de sodiu, 0,1M (pH=7,4)-SDS, 20-200 V (100mA)
0,1%
Vertical Hemoglobin/DNP-albumin; - SDS, T%=7,5% Tris, 12,5mM-glicin, 96mM 25-35 mA per tub
globulin marcat fluorescent, etc (pH=8,3) (140-180 V)
7-20 mg (cca. 2 ml)
Vertical dimer -tubulin marcat + SDS, T%=5-10% 2.5 mM Tris-glycine (pH 8.3)- SDS, 1-2 mA per tub
fluorescent, etc. 0.1% (350-400V)
ca. 1 mg
Orizontal Proteine de membran, colorate + SDS, T% = 8,75% Tris, 25mM- glicin, 192mM 10 V/cm (70 mA)
(Mr=3000-19000) (pH=8,3) SDS, 0,l%
Pasaj H-2Kk radiomarcat (Mr=12000- + SDS, gradient, T% = 5- NEMb 50mM -acetat (pH 8.5)- 1 W (4-7mA)
68000) 20% 0.001% SDS

Pasaj protein radiomarcat (Mr=65000) + SDS NH4HCO3, 50mM-SDS, 0,1% [Tris- 50 i 80V
1g-1mg acetat, 50mM (pH=7,8) SDS, 0,1%c]

Gradient discontinuu de ATP-citrat liaz colorat i proteine + SDS Tris, 25mM-glicin, 75mM (pH=8,8) - 4,0 mA
conductivitate colorate DTEd 1mM-glicerol, 40%. Captare:
0,1-0,5g (dou fragmente de gel) NaCl, 2M

Stivuire n stare staionar Hormon de cretere uman - SDS, T%=6% Electroforez zonal multifazic. 6-7mA/cm2, apoi 3-
radiomarcat Sistem tampon 2950.0.X 3,5mA/cm2

Stivuire n stare staionar, Proteina de legare a retinolului + SDS, T%=15% Le: NEM, 23mM- HCl, 10mM 4 mA per tub
cu Sephadex G-25 0,3-4mg (1-5ml) (pH=8,0);Tf: Tris, 30mM-6ACAg,
500mM (pH=9,1) SDS, 0.1%
Sh: Tris, 3 mM-6ACA, 50 mM
(pH=9,1)- SDS, 0.1%

Stivuire n stare staionar, Albumin necolorat, etc. (cca. +/- SDS Pentru geluri alcaline, L: Tris, 378 250-300 V
cu ionului frontal 0,5ml de gel) mM HCl, 124mM (pH=8,5)-
concentrat sucroz, 10%; T: Tris, 2,5mM-glicin,
10mM (pH=8,5)
 Eluia acizilor nucleici din geluri de agaroz

Reprezentarea schematic a protocolului de extracie a

fragmentelor de ADN dup electroforez pe gel de agaroz
ELECTRODIALIZA PREPARATIV A
PROTEINELOR DIN GELURI DE AMIDON

Prezentarea schematic a aparaturii

utilizate la electrodializa gelului de amidon.
Se observ sacul de dializ suspendat n
tamponul din rezervor. n detaliu se
prezint fragmentele de gel de amidon
aflate ntr-un sac de tip plas, introdus n
sacul de dializ
 GELURI COMPOZITE DE
AGAROZ/POLIACRILAMID
Dei cel mai mic procent de acrilamid care permite gelificarea este de aproximativ
3% (concentraie sub care polimerul rmne sub form lichid), n realitate, gelurile
de acrilamid realizate cu mai puin de 4% acrilamid:bisacrilamid sunt extrem de
dificil de manipulat. Cu toate acestea, tehnica PAGE n condi ii nedenaturante s-a
dovedit a fi cea mai efectiv n caracterizarea unor interac ii protein-DNA ori
interacii protein-RNA, n mod clar datorit caracteristicilor de sarcin electric
favorabil, adic, datorit sarcinilor preponderent negative ale acizilor nucleici
oligomerici. n astfel de studii, activitatea potenial de legare a DNA sau RNA de
proteinele de recunoater este monitorizat ca o schimbare a mobilit ii electroforetice
a acidului nucleic marcat, fie izotopic, fie fluorescent

Reprezentarea schematica a unei

matrice compozit, agaroz-
poliacrilamid. Fibrele groase de
agaroz sprijin structura fragil de
poliacrilamid, foarte puin
concentrat. Astfel de matrici
compozite permit o rezoluiei fin a
Demonstrarea triei mecanice a unui gel compozit.
 IZOTACOFOREZA
Izotacoforeza sau electroforeza de dizlocuire, dup cum a fost denumit la un moment dat, este o
dezvoltare mai recent a principiului descris n 1920, fiind o metod de separare n func ie de
sarcina electric. Ea se utilizeaz pentru separarea particulelor care se deosebesc n special prin
ncrctura electric net i nu prin dimensiuni fizice, vitezele de separare ale frac iunilor din
prob, dup ce separarea este complet, cnd s-a atins o stare de echilibru, sunt egale, de unde i
denumirea acestei metode. n aceast tehnic electrolitul dintre cei doi electrozi nu este o singur
soluie uniform, ci este format dintr-o secven discontinu de solu ii diferite ( figura de mai
jos), n care ionii acestora migreaz cu aceea i vitez (iso = egal, tachos = vitez, phoresis =
migrare).
Izotacoforeza este similar stivuirii, concentrrii n faza sta ionar sau
electroforezei zonale n sisteme multifazice. n practic, totu i se face distinc ie
ntre aceste metode. Concentrarea n faza sta ionar se realizeaz n dou moduri:
Concentrarea selectiv (selective stacking) prin care componentul/componentele
de interes sunt incluse n fronul mobil, iar celelalte componente rmn n afara
acestuia (unstacked). Este de altfel cazul izotacoforezei;
Excluderea selectiv (selective unstacking) prin care componentul/componentele
de interes sunt excluse selectiv din frontal mobil, iar celelalte componente sunt
incluse n acesta.
Utilizarea unui contraion comun de tamponare, care definete pH-ul i, prin
urmare, mobilitatea efectiv precum i ordinea de migrare a zonelor n starea
staionar, sub form stivuit reprezint o caracteristic a separrii
izotacoforetice. Acest proces este de altfel reprezentativ sistemului
discontinuu de electrolii din stadiul de concentrare (stivuire) descris de
Ornstein (1964) i Davis (1964). n ultim instan aceast procedur este un
proces de izotacoforez. Totui, n disc-electroforez, analiza efectiv este
derivat din a doua etap, care este o electroforez zonal, procesul
izotacoforetic fiind folosit n acest caz, pur i simplu pentru a concentra zonele
de proteine, n scopul mbuntirii rezoluiei de separare n etapa a doua, de
electroforez zonal.
De multe ori prin izotacoforez se subnelege numai tehnica capilar, dar
procesul se poate realiza i n geluri de poliacrilamid ori agaroz, geluri cu
porii mari, i n astfel de condiii se pot separa proteine cu masa molecular
de pn la 500.000 Da.
 CARACTERISTICILE PROCESULUI DE SEPARARE PRIN
IZOTACOFOREZ

Migrarea tuturor ionilor se realizeaz cu aceeai vitez;

Separarea componentelor se realizeaz sub un model de tren
ionic;
Apariia efectelor de ngustare a zonei;
Efectele de reglare a concentraiei.
Principala pre-necesitate pentru o separare izotacoforetic este
sistemul dicontinuu de tampon care conine un electrolit frontal
i unul, terminal. Dintre anionii din prob care se doresc a fi
determinai anionii frontali trebuie s aib cea mai mare
mobilitate iar anionii terminali trebuie s aib cea mai mic
mobilitate dect componentele probei.
 Separarea componentelor printr-un model de tren ionic

Deoarece toi ionii sunt forai s migreze cu aceea i vitez, tria

cmpului electric este mai mare n aria ionilor cu mobilitate mai mic
i este mai redus n domeniul ionilor mai mobili. n timpul acestei
migraii se formeaz zone pure alturate ale probei alctuite din
analii individuali. La echilibru, ionul cu cea mai mare mobilitate
migreaz n front, ceilali migrnd n spatele lui n ordinea scderii
mobilitii:
mL->mA->mB->mT-

unde m reprezint mobilitatea, L-, simbolizeaz ionul frontal, T-, ionul

terminal, A- i B- fiind ioni din cadrul probei. Zona cu cea mai mare
mobilitate posed cea mai mic trie a cmpului electric, iar zona cu
cea mai mic mobilitate prezint cea mai nalt trie ionic a
cmpului. Produsul triei ionice i a mobilitii fiecrei zone este
astfel constant
Schema de principiu a unui ansamblu izotacoforetic de tip
analitic
 APLICAII ALE IZOTACOFOREZEI

Izotacoforeza este utilizat frecvent n separarea i detec ia anali ilor ntr-o gam larg de
aplicaii de la cele farmacologice i genetice pn la analiza i depistarea unor toxine din
alimente. Detecia, n ITP poate fi realizat prin msurarea schimbrilor de conductivitate, de
absorban UV sau de intensitate a fluorescenei.
Identificarea este de obicei procesul de determinare a identitii unuia sau a mai multor
analii care au provocat o schimbare observabil n semnal la detector. Acest proces poate fi
dificil atunci cnd exist mai muli analii de interes ale caror proprietati nu sunt apriori
cunoscute. Pentru astfel de aplicaii, identificarea trebuie s se bazeze pe o abordare mai general
a caracteristicilor fizico-chimice, precum masa, sarcina electric, constantele de disociere, sau
mobilitile electroforetice

Aplicaii ale izotacoforezei n separarea penicilinelor.

Izotacoforeza analitic. Acidul ascorbic (vitamina C, figura A) este prezent n
mod natural n multe alimente i deseori adugat n altele. Ocazional, se
utilizeaz izomerul mai ieftin, acidul izoascorbic (figura B), care nu are
aciune vitaminic, fiind distinctibil fa de izomerul natural prin diverse
metode analitice, printre care i prin izotacoforez. Panelul (a) arat analiza
unei probe comerciale de suc de fructe n timp ce panelul (b) arat acelai
suc de fructe la care s-a adugat o cantitate cunoscut (4 nmoli) de acid
izoascorbic.
Un dispozitiv care pune n aplicare
microchip-ul izotacoforetic dotat cu
un sistem de detecie prin
fluorescen indus de laser.
 AVANTAJELE IZOTACOFOREZEI
Izotacoforeza este o tehnica electroforetic neliniar utilizat
la separarea unei mari varieti de compusi ionici, de la
molecule mici, cum ar fi ionii de metal, ori pentru separarea
unor moleculele mari precum proteinele.
Spre deosebire de electroforeza "liniar", n care se separ
benzile de solut n zone continue i care se disperseaz prin
difuziune sau dispersie, izotacoforeza formeaz zone auto-
ngustate, adiacente, de substan pur din soluie a crei
concentraie depete adesea domeniul de mg/ml.
 ELECTROFOREZA CAPILAR

Electroforeza capilar (capillary electrophoresis, CE), s-a dezvoltat ca tehnic la sfritul anilor
1980 i a crescut constant n popularitate de atunci. n forma sa cea mai simpl i mai frecvent
utilizat, CE reprezint o ntoarcere la metoda original descris de Tiselius, dar popularitatea sa
nu se bazeaz numai pe aceast simplitate inerent, ci i cu privire la avantajele suplimentare
date de vitez, versatilitate i costuri reduse. Fiind n esen o metod analitic, ea i-a gsit
aplicabilitatea n separarea biopolimerilor, cum ar fi peptide, proteine, oligonucleotide, ioni de
metale i ioni anorganici, precum i n analiza de produse farmaceutice ori n monitorizarea
calitii apei

ELECTROFOREZA CAPILAR ESTE O METOD DE SEPARARE A

COMPONENTELOR UNUI AMESTEC LICHID PE BAZA MOBILITI LOR
DIFERITE N INTERIORUL UNUI CMP ELECTRIC.
ACEAST METOD SE APLIC LA MOLECULE CARE POSED
SARCIN FIE POZITIV, FIE NEGATIV I CARE MIGREAZ NTR-UN
CMP ELECTRIC CU VITEZE DIFERITE.
SEPARAREA DIFERITELOR COMPONENTE DINTR-UN AMESTEC ESTE
DEPENDENT DE TIMP I DEPINDE DE DOI FACTORI PRINCIPALI:
MOBILITATEA ELECTROFORETIC I FLUXUL
ELECTROENDOOSMOTIC.
 Parametrii de migrare n electroforeza capilar

(1) Mobilitatea electroforetic efectiv. Mobilitatea (migrarea)

electroforetic efectiv se refer la micarea de moleculele
ncrcate electric ntr-o soluie de electrolii considerat a fi
"imobil", spre electrodul de semn opus. ntr-adevr, o molecul
ncrcat, ntr-un cmp electric, este supus la o for care este
proporional cu sarcina efectiv a acestuia (q) i cmpul electric
care este aplicat (E). Speciile neutre nu sunt separate cu excepia
cazului n care exist unele asocieri cu ionii de electrolit n sine,
care s conduc la diverse fore atractive. Mobilitile diferite
sunt desemnate ca (+) sau (-) n funcie de sarcina pe care o
poart moleculele. Pentru speciile care nu au o sarcin net,
mobilitatea este zero.
(2) Mobilitatea aparent. Mobilitatea aparent corespunde vitezei
efective de migrare a moleculelor din interiorul capilarului. Ea
reprezint suma mobilitilor electroforetice ale unei specii de
molecule i a fluxului electroosmotic. Astfel, n electroforeza
capilar, timpul necesar pentru un solut s migreze depinde de
mobilitate sa electroforetic i de mobilitatea fluxului.
(3) Injecia probei. n electroforez capilar, exist dou modaliti
principale pentru injectarea probei: injecia hidrodinamic i
electromigrarea. Injectare hidrodinamic poate utilizea presiunea sau
vacuum-ul. Ea nu poate fi utilizat pentru electroforeza capilar n gel
sau n prezena unor soluii tampon vscoase, care necesit perioade
mai lungi de injectare. Injecia la presiune este metoda cea mai
comun n care volumul de injecie este limitat la 1-2% din volumul
total al capilarului. Injectarea poate fi realizat prin presiune
gravitaional, aceasta fiind o metod care const n ridicarea pur i
simpl a probei. Metoda permite ajustarea volumului de prob care
poate fi injectat cu o precizie mai mare dect cea realizat la
presiune/vacuum. Metoda electromigrrii este mult mai puin
frecvent.
 APARATURA UTILIZAT N
ELECTROFOREZA CAPILAR

Schema de principiu al unui aparat de electroforez

capilar. Sunt prezentate prile principale ale
sistemului. Liniile continue indic condiiile de
separare, n timp ce liniile discontinue indic condiiile
de injecie electrocinetice.
 ELECTROENDOSMOZA N ELECTROFOREZA CAPILAR
n condiii ideale de electroforez n absena oricrui mediu suport, mobilitatea oricrui ion
este guvernat de fora de propulsie generat de cmpul electric iar efectul de ntrziere este
rezultanta vscozitii sale, care, n termen general este o funcie de masa molecular i
forma sa. n aceste condiii, seciunea transversal mic a tubului capilar aduce n discu ie
fenomenul de electroendosmoz, proces u or ignorat n electroforeza convenional.
Electroforez capilar se realizeaz n mod normal n tuburi capilare fabricate din silice
topit. Gruprile silanol negative prezente n acest material dau natere unei suprafee
ncrcate cu sarcin negativ (cu potenial zeta, ), care este responsabil de fenomenul de
electroendoosmoz. Aceast suprafa ncrcat cu sarcin conduce la o distribuie distinct
a speciilor cationice din oricare soluie ionic aflat ntr-un tub capilar

Electroforeza capilar zonal: (a) mecanismul de

separare prin care se arat mobilitatea
electroforetic a ionilor pozitivi (M+) i a celor
negativi (M); N reprezint o molecul neutr.
(b) Ordinea de migrare a ionilor.
 VARIANTE ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE
Ca tehnic de diagnostic, electroforeza capilar se bazeaz pe diferena de mobiliti ntre dou substane
distincte supuse unui cmp electric. Prin urmare, ea este complementar cromatografiei lichide i joac un
rol important n cadrul diferitelor tehnici analitice disponibile n prezent.
Electroforeza zonal capilar
Electroforeza zonal capilar (CZE) este cea mai simpl form de electroforez, fiind n esen o
electroforez n mediu liber unde migrarea analiilor n soluie, realizat sub influen a unui cmp electric,
este afectat de raportul sarcina biomoleculei/mrimea ei, fiind opus for elor fric ionale din solu ia de
electrolit.

Focalizarea izoelectric capilar

Focusarea izoelectric este o tehnic bine-stabilit pentru separarea moleculelor amfotere precum sunt cele
ale proteinelor i care poate fi uor adaptat la mediul capilar. Tehnica se bazeaz pe formarea unui gradient
de pH prin utilizarea unor molecule amfotere cunoscute sub denumirea de amfoli i, compu i, n general
caracterizai drept poliamine sntetice alifatice ori acizi polcarboxilici sau polisulfonici. Aplicarea unui cmp
electric la un amestec de amfolii conduce la formarea unui gradient de pH dup cum amfoli ii se a eaz ntr-o
ordine conform punctului lor izoelectric. Amfoliii sunt inui n mediul suport prin utilizarea unei solu ii
catodice cu pH nalt (obinuit hidroxid de sodiu) i o soluie anodal cu un pH sczut precum cea de acid
fosforic. Dup cum proteinele sunt molecule amfotere, ele vor avea un comportament de manier identic i
vor fi concentrate ntr-o poziie dictat de punctullor izoelectric. Rezolu ia nalt asociat cu aceast metod
este datorat de faptul c o molecul amfoter care difuzeaz din pozi ia ei corespunztoare, n zone cu pH
mai mare sau mai mic este readus la linia de baz corespunztoare pH-lui ei izoelectric.
 Cromatografia electrocinetic capilar micelar

Una dintre limitrile evidente ale electroforezei este c, aproape prin definiie, gama de
molecule care pot fi separate este limitat la acele care pot transporta o sarcin electric.
Cromatografia electrocinetic capilar micelar este o versiune a electroforezei capilare care
combin fenomenul de curgere electroendoosmotic, cu o form de cromatografie de partiie
pentru a extinde gama de molecule care pot fi separate pentru a le include i pe cele care nu
posed sarcin. Dup cum s-a artat mai sus, potenialul zeta de pe peretele unui capilar
neacoperit combinat cu diametrul mic al acestui capilar, n sine, duce la producerea unui
flux electroendoosmotic semnificativ.
Cromatografia electrocinetic
capilar micelar. Micelele ncrcate
negativ sunt atrase spre anod, dar,
datorit marii amplitudini a curgerii
electroendoosmotice are loc o
deplasare nspre captul catodic al
capilarului. Moleculele ncrcate
pozitiv sunt retardate (ntrziate) prin
asocierea cu micelele ncrcate
negativ; moleculele neutre posednd
o mobilitate intermediar se
partiioneaz ntre fazele micelar i
electrolit n timp ce moleculele
APLICAII ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE

Analize genetice;
Analize de produse farmaceutice (care conin baze
azotate);
Produse farmaceutice care conin centre chirale
(enantiomeri);
Analize ale unor contra-ioni n dezvoltarea unor noi
medicamente;
Caracterizarea unor proteine i a unor proteine
terapeutice;
Analiza de carbohidrai pentru determinarea
modificrilor post-translaionale.
 ELECTROFOREZA DE AFINITATE
Electroforeza de afinitate, n sens larg, include toate metodele utilizate n biochimie i
biotehnologie n care un anumit tip de interaciune specific are loc ntre un component
din proba supus electroforezei i un alt component prezent n constituia mediului
suport, denumit ligand specific. Cu ceste metode, unele nrudite cu imunoelectroforeza,
altele, cu cromatografia de afinitate, se detecteaz componentele dintr-o prob care
prezint afinitate pentru un ligand, se determin omogenitatea sau heterogenitatea
legrii componentului/componentelor de ligand, modificrile induse de diverse
tratamente i uneori cantitatea de component/componente care leag specific ligandul,
sau se elfectueaz studii cantitative privind formarea complexelor component-ligand (n
spe, protein-ligand).
Ligandul poate fi liber sau imobilizat n mediul suport. Dac masa sa molecular este
foarte mic n raport cu masa molecular a proteinelor int, modificrile electroforetice
vor fi relativ mici sau chiar neglijabile, n special dac i sarcina ligandului este mic
sau zero (de exemplu substratele cu mas molecular mic i inhibitorii enzimatici).
Efectele asupra mobilitii electroforetice vor fi mai evidente dac ligandul i proteinele
int sunt cu mase moleculare relativ apropiate, sau dac ligandul are fie o sarcin
electric mare, fie o structur ramificat, care s permit interac iunea simultan cu mai
multe molecule int de proteine. n aceste cazuri interaciunea se va concretiza printr-o
scdere sau cretere semnificativ a mobilitii electroforetice a proteinelor sau prin
apariia unui precipitat.
 IMUNOELECTROFOREZA
Imunoelectroforeza reprezint o metod care combin electroforeza n mediu
stabilizat cu reacia antigen-anticorp. Aceast asociere, ntre rezoluia proprie i
specificitatea reaciilor imunochimice, permite caracterizarea calitativ i cantitativ
a amestecurilor complexe de proteine. Imunoelectroforeza este o denumire
generic pentru o serie de metode biochimice de separare i caracterizare a
proteinelor care au la baz preocedee electroforetice i reacii cu anticorpi. Toate
variantele de imunoelectroforez necesit imunoglobuline, anticorpi care
reacioneaz cu proteinele separate sau caracterizate.
Ilustrarea principiului care st la baza
utilizrii fenomenului de imunodifuzie i
imunoelectroforez. ntr-o matrice de gel,
n care este stabilit un gradient de
concentraie de anticorpi care scade liniar
ntr-o direcie dat, iar concentraia de
antigen crete n gradient din direcie
opus, se va forma o band de precipitat
perpendicular pe direcia gradientului, ntr-
un punct de concentraie a antigenului
respectiv a anticorpului aproximativ egal.

Cnd sunt prezeni la concentraii aproximativ egale, antigenul i anticorpul vor precipita
ca un agregat
Toate aceste posibiliti stau la baza diferitelor metode apar innd de
electroforeza de afinitate. Cele mai cunoscute metode sunt :
Imunoelectroforeza ncruciat;
Imunoelectroforeza tip rachet;
Imunoelectroforeza zonal;
Electroforeza ncruciat;
Imunoafinoelectroforeza ncruciat;
Afinoelectroforeza bidimensional;
Afinoforeza;
Electroforeza de afinitate propriu-zis (care este asemntoare ca
principiu cromatografiei de afinitate).
 ELECTROIMUNOANALIZA MONODIMENSIONAL

Electroimunoanaliza monodimensional (sinonime: imunoelectroforeza tip rachet, cu

peak-uri, electroimunodifuzia, electroforeza ncruciat simpl). Antigenul, aplicat ntr-o
n godeul gelului plac, este forat imediat spre gelul care conine anticorpi, conurile
(rachetele) formate au o suprafa aproape proporional cu cantitatea de antigen.
Lungimea conului (peak-ului) va da, n general, o aproximare suficient de exact a
concentraiei de antigen

Reprezentarea schematic a tehnicii

de electroimunoanaliz i imaginea
unui gel dup imunoelectroforez tip
rachet.

Prin compararea nlimii rachetei din probele de testat

(necunoscute) cu cele formate de standardele cunoscute, dilutate
corespunztor, se pot determina concentraiile unor antigeni
specifici. n acest scop se realizeaz o curb semilogaritmic log
concentraie proteic de antigen (dat n mg/ml sau U.I./ml) i
nlimea rachetelor (dat n mm).
ELECTROIMUNOANALIZA BIDIMENSIONAL

Imunoelectroforeza ncruciat a unor

antigene i a unui antiser. ntr-o prim
dimensiune proteinele sunt separate
printr-o electroforez de tip standard.
Proteinele astfel separate sunt supuse
unei migrri ntr-o a doua
dimensiune, la un unghi de 90 fa
de prima dimensiune. Gelul conine n
a doua dimensiune un antiser, care
genereaz un model de
imunoprecipitare ca cel prezentat n
figur.
 Tampoane utilizate n imunoelectroforez
acid 5,5-dietilbarbituric/5,5-dietilbarbiturat de sodiu

Aditivi utilizai n imunoelectroforez

Prezena sau absena unor cationi bivaleni sau a unor agen i complexan i
n sistemul electroforetic este de mare importan. Astfel, prezen a Ca 2+
conduce la obinerea unor linii de precipitare mai ascu ite n multe
sisteme antigen-anticorp n conformitate cu tehnica descris de Laurell.
De mai mare importan sunt ns diferenele calitative (zone mai clare i
mobiliti relative modificate) observate n electroforeza dup adugarea
sau eliminarea Ca2+, din cauza faptului c acesta modific afinitile
multor proteine pentru cationi bivaleni. De regul, se utilizeaz 1-2 mM
lactat de calciu.
 Aplicaii ale imunoelectroforezei calitative i cantitative
Imunoelectroforeza calitativ se utilizeaz la investigarea cre terii globulinelor gama. Astfel,
n cazul unei gamapatii monoclonale se constat cre terea unei proteine specifice (paraprotein).
Ea este n primul rnd remarcat prin electroforegram, dup care este identificat imunologic
cu un imunoser specific. Paraproteinele monoclonale sunt caracteristice mielomului multiplu.
Imunoelectroforeza cantitativ este o metod bazat pe o migrare asistat a antigenului,
putndu-se considera o variant a electroforezei de afinitate. Ea a fost introdus de Laurell
prin anii 1965-1966, fiind cunoscut drept imunoelectroforeza model Laurell sau
imunoelectroforeza tip rachet.
CONTRAIMUNOELECTROFOREZA
Contraimunoelectroforeza, denumit uneori i imunoelectroforez
suprancruciat este o tehnic de laborator utilizat la evaluarea legrii
unui anticorp de antigenul su. Metoda, care nu trebuie confundat cu cea
de imunoelectroforez ncruciat, este similar cu imunodifuzia, dar la
care se adaug un cmp electric aplicat unui mediu de difuzie, de obicei
un gel de agar sau de poliacrilamid.
Demonstrarea prezenei antigenului Australia. Dou seruri pozitive (Au) se
depun n godeurile situate la partea catodic, n timp ce anticorpul uman
anti-Au se introduce n godeurile situate pe partea anodal. Se observ c
reacia de identitate indic specificitatea reaciei antigen-anticorp
Cele trei principii ale imunoelectroforezei: A, Contraimunoelectroforeza dup
Bussard (1959): ntr-un gel de agaroz care manifest o electroendosmoz
mare, tamponul este stabilit la un pH=8,6, astfel c anticorpii nu posed nici
o sarcin net. Proba i anticorpii sunt plasai n godeuri i se mic unul fa
de cellalt: antigenele care posed sarcin migreaz electroforetic iar
anticorpii se mic prin intermediul fluxululuielectroosmotic. B, Electroforez
zonal/imunodifuzie n conformitate cu Grabar i Williams (1953): la nceput
se realizeaz o electroforez zonal ntr-un gel de agaroz, urmat de
difuziunea fraciuniilor de antigen spre anticorpul care se afl depus n
godeurile realizate paralel cu direcia cmpului electric; C, Tehnica tip
rachet, n conformitate cu protocolul dezvoltat de Laurell (1966), precum
i metodele conexe acestuia: antigenele migreaz ntr-un gel de agaroz,
care conine o concentraie determinat de anticorp. Ca i n metoda
contraimunoelectroforetic anticorpii nu posed sarcin datorit tamponului
 Imunoelectroforeza ncruciat. Tehnica a fost pus la punct de ctre Bog-Hansen, n
perioada 1973-1980 i este utilizat la separarea, identificarea i caracterizarea
glicoproteinelor cu ajutorul lectinelor i a anticorpilor specifici.
Metoda are aplicabilitate n cercetare (de exemplu la studiul interac iilor anticorpilor
monoclonali) ori n clinic (n laboratorul de diagnostic al maladiilor n care sunt implicate
glicoproteine anormale).
Afinoelectroforeza bidimensional. Tehnica are la baz acelai principiu ca i
imunoelectroforeza ncruciat, dar spre deosebire de aceasta anticorpii specifici se gsesc
ntr-o membran de nitroceluloz. Metoda se caracterizeaz printr-o rezolu ie foarte bun i
este o metod de perspectiv.
Afinoforeza. A fost pus la punct de ctre Shimura i Kasai. Tehnica are la baz
interaciunea dintre un ligand macromelecular solubil cu sarcin electric mare ( afinofor) i o
protein. Complexul protein-afinofor se remarc printr-o mobilitate electroforetic
substanial mai mare dect al proteinei libere.
Electroforeza de afinitate propriu-zis. Este analog cromatografiei de afinitate. n aceast
tehnic, ligandul este imobilizat ntr-un gel astfel c proteina int, n cursul electroforezei,
este mpiedicat i astfel ntrziat datorit interac iunii specifice.
Se poate remarca faptul c nu exist o delimitare net ntre variantele asemntoare
imunoelectroforezei i variantele asemntoare cromatografiei de afinitate, deoarece
imobilizarea ligandului, n cazul variantelor cromatografice nu este necesar s fie complet,
mai ales pentru liganzii mari.
 METODE DE DETECIE A PROTEINELOR DUP
ELECTROFOREZ MONO/BIDIMENSIONAL PE GELURI
DE POLIACRILAMID
Cutarea unor metode de a vizualiza proteinele
rezolvate prin electroforeza pe oricare suport, de la benzi
de acetat de celuloz la geluri de poliacrilamid dateaz de
la originile electroforezei n sine.
Odat cu introducerea disc-electroforezei, la
nceputul anilor 1960, cea mai frecvent utilizat coloraie a
proteinelor s-a realizat cu amido black. Cum nevoia de
metode de colorare cu sensibilitate nalt i colorare
uniform a crescut pentru a satisface cerinele de
cuantificare proteine n geluri, coloraia cu amido negru a
devenit improprie. Colorantul amido black nu are
sensibilitate necesar, calitatea variaz de la lot la lot iar de
multe ori proteinele se coloreaz multicromatic
 pentru vizualizarea proteinelor separate prin electroforeza pe
benzi de acetat de celuloz, Fazekas St Groth i colaboratorii
(1963) au testat sistematic un numar mare de tehnici standard de
colorare utilizate n industria textil convenabili ca poten iali
colorani ai proteinelor dup electroforez. n 1963 ei au introdus n
practica electroforetic un colorant acid, Coomassie Brilliant Blue
250, tradiional utilizat pentru colorarea lnei, colorant convenabil
din punct de vedere al gradului crescut de sensibilitate, a marii
intensiti a culorii i a absorbanei peakului. n anul 1965, Meyer i
Lambert au aplicat cu succes metoda de colorare cu Coomassie
Blue descris de St. Groth la detectarea unor proteine din saliv,
separate prin electroforeza pe benzi de gel din acrilamid. Succesul
experimentului de colorare i-a condus pe cercettori n a conchide
c "Commasie Brillant Blue i-ar putea gsi o aplicare n cadrul
investigaiilor altor fluide biologice prin electroforez n gel de
poliacrilamid".
 Metodele de detecie a proteinelor

Acestea includ protocoale bazate pe:

colorani organici;
sruri de metale anorganice;
marcare fluorescent de grup;
capaciti specifice de legare protein-ligand;
detecia unei activiti enzimatice;
colorare specific de grup:
o glicoproteine;
o fosfoproteine;
o lipoproteinelor
imunocolorarea cu anticorpi.
Alternativ, proteinele care sunt marcate cu izotopi, fie
nainte (pre), fie postelectroforetic pot fi vizualizate prin
utilizarea unor detectori autoradiografici i fluorografici
cu impresionarea unui film de radiaii X.
o metod special de detecie a proteinelor
depinde de numeroi factori, inclusiv, cel mai important,
modulul experimental abordat. Alte consideraii includ
uurina i reproductibilitatea procedurii de vizualizare,
precum i gradele de sensibilitate i de precizie
necesare n cuantificare.
Dei au fost descrise o multitudine de protocoale
de colorare-vizualizare a proteinelor/enzimelor, nici una
nu este total ideal, deseori fiind necesar utilizarea
combinat a tehnicilor de colorare a proteinelor i/sau
marcarea acestora.
Coomassie Brilliant Blue, un colorant anionic trifenilmetanic este utilizat n dou forme:
Coomassie R-250 (de culoare roie) i Coomassie G-250 (de culoare verde), ultimul
avnd dou grupri metil adiionale

n prezena unui mediu acid, aceti coloran i se leag de gruprile amino a

proteinelor prin interacii electrostatice i hidrofobe. n protocoalele originale
gelurile sunt plasate pentru o perioad de timp ntr-o soluie de colorare de 0,1%
colorant Coomassie dizolvat ntr-un amestec de metanol, 45% (v/v), ap, 45% (v/v)
i acid acetic 10%; background-ul se decoloreaz ntr-un amestec alctuit din
metanol, 25% (v/v), ap, 65% (v/v) i acid acetic 10% (deseori se utilizeaz acela i
amestec de solveni).
 ALI COLORANI ORGANICI UTILIZAI N EVIDENIEREA
POSTELECTROFORETIC

Fast Green FCF (food green 3), uor

de utilizat n densitometria cantitativ.

colorarea proteinelor n geluri de

SDS-PAGE comparabil ca
sensibilitate cu coloraia CBB:
utilizarea acidului 1-(2-hidroxi-4-
sulfo-1-naftilazo)-2-hidroxi-3-
naftoic (acidul calconcarboxilic,
NN).
 COLORAIA STAINS-ALL

o tehnic sensibil utilizat la caracterizarea electroforetic a gelurilor compozite de

agaroz-acrilamid, precum i a gelurilor de poliacrilamid care con in acid hialuronic. n plus,
Stains-all difereniaz fosfoproteinele, cum ar fi cazeina, de proteinele nefosforilate. Metoda
este potrivit pentru colorarea difereniat a acizilor nucleici i a proteinelor, dup cum
urmeaz:
ARN (albastru-violet),
ADN (albastru, abs=675nm),
proteine (rou, abs= aprox. 510nm),
mucopolizaharidele acide-culori variate.

Structura chimic a colorantulului cationic carbocianinic bromur

de (l-etil-2-[3-(l-etil-nafto[l,2-d]tiazolin-2-iliden)-2-
metilpropenil]nafto[1,2-d] tiazoliu, denumit colorant total sau
Stains-all (formula brut, C H BrN S
 COLORAIA CU CUPRU

Coloraia reversibil cu cupru este o metod realizat ntr-o singur etap pentru
detectarea rapid a proteinelor fracionate prin SDS-PAGE. n aceast tehnic nu
este necesar o etap de decolorare. Colorarea se bazeaz pe interaciunea ionilor
de cupru cu poliacrilamida i cu proteinele separate. Tehnica de colorare implic
precipitarea ionului de cupru n gel care astfel devine verde opac, n timp ce SDS
previne legarea ionului de cupru la proteine, rezultnd astfel o imagine negativ. n
final se evideniaz benzi clare de proteine pe un fundal semiopac albastru-verzui de
poliacrilamid. Benzile proteice sunt vizualizate n mai putin de 5 minute.
Sensibilitatea coloraiei reversibile este cuprins ntre 0,5ng i 12ng/band proteic.
Colorarea nu interfer cu tehnicile ulterioare de electroeluie a proteinelor i nu
modific proprietile biologice ale acestora.
Gelurile colorate reversibil cu ioni de cupru pot fi decolorate n 20-25 de
minute, nainte de transferul sau electroeluia proteinelor din gel. Un dezavantaj major
totui, este c aceast coloraie nu este compatibil cu gelurile native

n cazul BSA sensibilitatea metodei ajunge la 0,5-10 ng protein/band, frac iile proteice fiind vizibile
dup o separare pe un gel de poliacrilamid cu T=12%. n cazul gelurilor cu o concentraie mai mic de
12% sensibilitatea scade din cauza creterii dimensiunilor porilor, cu consecin n creterea procesului de
difuziune a benzilor de proteine.
 COLORAIANEGATIVIMIDAZOL-SDS-ZINC

Un complex al srii de zinc, al SDS i imidazolului precipit n gelul de poliacrilamid

i formeaz un background alb opac, dar care rmne incolor n prezen a spotului
proteic. Zonele proteice devin astfel vizibile ca un background nchis la culoare.
Sensibilitatea deteciei (care este de ordinul a ctorva nanograme) este cuprins ntre
cea a CBB i coloraia cu argint.
Evidenierea fosvitinei dup colorare reversibil cu imidazol-zinc
 Coloratia argentic (silver staining)

De 100 X mai sensibila decat coloratia cu

coloranti organici
Metoda simpla, ieftina. Se poate realiza
prin:
Reducere fotochimica
Formare de argint amoniacal
Metoda ce adimite supracolorarea
gelurilor colorate initial cu CBB
 COLORAIACUARGINT

Detecia proteinelor prin coloraie cu argint este larg utilizat deoarece

sensibilitatea ei este de aproximativ 1 ng per spot, costurile pentru reactivi
sunt relativ sczute i, dei presupune o procedur multistadial, rezultatele
sunt disponibile relativ repede.
Ideal spoturile sunt brun-nchise spre negru pe un background uor bej.

Principiul protocolului de colorare cu azotat de argint este urmtorul:

n prima etap proteinele sunt fixate;
SDS-ul i componentele tamponului sunt ndeprtate prin splare cu o
soluie de etanol, 40% i acid acetic, 10%.
Urmtoarea treapt combin legarea ncruciat a proteinelor din matricea
de gel cu ajutorul glutardialdehidei/formaldehidei i de sensibilizare cu tiosulfat de
sodiu n prezen de acetat de sodiu.
Dup un numr de splri cu ap distilat la intervale exacte de timp, gelul
se plaseaz ntr-o soluie care conine azotat de argint 0,25% i o cantitate mic de
formaldehid. Dezvoltarea se realizeaz cu formaldehid la o valoare bazic de pH,
creat cu ajutorul carbonatului de sodiu. Reacia este stopat prin plasarea gelului
ntr-o soluie de acid acetic, 5% ori ntr-o soluie de EDTA 1,5%.
 Fosfoproteinele
Colorare in rosu a proteinelor sub actiunea bromurii de 1
etil 2,3 (1 eilnafto-(1,2d) tiazolin-2-iliden)2-metil-
propenil-nafto-(1,2d)-tiazol denumit colorant total
Fosfoproteinele se coloreaza in albastru

Lipoproteinele
Precolorare cu Sudan Black

Glicoproteinele
Colorare cu sulfit de fucsina (reactiv Shiff) in conditii oxidante realizate cu
acid periodic;
Colorare argentica
Colorare cu Alcian blue (glicoproteinele acide)
Colorare cu izocianat de fluoresceina (FTIC)- lectinebenzi fluorescente
EZBlueGelStainingReagent
 COLORAIA FLUORESCENT

Coloranii fluoresceni prezint un mare domeniu de linearitate dinamic, de peste

4 ori magnitudine fa de coloraiile clasice, cu rezultate nalt reproductibile
deoarece coloraia fluorescent este o metod de tip endpoint. De la introducerea
colorrii cu Nile Red n ultimii ani, au fost dezvoltai o varietate de colorani cu
diverse i marcante sensibiliti i proprieti, precum familia coloranilor Sypro
(Orange,Red,TangerineiRuby)

Structura chimic a colorantului hidrofob

Nile red.
PREMARCAREA PROTEINELOR CU FLUOROFORI
Reprezentarea schematic a mbuntirii confidenei n schimbrile
de abunden a unor proteine. folosind tehnologia multi-fluorescent
DIGE.
 Ali fluorofori frecvent utilizai la marcarea
proteinelor nainte de electroforez includ:
clorura de 1-dimetilaminonaftalen-5-
sulfonil (dansil);
4-fenilspiro [furan-2 (3H)-l-ftalan]-3,3-
diona (fluorescamina);
2-metoxi-2,4-difenil-3-(2H)-furanona
(MDPF);
N-(7-dimetilamino-4-metilcumarinil)-
maleimida (DACM) (Yamamoto i colab.,
1978);
o-ftaldialdehida
Electrotrensferulproteinelorpemembrana(western
blotting,immunoblotting)-evidentiereaspecifica
TRANSFERUL PROTEINELOR DIN GELURI PE ALTE MEDII SUPORT
 Proteins migrate to the membrane
following a current (I) that is generated by
applying a voltage (V) across the
electrodes, following Ohms law:
V=IxR
where R is the resistance generated by
the materials placed between the
electrodes (that is, the transfer buffer, gel,
membrane, and filter papers)
 separarea amestecurilor de proteine pe baza
dimensiunilor utiliznd gel-electroforeza;
transferul eficient al proteinelor separate pe un
suport solid;
detectarea specific a unei proteine int cu
anticorpi corespunztori.
O prezentare general a procedurii de Western
Blotting. Separarea proteinelor din amestecuri prin
electroforez, transferul de pe gel pe o membran de
blott-are i detecia proteinei int, care devine vizibil
doar n faza final, dup cum se observ o band de
pe linia 3. Linia 1: standarde de mas molecular
precolorate. Liniile 2 i 3: amestecuri de proteine
O diagram care prezint o serie de aplicaii ale
proteinelor imobilizate
Schema logic a unei metode
de transfer a proteinelor de pe
gel pe membran urmat de
etapa de detecie
 ncrcare Tipul de legtur stabilit cu
Tip de membran
electric proteinele
Nitroceluloz Negativ Electrostatic/Interacie hidrofob
Acetat de celuloz Negativ Electrostatic
Celuloz
Pozitiv Electrostatic i covalent
diazobenziloximetilat
Nylon Pozitiv Electrostatic
DEAE-celuloz Pozitiv Ionic
Celuloz activat cu BrCN Covalent
Difluorur de poliviniliden Interacie hidrofob
Timp de transfer Peste noapte 1 or
Tensiune aplicat 30V 100V
Intensitate 90mA 350mA
Proteintransfersystems
 METODEDEDETECIEAPROTEINELORPEMEMBRANDUPTRANSFER
ELECTROFORETIC

Transferul proteinelor pe membran (denumit western blotting) reprezint o tehnic de rutin,

deosebit de utilizat n detectarea i caracterizarea proteinelor. Metoda prezint avantajul
specificitii anticorpilor care conduc la identificarea fr dubii a proteinelor dup separarea lor
prin electroforez pe gel de poliacrilamid i transferate pe o membran. Western blotting-ul
implic recunoaterea secvenial dintre trei componente: proteina int, anticorpul primar
care recunoate proteina int i un anticorp secundar care recunoate anticorpul primar i
genereaz un semnal detectabil. Dup legarea proteinelor la o membran, situsurile nelegate
sunt inactivate (membrana este blocat), incubat cu un anticorp primar, apoi cu un anticorp
secundar i n final, splat. Anticorpul primar se leag la proteina de interes n timp ce
anticorpul secundar este pregtit pentru detecie.
Anticorpul secundar poate fi marcat cu un radioizotop, un fluorofor, sau cu o enzim, n marea
majoritate peroxidaza din hrean (horseradish peroxidase- HRP) sau fosfataza alcalin (AP)
O lung perioad de timp, radioizotopii au reprezentat singura cale de marcare a probelor de
anticorpi secundari i astfel utilizai n aplicaiile de transfer ale proteinelor. Ultimii ani au
dezvluit noi metode mai puim periculoase i mai fezabile dect cele radioactive, care conduc la
rezultate comparabile n ceea ce privete sensibilitatea lor. Tehnicile curente de detecie dup
transfer pe membran includ metode bazate pe detecia emisiei de lumin (chemiluminiscen,
bioluminescen, chemifluorescen i fluorescen), detecie prin autoradiografie, ori
colorimetrie.
 Detecia prin chemoluminiscen

Chemiluminescena reprezint producerea unei cuante

de lumin detectabil rezultat n urma unei reacii
chimice. n detecia pe membrane de transfer, reaciile sunt
catalizate de ctre o enzim precum fosfataza alcalin ori
peroxidaza conjugat cu un anticorp. Semnalul luminos
poate fi capturat prim impresionarea unui film de tipul celor
utilizate la captura radiaiilor X sau de ctre sisteme video
de captare a imaginilor. Beneficiile detectrii semnalelor
chemiluminescente de ctre un sistem de preluare a
imaginilor sunt numeroase. Astfel, domeniul de linearitate
dinamic a sistemelor video este de 2 pn la 5 ori
magnitudine mai sensibile comparativ cu sistemele de
impresionare a filmului fotografic. Aceste sisteme video
digitale de preluare a imaginii ofer pe lng o sensibilitate
crescut i o economicitate n sensul eliminrii achiziionrii
continue de film ori consumabile de prelucrare al acestuia.
Tehnica chemiluminescent este uor de
adaptat la procedurile de western blotting
existente deoarece utilizeaz anticorpi
conjugai cu enzim, pentru a genera semnalul
luminos. Treptele de blocare i splare sunt
comune celor utilizate n n tehnicile de
western blotting. Cele mai multe metode
chemiluminescente necesit puine componente
necesare n generarea semnalului luminos. n
cazul chemiluminescenei luminolului,
substratul este oxidat chimic de ctre HRP cu
producia unui compus aflat n stare excitat.
n cele mai multe metode bazate pe oxidarea luminolului, semnalul
luminos se produce n momentul n care produsul excitat se ntoarce la
starea sa de baz. Semnalul este vizualizat prin expunerea membranei pe
un film foto sau prin utilizarea sistemelor de achiziie a imaginii. Pe
lng luminol sunt, disponibile comercial i alte substrate
chemiluminescent precum substratele bazate pe acridan (este cazul
Lumigen PS-3 (care utilizeaz AP sau HRP ca enzim reporter) ori
substraturi pe baz de 1-2-dioxetan (care utilizeaz AP ca enzim
reporter) Emisia de lumin poate fi crescut de pn la 1000 de ori prin
adugarea unor amplificatori cu structur fenolic. Amplificatorul difer
de tipul de kit utilizat. Detecia chemiluminescent prezint ca avantaje,
viteza i sensibilitatea. Timpul mediu de expunere de 30 secunde pn la
15 minute. Timpul scurt este principala mbuntire fa de metoda
bazat pe detecia cu 125I, care necesit pn la 48 de ore de expunere pe
film foto.
Prin aceast metod se pot detecta cantiti de
ordinul picogramelor de protein mai sensibile
dect majoritatea metodelor colorimetrice i
sunt aproximativ egale cu cele radioizotopice.
Este important a se nota c sensibilitatea
deteciei este oarecun dependent de afinitatea
antigenului i a anticorpilor primar i secundar
care poate varia considerabil de la o prob
proteic la alta. Detecia chemiluminescent nu
prezint n plus dezavantajul celei
radioizotopice n ceea ce prezint riscul de
expunere la iradiere, costul crescut n ceeea ce
privete msurile de protecie fa de
reziduurile radioactive n ceea ce privete
contaminarea mediului. Nu n ultimul rnd,
membranele utilizate n cazul metodelor
chemiluminescente pot fi utilizate de mai multe
ori prin splare i rebandarea proteinelor,
proces care nu este posibil n cazul tehnicilor
de detecie colorimetrice.
 Detecia prin bioluminescen

Membrana PVDF este

Bioluminescena este un fenomen de emisie de lumin de ctre
preferabil n detecia
multe organisme. Sistemele bioluminescente difer n structura i
bioluminescent deoarece
funcia enzimelor i cofactorilor implicai n proces alturi de
membrana de
mecanismul reaciilor de generare a luminii. Bioluminescena
nitroceluloz poate conine
poate fi exploatat ca metod de detecie pe membrane. Detecia
substane ce inhib
prin bioluminescen implic incubarea membranei care conine
activitatea luciferazic i
un antigen legat/complex anticorp-enzim n prezena unui
astfel sunt posibile
substrat bioluminogenic, cu msurarea simultan a luminii
interferene n analiz.
emise. Substratul n acest sistem de detecie este un derivat al
luciferinei. Detecia luminii este realizat ntr-o camer
fotoevideniere iar proteinele sunt vizualizate ca spoturi
luminoase. Din punct de vedere al sensibilitii i a vitezei de
realizare, tehnica este similar celei de chemiluminescen dar
nu este generalizat datorit numrului mic de substrate
bioluminogenice comercializate.
 Detecia chemifluorescent

Chemifluorescena reprezint a conversie enzimatic a unui substrat

ntr-un produs fluorescent. Compuii fluorogenici (substane
nonfluorescente sau slab fluorescente care pot fi convertite n produi
fluoresceni) sunt utilizai cu o mare varietate de enzime, inclusiv cu
AP ori HRP. Enzima cliveaz o grupare fosfat a unui substrat
fluorogenic cu producerea unui compus nalt fluorescent. Fluorescena
poate fi detectat prin utilizarea unui sistem de preluare a imaginii
astfel, cuantificat de ctre un program.
Chemifluorescena poate conduce la produi de reacie
fluoresceni stabili, astfel membranele pot fi analizate n
condiiiile de timp convenabile.
Metoda este compatibil pentru recolorri i splri.
 Detecia prin fluorescen

n cazul deteciei fluorescente, anticorpul secundar este

marcat cu un fluorofor precum fluorescein (FITC), Texas
Red, rhodamine (TRITC), ori R-phycoerythrin. Principalul
avantaj n detecia fluorescenei este faptul c domeniul
dinamic linear este de circa 10 ori mai mare dect n detecia
prin chemiluminescen cu o reducere a sensibilitii de
numai 24 ori.
Detecia fluorescent a proteinelor legate de
membrane poate conduce uneori la o mai bun
linearitate i la cuantificri mai bune n limitele
de detecie. Detecia fluorescent poate fi
deasemenea multiplex. Legarea mai multor
fluorofori colorai la diveri antigeni conduce
la detecia simultan a mai multor proteine int
pe aceeai membran.
 Autoradiografia

Pentru multe aplicaii radioizotopii pot fi utilizai pentru a marca probele

(n cazul membranelor rezultate din transfer este vorba de anticorpul
secundar) Radioizotopii cei mai utilizai n tiinele biologice sunt 35S,
32
P, 33P, 14C, i 125I. Pentru a detecta radioactivitea, metoda cea mai
utilizat este autoradiografia pe filme de radiaii X. Autoradiografia
conduce la o relaie bun ntre sensibilitate i rezoluie fr o investiie
mare. Pentru intensificarea semnalului autoradiografic se utilizeaz
scintilatori. Exist sisteme de analiz a fosforului care ofer o alternativ
la metodele de detecie pe film. Marele avantaj al metodei const ntr-o
relaie linear ntre intensitatea semnalului i cantitatea de protein.
 Detecia colorimetric

O serie de substrate sunt convertite la un precipitat colorat de ctre o

serie de enzime precum HRP ori AP, enzime uzual conjugate la
anticorpul secondar. Cele mai comune sisteme utilizeaz substraturi
precum 5-bromo-4- chloro-3-indolil fosfat/Nitroblue Tetrazoliu
(BCIP/NBT) pentru AP ori diaminobenzidina (DAB) sau 4-cloro-1-
naftol (4CN) pentru HRP. n momentul acumulrii de precipitat pe
band, se dezvolt un semnal colorat pe membran. Reacia enzimatic
poate fi monitorizat i stopat n condiiile n care semnalul are o
intensitate dorit pentru a preveni zgomotele de fond.
Metoda este cea mai simpl dintre toate tehnicile de
evideniere, semnalul detectabil fiind rodul legrii
anticorpului secundar la un anticorp specific proteinei
de interes
 Metodededetecieaproteinelor
duptransferulpemembran
Comparaientremetodelededetecieaproteinelorduptransferpemembran
 DETECTAREAENZIMELORNGELURI

Detectarea activitilor enzimatice dup electroforez n gel i stabilirea exact a benzilor

individuale proteice produse astfel datorit activitii catalitice specifice rmne o int
fascinant. Acest lucru a fost bine evideniat de numrul mare de studii focusate n acest scop. Cu
o vedere spre trecut este interesant de observat legturile intime dintre metodele de evideniere
postelectroforetice de cele histochimice din care, majoritatea metodelor de evideniere au
provenit. n acelai timp, noi enzime continu s fie descoperite, de unde noi probleme n
evidenierea lor postelectroforetic.
Singurele probleme sunt ntmpinate din cauza faptului c activitatea enzimatic trebuie
demonstrat dup rezolvarea gelului. Separarea proteinelor native care i menin activitatea
nativ n timpul procesului electroforetic este una din metodele posibile. Alternativ, separarea
poate fi realizat n condiii denaturante de exemplu n prezena dodecilsulfat de sodiu (SDS),
urmat de renaturarea n scopul recuperrii activitii enzimatice maxime. n orice instan,
activitatea poate fi determinat direct pe gel ori dup transfer pe un suport potrivit. Alegerea
tehnicii electroforetice specifice va depinde de proprietile individuale ale enzimelor, de ali
componeni ale probei ori de rezoluia maxim atins n condiii native deoarece proteinele
native nu pot fi la fel de bine rezolvate precum cele denaturate.
Astzi, detecia activitilor enzimatice sunt n mod uzual
realizate pe geluri plate verticale, mai mult dect pe geluri
cilindrice. Compararea proprietilor de migrare este mai uor
realizat i este de preferat n condiii identice, fa de cele
realizate n condiiile gelurilor cilindrice. Pe de alt parte,
acoperirea cu tampon-substrat care conine enzime auxiliare,
substrat, coenzime, ori ali cofactori necesari poate fi produs
maxim numai n cazul gelurilor plate, factori de asemenea
importani n detectarea activitii. Alternativ, transferul pe alte
membrane poate reprezenta o alt alternativ n evidenierea
postelectroforetic a activitilor enzimatice.
Separarea electroforetic a protein-enzimelor poate fi nsoit de dou trsturi diferite.
Este vorba de:
a.sarcina intrinsec a proteinei, proprietate ce poate fi utiliza n procesul de migrare
electroforetic, sau de
b.sarcina extrinsec, care poate fi indus prin utilizarea unui tampon/tratament adecvat.
Separarea pe baza sarcinii intrinseci, n electrolii cu o singur valoare a pH-ului ori
prin focusare izoelectric reprezint alegeri atractive din cauza faptului c astfel se menine
proteina n starea ei nativ, cu pstrarea activitii, ce poate n acest mod determinat direct.
Electrofocusarea este n particular utilizat deoarece prin ea se rezolv izoforme apropiate.
Separarea bazat pe sarcinile extrinseci are la baz denaturarea i legarea SDS la
situsurile hidrofobe ale proteinei. Pornind de la aceasta, treapta de maturare este necesar dup
electroforez.
 Electroforeza n prezen de SDS reprezint
una dintre cele mai comune forme de electroforez n
gel. Ea se bazeaz pe separarea n funcie de
mrimea proteinei la care domeniile hidrofobe ale
fiecrei molecule proteice interacioneaz cu catena
alifatic a SDS, care sunt repartizate ca sarcini
extrinseci pe ntreaga suprafa a proteinei.
Din nefericire, cele mai multe enzime sunt
inactivate de ctre SDS, numai un numr restrns
reinnd activitatea chiar n prezena detergentului.
 PREPARAREA PROBEI I ELECTROFOREZA EI

naintea oricrei separri i localizri este necesar a cunoate proprietile enzimei luate n studiu,
precum:
pH-ul optim,
necesitile n cofactori, inclusiv a unor activatori cationici i a cosubstratelor.
detergenii, agenii de oxidare sau ali factori detrimentali care pot influena activitatea
enzimatic precum pH-ul i mediul ionic trebuie monitorizai cu strictee, att n timpul
preparrii probei ct i n timpul procesului electroforetic.
Este bine de notat c prezena coloranilor de evideniere a migrrii pot ei nsui s denatureze
ireversibil o serie de enzime. naintea electroforezei este esenial a se determina concentraia
proteic i a se efectua un test convenabil al activitii enzimatice. O cantitate de 1 pn la 10 g
de protein pur reprezint optimul n timp ce amestecurile de proteine pot conine pn la 100
g.
Este important a alege o cantitate optim de soluie proteic care s prezinte o activitate bine-
decelat n urma procesului de evideniere postelectroforetic, o cantitate prea mic fcnd
dificil identificarea enzimei n timp ce o ncrcare mare va conduce la suprapunerea benzilor i
la o distorsiune a lor.
Electrofocusarea este pe departe mult mai sensibil la suprancrcare, dup cum proteina va
distorsiona n gradientul de pH.
n condiiile n care toate informaiile pertinente sunt obinute,
este necesar un experiment pilot n determinarea activitii
enzimatice. n acest scop, este preparat un gel care conine toate
componentele necesare n timpul procesului de separare
electroforetic. Proba este plasat ntr-un godeu i lsat s
difuzeze n matricea gelului, fr migrare electroforetic. Metoda
de detecie este astfel testat fr separare electroforetic, n
scopul stabilirii prezenei sau absenei agenilor denaturani ori a
inhibitorilor n gel.
Dac testele preliminarii relev o inactivare a enzimei,
trebuie aleas i testat o alt strategie de evideniere n scopul
meninerii activitii enzimatice n timpul procesului
electroforetic.
Cele mai comune i nedorite componente inhibitorii ale unei activit i
enzimatice analizate pe gel de poliacrilamid sunt:
iniiatorii reaciei de polimerizare, persulfatul i riboflavina,
monomerul de acrilamid nepolimerizat i
acidul acrilic, deseori prezent n amestecul de polimerizare. Exist o serie
de ci n limitarea a efectului acestor componente. De exemplu, pre-
electroforeza gelului de separare, singur, naintea polimerizrii gelului de
concentrare va elimina iniiatorii reaciei de polimerizare care au capacitatea
de a oxida gruprile tiol deseori implicate n actul catalitic.
O alt tehnic este aceea de a aduga acid cisteic la tamponul de migrare,
care va "cura" gelul de peroxizi datorit faptului c acest acid va migra
alturi de ionul lider, conductor.
Alternativ, gelurile subiri (de 1 mm sau mai mici) pot fi imersate i
umectate ntr-un tampon care conine ditiotreitol n scopul ndeprtrii
oxidanilor.
Eliminarea acidului acrilic poate fi realizat prin recristalizarea
monomerului de acrilamid chiar naintea polimerizrii.
 PRINCIPIILELOCALIZRIIIN SITUAENZIMELOR

Capturasimultanaprodusuluireacieienzimatice.
Produsul reaciei este cuplat cu un reactiv care
conduce la obinerea unui produs colorat.
Aceast tehnic este utilizat n toate cazurile n care
enzima rmne activ n prezena reactivilor de
colorare.
Marele ei avantaj este reprezentat de faptul c
procedura este realizat ntr-o singur treapt, fr o
difuzie substanial a enzimei n gel.
Postincubareacuplatasubstratului.
Aceast tehnic necesit o metodologie n dou trepte.
Incubarea enzimei prezente n gel cu substratul este urmat
de incubarea cu un reactiv ce permite formarea unui produs
secundar colorat i insolubil.
n cazul acesta, difuziunea se manifest n timpul perioadei
iniiale de incubare a gelului cu substratul.
Metode autocromice. Evoluia
activitii enzimatice poate fi
urmrit n mod direct prin
observarea modificrilor
proprietilor optice precum
absorbia luminii sau fluorescena,
produs de substrat sau de ctre
produsul de reacie. O serie de
substrate sau coenzime i
modific proprietile optice n
lumin vizibil sau ultra violet n
timpul reaciei enzimatice.
Schimbarea fluorescenei servete
de asemenea ca indicator n cazul
metodelor autocrome.
Analizaindicator-matrice.
Enzimele de cuplare auxiliare i substratele
cu mas molecular mare necesit o
incubare a gelului cu un strat care conine o
matrice indicatoare, un gel suplimentar,
indicator. Incubarea de tip sandwich a gelului
de separare i indicator conduce la
localizarea activitii enzimatice. O variant a
acestei tehnici o reprezint incubarea dup
separare cu o matri/membran pe care
proteina a fost transferat i imobilizat.
Astfel, dup separare, proteina este
transferat din gel pe membran prin tehnicile
descrise ca Western blotting.
Copolimerizarea substratului n gelul de separare.
Substraturile cu mas molecular mare precum polimerii
carbohidrai, proteinele sau acizii nucleici pot fi copolimerizai
n gelul de separare. Acest procedeu poate totui influena
separarea enzimei. n timpul electroforezei, activitatea
enzimatic poate fi stopat prevenindu-se astfel aciunea ei
asupra substratului, de exemplu prin utilizarea unor inhibitori
reversibili precum SDS. Dup separare, gelul este splat n
tampon fr detergent, ceea ce conduce la renaturarea sa.
O alt cale de prevenire a activrii enzimei n timpul
procesului de electroforez este reprezentat de incubarea
cu diveri ageni chelatori care leag ionii metalici eseniali.
Dup finalizarea procesului de separare gelul este incubat n
tampon care conine cationul esenial ntr-o concentraie mai
mare dect cea a agentului chelator, i prin aceasta se
restabilete activitatea.
 Oxidoreductaze-
Detecia direct a enzimelor NAD- i NADP-
dependente prin conversia coloranilor tetrazolici la
formazani

Aplicarea cu succes a acestei metode necesit ca sensul reaciei enzimatice s

conduc la oxidarea substratului cu reducerea concomitent a coenzimei
(formarea de NADH ori NADPH) Echivalenii de reducere sunt apoi transferai
spre colorantul tetrazolic, reacie de cele mai multe ori mediat de fenazin
metosulfat; astfel prin reducerea srii de tetrazoliu rezult formazan, colorat i
insolubil. Stoichiometria transferului necesit un echivalent de reducere la o
pereche de electroni transferai pentru formarea unui formazan din srurile
monotetrazolice i doi echivaleni pentru srurile ditetrazolice. Astfel, srurile
monotetrazolice precum MTT (bromur de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazoliu, tiazolilblue) sunt mult mai sensibile dect srurile de srurile
de ditetrazoliu. De exemplu, NBT (clorura de 2,2'-di -p-nitrofenil-5,5'-difenil-3,3'-
(3,3'-dimetoxi-4,4'-difenilen) tetrazoliu, n condiiile reducerii incomplete,
conduce la un formazan de culoare roie, n timp ce forma total redus este
albastr.
 N

N+
CH3OSO3
CH3

Structurafenazin metosulfatului(N-Metilfenazinmetilsulfat).
Compusulareroluldeacuplatransferuldeelectronidinspre
NAD(P)Hspresruriledetetrazoliu,fcndastfelposibil
urmrireareduceriiNAD(P)+.

Exemplu: -Glicerofosfat Dehidrogenaza

Amestecul de reacie, 50 ml, este astfel preparat s conin 25 mg de NAD +, 15 mg de

clorur de nitroblue tetrazoliu (NBT), 1 mg de fenazin metosulfat (PMS), 5 ml de -
glicerofosfat sare de sodiu, 1 M, pH 7,0 i 10 ml de tampon Tris-HCI 0,2 M, pH 8,0. Gelul,
care conine enzima, se incubeaz la 37C pn cnd apar benzile albastre. Gelul se cltete
cu ap, apoi se fixeaz ntr-un amestec etanol/acid acetic/glicerol/ap (5:2:1:4).
Este necesar a se utiliza un control pentru a arta dependena culorii de substrat i nu ca
efect al reducerii datorate luminii ori a oxidrii produse de oxigen.
Formulelegeneralealesrurilordemono-(A)idi-tetrazoliu(B)
 Evideniereaalcool
dehidrogenazei,EC1.1.1.1
un alcool + NAD+ <=>
o aldehid sau o
ceton + NADH+H+

NAD+, 1 mg/ml,
PMS, 0,02 mg/ml,
Nitro blue tetrazoliu,
0.2 mg/ml,
Etanol, 0.1 M
 Schema reaciei de identificare
postelectroforetic a Glutamat-Piruvat
Transaminazei.
L-Alanina + -cetoglutarat piruvat + L-glutamat
L-glutamat + APAD+ -cetoglutarat + APADH + NH3
PMS
APADH + MTT APAD+ + MTT-formazan

APAD= 3-acetilpiridin adenin dinucleotid,

APADH, forma redusa a 3-acetilpiridin
adenin dinucleotid. Se utilizeaz cuplul
redox APAD/ APADH datorit unui
potenialul redox mai favorabil dect
NAD/NADH