Tehnici de Biofizica - Cucu - Mernea

TEHNICI DE BIOFIZIC
Editor: Ioan Crciun

DTP: Ars Docendi
Editura ARS DOCENDI Universitatea din Bucureti

Editur cu profil academic i cultural recunoscut de
CONSILIUL NAIONAL AL CERCETRII TIINIFICE
os. Panduri 90-92, sector 5, Bucureti

Tel./Fax: +4 021 410 25 75
www.arsdocendi.ro
office@arsdocendi.ro
Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei

CUCU, DANA
Tehnici de biofizic
lector dr. Dana Cucu, asistent dr. Maria Mernea
Bucureti, Ars Docendi, 2015
Conine bibliografie
ISBN 978-973-558-890-8
I. Mernea, Maria
577.3
Dana Cucu, Maria Mernea, 2015
Tiprit la Editura Ars Docendi

TEHNICI DE BIOFIZIC
LECTOR DR. DANA CUCU

ASISTENT DR. MARIA MERNEA
Dedic aceast lucrare mamei pentru susinerea necondiionat
de-a lungul multor ani petrecui n cercetare, fr s mi pun
vreodat la ndoial opiunea pentru o meserie rspltit prin
recompense profitabile doar pentru cel care o practic.
Dana Cucu
CUPRINS
Cuvnt nainte........................................................................................................................... 9
EVALUAREA I CARACTERIZAREA COMPUILOR OPTIC ACTIVI
PRIN METODA POLARIMETRIC (P) ............................................................................. 11
1. Obiective.........................................................................................................................11
2. Norme de protecia muncii n laborator ...........................................................................11
3. Materiale ........................................................................................................................14
4. Protocoale experimentale ...............................................................................................16
4.1. Experimentul A Determinarea concentraiei unei soluii optic active cunoscute.. 19
4.2. Experimentul B Determinarea puritii enantiomerice a unui compus ...................... 19
4.3. Experimentul C Evaluarea i caracterizarea compuilor optic activi
dintr-o soluie necunoscut 19
4.4. Experimentul D hidroliza sucrozei ............................................................................... 19
5. Aplicaii...........................................................................................................................21
6. Bibliografie......................................................................................................................22
7. Teste gril .......................................................................................................................23
8. Resurse online.................................................................................................................26
DETERMINAREA CONCENTRAIEI UNEI SOLUII PRIN
METODA REFRACTOMETRIC (R) .................................................................................. 27
1. Obiective.........................................................................................................................27
3. Materiale ........................................................................................................................30
4.1. Experimentul A Determinarea concentraiei unei soluii necunoscute de
sucroz/fructoz/alcool etilic ......................................................................................... 32
4.2. Experimentul B Studiul dependenei de temperatur a indicelui de refracie ........... 34
5. Aplicaii...........................................................................................................................35
6. Bibliografie......................................................................................................................37
7. Teste gril .......................................................................................................................38
8. Resurse online.................................................................................................................42
STRESUL OSMOTIC I PROCESE DE TRANSPORT MEMBRANAR N DROJDII ..... 43
1. Obiective.........................................................................................................................43
3. Materiale ........................................................................................................................45
4.1. Experimentul A Absorbia selectiv a drojdiilor .......................................................... 48
4.2. Experimentul B Determinarea viabilitii celulare n urma
modificrilor de osmolaritate ......................................................................................... 50
5. Bibliografie......................................................................................................................52
6. Teste gril .......................................................................................................................53
7. Resurse online.................................................................................................................56
7
VIZUALIZAREA I MSURAREA SEMNALELOR ELECTRICE
CU AJUTORUL OSCILOSCOPULUI (O) ............................................................................. 57
1. Obiective.........................................................................................................................57
3. Materiale ........................................................................................................................60
4.1. Exerciiul A Caracterizarea unui semnal electric n curent alternativ (AC) .................. 61
4.2. Exerciiul B Caracterizarea undelor sonore (AC) ......................................................... 61
4.3. Exerciiul C Figurile Lissajous ....................................................................................... 62
4.4. Exerciiul D Determinarea unui semnal vocal prin intermediul unui microfon ........... 62
5. Teste grile .......................................................................................................................74
6. Resurse online.................................................................................................................79
POTENIALUL DE REPAUS AL CELULELOR. RELAIA NERNST.
RELAIA GOLDMAN (GN) ................................................................................................... 80
1. Obiective.........................................................................................................................80
3. Materiale ........................................................................................................................84
4.1. Exerciiul A Programul The NERNST/GOLDMAN equation simulator va fi accesat
utiliznd executabilul ngswin.exe care se gsete pe Desktopul calculatoarelor din
Laboratorul de Biofizic. Programul cuprinde patru module ......................................... 85
4.2. Identificarea diferenelor dintre tipurile de celule......................................................... 87
4.3. Efectul variaiei concentraiilor ionilor la interiorul i exteriorul celulei ........................ 88
4.3.1. Efectul variaiei temperaturii ................................................................................. 89
4.3.2. Efectul variaiei permeabilitii membranei pentru ioni........................................ 89
4.4. Exerciiul B Experiment cu o membran artificial ..................................................... 89
5. Aplicaii practice .............................................................................................................92
6. Bibliografie......................................................................................................................92
7. Teste gril .......................................................................................................................93
8. Resurse online.................................................................................................................98
SPECTROFOTOMETRIA I APLICAIILE ACESTEIA
N ANALIZELE CANTITATIVE (S) ..................................................................................... 99
1. Obiective.........................................................................................................................99
3. Materiale ...................................................................................................................... 102
4. Protocoale experimentale ............................................................................................. 104
4.1. Experimentul A Determinarea absorbantei maxime a unei substane (Amax) ........... 104
4.2. Experimentul B Efectul concentraiei unei soluii asupra absorbanei ..................... 105
5. Aplicaii......................................................................................................................... 106
5.1. Determinri ale concentraiei i puritii acizilor nucleici (ADN i ARN) ...................... 106
5.2. Determinri ale proteinelor ......................................................................................... 107
5.3. Determinri de fluorescen ........................................................................................ 108
5.4. Determinri ale glucidelor i lipidelor .......................................................................... 108
6. Bibliografie.................................................................................................................... 109
7. Teste gril ..................................................................................................................... 110
8. Resurse online............................................................................................................... 116
REZOLVRILE GRILELOR .................................................................................................117
8
Cuvnt nainte
n laboratoarele moderne de cercetare tiinific, problemele ridicate acum, n era
post-genomic, au la baz relaia dintre structura i funcia acizilor nucleici, a
proteinelor i a celorlalte molecule care formeaz lumea vie, precum i dinamica
interaciunilor dintre ele. Complexitatea acestor probleme necesit i, de altfel, se
abordeaz prin utilizarea unor metode interdisciplinare care cuprind tehnici de
biologie molecular, biochimie i biofizic. Biofizica este n aceeai msur aplicat
n analiza biomedical i n monitorizrile ecologice moderne, unde tehnici de
determinare a concentraiei unor compui sunt deja metode curente.
Tehnici de biofizic se adreseaz n primul rnd studenilor la biologie, biochimie,

ecologie i tiine medicale, dar i altor specialiti din domeniul biomedical care
doresc s se familiarizeze cu noiunile de baz ale tehnicilor optice, spectro-
fotometrice sau electrofiziologice utilizate n laboratoarele care folosesc metode de
analiz performant. Ca urmare, cartea are ndeobte un caracter practic prin
prezentarea unor protocoale experimentale aplicate, precum i a aparatelor necesare
desfurrii acestor protocoale. Aceste metode sunt completate cu descrierea succint
a unor aplicaii pe aparate utilizate n cercetarea tiinific sau n laboratoare de
analize.
Pentru a explica ntr-un mod accesibil bazele a numeroase metode moderne prin care
se studiaz structura molecular, structura celular i interaciunile cu alte molecule,
astfel nct utilizatorii s poat nelege principiile metodelor folosite curent n
cercetarea tiinific i analiza biomedical, cartea conine o serie de Protocoale
Experimentale i Casete pentru a oferi cunotinele de baz. nelegerea este
susinut de ntrebri la sfritul fiecrei tehnici, precum i de o bibliografie
adecvat, care include articole i capitole din cri n care se descriu tehnici de
biofizic utilizate n cercetarea contemporan. Sunt adugate i o serie de lucrri
publicate online care vin n sprijinul studenilor din generaiile care prefer resursele
de pe web, cu meniunea c aceste resurse trebuie verificate i susinute de capitole
relevante din manuale de circulaie internaional citate n acest ndrumar.
ntr-o er n care ntreaga comunitate tiinific se strduiete s neleag comple-

xitatea sistemelor biologice i s aplice rezultatele obinute n mbuntirea vieii,
Tehnici de biofizic poate fi un ghid ideal pentru oricine i dorete s neleag
puterea i sensul metodelor biofizice n descrierea lumii vii.
9
Le mulumim studenilor Facultii de Biologie a Universitii din Bucureti, care au
fost de-a lungul anilor o permanent surs de inspiraie, ncredere i bucurie. Cartea
este conceput n primul rnd pentru uzul lor, pentru a-i ajuta ca n timpul scurt
dedicat lucrrilor practice din anul II s poat s i dezvolte abilitile de laborator,
s i gestioneze corect timpul i s i descopere eventuala nclinaie spre cercetarea
tiinific. Cei care au optat pentru lucrarea de dizertaie n DAFAB (Departamentul
de Anatomie, Fiziologie Animal i Biofizic), unde se desfoar aceste lucrri
practice, au contribuit direct la text, figuri sau conceperea grilelor. Le mulumim
deci studentelor de la masterul de Biologie Medical Flori Cojocaru, Andreea Miric
i Ana-Maria Coman pentru ajutor i perseveren. Lucrarea a fost conturat i prin
contribuia a trei refereni propui de Facultatea de Biologie ntr-o etap de nceput a
scrierii, iar corecturile, modificrile i majoritatea sugestiilor au fost incluse n
aceast form a crii.
ntr-o perioad tulbure, n care demersul oamenilor de tiin din Romnia de a

publica manuale pentru studeni sau cri tiinifice este dramatic viciat de publicaii
discutabile girate de multe edituri, mulumim echipei Ars Docendi, care a ales s se
pun doar n slujba cadrelor didactice i cercettorilor care au randamente modeste
ca numr de publicaii pe an sau pe or... Avem sperana c anii vor cerne
adevratele lucrri tiinifice de restul maculaturii, iar certificatul de calitate al unei
edituri se va reflecta i n calitatea publicului su.
10
Evaluarea i caracterizarea compuilor optic activi
prin metoda polarimetric (P)
1. Obiective
Efectuarea cu succes a experimentului ct mai independent, n condiii de siguran;
Abilitatea de a prepara soluii cu concentraii procentuale sau molare, diluii;
nelegerea noiunilor de unghi de rotaie i rotaie specific;
nelegerea fenomenului polarizrii i a proprietii de chiralitate;
Abilitatea de determinare a unei concentraii necunoscute prin metoda grafic.
2. Norme de protecia muncii n laborator

Lucrarea nu necesit msuri speciale de protecie. Cu toate acestea, pentru c soluia
de acid clorhidric (HCl) poate fi uor iritant, se folosete o pipet Pasteur cu par
pentru extragerea unui mililitru de soluie diluat. Dup utilizarea lor n experimente,
toate soluiile preparate vor fi deversate ntr-un recipient dedicat reziduurilor.
Trebuie avut grij ca soluiile stock gsite pe bancul de lucru s nu fie deversate.
Pentru acurateea msurtorilor i creterea duratei de via a aparatului se vor
respecta urmtoarele norme:
Soluiile se prepar n tuburi Corning individuale;
n cazul utilizrii pipetorului automat (salpeta), se aspir soluia cu atenie, astfel
nct aceasta s nu ajung n aparat;
Polarimetrul nu trebuie folosit ca suport pentru pahare Berzelius sau referate;
Dup ncheierea experimentului, tubul polarimetrului se spal cu ap deionizat
i se las gol n aparat;
Capacul polarimetrului se ine nchis;
Pipetele, tuburile i alte materiale care se refolosesc se spal cu ap de la robinet
de mai multe ori i apoi se cltesc cu ap deionizat;
n cazul pipetelor se folosete pipetorul i apa deionizat pentru curarea lor;
Se terge masa de lucru.
11
CASETA 1 ACTIVITATE OPTIC: NOIUNI FUNDAMENTALE
Polarizarea poate fi explicat pe baza proprietilor de und prin care este descris
lumina. Conform acestei descrieri, radiaia electromagnetic este compus dintr-un
cmp electric i un cmp magnetic care oscileaz perpendicular ntre ele i perpen-
dicular pe direcia de propagare.
Lumina nepolarizat
n lumin natural direciile de vibraie ale vectorului cmp electric sunt orientate
aleator unele fa de altele.
Lumina polarizat liniar

Lumina este considerat ca fiind liniar polarizat atunci cnd oscilaiile vectorului
electric au loc ntr-un singur plan.
Lumin natural Lumin polarizat liniar
Activitatea optic
Moleculele chirale au n structura lor un centru asimetric care reacioneaz la
lumin rotind planul luminii polarizate liniar. Capacitatea de a roti planul luminii
polarizate poart denumirea de activitate optic, iar substanele care au aceast
proprietate se numesc substane optic active sau substane chirale. Pentru a observa
rotaia, lumina care trece prin materialele chirale trebuie s fie polarizat liniar.
Unele substane optic-active sunt dextrogire, adic rotesc planul de polarizare spre
dreapta (n sensul de rotaie al acelor unui ceas), iar altele sunt levogire, adic
rotesc planul spre stnga. Toate zaharurile din corpul uman sunt de tip D
(dextrogire), n timp ce toi aminoacizii sunt de tip L (levogiri). Enantiomerii sunt
acei compui care rotesc planul luminii polarizate cu exact acelai unghi, dar n
direcie opus. Amestecurile racemice (concentraii egale a doi enantiomeri) nu vor
determina o rotaie net (Bran, I. et al., 2013).
12
Substan dextrogir Substan levogir
Gradul rotaiei planului luminii polarizate poate da indicaii despre:

a) concentraia unei substane cunoscute; b) identitatea unei substane optic active;
c) puritatea enantiomeric a unei substane; d) activitatea enzimatic a unei soluii
care conine substane optic active (Pomeranz, Y., 2013).
Unghiul obs cu care o soluie rotete planul de polarizare al luminii este direct
proporional cu concentraia c a substanei, precum i cu grosimea l a stratului de
substan strbtut conform relaiei lui Biot:
(P1) obs T = [ ] c l
[] rotaia specific (putere rotatorie specific) la temperatura T

i lungimea de und
obs unghiul de rotaie observat n grade la temperatura T
i lungimea de und
c concentraia n grame per mililitru (g/ml)
l lungimea cuvei de msur n dm
Istoric, polarimetria a fost aplicat n lumina unui bec de sodiu. Ca urmare,

lungimea de und utilizat pentru msurtori a fost cea a radiaiei vizibile de 589
nm. S-a observat c rotaia optic la 436 nm este aproximativ dubl, iar la 365 nm
este aproximativ tripl fa de rotaia optic la 589 nm. Polarimetrul de tip
Polamat A este aparatul optic cu ajutorul cruia se poate msura unghiul de rotaie
al luminii polarizate, rezultat n urma trecerii razei de lumin prin substana cu
activitate optic (Amuzescu, B. et al., 2005).
13
3. Materiale
Pentru realizarea experimentului sunt necesare urmtoarele aparate i substane:
Polarizor
Filtru UV-VIS
Celul Faraday
Surs de lumin Capac pentru protecia Analizor
locului de plasare a tubului Monocromator
POLAMAT A
Indicator
Figura P1. Panoul frontal al polarimetrului
Polarimetrul i tubul polarimetrului (Figurile P1 i P2);

Plit pentru nclzire cu agitator magnetic (experimentul C i D) (Figura P2);
Tuburi gradate Corning de 50 ml (Figura P2);
Pipetor automat (salpet) (Figura P2);
Pipete Pasteur (Figura P2);
Soluii stock de sucroz, fructoz (experimentul A);
Sucroz sau fructoz n form solid (experimentul B);
Soluie de HCl (experimentul D);
Ap deionizat.
14
Buton de a
aspirare
Buton de evvacuare
pomp
Pipetor automat (salpet) T

Tubul polarimeetrului Pipeta Pasteur
b Corning
Tub Pah
har Berzelius Agitator magn netic
cu plit
FFigura P2. Usteensile de laborrator
15
4. Protocoale experimentale
Zaharurile au tendina de mutarotaie n soluie (unghiurile de rotaie i schimb

gradat valorile). Ca urmare, msurtorile trebuie fcute ct mai repede dup
prepararea soluiilor.
Se pornete polarimetrul comutnd butonul pe poziia I. Se las aproximativ 10

minute, timp n care se pregtesc soluiile conform experimentului care va fi realizat.
1. Se pune apa deionizat n tubul polarimetrului n aa fel nct s nu rmn bule.

Tubul se umple detand unul dintre cele dou dopuri care l nchid sau prin
ndeprtarea unei lentile din captul tubului.
2. Se identific punctul zero al polarimetrului la lungimea de und de 590 nm. n

cazul n care scala polarimetrului nu indic zero, se va nota eroarea.
3. Se scoate tubul i se nlocuiete apa deionizat cu soluiile care vor fi msurate.
4. Se va efectua unul dintre urmtoarele experimente, conform indicaiilor ndrum-

torulului de lucrri:
4.1. Experimentul A Determinarea concentraiei unei soluii optic active

cunoscute
5. Se calculeaz volumul de soluie stock necesar pentru 20 de ml de sucroz sau

fructoz cu urmtoarele concentraii (a, b sau c n funcie de indicaiile primite):
a) c1 = 5%, c2 =15%, c3 = 30%
b) c1 = 2%, c2 = 10%, c3 = 20%
c) c1 = 150 mM, c2 = 15 mM, c3 = 10 mM;
6. Se iau 3 tuburi gradate Corning i se noteaz pe ele concentraiile corespunztoare;
7. Se ataeaz pipeta serologic la pipetor, apoi se pornete pompa pipetorului

(Figura P2);
8. Se aspir volumul de soluie necesar (butonul on) innd cont de gradaia pipetei;
9. Se evacueaz n cte un tub Corning de 50 de ml soluia aspirat (butonul off)

necesar pentru fiecare diluie;
16
10. Se adaug n fiecare tub volumul de ap necesar pentru diluia corespunztoare
cu ajutorul unei alte pipete serologice;
11. Se nchide tubul, iar soluia se agit pentru omogenizare;
12. Se umple tubul polarimetrului fr bule, cu fiecare dintre aceste soluii (atenie:
punctul zero a fost determinat!), pe rnd, n ordinea cresctoare a concentraiei;
13. Se citete unghiul de pe scala polarimetrului, n momentul n care valoarea s-a

stabilizat;
14. Prezentarea rezultatelor se va realiza conform tabelului:
Cantitatea de soluie Concentraia Valoarea unghiului obs

stock la un volum final
de 20 ml
c1
c2
c3
15 Se traseaz grafic dependena unghiului obs/dm de concentraie a soluiei; n

grafic se trece i valoarea corespunztoare concetraiei zero (ap distilat);
16 Se msoar obs pentru o soluie de concentraie necunoscut cx.;
17 Se determin concentraia necunoscut cx prin metoda grafic sau prin metoda

matematic, conform ecuaiei dreptei;
18 Calculai unghiul specific al substanei analizate;
19 Verificai n tabel dac valoarea corespunde substanei analizate;
20 Interpretai rezultatul (n cazul n care nu corespunde, justificai rezultatul).
17
Tabel P1 Unghiul de rotaie specific a unor substane optic active
Denumire Unghi de rotaie
(grade)
D-glucoz +52.6
Lactoz +55.4
L-fructoz -92.4
L-arabinoz +104.5
D-manoz +14.2
D-arabinoz +105.0
D-xiloz +18.8
D-galactoz +80.2
Sucroz +66.5
Maltoz +130.5
Dextrin +195
Ibuprofen 57
Bromobutan -23.1
18
4.2. Experimentul B Determinarea puritii enantiomerice a unui
compus
5. Se msoar unghiul de rotaie al etanolului, pentru a realiza corecia probelor;

6. Se dizolv proba de ibuprofen n 2 ml etanol ntr-un pahar Berzelius, plasnd-o
pe un agitator magnetic;
7. Se transfer ntr-un tub Corning gradat de 50 ml;
8. Se adaug etanol pn la 20 ml;
9. Se agit soluia pn devine omogen;
10. Se msoar obs;
11. Din relaia (P1) se calculeaz ;
(1)
100

12. Din relaia (1) se calculeaz puritatea compusului;

13. Puritatea optic egalez i excesul de enantiomer (ee)
.
(2) 100
14. Folosind relaia (2), calculai procentul de izomeri D i L din prob.
4.3. Experimentul C Evaluarea i caracterizarea compuilor optic activi

dintr-o soluie necunoscut
5. Se cntrete aproximativ 1 g din fiecare substan necunoscut. nregistrai 3

subuniti ale masei i notai-le;
6. Folosind pahare Berzelius de 50 ml se dizolv coninutul n aproximativ 10 ml
de ap deionizat. Agitai coninutul pn cnd substana se solubilizez complet;
7. Se noteaz dou tuburi gradate (Corning) 1 i 2;
8. Se transfer cu atenie coninutul n tuburile gradate;
9. Se cltesc paharele Berzelius cu aproximativ 2 ml de ap deionizat. Transferai
apoi n tubul gradat (atenie: corespunztor fiecrei substane!). Repetai;
10. Se adaug cu atenie, cu ajutorul unei pipete Pasteur, ap deionizat pn la
volumul de 20 ml. n caietul de laborator calculai concentraia n g/ml;
11. Se umple tubul polarimetrului fr bule, cu soluiile preparate pe rnd;
12. Se citete obs/dm pe scala polarimetrului, n momentul n care valoarea s-a
stabilizat;
19
13. Se utilizeaz relaia P1 pentru determinarea unghiului de rotaie specific i se
identific substanele pe baza valorilor din tabelul 1.
4.4. Experimentul D hidroliza sucrozei
5. Se pregtete o baie de ap ntr-un pahar Berzelius de 500 ml. Se pun

aproximativ 125 ml H2O de la robinet, se fierbe pe plit i se d plita la minim,
astfel nct apa s fie meninut la temperatura de fierbere;
6. Se prepar 100 ml soluie de sucroz (sucroz) de concentraie 5%;
7. Se noteaz 5 tuburi gradate Corning de la 1 la 5;
8. Cu ajutorul unei pipete serologice sau a unei siringi se adaug 16 ml soluie de
sucroz n fiecare tub;
9. Se adaug n tuburile 2, 3 i 4 cte 4 ml HCl diluat (50 mM);
10. Notai timpul i plasai toate tuburile (1, 2, 3, 4) n baia de ap. Vor fi scoase
din baia de ap pe rnd, dup 5, 10, 15, 45 de minute fiecare. Tubul 1 nu va fi
nclzit, este controlul;
11. Dup 5 minute, se scoate tubul 2 din baia de ap i se rcete sub jet de ap la
chiuvet;
12. Se neutralizeaz acidul prin adugarea de bicarbonat de sodiu solid, cte un pic,
pn cnd adugarea nu mai produce spumare;
13. Se msoar unghiul []obs;
14. Dup 10 minute se scoate tubul 3 din ap i se repet procedura i msurtoarea;
15. Dupa 15 minute se scoate tubul 4 din ap i se repet procedura i msurtoarea;
16. Se msoar []obs al soluiei din tubul 2;
17. Dup 60 de minute se scoate tubul 5 din ap i se repet procedura i msurtoarea;
18. Cunoscnd rotaia specific a sucrozei conform relaiei P1, calculai concen-
traia de sucroz la fiecare moment i prezentai datele n tabel:
ci concentraia iniial 1
ct1 (t1= 5 minute) 2
20
19. Se face un grafic al variaiei concentraiei n timp;
20. Conform relaiei stoichiometrice a hidrolizei sucrozei:
3
6 6
Putem concluziona c n orice moment t al reaciei concentraiile sunt urmtoarele:
(4) cf (t) = cg(t) = ci-cs(t)
unde cf, cg, cs reprezint concentraia fructozei, glucozei, sucrozei la momentul t,
iar ci este concentraia sucrozei la nceputul experimentului;
21. Se calculeaz concentraiile de glucoz i fructoz la fiecare moment folosind
relaiile (P1) i (4);
20. Trasai un grafic al concentraiei fructozei i glucozei la cele trei momente
msurate.
5. Aplicaii
Polarimetrul msoar un singur parametru; de aceea nu este un instrument utilizat
frecvent n cercetare sau n aplicaiile medicale. Cu toate acestea, compania
Rudolph, distribuitor de polarimetre, descrie o serie de aplicaii n care polarimetrul
este utilizat exclusiv (www.rudolphresearch.com).
n industria alimentar, polarimetrele sunt utilizate pentru a determina puritatea sau

concentraia n zaharuri a diferite alimente, ca de exemplu cerealele sau siropurile.
Mai mult, metoda se utilizeaz pentru determinarea puritii zaharurilor n fabricile
de zahr (http://www.mep.net.au/foodlab/FL_16/FL16_D02IA03-A_Application_Note_
Sugar.pdf). Analizele pentru determinarea unghiului de polarizare a zahrului alb se
fac prin metoda polarimetric stadardizat i agreat de Comisia Internaional
pentru Uniformizarea Metodelor de analiz a zahrului (ICUMSA). Pentru a
determina puritatea zahrului, se compar rotaia specific a unei probe de analizat
cu rotaia specific cunoscut a zahrului.
Polarimetrele automate sunt folosite i n industria parfumurilor deseori falsificate

prin adugarea de camfor, acid citric, eucaliptol etc. Toate acestea pot fi detectate n
compuii finali prin determinarea rotaiei specifice a probelor.
n cercetarea tiinific, cea mai recent utilizare a polarimetrului este senzorul

polarimetric de msurare a aerosolilor (APS) dezvoltat de ctre NASA
21
(http://glory.gsfc.nasa.gov/ overview-aps.html). Aerosolii includ particule de fum,
praf, cenu vulcanic, spray de mare, nori stratosferici polari i smog. Este evident
c aceste particule influeneaz major modificrile climatice ale planetei. Crearea
unui instrument ca APS permite determinarea compoziiei aerosolilor, a grosimii
norului format de ei i a efectelor pe care le pot avea asupra planetei.
O aplicaie medical este utilizarea polarimetrului pentru determinarea modificrilor

proprietilor esuturilor vii (Ratti, G. and G. P. Sanna, 1963). Astfel, diferenele
structurale i metabolice ale esuturilor normale fa de cele canceroase sunt
suficient de mari pentru a fi msurabile prin metode polarimetrice. n acest sens,
Gibbs et al. au pus la punct o metod de scanare prin care, cu ajutorul unui
polarimetru combinat cu metode de imagistic, au scanat chiralitatea esuturilor. Cu
acest sistem, autorii au reuit s monitorizeze chiralitatea ntr-un sistem cu 1536
microplci, urmrind reacia sucroz-invertazei, o enzim care catalizeaz trans-
formarea sucrozei ntr-o cantitate echimolar de dextroz (Gibbs, P. R. et al., 2003).
n industria farmaceutic este de multe ori utilizat un anumit enantiomer al unui

amestec racemic, cealalt molecul avnd efecte secundare nedorite. Ca urmare,
polarimetria este utilizat pentru determinarea eficient a produsului dorit. Toate
aceste aplicaii dovedesc faptul c metodele polarimetrice au toate ansele s se
diversifice i s aib o utilizare din ce n ce mai extins, fie pentru determinarea
compusului cu o anumit chiralitate, fie combinate cu alte metode analitice pentru
determinarea exact a structurii unui compus sau a naturii anumitor interaciuni.
6. Bibliografie
Amuzescu, B.; Avram, S.; Macri, B. (2005). Lucrri practice de biofizic, Editura
Universitii din Bucureti.
Bran, I.; Clinescu, O.; D. I.; Iftime, A.; Mocanu, M.; Nisiparu, L.; Omer, L.; Onu,
M.; Sulica, D.; Vinersan, J. (2013). Lucrri practice de biofizic i fizic
medical, Editura Universitar Carol Davila, Bucureti.
Gibbs, P.R.; Uehara, C.S.; Nguyen, P.T.; Willson, R.C. (2003). Imaging
polarimetry for high throughput chiral screening, n Biotechnology progress
19, 1329-1334.
Pomeranz, Y. (2013). Food Analysis: Theory and Practice, Chapman & Hall,
London.
Ratti, G.; Sanna, G.P. (1963). [Myocardial Infarct from the Electric and Ionic Point
of View. Mechanism of Action and Effects of Polarizing Solutions
(Potassium-Glucose-Insulin)] Recenti progressi in medicina 35, 345-369.
22
7. Teste gril
GP1. Cum difer lumina polarizat de lumina natural?
A. Lumina polarizat prezint oscilaii ale vectorului electric la 90 fa de vibraiile

luminii naturale;
B. Lumina polarizat prezint oscilaii ale vectorului electric n mai multe planuri,
n timp ce n lumina natural vectorul electric oscileaz ntr-un singur plan;
C. Lumina polarizat i lumina natural prezint oscilaii opuse ca sens n spaiu;
D. n lumina polarizat vectorul electric oscilez ntr-un singur plan, n timp ce n
lumina natural oscileaz n mai multe planuri.
GP2. Lungimea de und a luminii reprezint:
A. Viteza de propagare a undei electromagnetice ntr-un mediu;

B. Variaia cmpurilor electrice i magnetice ale luminii;
C. Perioada de repetare temporal a oscilaiilor;
D. Distana parcurs de und pe durata unei oscilaii.
GP3. Ce se nelege prin lumin polarizat i plan de polarizare?
A. Vibraiile de und ale luminii polarizate sunt limitate la un singur plan, iar planul
de polarizare este cel care conine vectorul de-a lungul cruia vibreaz lumina;
B. Vibraiile de und ale luminii polarizate sunt limitate la mai mult de un plan, iar
planul de polarizare este cel care conine vectorul de-a lungul cruia vibreaz
unda de lumin;
C. Vibraiile de und ale luminii polarizate sunt limitate la mai mult de un plan, iar
planul de polarizare este cel n unghi drept fa de vectorul de-a lungul cruia
vibreaz unda de lumin;
D. Vibraiile de und ale luminii polarizate sunt limitate la un singur plan, iar planul
de polarizare este cel n unghi drept fa de vectorul de-a lungul cruia vibreaz
unda de lumin.
GP4. Care sunt factorii de care depinde activitatea optic a unei substane?
A. Temperatura, lungimea de und folosit, concentraia substanei;

B. Temperatura, lungimea de und folosit, concentraia substanei i lungimea
tubului polarimetrului;
C. Lungimea de und folosit i concentraia substanei;
D. Temperatura, lungimea de und folosit i lungimea tubului polarimetrului.
23
GP5. Polarizarea luminii se poate realiza de ctre:
A. Substane optic active;
B. Enantiomeri;
C. Cristale de cuar;
D. Sticl.
GP6. Cum depinde activitatea optic de chiralitatea substanei, considernd c se

fac msurtori n aceleai condiii i la aceeai concentraie?
A. n cazul n care compusul este n forma (+) se rotete planul luminii polarizate n
sensul invers de rotire al acelor de ceasornic, iar dac este n forma (-) se rotete
planul luminii polarizate n sensul de rotire al acelor de ceasornic cu aceeai
magnitudine;
B. n cazul n care compusul este prezent n forma (+) se rotete planul luminii
polarizate n sensul acelor de ceasornic, iar n cazul n care acesta este prezent n
forma (-) se rotete planul luminii polarizate n sens invers acelor de ceasornic cu
magnitudine diferit;
C. n cazul n care compusul este prezent n forma (+) se rotete planul luminii
polarizate n sensul acelor de ceasornic, iar n cazul n care acesta este prezent n
forma (-) se rotete planul luminii polarizate n sens invers acelor de ceasornic cu
aceeai magnitudine;
D. Amndou rotesc planul luminii polarizate n aceeai direcie cu magnitudini
egale;
E. Amndou rotesc planul luminii polarizate n direcii opuse cu magnitudini diferite.
GP7. Rotaia specific depinde de lungimea de und a luminii folosite i de

temperatur?
A. Da;
B. Nu.
GP8. Dac unghiul de rotaie a luminii polarizate este zero, atunci soluia poate
conine:
A. Fructoz;
B. Sucroz;
C. Manoz;
D. Concentraii egale de D-/L-fructoz.
24
GP9. Care izomer este dominant ntr-un amestec racemic de fructoz (D) i (L), cea
din urm avnd rotaia specific este -92,4?
A. Amndoi enantiomerii D i L sunt n soluie n proporii egale;
B. Semnul negativ indic faptul c enantiomerul D este cel dominant;
C. Semnul negativ indic faptul c enantiomerul L este cel dominant;
D. Niciuna dintre opiuni nu este real.
GP10. Unghiul de rotaie msurat la concentraia de 20% ntr-un tub de 20 cm

lungime este 5,68. Substana msurat este:
A. Fructoz;
B. Sucroz;
C. Galactoz;
D. Manoz.
GP11. Concentraia de sucroz cu unghiul de rotaie 6,65 msurat ntr-o cuv cu

lungimea de 20 cm este:
A. 10%;
B. 3 mM;
C. 5%;
D. 5 mM.
GP12. Lumina reprezint o radiaie:
A. Ionizant;
B. Electromagnetic;
C. X;
D. Niciuna dintre situaiile anterioare.
GP13. Parametrul care poate afecta unghiul de rotaie este:

A. Temperatura;
B. Difuzia soluiei;
C. Unghiul de refracie;
D. Amplitudinea oscilaiilor.
GP14. Camforul are o rotaie specific de +46.26. Cte grame de camfor sunt
necesare pentru a produce un unghi de rotaie de 35 ntr-un volum final de 10 ml n
care solventul principal este H2O, pentru un tub cu lungimea de 1 dm?
A. 5 g;
B. 10,2 g;
C. 7,6 g;
D. 12 g.
25
GP15. Prin msurarea unui amestec de D i L bromobutan a fost obinut un unghi
rotaie de -9.5. Care este puritatea optic a amestecului?
A. 60% exces D fa de L;
B. 40% exces L fa de D;
C. Sunt n cantiti egale;
D. Niciuna dintre situaiile de mai sus.
GP16. ntr-un amestec racemic de D i L bromobutan (rotaie specific = +/- 23,1),

izomerul dominant este:
A. Cel care rotete planul luminii polarizate spre dreapta -D-;

B. Cel care rotete planul luminii polarizate spre stnga -L-;
C. Sunt n cantitti egale;
GP17. Avnd n vedere c D-2-bromobutan are o rotaie specific de +23,1 i

(L)-2-bromobutan are o rotaie specific de -23.1, puritatea optic a amestecului a
crui rotaie a fost msurat ca fiind 18.4 este:
A. 80% exces D fa de L;
B. 60% exces D fa de L;
C. 60% exces L fa de D;
D. 80% exces L fa de D.
8. Resurse online
Descrierea unor experimente o putei gsi i aici:
http://www.tau.ac.il/~phchlab/experiments_new/SemB04_Sucrose/
04ExperimentalProcedure.html
http://infohost.nmt.edu/~jaltig/Polarimetry.pdf
http://iiith.vlab.co.in/?sub=19&brch=208&sim=563&cnt=958
Noiuni despre polarimetrie i proprietile radiaiei electromagnetice:
http://ro.wikipedia.org/wiki/Lumin%C4%83
http://ro.wikipedia.org/wiki/Polarizare
http://www.chem.ucla.edu/~bacher/General/30BL/tips/Polarimetry.html
http://www.youtube.com/watch?v=kc2o73FyN3I
Informaii despre polarizare i aplicaiile ei:
http://rudolphresearch.com/products/polarimeters/polarimetry-definitions
26
Determinarea concentraiei unei soluii prin
metoda refractometric (R)
1. Obiective
Efectuarea cu succes a experimentului ct mai independent, n condiii de
siguran;
Capacitatea de a prepara soluii cu concentraii procentuale sau molare, diluii;
nelegerea noiunii de unghi-limit;
nelegerea dependenei dintre indicelele de refracie i concentraia unei soluii;
Capacitatea de a reprezenta grafic datele obinute;
Capacitatea de a determina concentraia unei substane necunoscute prin metoda
grafic.

Lucrarea nu necesit msuri speciale de protecie. Dup utilizare, toate soluiile
preparate vor fi deversate ntr-un recipient dedicat reziduurilor. Trebuie avut grij
ca soluiile stock gsite pe bancul de lucru s nu fie deversate. Pentru acurateea
msurtorilor i creterea duratei de via a aparatului se vor respecta urmtoarele
norme:
Se utilizeaz pipete pentru manipularea soluiilor;
Dup ncheierea experimentului, prismele se spal cu ap deionizat i se terg cu
un erveel neabraziv;
de mai multe ori i apoi se cltesc cu ap deionizat;
n cazul pipetelor serologice se folosete pipetorul i apa deionizat pentru
curarea lor;
27
CASETTA 2 INDICELE DE REEFRACIE
Metoda refrractometriei eeste o metod a opticii geoometrice prin care se studdiaz

fenomenele de reflexie i refracie. n lucrarea dee fa se anaalizeaz parcuursul
razelor de lumin ntr-uun sistem optic (refractom metrul), cu ajjutorul cruiaa se
determin indicele
i de rrefracie al soluiei de studiat.
s Se pooate evalua apoi
a
concentraiaa soluiei, folosind astfel o metod
m simpl i rapid.
Indicele de refracie al unei substane (n) este o mrime adimensional care c
descrie cum
m lumina sau orice alt rad diaie se proppag ntr-un mediu
m (Pomeranz,
Y. and C. E.. Meloan, 19994).
c = viteza luuminii n vid

v = viteza luuminii n substtan
Figura R1. Refflexia i refraccia
S considerm dou meddii omogene trransparente M1M i M2 cu indici

i de refraacie
diferii n1 i
n2, separatee de o supraffa plan. Cnd lumina se
s deplaseaz din
mediul M1 cu indicele dee refracie n1 n
alt mediu, M2,
M cu indiceele de refraciee n2,
ea formeaz cu normala un unghi de incidena i la l suprafa. Se
S separ apooi n
28
felul urmtor: o parte a razei se reflect din suprafa cu un unghi de reflexie rft
egal cu I, n timp ce alt parte ptrunde n mediul M2 suferind fenomenul de
refracie (Figura R1). n urma lui, raza i schimb direcia. Indicele de refracie al
materialelor variaz cu lungimea de und (Bran, I. et al., 2013).
Dac n2> n1, adic lumina trece dintr-un mediu mai puin refringent ntr-un mediu
mai refringent (de exemplu, din aer n ap; din ap n benzen), ntre aceti
parametri exist relaia:
n1 sin i n2 sin rfr ecuaia Snell-Descartes
n1 i n2 = indicii de refracie ai celor dou medii optice

i = unghi incident
rfr = unghi de reflexie
Valoarea unghiului de refracie variaz n funcie de unghiul de inciden, existnd
i posibilitatea ca raza s nu fie refractat, cum este ilustrat n Figura R2.
Figura R2. Reflexia i refracia unei raze de lumin din medii cu refringen diferit
la unghiuri de inciden diferite.
Unghiul de inciden pentru care raza refractat rmne n planul de separare a

celor dou medii se numete unghi-limit. rfr = 90
Refractometrele funcioneaz pe baza determinrii unghiului-limit, conform
ecuaiei Snell-Descartes.
29
3. Materiale
Pentru realizarea experimentului sunt necesare urmtoarele aparate i substane:
Refractometrul Abb
Piesa principal a refractometrului este un bloc de dou prisme identice avnd ca

seciune principal un dreptunghi.
Figura R3. Refractometrul Abbe i modul de determinare a indicelui de refracie
Baie de ap (experimentul B);
Tuburi gradate Corning de 50 ml;
Pipetor automat (salpet);
Pipete Pasteur;
Soluii stock de sucroz, fructoz, alcool etilic (experimentul A);
Solutii de benzen, aceton, etanol (experimentul B);
30
Ap deionizat;
Surs electtric de luminn.
Pipeetor automat (ssalpet) Pipeta Pastteur
Tub Corn
ning Pahar Berzeelius Baie term
mostatat
gura R4. Usten

Fig nsile de labora
ator
31
4.1. Experimentul A Determinarea concentraiei unei soluii necunoscute de

sucroz/fructoz/alcool etilic
1. Se calculeaz volumul de soluie stock necesar pentru 5 ml de sucroz sau

fructoz sau 10 ml alcool etilic cu urmtoarele concentraii (a, b sau c, n funcie
de indicaiile primite):
a) c1 = 5 %, c2 = 15%, c3 = 30%
b) c1 = 2%, c2 = 10%, c3 = 20%
c) c1 = 150 mM, c2 = 15 mM, c3 = 10 mM
2. Efectuarea calculelor necesare pentru realizarea ulterioar a diluiilor;
3. Se iau 3 tuburi gradate Corning i se noteaz pe ele concentraiile corespunztoare;
4. Se ataeaz pipeta serologic la pipetor apoi se pornete pompa pipetorului

(Figura R4);
5. Se aspir volumul de soluie necesar (butonul on) innd cont de gradaia pipetei;
6. Se evacueaz n cte un tub Corning de 50 de ml soluia aspirat (butonul off)

necesar pentru fiecare diluie;
7. Se adaug n fiecare tub volumul de ap necesar pentru diluia corespunztoare

cu ajutorul unei alte pipete serologice;
8. Se nchide tubul, iar soluia se agit pentru omogenizare;
9. Sursa electric de lumin se plaseaz n fa oglinzii;
10. Se deschide blocul prismelor din micul buton, meninnd una dintre fee (cu
ajutorul minii!) n poziie orizontal. Pe aceasta se pun 1-2 picturi din lichidul
de studiat, apoi se nchide blocul prismelor;
Blocul prismelor este rotit (butonul stng) astfel nct linia de delimitare dintre aria
nchis la culoare i cea luminoas s fie plasat n centrul cmpului vizual (Figura
R5 dreapta). Vizualizarea se face prin ocularul drept.
32
Figura R5. Model de vizualizare prin ocularul stng i drept
11. Dispersia este compensat prin rotirea butonului din partea dreapt, astfel nct
linia de delimitare dintre zona nchis la culoare i cea luminoas este foarte
clar (nu se vd benzi de tranziie roii sau albastre datorate dispersiei);
12. Cnd blocul prismelor este aezat n poziia corect se citete indicele de
refracie pe o scal vizibil prin ocularul stng (Figura R3);
13. Se msoar la nceput indicele de refracie al apei;
Cantitatea de soluie stock la Concentraia Valoarea indicelui de refracie

un volum final de 5 ml
c1
c2
c3
15. Se traseaz grafic dependena indicelui de refracie de concentraia soluiei;

n grafic se trece i valoarea corespunztoare concetraiei zero (ap distilat).
Graficul se realizeaz pe o foaie A4 ntreag. Se fac nti scalrile axelor, apoi
se trec valorile msurate;
16. Se msoar n pentru o soluie de concentraie necunoscut cx.;
33
17. Se determin concentraia necunoscut cx prin metoda grafic sau prin metoda
matematic conform ecuaiei dreptei.
4.2. Experimentul B Studiul dependenei de temperatur a indicelui de

refracie
1. Se utilizeaz cteva soluii aflate pe masa de lucru: sucroz, aceton, benzen,

etanol;
2. Se iau cte trei tuburi gradate Corning i se noteaz pe ele temperaturile n grade
Celsius (de exemplu 20oC, 37oC i 60oC) i soluiile corespunztoare;
3. Se plaseaz tuburile n baia de ap reglat la prima temperatur aleas (20oC) i

se ateapt pn cnd soluia ajunge la temperatura setat (~ 10 minute);
4. Se determin indicele de refracie al apei;
5. Se determin indicele de refracie al fiecrei soluii;
6. n acest timp, se plaseaz tuburile cu soluiile n baia de ap setat la 37oC;
7. Se msoar i indicele de refracie la cea de-a doua temperatur, respectiv 37oC;
8. Se repet etapele de lucru i pentru ultima temperatur;
Soluia lichid Temperatura Valoarea indicelui de refracie

t1
t2
t3
10. Se observ dependena indicelului de refracie n funcie de temperatur.
34
5. Aplicaii
Metoda de determinare a concentraiei unei soluii cu ajutorul refractometrului este

o metod rapid i suficient de precis pentru a fi folosit n analize medicale
(concentraia glucozei), n industria alimentar, industria farmaceutic etc.
5.1. n procesele de amestecare. Erorile n adugarea sau amestecarea noilor

substane ntr-o soluie pot avea consecine drastice att n calitatea produsului, ct i
n costurile produciei. Refractometrele de proces pot fi folosite n aceste protocoale
pentru a verifica erorile. Corelarea analizei de referin i a valorilor msurate
de refractometru n timpul optimizrii permite procesului de producie s fie
monitorizat i controlat prin utilizarea refractometriei.
5.2. n procesele de concentrare. Abaterile n materiile prime sunt o problem

general pentru produsele bazate pe ingrediente naturale. Procesul de concentrare a
sucurilor de fructe implic ndeprtarea unei anumite cantiti de ap, care se
realizeaz n general prin evaporare. Acest proces de evaporare poate fi efectiv
controlat folosind refractometrul de proces. Deviaiile coninutului de ap al
materiilor prime sunt automat detectate, deci acea calitate constant poate fi obinut
n produsul final.
5.3. Inspecia de curare. Dac un sistem de procese este utilizat n fabricarea

diferitelor produse, este important s se asigure c nu are loc contaminarea.
Refractometrele de proces pot fi utilizate pentru a verifica urme de produse reziduale
n timp real. n acest fel, procesul de curare poate fi optim monitorizat i controlat
pe baza nivelurilor de puritate.
a) Cristalizarea joac un rol central n timpul purificrii solidelor n producia

multor produse farmaceutice. Monitorizarea i controlarea nivelurilor de concen-
traie n timpul fazei de saturaie sunt esentiale pentru inoculare i, ulterior, pentru
procesul de cristalizare. Prin msurarea n timp real, refractometrele de proces ajut
operatorii s controleze optim aceste procese de cristalizare.
35
Fig
gura R6. Refra
actometre porttabile
A. Brix penntru determinnarea concentraiei de zahhr dintr-o prob.

p B. VSST.
Pentru determinarea
d cconcentraiei totale de subsstane dizolvatte (TDS)
5.4. Cea maii larg aplicaaie a refractoometrului estee utilizarea luui n tehnoloogia
producerii vinurilor,
v fiinnd utilizat nn determinareea concentraiiei de zahr din
struguri pentrru a determinna gradul de coacere a struugurilor, n vederea
v msurrrii
progresului prrocesului de ffermentaie, determinnd asstfel cnd struugurii sunt n faza
f
de coacere coomplet i pot fi culei (http://www.moun ndtop.com/fermentation/RB BRIX-
ATC-Fermentaation-Tables.pd df). Instrumenntul utilizat esste de regul un refractom
metru
portabil, uorr de folosit, care indic doar
d concentrraia de zahrr (Figura R6 A).
Recent s-a propus utilizarrea unui refraactometru n combinaie cu c un hidrom metru
pentru o mai corect
c evaluaare a gradului de fermentaiie (Son, H. S. et al., 2009).
5.5. Medicinaa veterinar uutilizeaz refrractometrul peentru determinarea cantittii

totale de serr la vieii nouu-nscui i a calitii coloostrului (Vanddeputte, S. et al.,
2014). Cantittatea de Imunnoglobulin laa un viel nouu-nscut este extrem
e de imppor-
tant pentru viabilitatea
v i evoluia ulterrioar a acestuuia. De aceeaa, determinareea ei
rapid, imediaat dup ftare,, printr-o metood refractometric este exttrem de util.
5.6. Indicele de refracie este corelat direct i cu cantitatea dee compui soolizi
existeni n caafea. Exist uun anumit praag de extraciie care atinge aproximativ 30%
3
din cafeaua suub form de bboabe, restul de
d 70% fiind celuloz
c insoluubil n ap. Dac
D
se depete pragul de eextracie, atunnci cafeaua va v avea un gust g amar ii nu
corespunde sttadardelor; daac se extrage mai puin de 21%, atunci va v fi prea slabb i
din nou nu se ncadreaz n normele cerute. S-a dezzvoltat astfel un refractom metru
digital pentru determinareaa calitii cafellei mcinate (F
Figura R6 B)
(https://cdn.shopify.com/s//files/1/0092/7 7622/ files/Lab
b_Coffee_Userr_Guide.pdf).
36
6. Bibliografie
Pomeranz, Y.; Meloan, C.E. (1994). Refractometry and Polarimetry, Y. Pomeranz
(ed.), p. 768, Springer, Chapman & Hall.
Son, H.S.; Hong, Y.S.; Park, W.M.; Yu, M.A.; Lee, C.H. (2009). A novel approach
for estimating sugar and alcohol concentrations in wines using refractometer
and hydrometer, n Journal of food science 74, C106-111.
Vandeputte, S.; Detilleux, J.; Rollin, F. (2014). Investigation of colostrum quality
in beef cattle by radial immunodiffusion and brix refractometry, n The
Veterinary record 175, 353.
37
7. Teste gril
GR1. Principiul metodei refractometrice const n determinarea:
A. Lungimii de und;
B. Unghiului de inciden al unei raze care trece printr-o prob;
C. Unghiului limit (critic) al unei raze care trece printr-o prob;
D. Concentraiei unei soluii.
GR2. Unghiul limit reprezint:
A. Unghiul de refracie al luminii;

B. Unghiul de inciden al luminii;
C. Unghiul de reflexie al luminii;
D. Unghiul de inciden pentru care unghiul de refracie are 90.
GR3. Unghiul de reflexie format de o raz la trecerea dintr-un mediu M1 n mediul

M2 este:
A. Unghiul dintre raza de lumin reflectat i normala la suprafa n punctul de

inciden;
B. Unghiul dintre raza de lumin reflectat i normala la suprafa ce se formeaz n
M2 (mediul 2) ;
C. Unghiul de 35 dintre raza de lumin i normala la suprafa n punctul de
inciden;
D. Unghiul care se formeaz ntre raza de lumin reflectat i raza de inciden.
GR4. Unghiul de refracie este:
A. Unghiul dintre raza refractat i normala la suprafaa de separaie dintre cele

dou medii n punctul de inciden;
B. Unghiul dintre raza refractat i raza de lumin incident;
C. Unghiul de 90 dintre raza refractat i normala la suprafaa de separaie dintre
cele dou medii;
D. Unghiul format n mediul M1 ntre raza refractat i raza de lumin incident.
38
GR5. Prin metoda matematic, substana al crei indice de refracie este 1,369
determinat din figura alturat are concentraia:
A. 40 mM; Equation y = a + b*x

B. 44,3%; 1.45 Adj. R-Square 0.99436
C. 44,3 mM; 1.44 Value Standard Error
1.43 n Intercept 1.3328 0.00184
D. 60 mM.
1.42 n Slope 8.3E-4 3.60555E-5
1.41
1.40
1.39
n 1.38
1.37
1.36
1.35
1.34
1.33
1.32
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95100
concentratie (mM)
GR6. Considerm indicele de refracie al apei (n=1.333), iar indicele de refracie al

unei substane variaz liniar cu concentraia procentual a acestei substane, graficul
avnd o pant de 8.3*10-4. Utiliznd ecuaia dreptei, se determin concentraia unei
soluii cu indicele de refracie 1.392 ca fiind:
A. 79 %;
B. 71 %;
C. 70 mM;
D. 68 mM.
GR7. Ce volum de soluie cu concentraia 25% s-a utilizat pentru a obine 15 ml de

soluie cu concentraia 2%?
A. 3330 l;
B. 1200 l;
C. 187,5 l;
D. 187,5 ml.
39
GR8. Cu ajutorul refractometrului Abb se determin:
A. Indicele de refracie al soluiei date;

B. Msura unghiului de refracie i reflexie;
C. Concentraia i unghiul specific al substanei de analizat;
D. Indicele de reflexie i msura unghiului de reflexie.
GR9. Indicele de refracie, exprimat matematic , se interpreteaz astfel:
A. Indicele de refracie este dat de raportul dintre concentraia i volumul soluiei

de analizat;
B. Lumina se propag cu o vitez de ori mai mare n vid dect n substana sau
mediul respectiv;
C. Indicele de refracie al unei soluii necunoscute depinde mai mult de concentraia
acesteia dect de volumul su;
D. Viteza luminii n mediu sau substan este de ori mai mare dect viteza luminii
n vid.
GR10. Cnd lumina se deplaseaz dintr-un mediu (M1) cu un indice de refracie n1

ntr-un alt mediu (M2) cu un indice de refracie n2, ea formeaz cu normala la
suprafaa de separare dintre M1 i M2:
A. Un unghi de inciden;
B. Un unghi de inciden i un unghi de refracie n mediul M1;
C. Un unghi de refracie n mediu M1;
D. Un unghi de refracie i un unghi de reflexie n acelai mediu.
GR11. Ce concentraie va avea o soluie de 20 ml tiind c ea s-a realizat prin diluia

a 6,4 ml de soluie cu concentraia 50%?
A. 156,25 %;
B. 2,56 %;
C. 16 %;
D. 4,6 %.
GR12. Indicele de refracie se determin cu ajutorul:

A. Polarimetrului;
B. Osciloscopului;
C. Ecuaiei Nernst;
D. Refractometrului Abb.
40
GR13.
G Relaia dintre
d unghiurrile de inciden
n i cel de reffracie este de
escris de:
A. Legea Snell-Wilson;
B. Ecuaia Nernst;
C. Legea Snell-Descartess;
D. Ecuaia dreptei.
GR14.
G Care din
ntre afirmaiilee referitoare laa indicele de refracie
r este adevrat?
a
A. Este o mrime
m adimen nsional ce carracterizeaz do
oar lumina;
B. Se calcuuleaz cu legeaa Snell-Rne;
C. Indicelee de refracie se msoar n grade;
g
D. E o mrime adimen nsional ce caaracterizeaz lumina sau orice
o alt radiiaie
care se propag ntr-u un mediu.
G 15. Unghiul de refracie aal materialelor variaz cu:

GR
A. Indicelee de refracie;
B. Cantitattea de soluie;
C. Lungimeea de und;
D. Lungimeea cuvei.
e de refracie al unei soluii este 1,39. Concentraia soluiei determin

GR16. Indicele nat
prin metoda grafic
g din figu
ura alturat este:
e
A. 70 %;
B. 80 mM;;
C. 75 %;
D. 67,5 mM
M.
41
GR17.
G Valoarea indicelui de refracie din imaginea de mai
m jos este:
A. 1,434;
B. 1,43-60%
%;
C. 1,446;
D. %.
1,44-60%
GR18.
G Cnd blocul
b prismelo
or este aezat n poziia corect pe o scal
s vizibil prin
ocularul stngg se citete:
A. Indicele dee refracie;

B. Indicele dee reflexie;
C. Lungimea ded und;
D. Concentraia soluiilor.
GR19.
G Salpeta reprezint:
A. Un aparat cu
c care se mssoar lungimeaa cuvei polarim
metrului;
B. Un instrum
ment de laboraator ce determ min gradul de permeabilitaate al membraanei
pentru ioniii de K, Cl i Naa;
C. Un aparat de
d laborator cu ajutorul cru
uia se pipeteazz soluiile;
D. Un aparat de laborator cu ajutorul cruia se mso oar semnalelee prin vizualizaarea
amplitudinii n timp.
8. Resurse on
nline
https://www.yyoutube.com//watch?v=w-YIzLQwtUk
http://www.che.utah.edu/d
department_eq
quipment/Projjects_Lab/A_R
Refractometer//
SOP3_Refracto
ometer_3.pdf
42
Stresul osmotic i procese
de transport membranar n drojdii
1. Obiective
Efectuarea cu succes a experimentului ct mai independent;
Observarea modificrilor de pH cu ajutorul unei soluii indicatoare;
Utilizarea microscopului;
Deprinderea metodei de numrare a celulelor;
nelegerea legturii dintre modificarea de pH i procesele de transport membranar;
nelegerea noiunii de osmolaritate;
nelegerea legturii dintre osmolaritate i procesele de transport.

Lucrarea nu necesit msuri speciale de protecie. Cu toate acestea, soluia de acid
clorhidric (HCl) poate avea un efect uor iritant, astfel c se utilizeaz o pipet
Pasteur cu par pentru extragerea soluiei diluate. Dup utilizare, toate soluiile
preparate vor fi deversate ntr-un recipient dedicat reziduurilor. Trebuie avut grij ca
soluiile stock gsite pe bancul de lucru s nu fie deversate. Pentru ca experimentele
s decurg fr probleme, se vor respecta urmtoarele reguli de lucru:

Se utilizeaz pipete diferite pentru manipularea soluiilor;
Se lucreaz cu grij la microscop astfel nct s nu se sparg lamele;
de mai multe ori i apoi se cltesc cu ap distilat;
Se cur hemocitometrul cu ap i se terge cu un erveel moale;
Se terge platforma microscopului (dup vizualizare) i masa de lucru.
43
CASETA 3 TRANSPORTUL N DROJDII I OSMOLARITATEA
Osmolaritatea
Osmolaritatea reprezint concentraia unui solut ntr-o soluie apoas, ceea ce

corespunde concentraiei moleculelor de solut dizolvate pe unitatea de volum
(mosm/L) (Rosenfeld, L. M., 1996).
Celulele vii au capacitatea de a pierde sau absorbi ap din mediul nconjurtor

datorit permeabilitii membranei celulare pentru ap. Cnd osmolaritatea
mediului nconjurtor este egal cu cea a mediului intracelular, celula se afl n
condiii de izo-osmolaritate. Dac mediul extracelular are osmolaritatea mai mic,
adic o concentraie mai mare de ap, celula va fi n condiii de hipoosmolaritate.
Dac mediul extracelular conine o cantitate mai mic de ap, deci o osmolaritate
mai mare, aceasta este o situaie de hiperosmolaritate. Modificri de osmolaritate
pot aprea n celule n condiii patologice (de exemplu, hipo- sau hipernatremie),
dar chiar i n condiii normale celulele pot genera diferene osmotice la nivel
transmembranar n urma transportului transepitelial al ionilor sau a absorbiei
substanelor organice (Wehner, F. et al., 2003).
Drojdiile, ca orice organism viu, trebuie s absoarb din mediu o serie de

substane pentru desfurarea proceselor metabolice. Procesul de absorbie poate
avea loc n dou moduri: fie prin difuzie pasiv (n sensul gradientului de
concentraie, nu necesit energie), fie printr-un proces activ (necesit energie
pentru a transporta o substan mpotriva gradientului de concentraie) i selectiv.
Odat intrate n drojdii, aceste substane vor afecta metabolismul celulelor,
determinnd modificri de pH. Pn acum, n drojdii au fost descrise procese de
transport ale Na+ (Ohgaki, R. et al., 2005), K+ (Reilly, C., 1967) sau ale
bicarbonatului (Jennings, M. L. et al., 2007). La fel ca pentru ioni sau alte
molecule, celulele sunt permeabile i pentru ap, a crei concentraie este invers
proporional cu concentraia soluilor. Astfel, apa tinde s difuzeze dintr-un
mediu mai diluat (unde este mai mult) ntr-un mediu mai concentrat. Procesul de
difuzie al apei se numete osmoz. n momentul n care apa difuzeaz ntr-un
mediu, volumul acestui mediu va crete, iar osmolaritatea va scdea.
44
Modificrile de osmolaritate induc modificri ale morfologiei i fiziologiei
celulare, astfel:
Trecerea dintr-un mediu izoosmotic ntr-unul hipoosmotic determin creterea

volumului i umflarea celulelor, n urma difuziei apei din mediul extracelular n
mediul intracelular. Celulele trec prin procesul de reglare a volumului celular i
revin la volumul iniial prin pierderea de ap i electrolii.
Trecerea dintr-un mediu izoosmotic ntr-unul hiperosmotic determin pierderea de

ap din celule, micorarea celulelor, modificri ale membranei celulare i, n final,
moartea lor.
3. Materiale
Tuburi Corning;
Pahar Berzelius;
Pipete Pasteur;
Filtre;
Seringi 20 ml;
Microscop optic (Figura D2);
Vase Petri;
Microscopul optic cu inversie (Figura D1).
45
Figura D1. Microscopul optic
46
Pipet Tub Corning 50 ml
P
Pahar Berzelius Filtru
Cam
mer de numrat/Hemocitometru
Fig
gura D2. Instru
umente de labo
orator
47
Pachet de drojdie uscat de 7 grame (Saccharomyces cerevisiae);
Soluie de bicarbonat de sodiu (NaHCO3) de concentraie 2% sau 5%;
Soluie NaOH 0,1 M;
Soluie HCl 0,1 M;
Soluii cu osmolariti diferite: NaCl 9g/l (mediu izoosmotic), NaCl 20g/l
(mediu hiperosmotic), ap distilat (mediu hipoosmotic);
Colorant neutru: rou de fenol;
Camer de numrat/Hemocitometru;
Soluie pentru indicarea viabilitii celulare (tripan-blue).
nainte de a ncepe executarea experimentului se va verifica dac pe masa de lucru
sunt toate materialele necesare indicate la punctul 3.
4.1. Experimentul A Absorbia selectiv a drojdiilor
1. Se vor prepara n trei tuburi Corning de 10 ml urmtoarele amestecuri:
a. 1 ml soluie colorant neutru (rou de fenol) cu NaOH- care se va picura. Se

vor nota momentele (timpul) n care culoarea se schimb;
b. 1 ml soluie colorant neutru cu NaHCO3- care se va picura. Se vor nota

momentele n care culoarea se schimb;
c. 1 ml soluie colorant neutru cu HCl- care se va picura. Se vor nota momentele

n care culoarea se schimb i se va completa urmtorul tabel:
Amestec Culoare pH
HCl + rou de fenol
NaHCO3 + rou de fenol
NaOH + rou de fenol
48
Explicai modificrile de culoare i rolul colorantului.
2. Se vor cntri 5 g drojdie i se vor dizolva n 50 ml de ap cald;
3. Se vor lua 20 ml din aceast soluie i se vor pune n patru tuburi Corning de 50
de ml- cte 5 ml n fiecare tub. Se vor aduga:
a. n primul tub: 5 ml de soluie de NaHCO3 n suspensie, se va omogeniza. Se

va picura colorant neutru peste acest amestec i se vor observa modificrile de
culoare;
b. n al doilea tub: 2 ml de soluie NaOH, se va omogeniza. Se va picura colorant

neutru peste acest amestec i se vor observa modificrile de culoare;
c. n al treilea tub: 1 ml de soluie HCl, se va omogeniza. Se va picura colorant

neutru peste acest amestec i se vor observa modificrile de culoare;
d. n al patrulea tub: se va picura colorant neutru peste cei 5 ml de soluie de

drojdii (tub control);
4. Timp de douzeci de minute se vor obseva modificrile de culoare. Se va nota

din cinci n cinci minute ceea ce se observ (sau se vor face fotografii);
5. Cu ajutorul unei seringi de 20 de ml se vor extrage 5 ml din toate tuburile

Corning pe rnd. Se va filtra acest amestec ntr-un pahar Berzelius. Pentru a etala
pe lam drojdiile, se va scoate membrana filtrant din suport i se va terge cu
partea ncrcat cu drojdii, pe lam. Imediat dup aceasta se va pune o lamel
peste poriunea cu drojdii pentru a se evita uscarea acestora. Operaiunea se va
repeta pentru celelalte amestecuri de soluii de drojdii cu NaOH, NaHCO3 i
pentru amestecul de drojdii cu colorant neutru;
6. n ultima parte a experimentului se vor observa la microscopul optic modificrile

de culoare intracitoplasmatice pe care drojdiile le sufer n toate cele patru
amestecuri. Se va ncepe cu observarea lamei notate Martor, pe care sunt
etalate drojdiile cu colorant neutru, nti la o mrire de 10x i apoi la 40x;
7. Se va completa urmtorul tabel:
49
Amestec Culoare pH
drojdii + rou de fenol
HCl + drojdii + rou de fenol
NaHCO3 +drojdii + rou de fenol
NaOH + drojdii + rou de fenol
4.2. Experimentul B Determinarea viabilitii celulare n urma modifi-

crilor de osmolaritate
1. n trei vase Petri se vor pune 10 ml mediu:
a. izoosmotic (NaCl 9g/l);
b. mediu hiperosmotic (NaCl 20g/l);
c. mediu hipoosmotic (ap distilat).
n fiecare dintre aceste vase se vor aduga 2 g de drojdie uscat (Saccharomyces

cerevisiae) i se amestec uor;
2. Se las aproximativ 15-20 de minute, dup care se vor observa la microscopul

optic cu ajutorul hemocitometrului, la o putere de mrire de 20x;
3. Se realizeaz o suspensie 1 ml de celule 1:1 cu tripan blue (indicator de

viabilitate);
4. Soluiile trebuie agitate uor nainte de a fi ncrcate n hemocitometru; astfel, se

va realiza o distribuie uniform a drojdiilor n soluie. Hemocitometrul se
verific s fie curat, dac este ptat se va cura cu ap i se va terge cu un
erveel neabraziv;
5. Pentru ncrcarea probelor pe hemocitometru se va folosi o pipet Pasteur curat.

Se plaseaz lamela peste camera de numrat a hemocitometrului i apoi, cu
ajutorul pipetei, se va aduga proba (agitat n prealabil);
6. Foarte important este faptul c soluia nu trebuie mpins cu putere deoarece prin
capilaritate aceasta va umple camera de numrat;
50
7. Se determiin numrul dde celule viabille, astfel:
a. Se num
mr celulele ddin cele 5 ptraate mari, evitnd numrareaa lor de dou ori;
o
b. Suspensia trebuie fccut n aa fel inct celulele s nu se suprrapun; dac acest

a
lucru see ntmpl, se mai face o dilluie;
c. Pentru acuratee
a se nuumr doar ceelulele n care nu a ptruns tripan
t blue;
d. Se calcuuleaz numruul de celule coonform formuulei:
factoor de dilutie
numar tottal de celulee = celule num
marate 10000 celulee / ml
numaar de patratee
8. Se observ cum osmolarritatea soluiilor utilizate peentru acest expperiment modiific

numrul ceelulelor viabille de Saccharoomyces. Se vaa completa urm mtorul tabel:
Caracteristtici prob Numr to

otal de celule Numr tottal de celule
viabile
Soluie NaCl 9gr/l
Soluie NaCl 20 gr/l
Ap distilaat
51
5. Bibliografie
Reilly, C. (1967). Sodium and potassium transport in normal and mutant yeasts:
inhibition by o-phenanthroline, n Nature 214, 1330-1331.
Rosenfeld, L.M. (1996). Physiology of water, n Clinics in dermatology 14, 555-
561.
Wehner, F.; Olsen, H.; Tinel, H.; Kinne-Saffran, E.; Kinne, R.K.H. (2003). Cell
volume regulation: osmolytes, osmolyte transport, and signal transduction,
n Rev Physiol Biochem Pharmacol, S.G. Amara E. Bamberg F, M.P.
Blaustein BHG, Innsbruck, R. Jahn GtWJL, Baltimore, A. Miyajima THM,
Zrich, S. Offermanns HNP, Freiburg i G. Schultz BMS, Berlin (eds.),
p. 157, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg.
Jennings, M.L.; Howren, T.R.; Cui, J.; Winters, M.; Hannigan, R. (2007).
Transport and regulatory characteristics of the yeast bicarbonate transporter
homolog Bor1p, n American journal of physiology Cell physiology 293,
C468-476.
Ohgaki, R.; Nakamura, N.; Mitsui, K.; Kanazawa, H. (2005). Characterization of
the ion transport activity of the budding yeast Na+/H+ antiporter, Nha1p,
using isolated secretory vesicles, n Biochimica et biophysica acta 1712,
185-196.
52
6. Teste gril
GD1. Drojdiile extrase dintr-un amestec care coninea rou de fenol aveau o culoare
portocalie deschis atunci cnd au fost observate la microscop. Ulterior s-a adugat o
soluie de H2SO4 i s-a observat c amestecul a cptat o culoare roie nchis. Ce se
poate spune c au absorbit drojdiile din soluie?
A. Att ionul de H+, ct i cel de SO-4;
B. Ionul de H+, dar nu i cel de SO-4;
C. Ionul de SO4-, dar nu i cel de H+;
D. Oricare dintre ioni.
GD2. Ce se poate spune despre pH-ul citoplasmei unei celule dac la microscop se
observ o culoare roie deschis aproape transparent?
A. pH-ul citoplasmei este foarte acid;
B. Nimic;
C. pH-ul citoplasmei este alcalin;
D. pH-ul citoplasmei este bazic.
GD3. Procesul de absorbie al unei substane din mediu are loc:
A. n trei moduri: n mod pasiv, n mod activ sau n mod selectiv;
B. n dou moduri: n mod pasiv sau n sensul gradientului de concentraie;
C. n dou moduri: n mod pasiv sau n mod activ i selectiv;
D. n trei moduri: n mod pasiv, n sensul gradientului de concentraie sau selectiv.
GD4. ntr-o soluie de drojdii cu rou de fenol s-a adugat o soluie de KOH i s-a
observat c amestecul a cptat o nuan roie nchis. Ce se poate spune c au
absorbit drojdiile?
A. Att ionul de K+, ct i ionul de OH-;
B. Ionul de OH-, dar nu i cel de K+;
C. Nimic;
D. Cristalul de KOH.
53
GD5. Pentru a determina pH-ul unei soluii este nevoie de:
A. Un colorant neutru;
B. Un voltmetru;
C. Soluii acide i alcaline pentru a realiza o curb de calibrare;
D. Un indicator de pH.
GD6. ntr-o suspensie de celule s-a adugat o soluie de NaCl. Ce specie ionic a fost
transportat n sensul gradientului de concentraie n celule?
A. Na+;
B. Cl-;
C. Ap;
D. Nu se poate determina din aceste date.
GD7. Se va completa urmtoarea afirmaie cu unul din termenii din list: Rou fenol
este o ..................., ntruct schimb culoarea soluiilor cu care este amestecat, n
funcie de pH-ul acestora.
A. Substan cu caracter alcalin;
B. Substan indicatoare de pH;
C. Substan cu caracter slab acid;
D. Substan amfoter (care se comport ca o baz fa de un acid i invers).
GD8. O suspensie de celule conine i un indicator de pH care poate fi transportat prin

membrana celular i a crui culoare se modific de la rou foarte nchis n mediu acid
la rou foarte deschis n mediu bazic. ntr-un mediu de cultur obinuit, dar care nu
conine glucoz, intracelular se observ o culoare roie nchis. n momentul adugrii
a 5 mM glucoz, mediul intracelular devine rou deschis. Se poate concluziona c:
A. Glucoza este acid, ca urmare modific i mediul intracelular corespunztor;
B. Glucoza este bazic, ca urmare modific i mediul intracelular corespunztor;
C. Celulele pot absorbi glucoza;
D. pH-ul intracelular se modific de la bazic la acid.
54
GD9. O suspensie de celule aflate doar ntr-un mediu de cultur obinuit, dar care nu
conine glucoz, intracelular se observ o culoare roie nchis. n momentul adugrii
a 5 mM glucoz, mediul intracelular devine rou deschis. Se poate concluziona c:
A. pH-ul intracelular se modific de la bazic la acid;
B. Observm o culoare provenit de la alte surse;
C. Glucoza este bazic, ca urmare modific i mediul intracelular corespunztor;
D. Celulele pot absorbi glucoza.
GD10. Pentru a se observa ce soluii au fost absorbite de ctre Saccharomyces

cerevisiae:
A. Se vor face observaii asupra modificrilor formei celulelor;
B. Se vor face observaii asupra dimensiunii celulelor;
C. Se vor face observaii asupra membranei celulelor;
D. Se vor observa modificri de pH.
GD11. ntr-o soluie de drojdii cu rou de fenol s-a adugat o soluie de KCl i s-a
observat c amestecul a cptat o nuan roie. Ce se poate spune despre caracterul
(pH-ul) soluiei de KCl?
A. Soluia are un caracter amfoter (care se comport ca o baz fa de un acid i

invers);
B. Soluia are un caracter acid;
C. Soluia are un caracter neutru;
D. Soluia are un caracter alcalin.
GD12. Pentru a determina modificrile de pH intracelular al unor celule aprute n

urma absorbiei glucozei din mediul extracelular trebuie s utilizm:
A. O prob martor care s nu conin glucoz;
B. Un osciloscop pentru determinarea cu precizie a potenialului de membran;
C. Un polarimetru prin care s determinm modificri ale rotaiei specifice a luminii

determinate de glucoz;
D. O soluie acid prin care s putem indica transportul de ioni de H+.
55
GD13. ntr-un experiment n care urmrim s determinm modificri la nivel intra-
celular al unui parametru (de exemplu, concentraia ionilor de Na+), proba martor va
conine:
A. O soluie indicatoare de pH;
B. Electrozi pentru a determina potenialul de echilibru al ionului de Na+;
C. O suspensie identic cu cea pe care vrem s o determinm, dar care nu conine Na+.
O suspensie cu o concentraie cunoscut de Na+.
7. Resurse online
http://www.hemocytometer.org/2013/04/09/counting-yeast-with-a-hemocytometer/
http://depts.washington.edu/eooptic/links/acidstrength.html
http://www.indiana.edu/~nimsmsf/P215/p215notes/LabManual/Lab5.pdf
http://bitesizebio.com/13687/cell-counting-with-a-hemocytometer-easy-as-1-2-3/
56
Vizualizarea i msurarea semnalelor electrice
cu ajutorul osciloscopului (O)
1. Obiective
Familiarizarea cu osciloscopul catodic, aparat foarte des ntalnit n practica de
laborator i n cea medical;
Obinerea i observarea unui semnal electric n curent alternativ (AC);
Determinarea caracteristicilor (frecvena i amplitudinea unui semnal electric);
Observarea i caracterizarea sunetelor;
Observarea figurilor Lissajous.

Utilizarea acestui aparat i a unor surse cu frecvene joase nu necesit msuri spe-
ciale de protecie. Se lucreaz cu osciloscopul i sondele de conectare ale acestuia
numai pe bancul de lucru dedicat, care nu este situat n apropierea unei surse de ap.
Se vor conecta la osciloscop doar sursele i cablurile indicate de ndrumatorul de
lucrri.
Se va evita orice contact cu substane corozive (HCl, H2SO4) sau ap;

Se vor verifica prizele la care se conecteaz aparatul pentru a fi n stare bun de
funcionare;
n momentul pornirii aparatului se ateapt pn cnd acesta i face toate
setrile.
57
CASETA 4 OSCILOSCOPUL CATODIC: NOIUNI FUNDAMENTALE
Osciloscopul catodic este un instrument electronic de msur care permite vizuali-

zarea variaiei n timp a unei tensiuni periodice sub forma unui grafic bidimensional
(voltaj versus timp) pe ecranul unui tub catodic. O alt funcie principal a
osciloscopului este vizualizarea formei de variaie n timp a unei tensiuni n raport
cu alt tensiune.
Se msoar practic un curent alternativ. Curentul alternativ i schimb amplitudinea
i direcia. Forma cea mai comun a curentului alternativ este semnalul sinusoidal
generat de un generator de frecvene.
Figura O1. Tensiunea semnalului de la vrf la vrf (peak to peak) este Vp-p , perioada
este T, iar frecvena se calculeaz 1/T. Amplitudinea semnalului este notat cu A.
Semnalul sinusoidal este descris de urmtoarea ecuaie: sin . Se

numete viteza unghiular 2 f, unde f este frecvena semnalului (numrul de
cicluri n unitatea de timp) n Hz i reprezint inversul perioadei. n Figura O1 este
reprezentat semnalul aa cum apare pe ecranul osciloscopului. Valoarea vrf la vrf
(peak-to-peak) a unui semnal, notat Vp-p n Figura O1, este diferena dintre
valoarea maxim i valoarea minim a semnalului, iar A este amplitudinea sem-
nalului sinusoidal. Semnalele din curent alternativ (AC) nu se pot msura cu un
ampermetru din cauza modificrilor de sens i de frecven. Ecranul osciloscopului
figureaz amplitudinea (tensiunea, voltajul) unui semnal n timp. Toate oscilo-
scoapele conin cteva comutatoare de baz, conform Figurii O2. La cele mai multe
osciloscoape exist posibilitatea de a conecta dou sau mai multe generatoare
58
simultan. Cele mai importante butoane care permit vizualizarea corect a semnalului
sunt urmatoarele:
Figura O2. Panoul frontal al osciloscopului cu principalele comenzi.
Butonul Autoscale (1) care permite setarea automat a scalelor verticale i orizon-
tale pentru afiarea semnalului.
Butoanele Volts/Div (2) seteaz scala vertical. Pentru vizualizarea unor semnale de
amplitudine mic se rotete acest buton spre dreapta, n timp ce pentru semnale cu
amplitudine mare se nvrte spre stnga. Osciloscoapele au limite (maxime i
minime) de detecie a semnalelor. Butonul SEC/DIV (3) determin viteza de
baleiere. ntoarcerea acestui buton n sensul acelor de ceasornic (mai multe diviziuni
pe unitatea de timp) permite afiarea semnalelor mai rapide, n timp ce rotirea lui n
sens invers acelor de ceasornic (mai puine diviziuni pe unitatea de timp) permite
vizualizarea semnalelor cu frecvena mai mic. Butonul Delay (4). Acest buton
permite mutarea semnalului ctre dreapta sau ctre stnga, permind vizualizarea
altor pri din semnal. Uniti de msur: 1000 mV=1V; 1 KHz = 1000 Hz;
1 s=1000 ms.
59
3. Materiale
Pentru msurarea semnalului este nevoie de:

Un osciloscop cu tub catodic;
Generator de frecvene;
Generator de sunete;
Cabluri de conexiune BNC;
Sond pentru osciloscop.
1. Generatorul de joas frecven EO501 se regleaz la frecvene de 2 Hz (x1 pe

butonul de amplificare din stnga) i la tensiunea de 0,4 V din butonul din partea
dreapt pe care este figurat tensiunea maxim de 1,5 V.
2. Se conecteaz generatorul de semnale cu ajutorul cablurilor la canalul 1 (CH1) al
osciloscopului, conform Figurii O3. Se apas butonul CH1 pentru asigurarea c
trasa de pe acest canal este vizibil.
3. Se conecteaz osciloscopul la reeaua de alimentare, apoi se pornete aparatul de
la comutatorul din partea superioar. Comutatorul SEC/DIV se fixeaz pe o
poziie median (ntre 0.1ms/div i 1ms/div).
4. Dup ce aparatul i face toate setrile, apare pe ecran o tras (o linie orizontal).
Utiliznd reglajele POSITION, trasa se poziioneaz central pe una dintre liniile
orizontale ale ecranului.
5. Se stabilizeaz semnalul prin fixarea scalei de msur din butoanele corespun-
ztoare canalului la care s-au fcut conexiunile. Butonul VOLTS/DIV controleaz
scala vertical. Butonul SEC/DIV controleaz scala orizontal. ncercai s
obinei o oscilaie complet pe tot ecranul. Important: butoanele de reglare a
scalelor nu afecteaz semnalul n niciun fel. Trebuie privite drept comenzi zoom
in, zoom out.
60
4.1. Exerciiul A Caracterizarea unui semnal electric n curent alternativ
(AC)
1. Modificai semnalul conform tabelului i completai Fia nr. 1 (a, b sau c).
2. Variai frecvena undelor generate prin rotirea butonului mare de pe generatorul
de frecvene. Valoarea frecvenelor generate este dat de valoarea scris pe buton.
3. Msurai perioada (T) a oscilaiilor prin numrarea diviziunilor orizontale
# nr de divizuni * SEC/DIV = T (s).
4. Calculai frecvena semnalului (n Hz) pe ecran din perioada obinut la punctul
4, unde
1
Comparai cu frecvena setat de generator. Dac apar diferene, explicai-le.

5. Msurai amplitudinea undelor prin numrarea diviziunilor verticale:
# of diviziuni * VOLTS/DIV = tensiune (voltaj) (V).
6. Variai tensiunea semnalului conform tabelelor i completai Fia nr. 2. Utilizai
butonul de divizare a valorii tensiunii i explicai n scris cum ai facut setrile
(1V=1000 mV).
4.2. Exerciiul B - Caracterizarea undelor sonore (AC)
1. Conectai generatorul de sunete conform imaginii O4, la canalul 2 (CH2).

2. Setai frecvenele i amplitudinile conform Fiei nr. 3.
3. Setai scalele astfel nct pe ecranul osciloscopului s fie afiat un semnal clar,
uor de msurat.
4. Fixai imaginea cu ajutorul butonului RUN/STOP.
5. Desenai semnalele diferite i trecei pe fiecare desen tensiunea i perioada
semnalului.
6. Putei asculta sunetele generate conectnd casca la mufa indicat pe aparat.
61
4.3. Exerciiul C Figurile Lissajous
1. Conectai ambele generatoare (de frecvene joase i de sunet pe cte un canal).

2. Modificai frecvenele i amplitudinile semnalelor provenite din ambele aparate.
3. Apsai butonul Display.
4. Comutai din butoanele marginale pe modul Format XY. Acest mod impune un
semnal pe axa X, iar cellalt pe axa Y, astfel nct se poate determina raportul
dintre cele dou frecvene ale semnalelor. n acest fel se poate determina un
semnal cu o frecven necunoscut folosind un semnal cu frecven cunoscut.
5. Conform Fiei Nr. 4, determinai frecvenele necunoscute.
4.4. Exerciiul D Determinarea unui semnal vocal prin intermediul unui

microfon
1. Conectai un microfon la mufa EXT TRIG.

2. Fluierai n microfon. ncercai s obtinei un semnal.
3. Ridicai tonul. Ce se ntmpl? Descriei calitativ datele obinute.
4. Vorbii mai repede.
5. Descriei ce anume din modularea vocii modific amplitudinea i/sau frecvena
semnalului.
62
FIA NR. 1
a)
Frecvena #DIV setare Perioada Frecvena msurat #DIV setare Vpp amplitudine
setat la aparat orizontal SEC/DIV (s) pe osciloscop vertical VOLT/DIV (V) (V)
(Hz)
63
3
3 X 102
3 X 103
3 X 104
Frecvena maxim detectabil
60
b)
Frecvena #DIV setare Perioada Frecvena #DIV setare Vpp amplitudine

msurat
setat la aparat orizontal SEC/DIV (s) pe vertical VOLT/DIV (V) (V)
(Hz) osciloscop
1.8
64
2.5
2.5 X 102
2.5 X 103
2.5 X 104
Frecvena maxim
detectabil
61
c)
Frecvena #DIV setare Perioada Frecvena #DIV setare Vpp amplitudine

msurat
setat la aparat orizontal SEC/DIV (s) pe vertical VOLT/DIV (V) (V)
(Hz) osciloscop
65
6
6X102
6X103
6X104
Frecvena maxim
detectabil
62
FIA NR. 2
Tensiunea setare Vpp amplitudine Tensiunea #DIV #DIV setare

msurat
setat la aparat VOLT/DIV (V) (V) pe vertical orizontal SEC/DIV
(mV) osciloscop
1 mV
20 mV
66
200 mV
0.5 V
1V
1.5 V
63
b)
Tensiunea setare Vpp amplitudine Tensiunea #DIV #DIV setare

msurat
setat la aparat VOLT/DIV (V) (V) pe vertical orizontal SEC/DIV
(mV) osciloscop
3 mV
30 mV
67
300 mV
0.6 V
1V
1.5 V
64
FIA NR. 3
a)
Frecvena Tensiunea (~) setare setare Semnal obinut
setat setat la aparat SEC/DIV VOLT/DIV
(mV)
50 Hz 1
68
65
b)
(V)
100 Hz 1
69
66
c)
(mV)
4 kHz 2
70
67
d)
(mV)
10 kHz 3
71
68
e)
(V)
1.5 kHz 4
72
69
FIA NR. 4
Frecvena generatorului Frecvena ateptat a Frecvena msurat a

Figura obinut
de frecvene joase (CH1) generatorului de sunet generatorului de sunet
73
70
5. Teste grile
GO1. Un semnal sinusoidal are amplitudinea de 5 V. Pentru msurarea tensiunii de

la vrf la vrf cnd setarea VOLTS/DIV este 5 V pe osciloscop va fi urmtorul numr
de diviziuni:
A. 5;
B. 2;
C. 10;
D. 1.

de diviziuni:
A. 2;
B. 2,5;
C. 10;
D. 4.

de diviziuni:
A. 2;
B. 2,5;
C. 8;
D. 1.
GO4. Un semnal sinusoidal are amplitudinea de 800 mV. La ct este setarea

VOLTS/DIV cnd pe osciloscop sunt dou diviuni pe axa vertical de la vrf la vrf?
A. 0,4 V;
B. 0,5 V;
C. 1 V;
D. 0,8 V.
74
GO5. Setarea VOLTS/DIV este la 2 V, iar pe osciloscop sunt 3 diviziuni pe axa vertical
de la vrf la vrf. Semnalul sinusoidal are amplitudinea:
A. 6 V;
B. 5 V;
C. 1 V;
D. 3 V.
GO6. Un semnal sinusoidal are frecvena de 5 Hz. Cnd setarea SEC/DIV este 200 ms,
pe osciloscop va fi urmtorul numr de diviziuni pe axa orizontal de la vrf la vrf:
A. 5;
B. 2,5;
C. 10;
D. 1.
GO7. Un semnal sinusoidal are frecvena de 100 Hz. Pentru msurarea perioadei cnd
setarea SEC/DIV este 1 ms pe osciloscop va fi urmtorul numr de diviziuni:
A. 2;
B. 2,5;
C. 10;
D. 1.
GO8. Un semnal sinusoidal are perioada de 20 ms. Pentru msurarea frecvenei cnd
setarea SEC/DIV este 1 ms, pe osciloscop va fi urmtorul numr de diviziuni pe axa
vertical:
A. 2;
B. 2,5;
C. 4;
GO9. Modificarea setrii osciloscopului de la 1 SEC/DIV la 5 SEC/DIV va modifica

frecvena semnalului de la 1 Hz la:
A. 5 Hz;
B. 2,5 Hz;
C. 10 Hz;
75
GO10. Dac setarea VOLTS/DIV este de 0,2, ce amplitudine are semnalul din figur?
A. 2 V;
B. 300 mV;
C. 10 V;
D. 3 V.
GO11. Dac setarea VOLTS/DIV este 10 V, ce valoare de la vrf la vrf are semnalul
din figur?
A. 20 V;
B. 200 mV;
C. 2 V;
D. 5 V.
GO12. Dac semnalul are 800 mV de la vrf la vrf, la ce setare VOLTS/DIV este fixat
osciloscopul?
A. 8V
B. 200 mV
C. 1V
D. 0,4 V
GO13. Dac semnalul are 50 Hz, la ce setare SEC/DIV este osciloscopul?
A. 1 s;
B. 20 ms;
C. 5 s;
D. 100 ms.
76
GO14. Dac setarea VOLTS/DIV este de 2 V, ce valoare de la vrf la vrf are semnalul
din figur?
A. 2 V;
B. 300 mV;
C. 6 V;
D. 3 V.
GO15. Un semnal cu frecvena de 50 Hz are o perioad de:
A. 10 ms;
B. 20 ms;
C. 20 s;
D. 20 V.
GO16. Un semnal cu tensiunea Vp-p de 50 mV are amplitudinea:
A. 25 mV;
B. 25 V;
C. 50 mV;
D. 25 ms.
O17. Pe osciloscop este setat scala de voltaj la 3V/DIV. Un semnal reprezentat prin
4 diviziuni de la vrf la vrf pe scala vertical are o amplitudine de:
A. 600 ms;
B. 60 mV;
C. 6 V;
GO18. Un semnal cu frecvena de 100 Hz are o tensiune de:
A. 600 ms;
B. 60 mV;
C. 6 V;
D. Nu poate fi determinat din aceste valori.
77
GO19. Un semnal cu amplitudinea de 7 mV are o perioad de:
A. 14 ms;
B. 50 s;
C. 70 ms;
D. Nu poate fi determinat din aceste valori.
GO20. n tabelul de mai jos sunt figurile Lissajous, obinute prin conectarea a dou
semnale dintre care unul cu frecvena cunoscut (pe axa OX). Determinai frecvena
semnalului necunoscut de pe axa OY.
Figura Lissajous Frecvena cunoscut Frecvena necunoscut

(Hz) (rspuns corect)
(Hz)
30
20
10
100
78
6. Resurse online
Oscilloscope Lab http://www2.hawaii.edu/~jmcfatri/labs/oscilloscope.html.
79
Potenialul de repaus al celulelor.
Relaia Nernst. Relaia Goldman (GN)
1. Obiective
Familiarizarea cu noiunile de potenial la echilibru al unui ion i de potenial
membranar de repaus;
Realizarea de simulri care permit determinarea celor dou poteniale pentru mai
multe tipuri de celule;
Identificarea parametrilor importani pentru calculul potenialelor Nernst i
Goldman;
nelegerea importanei urmtorilor parametri pentru calculul potenialelor Nernst
i Goldman:
i) concentraia ionilor de Na+, K+ i Cl- n compartimentul intracelular sau
extracelular;
ii) temperatura;
iii) permeabilitatea membranei pentru cele trei tipuri de ioni;
Reprezentarea grafic a valorilor determinate;
Observarea fenomenelor bioelectrice care apar la nivelul unei membrane, utiliznd
o membran artificial:
Efectuarea cu succes a experimentului n condiii de siguran;
Dobndirea capacitaii de a prepara soluii cu concentraii molare, diluii;
Aplicarea relaiei Nernst pentru calculul potenialului de echilibru;
Estimarea rapoartelor de permeabilitate ale unei membrane artificiale aplicnd
relaia Goldman.
Lucrarea nu necesit msuri speciale de protecie.

Pentru exerciiul A, activitatea va fi desfurat pe calculator, ceea ce implic
respectarea urmtoarelelor norme:
Toate fiierele obinute se vor salva n folderul indicat la nceputul laboratorului;
80
Se va evita salvarea de fiiere pe Desktop;
Nu vor fi instalate programe descrcate de pe internet;
Pentru transferul datelor nu se vor utiliza uniti de stocare virusate;
n caz de nevoie, calculatoarele vor fi restartate doar utiliznd opiunea Restart
din meniul Start;
Calculatoarele vor fi stinse doar utiliznd opiunea Shut down din meniul
Start;
n cazul n care restartarea sau oprirea calculatorului nu este posibil utiliznd
indicaiile de mai sus, se va evita scoaterea din priz a calculculatorului sau
realizarea altor manevre care ar putea deteriora calculatorul.
n cadrul exerciiului B, se lucreaz cu soluii pentru care nu sunt necesare msuri

speciale de protecie. Trebuie avut grij ca soluiile stock gsite pe bancul de lucru
s nu fie deversate. Pentru buna desfurare a experimentului trebuie respectate
urmtoarele norme:
Diluiile se prepar n pahare Berzelius sau n pahare Erlenmeyer individuale;
Dup ncheierea experimentului, compartimentele cuvei Ussing, membrana
selectiv, pipetele, paharele i celelalte materiale utilizate se spal cu ap de la
robinet de mai multe ori i apoi se cltesc cu ap deionizat;
n cazul pipetelor serologice se folosete pipetorul i apa deionizat pentru
curarea lor;
81
CASETA 5 FENOMENE BIOELECTRICE N MEMBRANELE CELULARE
Fenomenele electrice sunt specifice tuturor celulelor vii. Acest fapt este datorat
prezenei a numeroase tipuri de atomi i molecule ionizate, deci cu sarcin electric,
att n citoplasma celulelor, ct i n mediul extracelular. Permeabilitatea selectiv a
membranelor celulare mpreun cu activitatea metabolic a celulelor contribuie la
meninerea unor diferene de concentraie ale moleculelor cu sarcin electric n
mediul intracelular fa de mediul extracelular (Hille, B., 2001). Astfel, o
caracteristic de baz a oricarei celule vii este existena unei diferene de potenial
ntre faa extern i faa intern a membranei celulare. Aceast diferen de potenial
se numete potenial de repaus (PR) i are valori cuprinse ntre -50 mV i -100 mV.
Pentru a nelege potenialul de repaus al celulelor este important nelegerea
permeaiei speciilor individuale de ioni. Ionii sunt purttori de sarcin extrem de
mobili, fiind capabili s difuzeze cu uurin de pe o fa a membranei pe cealalt
prin intermediul proteinelor canal. Difuzia ionilor este dictat de gradienii chimici
(diferena de concentraie dintre cele dou compartimente) i electrici (diferena de
sarcin electric dintre cele dou compartimente). Relaia dintre cei doi gradieni
este descris cantitativ de ecuaia Nernst:
R- constanta universal a gazului ideal ( 8,314 Joule/ K*mol)
T- temperatura n grade Kelvin (K = C0 +273)
F- Numrul lui Faraday (e* NA= 9,64833*104 C/ mol-1)
z- valena ionului transportat
- concentraia ionului n exteriorul celulei (msurat n mM)
- concentraia ionului n interiorul celulei (msurat n mM)
Rezultatul aplicrii ecuaiei Nernst, (msurat n mV) reprezint potenialul la

echilibru pentru respectivul ion i, aa cum arat ecuaia, depinde doar de
concentraia ionului n afara i n interiorul celulei, de valena ionului i de
temperatur.
82
S-a observat c membrana celular nu are aceeai permeabilitate pentru toi ionii.
Din acest motiv, speciile de ioni pentru care membrana este mai permeabil vor
influena mai mult potenialul membranar. Relaia care integreaz i permeabilitatea
membranei pentru diferii ioni se numete relaia Goldman-Hodgkin-Katz (adesea
numit simplu ecuaia Goldman). Ecuaia Goldman calculeaz un potenial de
membran ( , msurat n mV) care reflect contribuiile relative ale gradienilor de
concentraie chimic i permeabilitatea relativ a membranei pentru K+, Na+ i Cl-:
R- constanta gazelor (8, 314 Joule K-1 mol-1)
T- temperatura n grade Kelvin (K=C +273)
F- constanta lui Faraday (cantitatea de sarcin electric aflat ntr-un

mol de electroni = 96 485 coulomb mol-1)
z- valena ionului transportat
- concentraia ionului de Na+ n exteriorul celulei (msurat n mM)
- concentraia ionului de Na+ n interiorul celulei (msurat n mM)
- permeabilitatea membranei pentru ionii de Na+
83
3. Materiale
Simulrile dinn cadrul exercciiului A vor fi realizate uttiliznd:
Calculatorrul din Laboratorul din Bioffizic.
Programull The NER RNST/GOLDM MAN equatiion simulatoor, dezvoltatt de
Colegiul de
d Medicin diin cadrul Univversitii din Arizona.
A
Reprezentaarea grafic a rezultatelor va fi efectuaat utiliznd Microsoft
M Offfice
Excel 20077.
Cuva Ussing pH-meetru
Buton de
e aspirare
Buton de evacuare
pomp

Pipetorr automat (salp

pet) Pahar Berrzelius Pah
har Erlenmeyerr
Fig
gura NG1. Usttensile de labo
orator
84
Pentru realizarea exerciiului B sunt necesare urmtoarele aparate i substane:
Cuva Ussing;
Membran selectiv-permeabil;
Electrozi de tensiune;
pH-metru sau osciloscop;
Soluie stoc salin (NaCl i KCl);
Ap deionizat;
Pipetor automat (salpet);
Pipete serologice;
Pahare Berzelius sau pahare Erlenmeyer.
4.1. Exerciiul A Programul The NERNST/GOLDMAN equation

simulator va fi accesat utiliznd executabilul ngswin.exe care se gsete
pe Desktopul calculatoarelor din Laboratorul de Biofizic. Programul
cuprinde patru module:
Nernst: modulul este destinat calculului potenialului la echilibru pentru ionii de

K+, Na+ i Cl- i permite modificarea concentraiilor ionilor la exteriorul i la
interiorul celulei, precum i temperatura.
Nernst @37o C: modulul este destinat calculului potenialului la echilibru pentru
ionii de K+, Na+ i Cl- i permite doar modificarea concentraiilor ionilor la
exteriorul i interiorul celulei, n timp ce temperatura este meninut la 37o C.
Goldman: modulul este destinat calculului potenialului membranar utiliznd
ecuaia Goldman (Em). Acesta permite modificarea concentraiilor ionilor la
exteriorul i interiorul celulei, modificarea permeabilitii membranei pentru
aceti ioni i modificarea temperaturii. Potenialul membranei este afiat pe
fundal negru, n dreapta, sus. Modulul afieaz n acelai timp potenialele la
echilibru pentru cele trei specii de ioni (EK, ENa i ECl) n dreapta, jos, pe fundal
rou n cazul K+, albastru n cazul Na+ i verde n cazul Cl-.
Goldman 37o C: are aceleai proprieti cu modulul Goldman, cu excepia
faptului c temperatura este fixat la 37o C.
85
Modulele programului afieaz ecuaiile utilizate pentru calculul celor dou poteniale
i explicaii legate de acestea atunci cnd mouse-ul este trecut peste zona de interes.
n plus, programul permite vizualizarea variaiei n timp a potenialelor la echilibru
i a potenialului membranei.
Programul include parametri implicii i parametri specifici pentru urmtoarele tipuri

de celule: celul generic; fibr muscular scheletic; axon de calmar i globul
roie. Atenie: ntre seturile de msurtori n care variai anumii parametri (sunt
descrii mai jos) este obligatoriu s revenii la parametrii iniiali ai tipului de celul
cu care lucrai.
Concentraiile ionice
n cadrul modulului Goldman, fiecrui tip de ion (K+, Na+ i Cl-) i sunt asociai trei
cursoare care permit modificarea permeabilitii membranei pentru acel ion,
concentraia ionului la exteriorul i la interiorul celulei. Concentraiile ionilor pot fi
variate ntre valorile de 1 mM i 600 mM. Toate valorile cursorului pot fi ajustate
prin dublu click pe valoarea raportat n caseta cursorului i tastarea valorii dorite.
Valorile implicite sunt: pentru K+ 10 mM n exterior i 100 mM n interior; pentru

Na+ 100 mM n exterior i 10 mM n interior, i pentru Cl- 100 mM n exterior i 10
mM n interior. Aceste valori absolute nu sunt de ateptat pentru niciun esut i au
fost selectate din motive didactice (factori de 10 pentru a simplifica matematica
asociat cu logaritmii). Cu toate acestea, concentraiile ionilor relevante din punct de
vedere fiziologic, n special cele intracelulare, sunt dificil de definit. Acest fapt se
datoreaz nu numai dificultilor tehnice asociate msurrii concentraiilor ionilor
intracelulari, ci i faptului c, de obicei, fiecare tip de celul menine concentraiile
intracelulare de ioni ntr-un interval de valori, care poate varia n funcie de diferitele
condiii fiziologice.
Permeabilitatea membranei
n modulul Goldman, permeabilitatea membranei fa de ionul de interes poate fi
variat ntre valorile stabilite arbitrar de 1 la 10.000. Cnd programul ruleaz n
modulul Nernst, cursorii pentru concentraie sunt singurii care pot fi ajustai.
Temperatura
Cursorul pentru temperatur raporteaz valori n grade Celsius, ns valorile de
temperatur utilizate pentru calculul potenialelor Nernst sau Goldman sunt n grade
Kelvin.
86
Reprezentarea grafic a datelor
n funcie de ntrebrile la care trebuie s rspundei, vei nregistra potenialele la
echilibru pentru ioni i potenialul membranei atunci cnd variai concentraiile
ionilor, permeabilitatea membranei pentru acetia sau temperatura.
Aceste date vor fi reprezentate grafic urmnd paii de mai jos:

Deschidei Microsoft Excel i generai un fiier nou;
Completai datele avnd grij ca pe prima coloan s trecei datele pentru para-
metrul care a variat i ca pe urmtoarele coloane s trecei valorile potenialelor
determinate n funcie de acea valoare. Mai jos este un exemplu de tabel n care
putei completa valorile potenialului la echilibru pentru Na+ (ENa) i a potenialului
membranar (Em) determinate atunci cnd variaz concentraia ionilor de Na+ la
exteriorul celulei ([Na+]o):
[Na+]o (mM) ENa (mV) Em (mV)
Selectai datele i inserai un grafic de tip Scatter (Prin puncte). Acest tip de
grafic permite asocierea datelor din prima coloan cu valori de pe axa Ox. Datele
din urmtoarele coloane vor fi asociate cu axa Oy i vor fi reprezentate n funcie
de valorile de pe prima coloan.
Utilizai opiunile din meniul Layout pentru a aduga titlul graficului i
legendele axelor. Nu uitai s menionai unitile de msur.
4.2. Identificarea diferenelor dintre tipurile de celule
1. Deschidei ngswin.exe, modulul Goldman i selectai pe rnd diferitele tipuri de

celule.
2. Rspundei la ntrebarea: ce caracteristici se menin constante ntre celula
generic, celula muscular scheletic i globula roie, dar difer mult fa de
axonul de calmar?
Care este explicaia biofizic a diferenelor dintre parametrii fibrei

musculare scheletice, a globulei roii i a axonului de calmar i care este
importana fiziologic?
87
4.3. Efectul variaiei concentraiilor ionilor la interiorul i exteriorul celulei
1. Alegei caracteristicile celulei generice n modulul Goldman la 37 C.
2. Meninnd restul valorilor constante, cretei concentraia ionilor de Na+ n
exteriorul celulei ([Na+]o) din 10 n 10, pornind de la 1 mM pn la 200 mM.
Deschidei programul Excel i pentru fiecare valoare a [Na+]o considerat notai
valorile potenialului Nernst al Na+ i ale potenialului Goldman. Trasai graficul
variaiei celor dou poteniale n funcie de concentraia ionilor de Na+ n
exteriorul celulei.
3. Meninnd restul valorilor constante, cretei concentraia ionilor de K+ n
exteriorul celulei ([K+]o) din 10 n 10, pornind de la 1 mM pn la 200 mM.
Deschidei programul Excel i pentru fiecare valoare a [K+]o considerat notai
valorile potenialului Nernst al K+ i ale potenialului Goldman. Trasai graficul
variaiei celor dou poteniale n funcie de concentraia ionilor de K+ n
exteriorul celulei.
4. Meninnd restul valorilor constante, cretei concentraia ionilor de Cl- n
exteriorul celulei ([Cl-]o) din 10 n 10, pornind de la 1 mM pn la 200 mM.
Deschidei programul Excel i pentru fiecare valoare a [Cl-]o considerat notai
valorile potenialului Nernst al Cl- i ale potenialului Goldman. Trasai graficul
variaiei celor dou poteniale n funcie de concentraia ionilor de Cl- n
exteriorul celulei.
5. Procedai similar ca mai sus pentru a trasa graficul variaiei potenialului Nernst
pentru Na+ i a potenialului membranar atunci cnd variaz concentraia ionilor
de Na+ la interiorul celulei ([Na+]i). Considerai valori ale concentraiei care cresc
din 10 n 10 mM, ncepnd cu 1 mM pn la 200 mM.
6. Procedai similar ca mai sus pentru a trasa graficul variaiei potenialului Nernst
pentru K+ i a potenialului membranar atunci cnd variaz concentraia ionilor
de K+ la interiorul celulei ([K+]i). Considerai valori ale concentraiei care cresc
din 10 n 10 mM, ncepnd cu 1 mM pn la 200 mM.
7. Determinai i reprezentai grafic potenialul la echilibru pentru ionii de Cl- i
potenialul membranar atunci cnd variaz concentraia ionilor de Cl- la
exteriorul celulei ([Cl-]o). Considerai valori ale concentraiei care cresc din 10 n
10 mM, ncepnd cu 1 mM pn la 200 mM.
8. Determinai i reprezentai grafic potenialul la echilibru pentru ionii de Cl- i
potenialul membranar atunci cnd variaz concentraia ionilor de Cl- la interiorul
celulei ([Cl-]i). Considerai valori ale concentraiei care cresc din 10 n 10 mM,
ncepnd cu 1 mM pn la 200 mM.
88
Care este ionul care influeneaz cel mai mult potenialul membranar?
De ce?
4.3.1. Efectul variaiei temperaturii
1. Alegei caracteristicile celulei generice n modulul Goldman.

2. Trasai graficele variaiilor potenialelor Nernst pentru ionii de Na+, K+ i Cl- i
ale potenialelor Goldman n funcie de temperatur din 5 n 5oC, ncepnd cu
0oC pn la 50C.
4.3.2. Efectul variaiei permeabilitii membranei pentru ioni
1. Alegei caracteristicile celulei generice n modulul Goldman la 37 C.

2. Trasai graficul potenialului Goldman atunci cnd variaz permeabilitatea mem-
branei pentru ionii de Na+. Considerai urmtoarele valori ale permeabilitii: 0;
1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024; 2048; 4096; 8192 (scal logaritmic).
3. Trasai graficul potenialului Goldman atunci cnd variaz permeabilitatea
membranei pentru ionii de K+. Considerai urmtoarele valori ale permeabilitii:
0; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024; 2048; 4096; 8192 (scal
logaritmic).
4. Trasai graficul potenialului Goldman atunci cnd variaz permeabilitatea
membranei pentru ionii de Cl-. Considerai urmtoarele valori ale permeabilitii:
0; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024; 2048; 4096; 8192 (scal
logaritmic).
Variaia permeabilitii crui ion determin cele mai mari modificri ale
potenialului Goldman? De ce?
Ce consecine fiziologice are acest fapt asupra modificrilor tipice de
permeabilitate din celula neuronal?
4.4. Exerciiul B Experiment cu o membran artificial
n acest experiment se folosete cuva Ussing (Figura NG2) pentru observarea

fenomenelor bioelectrice care apar la nivelul unei membrane permeabile.
Plasai membrana artificial (cation selectiv sau neselectiv, dup caz) n partea
liber a unuia dintre compartimentele cuvei Ussing, dup care ataai cellalt
compartiment. Camera se etaneizeaz cu ajutorul a 4 uruburi speciale care trebuiesc
strnse foarte bine (Amuzescu, B. et al., 2005).
89
1. Din soluiiile stock de pe bancul de luucru se fac diiluii de NaCl i KCl pn la o
concentraie de 5 mM (ppentru fiecare soluie) ntr-uun volum finall de 80 mL.
2. Se consider primul siistem n caree ntre cele dou d compartiimente exist un
gradient dee concentraiee pentru NaCll. Adugm sooluie NaCl 150 mM n priimul
compartim ment (exteriorr) i 5 mM NaCl n al doilea (interrior). Cele dou d
compartim mente sunt marrcate. Cele doou compartim mente trebuie umplute
u la aceelai
nivel (cuvaa este marcat). Se creeaz astfel un graddient pentru ioonii de Cl- i ionii
i
+
de Na . Se msoar raapid. Dup cee cuva a fost umplut, se pun electroziii n
soluie (unnul pentru fieccare compartimment) i se coonecteaz la pHH-metru (setaat pe
mV) (ca nn figura de maai jos) sau la un
u osciloscop.
Fiigura NG2. Model

M experim
mental
3. Se consider primul siistem n caree ntre cele doud compartiimente exist un

gradient de concentraiee pentru NaCll. Adugm soluie
s KCl 1550 mM n priimul
compartim ment (exteriorr) i 5 mM KCl n al doilea (interrior). Cele dou d
compartim mente sunt maarcate. Cele dou comparrtimente trebuuiesc umplutee la
acelai nivvel (cuva este marcat). Se creeaz
c astfel un gradient pentru
p ionii dee Cl-
i ionii de Na+. Se msoar rapid.
90
Figura NG3. Apariia diferenei de potenial n urma difuziei ionilor
printr-o barier semipermeabil
Dup ce cuva a fost umplut, se pun electrozii n soluie (unul pentru fiecare
compartiment) i se conecteaz la pH-metru (setat pe mV) (ca n Figura NG3) sau la
un osciloscop (Bran, I. and C. Ganea, 2009).
Conform legilor difuziei va aprea un flux de substan n sensul gradientului de
concentraie, dinspre compartimentul 1 nspre 2.
4. Observm prin citirea pe aparat modificrile de tensiune. Acesta este un potenial
de difuzie. Potenialul de difuzie scade n timp, pe msur ce potenialul se
egalizeaz. Notai valorile i momentul cu ajutorul unui ceas. (t1,/V1, t2,/V2,
tn/Vn etc.).
5. Figurai pe un grafic valorile potenialului n decursul a 45 de minute.
6. Se ajunge n final la o stare staionar corespunztoare unui potenial de echilibru
(valoarea potenialului de difuzie nu se mai modific). Notai potenialul final
obinut.
7. Calculai, utiliznd relaia lui Nernst, potenialul de echilibru al ionului de Na+
pentru concentraiile date.
n cazul n care membrana ar fi permeabil pentru amndoi ionii, ce

rezultat credei c vei obine?
8. Folosii i alte concentraii de NaCl i verificai relaia lui Nernst.

9. Repetai experimentul i msurtorile pentru soluiile de KCl (punctele 2->7).
10. Comparai datele obinute la acest experiment cu cele de la exerciiul A, n care
calculele se fac teoretic. Explicai diferenele, dac acestea exist.
91
11. n cazul celui de-al doilea sistem se adaug n primul compartiment o soluie cu
concentraia de 150 NaCl i n al doilea soluie de KCl 150 mM. Se creeaz un
gradient de concentraie pentru ionii de Na+ i de K+. Care este valoarea
potenialului? Explicai rezultatul.
12. Schimbai filtrul selectiv i observai modificrile de potenial n cazul acesta.
Definii termenul de permeabilitate membranar.
5. Aplicaii practice
Ecuaia Nernst este util pentru determinarea potenialului la echilibru pentru un
anumit ion atunci cnd se cunoate concentraia ionului la interiorul i n exteriorul
celulei. Semnul potenialului la echilibru ofer informaii asupra direciei n care se
desfoar pasajul ionilor: potenialele pozitive arat c ionii vor difuza din
exteriorul celulei spre interior i potenialele negative arat c ionii vor difuza din
interiorul celulei spre exterior. Diferena dintre potenialul membranar i potenialul
la echilibru pentru acel ion este direct proporional cu intensitatea curentului ionic
datorat pasajului acelui ion.
Ecuaia Goldman poate fi utilizat pentru estimarea rapoartelor de permeabilitate

atunci cnd sunt cunoscute concentraiile ionilor i potenialul membranar. Permea-
bilitatea membranei pentru ioni este asociat cu numrul de canale ionice deschise,
deci disponibile pentru pasajul ionilor. Modificri majore de permeabilitate au loc
n timpul potenialului de aciune. nelegerea legturii dintre permeabilitatea
membranei pentru ioni i potenialul membranar permite nelegerea:
- depolarizrii membranei atunci cnd se deschide un numr mare de canale de sodiu
dependente de voltaj care permit intrarea masiv a Na+ n celul i declaneaz
potenialul de aciune;
- repolarizrii i hiperpolarizrii membranei atunci cnd se deschid canalele de K+
dependente de voltaj.
6. Bibliografie
Bran, I.; Ganea, C. (2009). Curs de Biofizic Medical, Editura Universitar
Carol Davila.
Hille, B. (2001). Ion Channels of Excitable Membranes, Sinaur Associates Inc.
92
7. Teste gril
GN1. Ce reprezint rezultatul ecuaiei lui Nernst calculat pentru ionul de Na+?
A. Potenialul de aciune;
B. Diferena dintre concentraia de Na+ din exteriorul celulei i concentraia de Na+
din exteriorul celulei;
C. Potenialul la echilibru pentru Na+;
D. Potenialul de receptor.
GN2. Ce parametri influeneaz potenialul Nernst?
A. Temperatura, concentraia intracelular i extracelular a ionilor de Na+, K+, Cl-,

permeabilitatea membranei;
B. Concentraia intracelular i extracelular a ionilor de Na+, K+, Cl-,
permeabilitatea membranei;
C. Temperatura, valena ionului transportat, concentraia intracelular i
extracelular a ionilor de Na+, K+, Cl-, permeabilitatea membranei;
D. Temperatura, valena ionului transportat, concentraia intracelular i
extracelular a ionilor de Na+, K+, Cl-.
GN3. Difuzia ionilor de pe o fa a membranei pe cealalt este dictat de:
A. Diferena de concentraie dintre cele dou compartimente i temperatur;

B. Diferena de concentraie dintre cele dou compartimente i permeabilitatea
membranei;
C. Diferena de concentraie dintre cele dou compartimente, diferena de sarcin
electric dintre cele dou compartimente, permeabilitatea membranei;
D. Diferena de sarcin electric dintre cele dou compartimente i temperatur.
GN4. Permeabilitatea relativ a membranei pentru diferii ioni este integrat n

relaia lui:
A. Nernst;
B. Goldman;
C. Faraday;
D. Snell-Descartes.
93
GN5. n urma rezultatelor obinute utiliznd programul Nernst ai observat c
muchiul scheletic are permeabilitatea cea mai mare pentru:
A. Na+;
B. K+;
C. Ca2+;
D. Cl-.
GN6. Conform graficului obinut n lucrarea GN, concentraia ionului care influeneaz
cel mai mult potenialul membranar al celulei generice este:
A. Na+;
B. K+;
C. Ca2+;
D. Cl-.
GN7. Conform graficului obinut n lucrarea GN, variaia permeabilitii crui ion
influeneaz cel mai mult potenialul Goldman?
A. Na+;
B. K+;
C. Ca2+;
D. Cl-.
GN8. Potenialul lui Nernst pentru ionul de Na+ odat cu creterea temperaturii.
A. Crete;
B. Scade;
C. Rmne constant, nu depinde de temperatur.
GN9. Dac temperatura crete, atunci potenialul lui Nernst pentru ionul de Cl- va:
A. Crete;
B. Scdea;
C. Rmne acelai, nu depinde de temperatur.
94
GN10. Calculai ENa utiliznd ecuaia lui Nernst tiind c n interiorul celulei concen-
traia de Na+ este 14 mM, iar la exterior este 1,4 mM (t=20 C). Rezultatul obinut este:
A. 58 V;
B. -58 mV;
C. 58 mV;
D. 5,8 V.
GN11. Calculai Ek utiliznd ecuaia lui Nernst tiind c n interiorul celulei concen-
traia de K+ este 140 mM, iar la exterior este 5 mM (t=20 C). Rezultatul obinut este:
A. 84,16 mV;
B. -84,16 mV;
C. 25,26 mV;
D. 0,9 mV.
GN12. Cum vor migra ionii de K+ dintr-o incint cu dou compartimente separate de
o membran selectiv-permeabil pentru K+, dac ntr-unul dintre compartimente
avem o soluie de KCl cu o concentraie de 200 mM (notat compartiment A) i n
cellalt o soluie de KCl cu concentraie de 20 mM (notat compartiment B)?
A. n sensul gradientului de concentraie din compartimentul A spre

compartimentul B;
B. n sensul invers gradientului de concentraie din compartimentul B spre
compartimentul A;
C. n sensul gradientului electrochimic din compartimentul A spre
compartimentul B;
D. Ionii de K+ nu vor migra.
GN13. Cum vor difuza ionii de Cl- dintr-o incint cu dou compartimente separate de
o membran permeabil selectiv pentru K+, dac ntr-unul din compartimente avem
o soluie de KCl cu o concentraie de 200 mM i n cellalt o soluie de KCl cu o
concentraie de 20 mM?
A. n sensul gradientului de concentraie din compartimentul A spre

compartimentul B;
B. n sensul invers gradientului de concentraie din compartimentul B spre
compartimentul A;
95
C. n sensul gradientului de concentraie din compartimentul A spre
compartimentul B;
D. Ionii de Cl- nu vor migra.
GN14. n primul compartiment al cuvei Ussing avem o soluie de NaCl cu o concen-

traie de 150 mM, iar n cellalt compartiment o soluie de NaCl cu o concentraie de
5 mM. Care este diferena de potenial calculat la 20 C, tiind c membrana nu este
permeabil pentru Cl-?
A. 0 mV;
B. 85,84 mV;
C. 25,26 mV;
D. 252,6 mV.
GN15. Calculai potenialul de membran utiliznd ecuaia lui Goldman, avnd

urmtoarele date:
[K]int = 400 mM, [K]ext = 20 mM

[Na]int = 4 mM, [Na]ext = 140 mM
[Cl]int = 40 mM, [Cl]ext = 54 mM
T = 37 C
Luai n considerare faptul c membrana este permeabil doar pentru ionul de Na+,
iar permeabilitatea relativ a membranei pentru ionul de Na+ este 2. Ce rezultat ai
obinut?
A. -55,6 mV;
B. -184,24 mV;
C. -18,46 mV;
D. 94,97 mV.
GN16. Calculai potenialul de membran utiliznd ecuaia lui Goldman, avnd

urmtoarele date:
PK = 1, [K]int = 400 mM, [K]ext = 10 mM

PNa = 0,03, [Na]int = 50 mM, [Na]ext = 460 mM
PCl= 0,01, [Cl]int = 40 mM, [Cl]ext = 54 mM
t= 20 C
96
Ce rezultat ai obinut?
A. 70 mV;
B. -70 mV;
C. 75 mV;
D. -75 mV.
GN17. Termenul de permeabilitate membranar se refer la:
A. Transportul prin membranele celulare;

B. Diferena de potenial dintre membrane;
C. Potenialul la echilibru;
D. Potenialul de repaus.
GN18. Potenialul la echilibru obinut pentru Na+ este +89,5 mV ([Na]int = 5 mM,
[Na]ext = 150 mM, t = 20 C). Semnul valorii potenialului ne arat c:
A. Ionii de Na+ difuzeaz din exteriorul celulei spre interior;

B. Ionii de Na+ difuzeaz din interiorul celulei spre exterior;
C. Ionii de Na+ nu difuzeaz;
D. Membrana nu este permeabil pentru ionii de Na+.
GN19. Dac valoarea lui Em a unei membrane care desparte dou compartimente n
care se afl o soluie NaCl cu o concentraie de 150 mM (ext.), iar n cellalt
compartiment o soluie de NaCl cu o concentraie de 5 mM (int.) este -85,9 mV,
atunci membrana este:
A. Permeabil doar pentru Na+;

B. Permeabil doar pentru Cl-;
C. Mai permeabil pentru Na+ dect pentru Cl-;
D. Mai permeabil pentru Cl- dect pentru Na+.
GN20. Dac valoarea lui Em a unei membrane care desparte dou compartimente n
care se afl o soluie KCl cu o concentraie de 100 mM (ext.), iar n cellalt compar-
timent o soluie de KCl cu o concentraie de 10 mM (int.) este +58,16 mV, atunci
membrana este:
A. Permeabil doar pentru K+;

B. Permeabil doar pentru Cl-;
C. Mai permeabil pentru K+ dect pentru Cl-;
D. Mai permeabil pentru Cl- dect pentru K+.
97
8. Resurse online
Programul The NERNST/GOLDMAN equation simulator poate fi accesat pe site-ul
http://www.nernstgoldman.physiology.arizona.edu/
Noiuni fundamentale despre difuzie:

http://ro.wikipedia.org/wiki/Difuzie
http://glencoe.mheducation.com/sites/9834092339/student_view0/chapter38/
how_diffusion_works.html
http://glencoe.mheducation.com/sites/9834092339/student_view0/chapter38/
diffusion_through_cell_membranes.html
Noiuni despre permeabilitatea selectiv a membranelor:

http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/biomembrane1/
permeability.html
Informaii despre potenialul de membran i ecuaia lui Nernst:

http://mathbench.umd.edu/modules/cell-processes_nernst-potenial/page09.htm
Informaii despre ecuaia Goldman:

http://en.wikipedia.org/wiki/Goldman_equation
Exemple de calcul cu ecuaia lui Goldman:

http://www.physiologyweb.com/calculators/ghk_equation_calculator.html
98
Spectrofotometria i aplicaiile acesteia
n analizele cantitative (S)
1. Obiective
Utilizarea corect a spectrofotometrului;
nelegerea proprietilor i caracteristicilor biofizice ale luminii;
Msurarea absorbanei unei substane la diferite lungimi de und;
Capacitatea de a reprezenta grafic spectrul de absorbie al unei substane;
Capacitatea de a determina concentraia necunoscut a unei substane;
Posibilitatea de a nelege aplicaiile metodei n analizele cantitative;
Proceduri de obinere, nregistrare i analiz a datelor;
Convenii utilizate n realizarea soluiilor molare i procentuale.

Unele dintre substanele utilizate pot fi periculoase. Acridin-orange poate produce
iritaii, n cazul n care vine n contact cu pielea pentru mai mult timp. Ca urmare,
este obligatorie utilizarea mnuilor i a halatului n timpul derularii experimentului.
Soluia va fi deversat ntr-un recipient dedicat reziduurilor. Pentru acurateea
msurtorilor i pentru creterea duratei de via a aparatului se vor respecta
urmtoarele norme:

Se nchide compartimentul probei ntre msurtori;
Dup ncheierea experimentului, cuva spectrofotometrului se spal cu ap
deionizat i se pune n cutia dedicat;
de mai multe ori i apoi se cltesc cu ap deionizat.
99
CASETA 6 NOIUNI FUNDAMENTALE DE SPECTROMETRIE
Radiaia electromagnetic este o form de energie care prezint proprieti de und
i de particul (Dne, A.F., 2010).
Proprieti de und:
Unda electromagnetic are o component electric i una magnetic care oscileaz
n planuri perpendiculare unul fa de altul i perpendicular pe direcia de propagare
(Figura S1).
Lungime de und
Cmp electric
Amplitudine
Direcie de
propagare
Cmp magnetic
Figura S1. Radiaia electromagnetic
Lungimea de und () este definit ca distana dintre dou maxime sau dou minime.
Frecvena () reprezint numrul de lungimi de und n unitatea de timp. Se poate
defini i ca numrul de oscilaii ale cmpului electric n unitatea de timp.
O oscilaie/secund = 1 Hz (hertz).
Intensitatea (I) reprezint energia care trece prin unitatea de suprafa n unitatea
de timp.
Proprieti de particul:
Radiaia electromagnetic este considerat o succesiune de fotoni. Energia unui
foton (n ergi) este descris prin urmtoarea relaie:
100
unde este frecvena radiaiei electromagnetice n hertzi, h este constanta lui Planck,
6,624 10-27 ergs i n este indicele de refracie al mediului (Dne, A.F., 2010).
Radiaiile electromagnetice variaz de la energii foarte mari (radiaii cosmice sau )
pn la energii foarte mici (undele radio). Spectrul electromagnetic reprezint
radiaiile de toate lungimile de und (Figura S2).
Figura S2. Spectrul electrogmagnetic. n domeniul vizibil opereaz

spectrofotometrul din laborator
Absorbia radiaiei electromagnetice

Apare la orice substan i este maxim l o anumit lungime de und caracteristic
substanei.
Emisia radiaei electromagnetice

Emisia anumitor lungimi de und, n funcie de molecul, ca rezultat al excitrii
moleculei (transfer de energie) (Bran, I. et al., 2013). Metoda spectrofotometric
face parte dintr-o clas larg de metode (metode spectrometrice) care se bazeaz pe
absorbia luminii. Spectrofotometrul msoar intensitatea luminii dintr-o anumit
zon a spectrului electromagnetic (Figura S1) absorbit sau transmis de o substan.
101
3. Materiale
Spectrofotometrele pot msura intensitatea luminii n funcie de lungimea de und.
Sunt dou clase majore de spectrofotometre, cu monofascicul i cu bifascicul (vezi
seciunea 5). n spectrofotometrele cu monofascicul, ca cel din laborator, toat
lumina trece prin prob. Secvena de evenimente care au loc ntr-un spectro-
fotometru cu monofascicul (reprezentat n Figura S3) este urmtoarea:
Figura S3. Parcursul razelor luminoase ntr-un spectrofotometru
1. O surs de lumin produce ntregul spectru vizibil pn aproape de domeniul UV,

ntre 380 i 760 nm.
2. Lumina generat de o surs ajunge la un monocromator. Acesta este un sistem
optic de separare a lungimilor de und. Este format dintr-o prism, o reea de
difracie i un filtru (fant). Monocromatorul va selecta din spectrul luminii albe
o singur lungime de und (culoare).
3. Unda selectat va ajunge la proba aflat ntr-o cuv de cuar sau plastic.
4. O fracie din lumin este transmis prin prob la fotodetector, care este un senzor
de detecie a luminii, ca de exemplu o fotodiod. Aceasta va genera un curent
proporional cu energia luminoas.
102
5. Un amplificator va converti curentul generat n tensiune.
6. Absorbia se va nregistra de ctre nregistrator, un microamperpetru gradat n
uniti liniare de transmisie i uniti logaritmice de extincie.
Pentru a identifica natura compuilor dintr-o prob trebuie s trasm un grafic de

tipul:

Cnd se traseaz o astfel de curb trebuie ca n timpul nregistrrii ceilali parametri

s nu se modifice (natura probei, concentraia i grosimea ei). Dac se respect
aceste condiii, forma curbei depinde doar de natura ei. Ea se numete curba de
absorbie. Nu exist dou substane care s aib exact aceeai curb de absorbie.
Cantitatea total de radiaii absorbite depinde i de numrul de atomi sau molecule

dintr-o prob care absorb la o anumit lungime de und. Pe baza acestui principiu,
spectrofotometria poate fi folosit ca tehnic cantitativ pentru a caracteriza o prob.
Concentraia unei probe poate fi determinat prin citirea absorbanei la o lungime de
und la care substana prezint maximul de absorbie i realizarea unei curbe etalon
(denumit i curb standard sau curb de calibrare). Curba standard este repre-
zentarea grafic a funciei:
Pentru a trasa acest grafic se citesc mai nti absorbanele unor probe a cror
concentraie este cunoscut (citirea se realizeaz la aceeai lungime de und ca i
pentru proba necunoscut).
Alte materiale
Pahar Berzelius;
Cuve;
Pipete;
Soluie de acridine orange, clorofil sau albastru de metil;
Spectrofotometrul UV-VIS;
Ap distilat (H2Od).
103
1. Asigurai-v c nu sunt probe n spectrofotometru, iar ua de acces la cuve i
compartimentul unde se pune proba sunt nchise;
2. Se pornete spectrofotometrul din butonul ON situat n spatele aparatului;
3. Se las aparatul s i fac setrile i lampa aparatului se nclzete;
4. Lungimea de und se selecteaz de la butoanele cu sgei;
4.1. Experimentul A Determinarea absorbantei maxime a unei substane

(Amax)
5. Se introduce cuva cu apa distilat n spectrofotometru, astfel nct pereii

transpareni ai cuvei s permit trecerea luminii prin cuva cu soluie;
6. Se nchide capacul spectrofotometrului;
7. Se regleaz absorbana automat prin apsarea butonului zero la valoarea de
420 nm;
8. Se scoate cuva cu ap;
9. Se introduce substana de msurat;
10. Se noteaz absorbana;
11. Se repet etapele 7-10 la fiecare 10 nm n domeniul 420-540 nm;
12. Se recalculeaz punctul zero la fiecare lungime de und;
13. Notai datele ntr-un tabel:
Absorbana Lungimea de und
14. Se reprezint rezultatele sub forma unui grafic A = f(). Variabila independent
(cea care se schimb, lungimea de und n acest caz) se figureaz pe axa OX.
Variabila dependent (absorbana) pe OY. Se realizeaz graficul pe o foaie A4.
104
Graficele mai mari sunt mai uor de citit. Se denumesc axele i se denumete
graficul.
15. Se determin Amax pentru proba utilizat.
4.2. Experimentul B Efectul concentraiei unei soluii asupra absorbanei
n acest experiment se vor face diluii seriale ale unui compus i se va msura
absorbana pentru a determina concentraia unei probe necunoscute.
1. Se utilizeaz 4 tuburi Corning numerotate de la 1 la 4;

2. Cu ajutorul unei pipete se pipetez 2 ml de ap distilat (H2Od) n fiecare tub;
3. Se pune n primul tub 1 ml din soluia stock, care va reprezenta din
concentraia iniial. Agitai pentru omogenizare;
4. Se pipeteaz 2 ml din tubul 1 n tubul 2. Tubul 2 va reprezenta o diluie de
din soluia stock;
5. Se realizeaz nc dou diluii;
6. Se seteaz spectrofotometrul la lungimea de und la care am obinut absorbana
maxim n exerciiul A;
7. Se seteaz punctul de zero cu cuva de referin (cu H2Od);
8. Se msoar soluia 4, apoi pe rnd 3, 2 i 1;
9. Se reprezint datele n urmtorul tabel:
Tubul nr. Diluia Concentraia Absorbana
10. Pe baza datelor din tabel se calculeaz coeficientul de extincie a substanei

msurate;
11. Se reprezint grafic rezultatele Abs = f (c);
12. Se determin o concentraie necunoscut a substanei msurate;
13. Dac spectrometrul nu va mai fi utilizat, se nchide;
14. Se deverseaz soluiile ntr-un recipient sau la chiuvet.
105
5. Aplicaii
Metodele spectrofotometrice sunt metodele cele mai curent utilizate n analize
medicale n industria alimentar, industria farmaceutic, laborator. Sunt descrise mai
jos aplicaiile acestor metode preluate i prelucrate din manualul de spectrofotometrie
publicat de Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/
Sigma-ldrich/General_Information/1/ge-spectrophotometry.pdf).
5.1. Determinri ale concentraiei i puritii acizilor nucleici (ADN i ARN)
Spectrofotometria poate fi utilizat pentru determinarea concentraiei de ADN sau

ARN ntr-o prob prin msurtori ale absorbanei la 260 nm, lungimea de und la
care purinele i pirimidinele absorb lumina. S-a observat c n cazul probelor pure
cantitatea de ADN/ARN care are absorbana de 1 unitate i grosimea de 10 mm este
de 50 g/ml ADN dublu catenar, 33 g/ml pentru ADN monocatenar sau 40 g/ml
ARN. Corelnd valoarea absorbanei obinut prin citirea la 260 nm cu formulele de
mai sus, putem afla concentraia de acizi nucleici dintr-o prob.
Figura S4. Analiza spectral n microvolume
Pentru c ntr-o prob biologic i alte substane pot absorbi lumina la aceleai
lungimi de und s-au dezvoltat o serie de corecii i metode de calibrare pentru
acurateea estimrilor. Instrumentele de msur moderne permit determinarea cantitii
de acizi nucleici dintr-o prob (Figura S4, adaptat dup http://www.biotek.com).
106
Verificarea cea mai uzual pentru stabilirea puritii probelor se face prin deter-
minarea raportului Abs260/Abs280, pentru c proteinele au un maxim de absorbie la
280 nm. Pentru o prob de ADN suficient de pur raportul optim Abs260/Abs280
trebuie s se ncadreze n intervalul 1.8-2, n timp ce pentru ARN o valoare mai
mare sau egal cu 2 n intervalul 1.9-2.1 indic un extract suficient de pur. n cazul
unei probe de ADN, valori mai mici ale raportului Abs260/Abs280 arat o contaminare
cu proteine, iar o valoare mai mare de 2, o contaminare cu ARN. Probele de
ADN pot fi contaminate i cu alte tipuri de compui, cum ar fi polizaharidele.
Gradul de contaminare cu polizaharide poate fi determinat prin calcularea raportului
Abs260/Abs230, deoarece glucidele prezint un maxim de absorie la 230 nm. Raportul
optim n acest caz este mai mare dect 2. O valoare mai mic indic o contaminare
cu polizaharide a probei.
5.2. Determinri ale proteinelor
Ca i n cazul acizilor nucleici, proteinele absorb lumina la o anumit lungime de

und, ce permite msurarea direct folosind un spectrofotometru. Aminoacizii
tirozin i triptofan au o absorbie specific la 280 nm, permind determinarea
direct a absorbanei la 280 nm i msurarea concentraiei proteinei. Msurarea
direct n UV la 280 nm are multe avantaje, ntruct proba este pur, fr adaos de
reactivi, iar aceasta rmne neschimbat sau inactivat n timpul procesului. Nu este
necesar nicio perioad de incubaie, astfel nct msurtorile sunt rapide i foarte
reproductibile.
Compoziia chimic a proteinei va afecta absorbia: numrul, precum i tipul de

aminoacizi vor determina mici variaii. De aceea condiiile care afecteaz structura,
cum ar fi temperatura, pH-ul, tria ionic sau prezena detergenilor pot afecta
capacitatea reziduurilor aromatice de a absorbi lumina la 280 nm i pot modifica n
consecin valoarea coeficientului de extincie.
O serie de metode colorimetrice sunt aplicate curent n biochimie. Ele sunt metoda
Bradford, metoda BCA, metoda Lowry, metoda biuretului. Principiul de baz al
primelor trei metode const n faptul c reactivii conin un colorant care se leag
specific la proteinele dintr-o soluie. Se face o curb standard prin msurarea
absorbiei unui set cunoscut de probe (standarde). Determinarea absorbiilor probelor
necunoscute pot fi apoi comparate cu curba pentru a stabili concentraia acestora.
107
5.3. Determinri de fluorescen
Metoda de determinare prin fluorescen const n ncorporarea unei probe fluores-

cente n protein sau ADN i determinarea absorbiei maxime a acestei probe. De
exemplu, concentraia de ADN poate fi determinat prin ncorporarea fluoresceinei,
Cy3, Cy. n biologia celular se utilizeaz o gam larg de spectrofotometre pentru
determinri ale viabilitii celulare, ale densitii proliferrii etc.
5.4. Determinri ale glucidelor i lipidelor
Dup cum am precizat anterior, glucidele prezint un maxim de absorie la 230 nm.
Zaharurile reduc ionii de Cu2+ la Cu+, rezultnd un compus colorat, aceast reacie
stnd la baza metodelor de dozare a glucidelor, cum ar fi metoda Nelson. Compusul
colorat obinut prezint un maxim de absorie la 630 nm. Pentru determinarea
concentraiei de glucoz din probele necunoscute se traseaz o curb standard (la fel
ca n cazul proteinelor).
Metoda de dozare a glucidelor cu o-toluidin prezint o deosebit importan

practic deoarece ne permite aflarea concentraiei de glucoz din snge. Aceast
metod se afl la baza determinrilor spectrofotometrice ale concentraiilor de
glucoz din snge ce se realizeaz n domeniul medical. Complexul colorat format
ntre glucoz i o-toluidin prezint un maxim de absorbie la 630 nm, iar principiul
de dozare presupune realizarea unei curbe etalon cu probe cu concentraii
necunoscute. Valoarea obinut prin dozarea probei din snge trebuie nmulit cu
2000 pentru ca rezultatul s fie exprimat n mg glucoz n 100 mL snge.
O alt metod colorimetric de importan n domeniul medical este reprezentat de

metoda Zollner-Krisch. Aceast metod permite determinarea concentraiei de lipide
serice totale prin compararea cu un standard corespunztor. Se citesc absorbanele
probei (Ap), standardului (As), blancurilor (ABR i ABS) la 530 nm, iar concentraia de
lipide totale se calculeaz cu ajutorul formulei:
ABR
500 100
As ABS
108
6. Bibliografie
Dne, A.F. (2010). Analiz Instrumental. Partea II, Editura Univesitii din
Bucureti, Bucureti.
109
7. Teste gril
GS1. Radiaia elecromagnetic este:
A. O und;
B. O serie de fotoni;
C. O radiaie cu caracter dual und/particul;
D. Un cmp electric.
GS2. Lumina ultraviolet:
A. Are o lungime de und scurt;

B. Este msurat ntre 180 i 300 nm;
C. Este dunatoare pielii;
D. Toate de mai sus.
GS3. Zona vizibil a spectrului electromagnetic este ntre ..nm i ..nm.
A. 100, 500;
B. 800, 1200;
C. 10, 300;
D. 380, 740.
GS4. Legea Beer-Lambert statueaz c:
A. Absorbia este direct proporional cu concentraia substanei;

B. Absorbia este inversul transmitanei;
C. Absorbia este invers proporional cu lungimea cuvei;
D. Spectrul de absorbie este specific fiecrei substane.
GS5. Punctul zero (blank) al unui spectrofotometru este:
A. Apa;
B. Cuva goal;
C. Solventul substanei care va fi determinat;
D. Substana de determinat la o concentraie cunoscut.
110
GS6. Care component al spectrofotometrului este ajustat pentru a selecta lungimea
de und:
A. Sursa de lumin;
B. Filtrul;
C. Fotodetectorul;
D. Proba.
GS7. Pentru a determina o curb standard a unui compus, lungimea de und se

fixeaz:
A. La cea mai mic valoare;

B. La cea mai mare valoare;
C. La lungimea de und la care absorbia compusului este minim;
D. La lungimea de und la care absorbia compusului este maxim.
GS8. Proba pentru determinarea punctului de zero (blank) conine:
A. Solvent;
B. Solut;
C. Filtru;
D. Spectrul de absorbie.
GS9. Proba prin care se seteaz punctul zero n determinarea spectrului de absorbie
a substanei acridin-orange este:
A. Ap de la robinet;
B. Aceton;
C. Apa distilat;
D. Alcool.
GS10. Cunoscnd absorbana maxim a unei substane necunoscute, din curba de

calibrare mai putem afla:
A. Lungimea de und a absorbanei maxime;

B. Greutatea molecular a probei;
C. Concentraia probei;
D. Identitatea probei.
111
GS11. Conform graficului alturat (calcul prin metoda matematic), proba care are o
absorban de 0.48 are concentraia:
Equation y = a + b*x
A. 30%;
Adj. R-Square 0.99331
B. 80%; 1.0 Value Standard Error
Abs Intercept 0.01286 0.01764
C. 70%; Abs Slope 0.00794 2.91373E-4
D. 67%. 0.8
0.6
Abs
0.4
0.2
0.0
0 20 40 60 80 100
concentra
tie (%)

GS12. Conform graficului alturat, proba care are o absorban de 0.48 are
concentraia:
A. 67%; Adj. R-Square 0.99331
B. 80%; 1.0 Value Standard Error
C. 67 mM Abs Slope 0.00794 2.91373E-4
D. 40%. 0.8
0.6
Abs
0.4
0.2
0.0
0 20 40 60 80 100
concentra
tie (mM)

112
GS13. Conform graficului alturat, proba la concentraia de 70% are o absorban de:
A. 80%;
B. 0.51; 1.0 Adj. R-Square 0.99728
Value Standard Error
C. 500 nm;
D. 0.49 grade. 0.8 Abs Slope 0.00754 1.76298E-4
Abs 0.6
0.4
0.2
0.0
0 20 40 60 80 100 120
concentration (%)
GS14. Un spectru de absorbie este:
A. Un grafic al conversiei luminii n energie electric;

B. Un grafic al relaiei dintre absorbana unui compus chimic i lungimea de und;
C. Un grafic al relaiei dintre absorbana unui compus chimic i concentraia sa;
D. Cantitatea de radiaie reinut de o prob.
113
GS15. Betacarotenul (spectrul alturat) absoarbe cel mai mult culorile din domeniul
spectrului vizibil:
A. Rou;
B. Portocaliu;
C. 600 700 nm;
D. Violet/albastru.
GS16. Acridine-orange absoarbe maxim n domeniul spectrului vizibil la:
A. 200-400 nm;
B. 470-500 nm;
C. 600-700 nm;
D. 800-1200 nm.
114
GS17. O prob
b de culoare rroie (de exem
mplu hemoglob
bina) are un Abs
A max n dome
eniul:
A. 300-400
0 m;
B. 500-600
0 nm;
C. 700-900
0 nm;
D. 10-100 nm.
GS18. Ce diluuie se realizeaaz cnd 900 l

dintr-un solvvent este omo 00 l
ogenizat cu 10
fluorescein:
A. 1/5;
B. 1/100;
C. 1/10;
D. 1/20.
GS19. Lungimmea de und optim pentrru a determin

na concentraia unei probe
e se
realizeaz:
A. o curb de calib
Printr-o brare;
B. Prin utillizarea legii Beer-Lambert;
C. Prin detterminarea punctului zero al aparatului;
D. Prin reaalizarea spectru ului de absorbie.
GS20. Urmrind diluiile effectuate n ep prubetele din imaginea

i altu
urat n care este
e
figurat volumul final, tubul iniial are con
ncentraia:
A. 10 mM
M;
B. 200 mM;
m
C. 5 mM;
D. 100 mM.
m
115
8. Resurse online
https://www.msu.edu
http://highered.mheducation.com
http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-
Aldrich/General_Information/1/ge-spectrophotometry.pdf
http://www.microeguide.com
116
Rezolvrile grilelor
GP1: D GR1: C GD1. D
GP2: D GR2: D GD2. B
GP3: A GR3: A GD3. C
GP4: B GR4: A GD4. A
GP5: C GR5: C GD5. D
GP6: C GR6: B GD6. D
GP7: A GR7: B GD7. B
GP8: D GR8: A GD8. C
GP9: A GR9: B GD9. B
GP10: D GR10: A GD10. D
GP11: C GR11: C GD11. C
GP12: B GR12: D GD12. A
GP13: A GR13: C GD13. C
GP14: C GR14: D
GP15: B GR15: A
GP16: C GR16: D
GP17: A GR17: A
GR18: A
GR19: C
117
GO1: B GN1: C GS1: C
GO2: D GN2: D GS2: D
GO3: C GN3: C GS3: D
GO4: D GN4: B GS4: A
GO5: D GN5: D GS5: C
GO6: D GN6: B GS6: B
GO7: C GN7: A GS7: D
GO8: D GN8: A GS8: A
GO9: D GN9: A GS9: C
GO10: B GN10: B GS10: C
GO11: A GN11: B GS11: D
GO12: D GN12: C GS12: C
GO13: B GN13: D GS13: B
GO14: C GN14: B GS14: B
GO15: B GN15: D GS15: D
GO16: A GN16: B GS16: B
GO17: C GN17: A GS17: B
GO18: D GN18: A GS18: C
GO19: D GN19: B GS19: D
GN20: A GS20: B
118

Tehnici de Biofizica - Cucu - Mernea

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Tehnici de Biofizica - Cucu - Mernea

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

TEHNICI DE BIOFIZIC

Editor: Ioan Crciun

Editura ARS DOCENDI Universitatea din Bucureti

os. Panduri 90-92, sector 5, Bucureti

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei

Dana Cucu, Maria Mernea, 2015

Tiprit la Editura Ars Docendi

LECTOR DR. DANA CUCU

Tehnici de biofizic se adreseaz n primul rnd studenilor la biologie, biochimie,

ntr-o er n care ntreaga comunitate tiinific se strduiete s neleag comple-

ntr-o perioad tulbure, n care demersul oamenilor de tiin din Romnia de a

2. Norme de protecia muncii n laborator

Lumina polarizat liniar

Lumin natural Lumin polarizat liniar

Gradul rotaiei planului luminii polarizate poate da indicaii despre:

[] rotaia specific (putere rotatorie specific) la temperatura T

Istoric, polarimetria a fost aplicat n lumina unui bec de sodiu. Ca urmare,

Pentru realizarea experimentului sunt necesare urmtoarele aparate i substane:

Figura P1. Panoul frontal al polarimetrului

Polarimetrul i tubul polarimetrului (Figurile P1 i P2);

Pipetor automat (salpet) T

FFigura P2. Usteensile de laborrator

Zaharurile au tendina de mutarotaie n soluie (unghiurile de rotaie i schimb

Se pornete polarimetrul comutnd butonul pe poziia I. Se las aproximativ 10

1. Se pune apa deionizat n tubul polarimetrului n aa fel nct s nu rmn bule.

2. Se identific punctul zero al polarimetrului la lungimea de und de 590 nm. n

3. Se scoate tubul i se nlocuiete apa deionizat cu soluiile care vor fi msurate.

4. Se va efectua unul dintre urmtoarele experimente, conform indicaiilor ndrum-

4.1. Experimentul A Determinarea concentraiei unei soluii optic active

5. Se calculeaz volumul de soluie stock necesar pentru 20 de ml de sucroz sau

6. Se iau 3 tuburi gradate Corning i se noteaz pe ele concentraiile corespunztoare;

7. Se ataeaz pipeta serologic la pipetor, apoi se pornete pompa pipetorului

9. Se evacueaz n cte un tub Corning de 50 de ml soluia aspirat (butonul off)

11. Se nchide tubul, iar soluia se agit pentru omogenizare;

13. Se citete unghiul de pe scala polarimetrului, n momentul n care valoarea s-a

14. Prezentarea rezultatelor se va realiza conform tabelului:

Cantitatea de soluie Concentraia Valoarea unghiului obs

15 Se traseaz grafic dependena unghiului obs/dm de concentraie a soluiei; n

16 Se msoar obs pentru o soluie de concentraie necunoscut cx.;

17 Se determin concentraia necunoscut cx prin metoda grafic sau prin metoda

18 Calculai unghiul specific al substanei analizate;

19 Verificai n tabel dac valoarea corespunde substanei analizate;

20 Interpretai rezultatul (n cazul n care nu corespunde, justificai rezultatul).

Denumire Unghi de rotaie

5. Se msoar unghiul de rotaie al etanolului, pentru a realiza corecia probelor;

12. Din relaia (1) se calculeaz puritatea compusului;

4.3. Experimentul C Evaluarea i caracterizarea compuilor optic activi

5. Se cntrete aproximativ 1 g din fiecare substan necunoscut. nregistrai 3

4.4. Experimentul D hidroliza sucrozei

5. Se pregtete o baie de ap ntr-un pahar Berzelius de 500 ml. Se pun

ct1 (t1= 5 minute) 2

ct2 (t2= 10 minute) 3

ct3 (t2= 15 minute) 4

ct4 (t4= 60 minute) 5

n industria alimentar, polarimetrele sunt utilizate pentru a determina puritatea sau

Polarimetrele automate sunt folosite i n industria parfumurilor deseori falsificate

n cercetarea tiinific, cea mai recent utilizare a polarimetrului este senzorul

O aplicaie medical este utilizarea polarimetrului pentru determinarea modificrilor

n industria farmaceutic este de multe ori utilizat un anumit enantiomer al unui

A. Lumina polarizat prezint oscilaii ale vectorului electric la 90 fa de vibraiile

GP2. Lungimea de und a luminii reprezint:

A. Viteza de propagare a undei electromagnetice ntr-un mediu;

GP3. Ce se nelege prin lumin polarizat i plan de polarizare?